JP5346211B2 - 血小板凝集絶対パーセント決定のための方法およびシステム - Google Patents

Description

本発明は、一般的に血小板の阻害パーセントを決定するための方法および装置に関し、より詳細には、血小板の様々な活性経路を抑制する薬で処理されたとき、血小板の阻害パーセントを決定するための方法および装置に関する。

哺乳類生理学での血小板の役割は非常に様々であるが、それらの主たる役割は止血を促進することにある。多くの場面で、血液を凝固させる能力、すなわち血小板の接着するおよび／または凝集する能力によってしばしば制御されるパラメータの評価が望まれる。従って、興味があるのは、血小板の接着機能の評価である。例えば、興味がある問題は、血塊形成を阻害するあるいは促進する薬を投与するかどうか、あるいは外科処置の前に血小板機能の欠陥を検出するかどうかを含む。興味があるのは、また、新薬として試験されている、あるいは認可臨床治療として患者に用いられている、血小板阻害剤の有効性の評価である。

血小板は、通常の止血の維持で重要な役割を果たす。損傷血管に露出されたとき、血小板は、露出された内皮下マトリックスに接着する。最初の接着に続いて、トロンビン、ＡＤＰ、およびコラーゲンのような、損傷部位で放出されあるいは作り出される様々な因子が、血小板を活性化する。一旦、血小板が活性化されると、血小板糖タンパク質ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に立体構造変化が起こり、受容体はフィブリノゲンおよび／またはフォン・ヴィレブランド因子を結合させる。隣接した血小板上のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体による多価フィブリノゲンおよび／またはフォン・ヴィレブランド因子分子のこの結合の結果、追加の血小板が損傷部位に補充され、且つ血小板が凝集して止血血栓あるいは血栓を形成する。

血小板凝集は、血小板の互いの結合を記載するために用いられる用語である。生体外血小板凝集は、一次止血血栓となる凝集体を形成する、血小板の生体内能力を評価するために用いられる実験方法である。この技術では、抗凝集全血サンプルを多条件で遠心分離し、血小板富血漿（ＰＲＰ）および血小板貧血漿（ＰＰＰ）サンプルの両方を作る。次いで、ＡＤＰあるいはコラーゲンのような凝集剤を、ＰＲＰに加え、血小板の凝集を光学的に監視し、これと平行して、ＰＰＰサンプルを用いて、別の光学測定をする。次いで、ＰＰＰチャネルの使用によって、ＰＲＰチャネルと比較する１００％凝集規準レベルとして凝集パーセントを決定する。血液の遠心分離により赤血球が溶血されることがあるので、調製の変化性によるＰＰＰの光学濃度の変化が、凝集パーセントを計算するために用いられる光学規準レベルに誤りをもたらす。

生体内血小板凝集能力を評価するために実験室で用いられる他の生体外血小板凝集方法は、希釈した全血を用いて、ＡＤＰあるいはコラーゲンのような凝集剤の添加後、血小板が接着し、且つ凝集するとき、２つの、間隔が接近した貴金属電極間の電気インピーダンスの変化を測定する。この方法では、血小板凝集のパーセントを決定する単一のアッセイ手段が無い。その代わりに、２つの別々のアッセイを作動し、２つの測定間の比を取って、凝集パーセントを決定しなければならない。患者が既に血小板阻害薬を使っている場合、血小板凝集のパーセントを決定する方法はない。血小板凝集を測定するための現在のアッセイは費用がかかり、時間がかかり、扱いにくく、且つ概して臨床環境に適さない。

