KR20100101157A - 폰 빌레브란트 질환을 그리고 폰 빌레브란트 질환 및 혈소판 기능의 후천적 또는 선천적 장애와 연관된 증가된 출혈 위험을 평가하기 위한 시험관내 진단 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 폰 빌레브란트 질환폰 빌레브란트 질환(von Wilebrand Disease: VWD) 및 폰 빌레브란트 질환 및/또는 폰 빌레브란트 인자와 혈소판의 상호작용을 감소시키는 후천적 또는 선천적 혈소판 기능 결함과 관련된 증가된 출혈 위험을 진단하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 시험관내 방법은 추가의 출혈 위험을 진단하는데 이용될 수 있다. 본 시험은 전혈에 기초한 스크리닝 시험으로서 이용하기에 적합하며, 현장 진단(point of care test)에 적합한 추가의 이익을 갖는다. 본 방법은 혈소판 및 지혈 인자를 포함하는 샘플을 혈소판 응집 활성화제와 항온처리하고, 예를 들어 혈전탄성그래피(TEG)에 의해 응고 유도 후 점탄성 변화를 측정하는 것을 포함한다.
Description
본 발명은 폰 빌레브란트 질환(von Wilebrand Disease: VWD)을 그리고 폰 빌레브란트 질환 및/또는 폰 빌레브란트 인자(von Wilebrand Factor:VWF)와 혈소판의 상호작용을 감소시키는 후천적 또는 선천적 혈소판 기능 결함과 관련된 증가된 출혈 위험을 진단하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 시험관내 방법은 추가의 출혈 위험을 진단하는데 이용될 수 있다. 본 시험은 전혈에 기초한 스크리닝 시험으로서 이용하기에 적합하며, 현장 진단(point of care test)에 적합한 추가의 이익을 갖는다.
VWF는 포유동물의 혈장에 존재하는 다량체의 부착성 당단백질로서 다수의 생리학적 기능을 갖는다. 초기 지혈 동안, VWF는 혈소판 표면의 특정 수용체와 콜라겐과 같은 세포외 기질 성분 사이의 매개자로서 작용한다. 또한, VWF는 응고촉진제(procoagulant) FVIII에 대한 캐리어 및 안정화 단백로서 작용한다. VWF는 내피 세포 및 거핵 세포에서 2813개 아미노산 전구체 분자로서 합성된다. 전구체 폴리펩타이드인 프리-프로-VWF는 22개 잔기의 시그널 서열, 741개 잔기의 프로-펩타이드 및 성숙 혈장 VWF에서 발견되는 2050개 잔기의 폴리펩타이드로 이루어진다 [참조: Fischer et al., FEBS Lett. 351: 345-348, 1994]. VWF는 내피 세포 및 거핵 세포에 의해 혈장으로 분비시, 상이한 분자 크기를 갖는 다양한 종의 형태로 순환한다. 이들 VWF 분자는 2050개 아미노산 잔기의 성숙 서브유니트인 올리고머 및 다량체로 이루어진다. VWF는 종종 혈장에서 하나의 이량체 내지 50 내지 100개 이량체로 이루어진 다량체로 발견될 수 있다 [참조: Ruggeri et al. Thromb. Haemost. 82: 576-584, 1999]. 사람 순환에서 사람 VWF의 생체내 반감기는 약 12 내지 20시간이다.
VWF는 생체내에서 FVIII를 안정화시키는 것으로 알려져 있으며, 따라서 FVIII의 혈장 수준을 조절하는 중요한 역할을 하고, 그 결과 일차 및 이차 지혈을 조절하는 중심적 인자이다. 또한, VWF를 포함하는 약제학적 제제를 VWD 환자에게 정맥내 투여한 후, 24시간에 내인성 FVIII:C의 1 내지 3 유니트/ml로의 증가가 관측될 수 있으며, 이는 FVIII에 대한 VWF의 생체내 안정화 효과를 입증한다.
VWF는 예를 들어 EP05503991에 기술된 바와 같이 사람 혈장으로부터 제조될 수 있다. EP0784632는 재조합 VWF를 분리하는 방법을 기술한다.
약 0.8% 내지 1.3%의 유병율을 갖는 사람에서 가장 빈번하게 유전되는 출혈 장애는 폰 빌레브란트 증후군 또는 폰 빌레브란트 질환(VWD)이며, 이는 혈장 또는 재조합 기원의 VWF를 함유하는 농축물로의 대체 요법에 의해 치료될 수 있다.
4가지의 유전 유형의 VWD가 기술된다 - 유형 1, 유형 2, 유형 3 및 혈소판-유형. 유전형 및 후천형의 VWD가 있다. 대부분의 경우는 유전적이나, 후천형의 VWD도 기술되었다. ISTH(The International Society on Thrombosis and Haemostasis)의 분류는 정량적 및 정성적 결함의 정의에 따른다.
유형 1
VWD
유형 1 VWD(모든 VWD 경우의 60 내지 80%)는 정량적 결함이나, 확실히 손상된 응고는 갖지 않을 수 있다. 대부분의 환자는 일반적으로 거의 정상적인 삶을 산다. 합병증은 수술(치과 절차를 포함) 후 출혈, 두드러진 쉬운 타박상(noticeable easy bruising) 또는 월경과다(heavy period)의 형태로 발생할 수 있다. 감소된 수준의 VWF가 검출된다(정상의 10 내지 45%, 즉 10 내지 45 IU).
유형 2
VWD
유형 2 VWD(10 내지 20%)는 정성적 결함이며, 출혈 경향은 각자 다양할 수 있다. VWF는 정상 수준이나, 다량체가 구조적으로 비정상이거나 크거나 작은 다량체의 서브그룹이 부재한다. 4가지의 주요 서브유형이 존재한다: 2A, 2B, 2M 및 2N.