高速血小板機能アッセイが最近開発され、米国特許第５，７６３，１９９号に記載されている。アッセイは、希釈していない全血での糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体阻害を決定する。フィブリノゲンのようなＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａリガンドでコーティングされた小さい高分子ビーズの凝集が、該ビーズが、阻害されない活性化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体を有する血小板を含有する全血と接触したときに、生じる。凝集しなかったことは、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体が活性化されなかったこと、および／またはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体が阻害されたことを示す。好ましい実施形態では、ＡＤＰあるいはアラキドン酸のような血小板活性剤の添加により、アッセイはベッドサイドで行うのに十分迅速且つ便利であり、もし活性化受容体が阻害されなければ、小さい高分子ビーズが、都合のよい既知の時間内で凝集する。アッセイは、試験されるべき血液を収集容器からアッセイ装置まで、収集容器の開放することなしに移送する能力を含む。

血小板凝集は、血栓症および急性冠動脈疾患の病因で重要な役割を果たす。証拠は、様々な抗血小板剤に応答して重要な血小板機能の変化性が存在することを示唆している。クロピドグレルのようなＰ２Ｙ１２拮抗薬が抗凝集効果を達成するために患者の治療に用いられるときに、血小板凝集の個体間の変化性が存在することも明らかにされてきた。ある研究の結果は、薬を受けている患者の少なくとも１０％は、期待される血小板凝集阻害を達成していなかったことを明らかにした（ミュラー．Ｉ、ベスタ．Ｆ、シュルツ．Ｇ、マスベルク．Ｓ、シェーニッヒ．Ａ、ガヴァツ．Ｍ、選択的な冠動脈ステントの配置が予定された安定狭心症の患者間のクロピドグレル無反応者有病率、Thromb Haemost、２００３年５月、８９（５）、７８３〜７）。

心臓血管疾患の多くの患者は、チエノピリジン薬の１つを慢性的に服用しているので、阻害されたサンプルの単一の測定に基づいて血小板阻害のレベルを決定するための方法は、有益である。その上、ＰＴＣＡ処置を受ける患者は、一般的には、処置の前にチエノピリジン薬の大量投与が与えられる。次いで、これらの患者の何人かは、緊急外科手術を必要とすることがあり、血小板阻害の絶対レベルについての情報を提供するアッセイが、外科手術前に出血の管理リスクを評価するのに有益であろう。

抗血小板薬による血小板の凝集パーセントあるいは阻害パーセントを得るための改良された方法の要求がある。単一の血液サンプルを用いて、抗血小板薬による血小板の凝集パーセントあるいは阻害パーセントを得るための方法の更なる要求がある。更に、単一の測定で、抗血小板薬による血小板の凝集パーセントあるいは阻害パーセントを得るための方法の更なる要求がある。

従って、本発明の目的は、抗血小板薬による血小板の凝集パーセントあるいは阻害パーセントを決定するための改良された方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、単一の血液サンプルを用いて、抗血小板薬による血小板の凝集パーセントあるいは阻害パーセントを得るための方法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、単一の測定で、抗血小板薬による血小板の凝集パーセントあるいは阻害パーセントを得るための方法を提供することにある。

本発明のこれらのおよび他の目的は、単一の血液サンプルを用いて、アスピリン、チエノピリジン、シロスタゾールなどを含むがこれらに限定されない抗血小板薬から生じる、血小板の凝集パーセントあるいは阻害パーセントを得るための方法で達成される。アッセイ装置が提供される。アッセイ装置は各々共通の導入口に連結された多チャネルを有する。
第１の血小板活性剤が、アッセイ装置の第１のチャネルに導入される。第１の血小板活性剤は、抗血小板薬によって目標にされる活性経路に敏感である。第２の血小板活性剤は、アッセイ装置の第２のチャネルに導入される。第２の血小板活性剤は、抗血小板薬によって目標にされる活性経路に鈍感である。抗凝集サンプルが、第１および第２のチャネルに同時に導入される。血小板凝集のレベルは、両方のチャネル内で同時に生じる。例示として、および限定で無く、血小板凝集のレベルは、光学濁度法によって決定することができる。血小板凝集のパーセント（ＰＡ）あるいは阻害パーセント（ＰＩ）は、以下のように決定される。
％ＰＡ＝（試験チャネル凝集／制御チャネル凝集）×１００％
％ＰＩ＝（１−（試験チャネル凝集／制御チャネル凝集））×１００％＝１００％−％ＰＡ

本発明の一実施形態では、抗血小板薬による血小板の凝集パーセントあるいは阻害パーセントは、単一の血液サンプルを用いて決定される。図１に示すように、全体として参照番号１０として示すアッセイ装置が提供される。アッセイ装置１０は、複数の混合チャンバ／検出ウェル１２と、ステージングウェル１４と、サンプルウェル１６と、保護シース１８と、を含む。アッセイ装置は、血液サンプルの独立の、および同時のアッセイに用いられる。カートリッジが提供される。

カートリッジは、各々共通の導入口に連結された多チャネルを有する。第１の血小板活性剤が、第１のチャネルの中に導入される。第１の血小板活性剤は、抗血小板薬によって目標にされた活性経路に敏感である。適当な第１の血小板活性剤は、アラキドン酸、ＡＤＰ、コラーゲン、トロンボキサンＡ２、エピネフリンなどを含むが、これに限定されない。第２の血小板活性剤は、カートリッジの第２のチャネルの中に導入される。第２の血小板活性剤は、抗血小板薬によって目標にされた活性経路に鈍感である。適当な第２の血小板活性剤は、トロンビン、イソＴＲＡＰすなわちイソトロンビン受容体活性化ペプチドなどを含むが、これに限定されない。

抗凝集サンプルが、第１および第２のチャネルに同時に導入される。血小板凝集のレベルは、両方のチャネルで同時に生じる。例示として、および限定でなく、血小板凝集のレベルは、光学濁度法によって決定することができる。

血小板凝集パーセント（ＰＡ）あるいは阻害パーセント（ＰＩ）は、以下の通りである。
％ＰＡ＝（試験チャネル／制御チャネル）＊１００％
％ＰＩ＝（１−（試験チャネル／制御チャネル））＊１００％＝１００％−％ＰＡ
比較は、アッセイ装置１０内でなされる。

１つの特定の実施形態では、アッセイ装置１０は凝集による光信号の変化を測定する機器である。適当な機器は、例示として、および限定でなく、動的分光光度計、すなわちＵｌｔｅｇｒａ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）機器（カリフォルニア州サンディエゴのアキューメトリックス社から商業的に入手可能であり、且つ通常サンプルの高速血小板機能活性測定のために用いられる）などを含む。

Ｕｌｔｅｇｒａ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ機器は、混濁に基づく光検出システムであり、血小板誘導凝集を光透過率の増大として測定する。システムは、アナライザーと、使い捨てカートリッジと、コントロールと、からなる。カートリッジは、微粒子凝集技術に基づく試薬を収容する。品質制御システムは、電子制御と、２つのレベルのアッセイ「ウェット」コントロール（ＷＱＣ）と、カートリッジ内湿度センサと、パッケージ内温度表示器と、２つのアッセイチャネルの一致テストと、を含む。アナライザー制御アッセイシーケンスは、アッセイ温度を確立し、要求された時間で試薬−サンプル混合を制御し、血小板機能の程度を決定し、結果を表示し、そして自己診断を行う。

本発明の１つの特定の実施形態では、カートリッジは、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体リガンドと共有結合した粒子と、ＡＡかつアスコルビン酸の組成と、バッファと、からなる凍結乾燥標品を含む。患者サンプルは、クエン酸全血であるのがよく、該クエン酸全血は、使用者による血液取り扱いを要求すること無しに、採血チューブからカートリッジの中へ、アナライザーによって自動的に分配される。相互作用が、粒子の赤外線吸収特性によって監視される。粒子が血小板と相互作用すると、粒子の凝集が、Ｕｌｔｅｇｒａ（登録商標）アナライザーの光学システムにより測定される。凝集は、サンプルを通る赤外光の透過の増大として検出される。反応速度が分析され、「アスピリン反応単位」すなわちＡＲＵに翻訳される。