유형 2A
VWD
이는 VWF 다량체의 합성 또는 단백질 분해의 이상으로 순환에서 다량체 유니트가 적게 존재한다. 인자 VIII 결합은 정상이다. 유형 2A VWD는 폰 빌레브란트 항원과 비교하여 불균형하게 낮은 리스토세틴 보조인자 활성을 야기한다.
유형 2B
VWD
이는 혈소판에의 자발적 결합 및 그 이후의 혈소판 및 거대 VWF 다량체의 신속한 제거를 야기하는 "기능 획득" 결함이다. 약한 저혈소판증이 일어날 수 있다. 순환에서 큰 VWF 다량체가 부재하며, 인자 VIII 결합은 정상이다.
유형 2M
VWD
이는 혈소판 상의 GPIb에 대한 감소된 또는 부재한 결합에 의해 일어난다. 인자 VIII 결합은 정상이다.
유형
2N(
Normandy
)
VWD
이는 VWF의 인자 VIII에 대한 결합 결핍이다. 이러한 유형은 정상적인 VWF 항원 수준 및 정상적인 기능 시험 결과를 제공하나 낮은 수준의 인자 VIII를 갖는다. 이것이 아마도 과거에 일부 2N 환자를 혈우병 A로 오진하도록 하였다.
유형 3
VWD
유형 3(1 내지 3%)은 기능성 VWF가 존재하지 않는 VWD의 가장 심각한 형태이며, 심각한 점막 출혈을 일으킬 수 있으며, 검출가능한 VWF 항원이 없고, 약한 혈우병의 경우처럼 출혈관절증(관절 출혈)이 일어나는 충분히 낮은 인자 VIII 수준을 야기할 수 있다.
혈소판-유형
VWD
혈소판-유형 VWD는 혈소판 상의 VWF 수용체, 구체적으로 당단백질 Ib 수용체(GPIb)의 알파쇄의 기능적 돌연변이 획득에 의해 야기되는 보통염색체 우성형의 VWD이다. 이러한 단백질은 혈소판 상의 완전한 VWF 수용체를 형성하는 보다 큰 컴플렉스(GPIb/V/IX)의 부분이다. 리스토세틴 활성 및 거대 VWF 다량체의 상실은 유형 2B와 유사하나, VWF 유전 시험은 어떠한 돌연변이도 보이지 않을 것이다.
VWF의 정량적 또는 정성적 결함 이외에도, 혈소판 표면상의 특정 수용체의 부재 또는 다른 혈소판 이상이 VWF 의존적 혈소판 응집에 영향을 끼칠 수 있다. VWF 분자는 혈소판 수용체 GPIb 및 GPIIb/IIIa, FVIIIC, 콜라겐, 설파타이드, 헤파린, 및 뱀독 유래된 단백질 보트로세틴에 대한 특정 결합 부위를 갖는다. 혈소판 응집은 혈소판간의 접촉으로부터 생긴다. 이러한 접촉은 피브리노겐 및 VWF에 의해 매개되며, 혈소판 표면상에 수용체가 존재해야 한다. 휴지 상태에서 혈소판은 응고물을 형성하지 않으나, 혈소판 응집이 개시되고 혈소판이 활성화될 때 수용체를 노출시킨다. VWF에 대한 상응하는 수용체의 결여 또는 손상된 활성화는 GPIb 결핍을 갖는 선천적 장애인 베르나르-술리에 증후군에 대해 나타나는 바와 같이 심각한 출혈을 야기시킨다. 혈소판-유형 VWD에서의 GPIb의 "기능 획득" 돌연변이와는 대조적으로, 베르나르-술리에 증후군에서는 VWF 수용체 GPIb의 "기능 손실" 돌연변이가 임상적 표현형을 야기시킨다. 임상적 표현형은 VWD와 필적하지만, VWF의 양 및 활성은 변화되지 않는다.
후천적 폰
빌레브란트
질환
후천적 VWD는 선천적 VWD에 대한 것과 유사한 실험 결과를 갖는 출혈 장애이다. 후천적 VWD는, 선천적 형태와는 달리, 일반적으로 출혈 장애의 개인력 또는 가족력이 없는 개체에서 발생한다. 후천적 VWD는 림프골수증식 장애, 면역학적 장애 및 심혈관 장애, 및 고형 종양 및 다른 여러 가지의 상태와 연관된다. 후천적 VWD는 자가항체를 갖는 환자에서 발생할 수 있다. 이러한 경우, VWF의 기능은 억제되지 않으나, VWF-항체 컴플렉스가 순환으로부터 신속히 제거된다. 후천적 VWD는 아마도 VWD에 대한 특정 시험들이 전형적인 실험 대부분에서 빠지기 때문에 진단되지 않는 후천적 출혈 장애의 많은 경우들에 대한 원인일 것이다. 후천적 VWD의 또 다른 형태는 대동맥판협착증을 갖는 환자들에서 일어나며 위장 출혈(헤이디 증후군: Heyde's syndrome)을 야기한다.
현재, 어떠한 단일 시험도 이상적이지 않기 때문에, 많은 시험들(이중 많은 시험들이 복잡하고 시간 소모적이다)이 VWD의 진단 및 분류에 필요하다. 몇몇 시험은 PTT, FVIII:C 및 출혈 시간의 측정과 같이 일반적인 출혈 위험을 평가하는 일반적인 응집 시험이며, 다른 시험들은 구체적으로 VWF 항원(VWF:Ag)의 측정과 같이 VWF에 관련된다.