分離された試薬が、カートリッジの個々のチャネル内にある。しかしながら、両方のチャネルの中へのサンプルの共通の導入がある。アッセイ装置１０は、血液サンプルの導入、試薬と血液サンプルとの混合、活性チャネル毎の凝集の独立した光学測定、および個々のチャネル結果に基づいた％ＰＩの決定を制御する。

本発明は、薬物誘導された血小板阻害の患者を測定したときでさえも、患者の非阻害レベルに対する血小板阻害のレベルを決定する単一のアッセイを提供する。

血小板受容体の阻害を決定するための血液アッセイ
血液を注射器によって患者から抜き取り、クエン酸ナトリウム（３．８％クエン酸ナトリウム１体積）を収容する標準ブルートップチューブ内に入れる。変形例では、血液を、ヴァキュテーナーによってブルートップチューブの中に直接引き込む。

次いで、チューブを逆さにして、抗凝集剤を全血と混合する。次いで、５０ｍＵ／ｌのこの混合物を５０ｍＵ／ｌのバッファ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ₂、０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）および５ｍＵ／ｌのバッファに加える。抗凝集サンプルを、カートリッジの第１および第２のチャネルに同時に導入する。

もしＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体が阻害されるならば、ビーズは懸濁したままである。もしＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体が阻害されないならば、血小板がビーズの表面に結合したフィブリノゲンと相互作用し、ビーズが凝集する。血小板凝集のレベルは、アッセイ装置１０によって両方のチャネル内で同時に生じる。

血小板受容体の阻害を決定するための血液アッセイ
血液を注射器によって患者から抜き取り、クエン酸ナトリウム（３．８％クエン酸ナトリウム１体積）を収容する標準ブルートップチューブ内に入れる。変形例では、血液を、ヴァキュテーナーによってブルートップチューブの中に直接引き込む。

血液サンプルを、カートリッジの第１および第２のチャネルに同時に導入する。アッセイ装置１０は、血液サンプルの導入、試薬と血液サンプルとの混合、活性チャネル毎の凝集の独立した光学測定、および個々のチャネルの結果に基づいて％ＰＩの決定を制御する。

第１の血小板活性剤、すなわちアラキドン酸が、第１のチャネル内にある。第２の血小板活性剤、すなわちトロンビンを、カートリッジの第２のチャネルの中に導入する。血小板凝集のレベルは、アッセイ装置１０によって両方のチャネル内で同時に生じる。

血小板受容体の阻害を決定するための血液アッセイ
血液を注射器によって患者から抜き取り、クエン酸ナトリウム（３．８％クエン酸ナトリウム１体積）を収容する標準ブルートップチューブ内に入れる。変形例では、血液を、ヴァキュテーナーによってブルートップチューブの中に直接引き込む。

血液サンプルを、カートリッジの第１および第２のチャネルに同時に導入する。アッセイ装置１０は、血液サンプルの導入、試薬と血液サンプルとの混合、活性チャネル毎の凝集の独立した光学測定、および個々のチャネルの結果に基づいて％ＰＩの決定を制御する。

第１の血小板活性剤、すなわちＡＤＰが、第１のチャネル内にある。第２の血小板活性剤、すなわちイソＴＲＡＰが、第２のチャネル内にある。血小板凝集のレベルは、アッセイ装置１０によって両方のチャネル内で同時に生じる。

血小板受容体の阻害を決定するための血液アッセイ
血液を注射器によって患者から抜き取り、クエン酸ナトリウム（３．８％クエン酸ナトリウム１体積）を収容する標準ブルートップチューブ内に入れる。変形例では、血液を、ヴァキュテーナーによってブルートップチューブの中に直接引き込む。

血液サンプルを、カートリッジの第１および第２のチャネルに同時に導入する。アッセイ装置１０は、血液サンプルの導入、試薬と血液サンプルとの混合、活性チャネル毎の凝集の独立した光学測定、および個々のチャネルの結果に基づいて％ＰＩの決定を制御する。