응집에서 통상적으로 이용가능한 일반적인 스크리닝 시험, 예를 들어 혈소판계수, 활성화된 부분적 트롬보플라스틴 시간 및 출혈 시간은 VWF와 혈소판 사이의 상호작용을 감소시키는 VWD 또는 혈소판 결함에 의해 야기되는 응집 이상의 검출에 반응이 없다. 출혈 시간은 상당히 다양하며, 혈장 VWF 항원(VWF:Ag) 또는 리스토세틴 보조인자 활성(VWF:RCo)과 완전히 관련되지 않는다. 따라서, 출혈 시간은 VWD에 대해 유용한 스크리닝 시험이 아니다.
보다 정교한 VWF 시험은 VWF 항원(WF:Ag), 리스토세틴 보조인자 활성(VWF:RCo), 콜라겐 결합 검정(VWF:CBA), 리스토세틴 유도된 혈소판 응집 분석(RIPA), VWF:FVIII 결합 검정 및 VWF 다량체 패턴에 대한 특히 시간 소모적인 분석이다. VWF 단백질은 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA) 절차 또는 보다 새로운 자동화된 기술로 정량화된다. 그러나, VWF의 활성, 기능 또는 부착 특성을 반영하지 않는다. 현재, 리스토세틴 보조인자 검정이 혈소판 응집을 이용하여 수행되는 VWF에 대한 유일한 일반적으로 이용되는 기능 검정이다. 그러나, 불량한 재생산성 및 불량한 실험간의 상관관계를 포함한 다수의 제한을 갖는다. 보다 재생가능한 잠재능을 갖는 ELISA 기술에 기초한, VWF:CBA가 대체적 기능 검정으로 개발되었다. VWF:CBA는 고분자량 VWF 다량체의 상실에 대해 특히 민감하다. VWF:FVIII 결합 검정은 FVIII를 결합하는 VWF의 능력을 평가하며, 유형 2N을 진단하는데 이용된다. RIPA 절차는 다양한 농도의 리스토세틴에 대한 민감성을 위해 개체의 혈소판-풍부 혈장을 필요로 한다, 리스토세틴 민감성은 VWF의 수준 및 기능 모두에 의존적이다. VWF:다량체 검정은 상이한 분자량의 VWF를 검출하고 특정 VWF 구조 이상을 확인하는 겔 전기영동을 포함한다. 다량체 분석은 상이한 서브유형으로의 할당을 가능하게 할 것이다. 이러한 분석은, 시험의 복잡성, 시간 및 비용 때문에, 단지 소수의 전문 실험실에 의해서만 수행된다. 또한, 시간 지연 및 샘플 취급 때문에, 샘플을 전문 실험실에 전달할 때, 고분자량 VWF 형태의 손실로 인해 때로는 잘못된 결과가 얻어진다.
또한, VWD 진단 및 혈소판 이상은, 응고방지된 혈액 샘플을 일정한 네가티브 압력에서 작은 구멍을 통해 흡입함으로써 고전단 조건 하에 일차 지혈을 측정하는 자동화된 분석기 PFA100(Siemens Medical Solution Diagnostics) 로 수행될 수 있다. 혈소판 플러그가 구멍에서 형성되며, 혈액 흐름이 정지되는데 필요한 시간(폐쇄 시간)이 측정된다. 혈소판 기능 및 VWF 수준은 폐쇄 시간의 중요한 결정자인 것으로 밝혀졌다 [참조: E.J. Favaloro, Seminars in Thrombosis and hemostasis 32: 456-471, 2006]. PFA100에 기초한 검정에서는, 어떠한 내인적 및 외인적 혈장 응집 케스케이드도 유도되지 않으며, 예를 들어 피브린이 형성되는 혈장 응집이 일어나지 않는다.
US 5,951,951는 항응집제에 의해 응고가 조기에 시작하지 않는 것을 확실히 하는 시험전-재석회화(pre-test-recalcification) 단계를 도입함으로써 혈소판을 포함하는 시트레이트처리된 혈액 샘플에서 활성화된 응고 시간을 측정하는 개선된 방법을 제안한다. 시트레이트처리된 혈액 샘플에 (a) 혈소판 기능 복원제, (b) 항응집제를 동시에 가하고 (c) 샘플의 적어도 일부에 혈소판 활성화제를 가하는 것을 제안하다. 시험전-재석회화 후, 응고제를 가해 응고를 유도한다. 이어서, 응고는 점성 변화의 측정을 포함한 다양한 방식으로 측정될 수 있다. 혈소판 활성화제의 기능은 정상 조건에서 혈액 응고 반응에 효과적으로 참여하여 응고 시간을 단축시키도록 혈소판의 능력을 향상시키는 것이다. 따라서, 건강한 정상 공여자로부터의 샘플에서의 혈소판 활성화제의 첨가는 혈소판 활성화제가 첨가되지 않은 동일한 공여자로부터의 샘플과 비교하여 점성을 증가시키는 반면, 혈소판 결함을 갖는 공여자로부터의 샘플에서 혈소판 활성화제의 첨가는 혈소판 활성화제가 첨가되지 않은 동일한 공여자로부터의 샘플과 비교하여 응고 시간의 감소된 단축, 예를 들어 점성의 감소된 증가를 야기하거나 변화를 전혀 야기하지 못한다. 기술된 시험 방법은 혈소판 결함을 검출하기 위한 방법을 제공하는 것을 목표로 한다.
WO 99/41615는 특정 금속 이온의 존재 하에서 혈액 응고 속도를 측정함으로써 혈액의 응고 활성을 평가하는 방법을 기술한다. 공여자로부터의 샘플을 2개 이상의 샘플로 나누며, 이중 하나 이상에 금속 이온이 첨가된다. 이 발명의 하나의 양태로, 점성 변화가 측정된다. 이러한 양태에서, 혈장 응집은 유도되지 않으나, 오히려 금속 이온이 하나 이상의 샘플에 첨가되고 그 후에 2개의 샘플 사이의 점성에 대한 상대적 변화가 측정된다. 점성의 변화를 측정하기 전에 임의로 혈소판 활성화제가 첨가될 수 있다. 그러나, 이러한 방법은 혈소판 활성화제를 단지 하나의 샘플에만 첨가하고 다른 샘플에는 첨가하지 않으며 이러한 차별적인 처리에 의해 야기되는 점탄성 변화량 차이를 비교하는 것을 교시하지 않는다.
최근에, 혈전탄성그래피 (thrombelastography)의 분석 기술이 임상 실시에 도입되었다. 혈전탄성그래피 (TEG)는 진동 시스템에서 응괴 형성 또는 용해를 기계적으로 조사하는 진단 방법이다. 이때, 용기 (컵)은 측정 로드 (핀) 주변에서 진동 운동을 하거나 (통상의 TEG), 그렇지 않으면 용기는 고정되고 핀이 진동 회전 운동을 한다 (ROTEG 또는 ROTEM). 컵과 핀 사이에서 발생하는 기계적 힘이 기록된다. 혈액 또는 혈장이 응고를 시작하자마자, 초기 측정 시그널의 변화가 일어난다. 양 디자인 모두 본원에서는 TEG로서 칭한다.
TEG는 응고-관련 변수(TEG 변수), 예를 들어 2 mm의 진폭을 갖는 제1의 유의한 응괴 형성때까지의 시간(응고 또는 반응 시간 r), 20 mm의 진폭을 갖는 응괴 두께에 도달할 때까지의 시간(k 값), 응괴가 형성되는 속도(알파 각), 최대 진폭(MA) 또는 임의의 다른 목적하는 시점에서의 응괴의 기계적 특성, MA까지의 시간(TMA), 또는 응괴 강도가 피브린 분해 때문에 다시 특정 값으로 떨어지는 시간을 결정하기 위해 혈액 또는 혈장을 조사하는데 이용된다. 임상적으로, TEG는 특히, 예를 들어 심장 수술, 간 이식, 복부대수술에서 응고병증의 평가를 위한 진단 측정, 및 수술 전후 응고 조절에서 준-현장(quasi-bedside) 시험으로서 이용된다.
TEG는 표준 응고 진단법(트롬보플라스틴 시간, aPTT, 혈소판 계수, AT III, 피브리노겐, D 이량체, 출혈 시간)에 추가하여 이용가능하며, 이는 출혈 경향에 대한 신속한 정보를 위한 값을 측정하기데 있어서는 보다 시간-소모적이다. 이는, 응고병증이 광범위한 외과적 시술 중 또는 다중외상 후 발생하는 경우 심각한 지혈 장애가 신속히 이차적인 조직 손상을 전개시킬 수 있고 종종 보다 시간-소모적인 표준 응고 진단에 기초하는 통상의 지혈 치료에 내성이기 때문에, 특히 중요하다.
상기 방법의 매력적인 요소는 포괄적 측면에 있으며, 결과가 응집 인자 및 억제제, 혈소판, 및 피브린분해 경로에 의해 영향을 받는다 [참조: Luddington, Clin. Lab. Haem. (2005) 27, 81-90]. 이는 보다 더욱 인위적인 응고 스크리닝 시험보다 의미있는 방식으로 샘플 중의 결함이 있는 지혈 및 응고에 기여하는 원리적 메카니즘을확인할 잠재능을 제공한다. TEG 변수는 다수의 인자, 특히 피브리노겐, 인자 XIII, 및 혈액 혈소판 수준 및 피브린분해 시스템의 성분, 예를 들어 플라스민, 프라스민 활성자 및 플라스민 억제자에 의해 영향을 받는다. 예를 들어, 응고 기질로서의 피브리노겐은 응괴 안정성과 관련된다. 이는 트롬브엘라스토그램(thrombelastogram)에서 분명히 나타날 수 있다. 또한, 응고 인자, 예를 들어 FVIII 또는 FIX의 부재가 혈전탄성그래피에 의해 검출될 수 있다.
응괴는 피브린과 활성화된 혈소판의 상호작용에 의해 형성된다. 피브린 스트랜드 및 혈소판 응집체는 형성된 응괴의 기계적 강도 및 샘플의 점탄성을 모두 결정한다. VWF 및 피브린과 연관된 응집된 혈소판은 정상 샘플에서의 점탄성(예를 들어, TEG에서 측정되는 최대 진폭)에 약 80% 기여하며, 피브린은 약 20% 기여한다.
상술된 바와 같이, 혈전탄성그래피는 응고에서의 수개의 결함, 예를 들어 혈우병 A 및 B, 저혈소판증, 혈소판병증, 과다응고, 및 피브린분해 시스템에서의 결함을 분석하는데 일반적으로 이용된다(도 1) [참조: R.J. Luddington, Clin. Lab. Haem. 27: 81-90, 2005]. WO 2006/084648는 피브리노겐 결핍 상태로부터 인자 XIII를 구별하기 위해 TEG를 사용하는 것을 교시한다.