第１の血小板活性剤、すなわちトロンボキサンＡ２が、第１のチャネル内にある。第２の血小板活性剤、すなわちトロンビンが、第２のチャネル内にある。血小板凝集のレベルは、アッセイ装置１０によって両方のチャネル内で同時に生じる。

血小板受容体の阻害を決定するための血液アッセイ
血液を注射器によって患者から抜き取り、クエン酸ナトリウム（３．８％クエン酸ナトリウム１体積）を収容する標準ブルートップチューブ内に入れる。変形例では、血液を、ヴァキュテーナーによってブルートップチューブの中に直接引き込む。

血液サンプルを、カートリッジの第１および第２のチャネルに同時に導入する。アッセイ装置１０は、血液サンプルの導入、試薬と血液サンプルとの混合、活性チャネル毎の凝集の独立した光学測定、および個々のチャネルの結果に基づいて％ＰＩの決定を制御する。

第１の血小板活性剤、すなわちエピネフリンが、第１のチャネル内にある。第２の血小板活性剤、すなわちイソＴＲＡＰが、第２のチャネル内にある。血小板凝集のレベルは、アッセイ装置１０によって両方のチャネル内で同時に生じる。

本発明の実施形態の前述の記載は、説明および記載のために示した。網羅的なものではなく、あるいは発明を、開示したそのままの形態に限定するものではない。明らかに、多くの変形および変更が当業者に明らかであろう。本発明の範囲は、添付した特許請求の範囲およびその均等物によって定められる。

複数の混合チャンバ／検出ウェルと、ステージングウェルと、サンプルウェルと、保護シースと、を有する、本発明について用いることができるアッセイ装置の図である。

Claims (8)

1. 血小板の凝集パーセントあるいは阻害パーセントを得るための方法であって、
   試験チャネルである第１のチャネルおよび制御チャネルである第２のチャネルを備えるアッセイ装置であって、抗血小板薬によって目標にされる活性経路に敏感である第１の血小板活性剤がアッセイ装置の試験チャネルである第１のチャネルに存在し、抗血小板薬によって目標にされる活性経路に鈍感である第２の血小板活性剤がアッセイ装置の制御チャネルである第２のチャネルに存在するアッセイ装置に、抗血小板薬で処理された個人から得られた抗凝集血液サンプルを、該抗凝集血液サンプルが試験チャネルである第１のチャネルおよび制御チャネルである第２のチャネルの両方に導入されるように導入し、
   両方のチャネル内の血小板凝集のレベルを同時に測定し、
   血小板凝集パーセント（ＰＡ）あるいは阻害パーセント（ＰＩ）を次のように決定する、
   ％ＰＡ＝（試験チャネル凝集／制御チャネル凝集）×１００％
   ％ＰＩ＝（１−（試験チャネル凝集／制御チャネル凝集））×１００％＝１００％−％ＰＡ
   ことを特徴とする方法。
2. 第１の血小板活性剤は、アラキドン酸、ＡＤＰ、コラーゲン、トロンボキサンＡ２、およびエピネフリンから選択される、請求項１に記載の方法。
3. 第２の血小板活性剤は、トロンビン、およびイソＴＲＡＰすなわちイソトロンビン受容体活性化ペプチドから選択される、請求項１に記載の方法。
4. 抗凝集血液サンプルは、希釈されない全血、血漿、および希釈された全血から選択される、請求項１に記載の方法。
5. 抗凝集血液サンプル、第１の血小板活性剤、および第２の血小板活性剤は、共通の導入口を通してアッセイ装置に導入される、請求項１に記載の方法。
6. 抗血小板薬は、チエノピリジンである、請求項１に記載の方法。
7. 抗血小板薬は、アスピリンまたはシロスタゾールである、請求項１に記載の方法。
8. 第１の血小板活性剤は、ＡＤＰであり、第２の血小板活性剤は、イソＴＲＡＰすなわちイソトロンビン受容体活性化ペプチドである、請求項６に記載の方法。

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