최근, 변형된 회전 트롬브엘리스토그램(ROTEM®, Pentapharm, Munich, Germany)이 종래의 TEG에 대한 수개의 한계를 극복하였다. 동시 측정을 위해 4개의 채널이 이용가능하다. 각각의 시험은 300 μl의 시트레이트처리된 전혈을 필요로 한다. 응집 활성화는 상이한 활성화 경로를 평가할 수 있게 하는 상이한 활성화제에 의해 수행될 수 있다. INTEM, EXTEM, NATEM, 및 FIBTEM이라 불리는 4가지의 표준 ROTEM® 검정을 제작자에 의해 제공되는 프로토콜에 따라 수행할 수 있다. INTEM 및 EXTEM은 내인성 또는 외인성 응고 경로가 유발되는 검정을 나타낸다. NATEM(비-활성화된 TEM: Non-activated TEM)은 재석회화 및 자발적 접촉 활성화 이외의 다른 응고 케스케이드 활성화의 부재 하에서 전혈의 응괴 형성을 평가하는데 이용된다. 마지막으로, FIBTEM 검정은 사이토찰라신 D에 의한 혈소판의 억제 후 응괴 형성에서 피브리노겐의 구체적 역할을 평가하기 위해 이용될 수 있다. INTEM 및 EXTEM을 위해, 300 μL의 시트레이트처리된 혈액이 20 μL의 CaCl2 0.2 M(star-TEM® 시약, Pentapharm GmbH, Munich, Germany)로 재석회화되고, 응집 케스케이드가 각각 토끼 뇌로 제조된 부분적 트롬보플라스틴 인지질 + 엘라그산(in-TEM® 시약, Pentapharm GmbH, Munich, Germany) 및 토끼 뇌로부터 제조된 트롬보플라스틴(ex-TEM® 시약, Pentapharm GmbH, Munich, Germany)에 의해 활성화된다. FIBTEM을 위해, 300 μL의 시트레이트처리된 혈액이 20 μL의 ex-TEM® 시약 + 20 μL의 사이토찰라신 D/DMSO 용액, 0.2 M CaCl2(fib-TEM® 시약, Pentapharm GmbH, Munich, Germany)에 혼합된다.
ROTEM®은 다양한 출혈 장애에서 신속한 진단을 위한 및 과다응고 상태를 갖는 환자에서 응고 상태의 포괄적인 평가를 위한 현장 디바이스(point of care divice)인 것으로 밝혀졌다. 특히, 이 방법은 혈우병, 기타 응고 인자 결핍 및 혈소판 장애와 같은 장애에서 통상적으로 발견되는 과소응고를 설명하는 잠재력을 갖는다. 또한, 다양한 지혈-촉진 성분을 사용한 실험적 생체외 치환에 의해, ROTEM®이 저하된(compromised) 지혈 능력의 보정을 설명하는데 유용한 것으로 밝혀졌다.
그러나, 여태까지 TEG는 VWD 또는 VWF와 혈소판과의 상호작용을 감소시키는 혈소판 결함과 연관된 증가된 출혈 위험의 진단에 대해 사용된 바 없다.
임상 실시에서, 수술 전에 환자의 출혈 위험을 측정해야 한다. 일반적인 응고 시험, 예를 들어 PTT가 증가되어 증가된 출혈 위험을 나타내는 경우, 증가된 PTT에 대한 원인을 측정하기 위해, 종종 다소 시간 소모적인 시험, 예를 들어 VWF의 다량체 분석을 수반하는 수개의 추가 시험이 수행될 필요가 있다.
이들 시험들의 결과가 이용가능하지 않은 경우, 생명-위협적인 징조를 겪지 않는 환자는 예정된 외과적 시술을 받지 않고 종종 수술이 수주까지 연기된다.
따라서, 개개 환자의 출혈 위험 및 VWF의 기능을 확인하고 신속한 결과를 제공하는 시험(이상적으로는 단지 소량의 혈액 샘플을 필요로 하는 전혈 분석에 적합한 현장 진단)에 대한 높은 의학적 필요성이 있다. 본 발명에 의해 해결하고자 하는 문제는 이러한 시험을 제공하는 것이었다.
놀랍게도, 본 발명에 의해 VWD 및 폰 빌레브란트 질환 및 VWF와 혈소판의 상호작용을 감소시키는 후천적 또는 선천적 혈소판 기능 결함과 연관된 출혈 위험의 정성적 및 정량적 결함을 포함한 VWF의 결함을 평가하는데 있어서 점탄성, 바람직하게는 혈전탄성그래피 변화의 측정을 이용하는 것이 밝혀졌다. 본 발명은 혈전탄성그래피에 기초한 전혈의 사용에 적합한 병상 또는 현장 진단을 포함한 신속한 VWD 및 혈소판 기능 결함 검정을 제공한다.
더욱 놀랍게도, 본 시험이 혈소판 저장 푸울 질환(platelet storage pool diseases) 및 이상피브리노겐혈증을 겪는 환자를 결정할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 혈소판 상호작용은 다수 과정을 필요로 하는 것으로 보이며, 상이한 수용체를 통한 상이한 메카니즘이 수반되는 것으로 보인다. 다양한 혈소판 부착 단백질, 예를 들어 피브리노겐 또는 von VWF와 이들의 각각의 표면 수용체 사이의 상호작용은 혈소판 상호작용을 매개하고, 임상적으로 뚜렷한 출혈 경향을 나타낼 수 있다. 이는 또한 혈소판 활성화 동안 혈소판 과립으로부터의 분비된 세포내 단백질에 대해서도 보고된다.
또한, 본 시험은 시험당 105 μl의 소용적의 체액, 바람직하게는 혈액으로 수행될 수 있다는 것이 밝혀졌으며, 이는 특히 소아 환자 및 신생아를 진단하는데 매우 유리하다. 따라서, 본 발명은 또한 시험당 300μl 이하, 바람직하게는 시험당 200μl 이하, 가장 바람직하게는 시험당 105 μl 이하의 혈액 샘플에서 VWD, 혈소판 결함, 혈소판 저장 푸울 질환 및 이상피브리노겐혈증에 의한 소정의 환자의 출혈 위험을 결정하는 시험을 포함한다. 본 발명의 가장 바람직한 양태는 105 μl 보다 적은 혈액 샘플로부터 출혈 위험을 결정하는 것이다.
도면:
도 1:
도 1은 정상의 트롬브엘라스토그램을 응집에 있어 다양한 결함의 트롬브엘라스토그램과 비교한 것이다.
도 2:
도 2는 시트레이트처리된 혈액을 증가량을 리스토세틴(최종 농도 1.05 mg/ml까지)과 항온처리함으로써 최대 진폭이 감소하고 응고 시간이 증가한다는 것을 나타낸다.
도 3:
도 3은 정상 혈액에 대한 혈전탄성그래피 분석이 수행되는 경우, 리스토세틴과의 사전항온처리 후의 최대 진폭이 리스토세틴과의 이러한 사전항온처리 없는 최대 진폭의 단지 약 20%에 도달한다는 것을 나타낸다. VWD 유형 3 환자로부터의 혈액에서는 리스토세틴 사전항온처리로도 거의 100%의 최대 진폭이 도달되며, VWD 유형 1 환자로부터의 혈액에서는 약 75%에 도달한다.
도 4:
도 4는 리스토세틴과의 사전항온처리가 없는 최대 진폭에 대한 리스토세틴과의 사전항온처리를 갖는 최대 진폭의 비율이 건강한 개체와 VWD를 갖는 환자를 구분하는 진단 변수를 제공한다는 것을 나타낸다. 최대 진폭의 감소는 도 3 및 도 2에서 보여지는 바와 같이 리스토세틴 농도의 함수이다.
도 5:
도 5는 모두 VWD 유형 1을 앓는 가족의 구성원들에 대한 최대 진폭의 비율을 나타낸다. 환자들은 관측된 진폭 비율과 상관관계가 있는 임상 증상에서 다양한 변화를 나타낸다.
도 6:
도 6은 VWD 유형 3 환자의 시트레이트처리된 혈액에 대해 시험관내에서 해메이트(Haemate)(0.5 U/ml)를 가한 후 최대 진폭의 비율([(리스토세틴이 첨가된 공여자의 혈액 샘플에서의 최대 진폭)/(리스토세틴이 첨가되지 않은 혈액 샘플에서의 최대 진폭)] *100)을 표준화한 것을 나타낸다.
도 7:
도 7은 3개의 시점(DDAVP의 투여전, 투여 30분 후 및 투여 180분 후)에서 3명의 VWD 유형 1 환자에서 DDAVP의 투여 후, 리스토세틴 보조인자 활성의 증가, VWF:Ag의 증가, 및 최대 진폭의 비율([(리스토세틴이 첨가된 공여자의 혈액 샘플에서의 최대 진폭)/(리스토세틴이 첨가되지 않은 혈액 샘플에서의 최대 진폭)] *100)의 상응하는 감소를 나타낸다.
도 8:
도 8은 VWF 농축물(Haemate® 33 U/kg)로의 대체 전 및 대체 후, VWD 유형 2 환자에서 VWF 농축물의 투여 전 및 투여 후, 최대 진폭의 비율([(리스토세틴이 첨가된 공여자의 혈액 샘플에서의 최대 진폭)/(리스토세틴이 첨가되지 않은 혈액 샘플에서의 최대 진폭)] *100), 리스토세틴 보조인자 활성 및 VWF-Ag를 나타낸다.
도 9:
도 9는 최대 진폭의 비율이 15% 이상([(리스토세틴이 첨가된 공여자의 혈액 샘플에서의 최대 진폭)/(리스토세틴이 첨가되지 않은 혈액 샘플에서의 최대 진폭)] *100 ≥ 15%)인 것으로 결정되었던 샘플을 나타낸다. 환자들은 기준 실험실의 분류에 따라 3개 그룹(그룹 1: VWD를 갖는 환자(1: VWD 유형 1, 2: VWD 유형 2, 3: VWD 유형 3, M: 약한 표현형 VWD 유형 1, 그룹 2: O: 달리 분류된 출혈 장애를 갖는 환자, 그룹 3: VWD가 없는 환자, N: VWD 부재, E: 미정의 VWD))으로 구분하였다.
도 10:
도 10은 최대 진폭의 비율이 15% 미만([(리스토세틴이 첨가된 공여자의 혈액 샘플에서의 최대 진폭)/(리스토세틴이 첨가되지 않은 혈액 샘플에서의 최대 진폭)] *100 < 15%)인 것으로 결정되었던 샘플을 나타낸다. 환자들은 기준 실험실의 분류에 따라 3개 그룹(그룹 1: VWD를 갖는 환자(1: VWD 유형 1, 2: VWD 유형 2, 3: VWD 유형 3, M: 약한 표현형 typ1, 그룹 2: O: 달리 분류된 출혈 장애를 갖는 환자, 그룹 3: VWD가 없는 환자, N: VWD 부재, E: 미정의 VWD))으로 구분하였다.
발명의 요지
본 발명은 폰 빌레브란트 질환, 및 폰 빌레브란트 질환 및 혈소판 기능 장애와 연관된 출혈 위험을 진단하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 전혈에 기초하는 스크리닝 방법으로의 용도에 적합하며, 현장 임상 방법으로서 적합한 추가의 이점을 갖는다. 본 발명의 방법은 혈소판 계수, 활성화된 부분적 트롬보플라스틴 시간, 프로트롬빈 시간 및 출혈 시간과 같은 공지된 진단 방법과 비교하여 출혈 위험의 예측이 뛰어나다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 응고를 유도한 후 혈액 샘플에서의 점탄성 변화를 측정하고 변화량을 비교하는 것에 관한 것이다. 응고를 유도한 후 건강한 사람의 샘플에서의 점탄성 변화의 총량은 일부는 혈장 응고가 유도된 후 형성되는 피브린 그물망으로부터 생기고, 일부는 (트롬빈에 의한 응고 동안 활성화된) 활성화된 혈소판의 응집, VWF 및 피브린 그물망으로부터 생긴다.
본 발명의 요지는, 혈장 응고가 샘플에 있는 혈소판을 얽히게 하는 충분한 트롬빈 및 피브린을 제공하기 전에 혈소판 및 VWF를 포함하는 건강한 공여자로부터의 혈액 샘플을 혈소판 응집 활성화제와 항온처리함으로써 혈소판의 거의 완전한 사전 응집을 하도록 하는 것이다. 그러나, 이러한 사전응집은 VWF와 혈소판 사이의 상호작용이 정상적 (공여자가 증가된 출혈 위험을 갖지 않는다는 것을 의미)이라는 필수 전제 조건을 갖는다.
사전응집된 혈소판은 사전응집되지 않는 혈소판과 유사한 방식으로 점탄성 변화의 총량에 기여하지 않기 때문에, 혈소판이 사전응집된 샘플에서 응고가 유도되고 피브린 그물망이 생성되는 경우, 혈소판 응집 활성화제와 항온처리되지 않은 샘플에서의 점탄성 변화량과 비교하여 단지 감소된 양의 점탄성 변화를 보인다. 이어서, 혈소판 응집 활성화제와 항온처리된 샘플에서의 이러한 낮은 수준의 점탄성 변화량은, 참조값 또는 혈소판 응집 활성화제와 항온처리되지 않은 동일한 공여자로부터의 유사한 샘플에서의 점탄성 변화량과 비교될 것이다. 2개의 점탄성 변화 양 사이의 큰 차이는 공여자가 증가된 출혈 위험을 갖지 않는다는 진단으로 해석된다.
이와는 반대로, VWF와 혈소판 사이의 저하된 상호작용에 의해 증가된 출혈 위험을 갖는 공여자로부터의 샘플에서는, 혈소판 및 VWF의 사전응집이 건강한 공여자로부터의 샘플과 비교하여 저하되고 낮은 정도로 일어나거나 전혀 일어나지 않는다. (사전응집이 일어나지 않거나 낮은 정도로 일어나기 때문에) 응고가 개시되는 경우, 혈소판이 여전히 점탄성 변화의 총량에 기여할 수 있다. 따라서, 증가된 출혈 위험을 갖는 공여자로부터의 샘플에서, 혈소판 응집 활성화제와 함께 항온처리된 샘플에서 응고가 유도된 후 큰 점탄성 변화량이 측정된다. 이어서, 혈소판 응집 활성화제와 함께 항온처리된 샘플에서 이러한 정상적인 큰 점탄성 변화량은 참조값 또는 혈소판 응집 활성화제와 함께 항온처리되지 않은 동일한 공여자로부터의 유사한 샘플에서의 점탄성 변화량과 비교될 것이다. 2개의 점탄성 변화 양 사이의 적은 차이는 공여자가 증가된 출혈 위험을 갖는다는 진단으로 해석된다.
참조값은, 비제한적 예로서, 증가된 출혈 위험을 갖지 않는 건강한 공여자에서 i) 혈소판 응집 활성화제와 함께 인큐베이이션하거나 (=REFH+) ii) 혈소판 응집 활성화제와 함께 항온처리하지 않고 (=REFH-) 응고를 유도한 후 점탄성 변화량을 측정함으로써 결정될 수 있다.
또한, 참조값은, 예를 들어 증가된 출혈 위험을 갖는 공여자로부터의 공여 샘플을 사용하여 결정될 수 있다.
참조값이 어떻게 결정되었는가에 따라, 증가된 출혈 위험을 갖지 않는 공여자로부터 생성된 참조 샘플 (REFH+ 또는 REFH-)에 대해 표 1에 나타난 바와 같이 해석이 상이할 것이다.
표 1
본 발명의 방법에 따른 공여자의 출혈 위험에 의존적인 점탄성 변화에 대한 혈소판 응집 활성화제의 첨가 효과
따라서, 본 발명의 하나의 양태는,
a) 혈소판 및 지혈 인자를 포함하는 체액을 포함하는 사람 개체 또는 동물로부터의 샘플, 예를 들어 전혈 또는 항응고처리된 혈액 또는 혈소판 또는 혈소판-풍부 혈장을 수득하는 단계,
b) 상기 샘플의 적어도 일부를 혈소판 응집 활성화제와 함께 항온처리하는 단계,
c) 단계 (b) 후, 이와 동시에 또는 이전에 수행할 수 있는 단계로서, 혈소판 응집 활성화제와 항온처리된 상기 샘플 일부에서 응고를 유도하는 단계,
d) 혈소판 응집 활성화제와 항온처리된 상기 샘플 일부에서 응고를 유도한 후 발생하는 점탄성 변화를 측정하는 단계,
e) 단계 (d)에서 결정되는 점탄성 변화량을 참조값과 비교하는 단계를 포함하고,
여기서, 단계 (d)에서 결정된 점탄성 변화량은, 동일한 방법을 혈소판 응집 활성화제가 첨가되지 않은 동일한 공여자로부터 단계 (a)에서와 동일한 방식으로 수득된 또 다른 샘플에 적용하는 경우 측정된 점탄성 변화량과 비교하였을 때 이보다 낮은,
환자에서의 출혈 위험을 결정하기 위한 시험관내 진단 방법에 관한 것이다.
따라서, VWF 유형 1 환자로부터의 샘플에서 단계 (d)에서 결정되는 점탄성 변화량은, 동일한 방법을 동일한 VWF 유형 1 환자로부터 단계 (a)에서와 동일한 방식으로 수득되나 혈소판 응집 활성화제는 첨가되지 않은 또 다른 샘플에 적용하는 경우 측정된 점탄성 변화량과 비교하였을 때, 이보다 낮다.
상기 방법의 단계 (e)에서 사용되는 참조값은, 비제한적 예로서,
a) 상기 방법의 단계 (a)에서 수득된 최초 공여 샘플을 2개 이상의 샘플로 나누거나 상기 방법의 단계 (a)에서 공여자로부터 2개 이상의 샘플을 수득함으로써 수득하거나(이때, 하나 이상의 샘플에서 단지 상기 방법의 단계 (a) 및 단계 (c) 내지 (e)를 수행하고 상기 방법의 단계 (b)는 생략하며, 상기 방법의 단계 (b)가 생략된 상기 샘플에서 측정된 점탄성 변화량은 참조 값이다),
b) 상기 방법의 단계 (a) 및 단계 (c) 내지 (e)를 포함하는 방법을 한 명의 건강한 공여자로부터의 하나의 샘플 또는 증가된 출혈 위험이 없는 건강한 공여자들로부터의 수개의 샘플에 적용시킴으로써 수득하거나(이때 상기 방법의 단계 (b)가 상기 생략된 샘플 또는 샘플들에서 측정된 점탄성 변화량은 참조 값이며, 바람직하게는 건강한 공여자로부터 수득되는 수개의 샘플에서의 점탄성 변화량의 평균값이 참조값이다),
c) 상기 방법의 단계 (a) 내지 (e)를 포함하는 방법을 한 명의 건강한 공여자로부터의 하나의 샘플 또는 증가된 출혈 위험이 없는 건강한 공여자들로부터의 수개의 샘플에 적용시킴으로써 수득할 수 있다(이때 샘플 또는 샘플들에서 측정된 점탄성 변화량은 참조 값이며, 바람직하게는 건강한 공여자로부터 수득되는 수개의 샘플에서의 점탄성 변화량의 평균값이 참조값이다).
i) 혈소판 응집 활성화제와 함께 항온처리된 샘플에서 측정된 점탄성 변화량과 ii) 혈소판 응집 활성화제와 함께 항온처리되지 않은 참조 샘플의 점탄성 변화량 사이의 큰 차이는, 샘플 공여자가 증가된 출혈 위험을 갖지 않는다는 진단을 제공하며;
반면, i) 혈소판 응집 활성화제와 함께 항온처리된 샘플에서 측정된 점탄성 변화량과 ii) 혈소판 응집 활성화제와 함께 항온처리되지 않은 참조 샘플의 점탄성 변화량 사이의 감소된 차이는, 공여자가 증가된 출혈 위험을 갖는다는 진단을 제공한다.
i) 혈소판 응집 활성화제와 함께 항온처리된 샘플에서 측정된 점탄성 변화량과 ii) 혈소판 응집 활성화제와 함께 항온처리된 참조 샘플의 점탄성 변화량 사이의 적은 차이는, 샘플 공여자가 증가된 출혈 위험을 갖지 않는다는 진단을 제공하며;
반면, i) 혈소판 응집 활성화제와 함께 항온처리된 샘플에서 측정된 점탄성 변화량과 ii) 혈소판 응집 활성화제와 함께 항온처리된 참조 샘플의 점탄성 변화량 사이의 큰 차이는, 공여자가 증가된 출혈 위험을 갖는다는 진단을 제공한다.
바람직하게는, 상기 방법의 단계 (b)는 상기 방법의 단계 (c) 전에 수행된다.
임의로, 응집 활성화제는 본 발명의 방법을 수행할 때 첨가될 수 있다. 바람하게는, 응집 활성화제는 단계 (b)에서 혈소판 활성화제의 첨가 전 또는 후이지만, 응고를 유도하기 전에 첨가된다.
본 발명의 방법은, US 5,951,951에 기술된 방법과는 달리, 항응고제의 첨가를 필요로 하지 않는다. 따라서, 본 발명의 바람직한 양태에서, 어떠한 항응고제도 샘플에 첨가되지 않는다.
최초 체액은 희석될 수 있으며, 혈소판 및 지혈 인자를 포함하는 한 이의 조성은 변화될 수 있다.
바람직하게는, 혈소판 응집 활성화제와 함께 항온처리된 샘플의 점탄성 변화량과 상술된 바와 같은 참조값 사이의 비율은 상기 방법의 단계 e)에서 결정된다.
점탄성 변화를 평가하는 바람직한 방법은 TEG이다. TEG에 의해 결정될 수 있고 점탄성 변화를 평가하는 다수의 변수들, 예를 들어 최대 진폭(MA), 곡선 아래 면적, 응괴가 형성되는 비율(알파 각), 정의된 시점에서의 진폭, 유도 변수가 본 발명의 방법을 수행하기 위해 이용될 수 있다. 최초 샘플의 양쪽 부분에서 본 발명의 방법의 단계 (e)의 최대 진폭 및 면적을 측정하는 것이 바람직하며, 단계 (f)에서 샘플의 양쪽 부분의 최대 진폭의 비율 또는 곡선 아래 면적을 측정하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 의미에서 "점탄성 변화"는 응고 과정 및 응괴의 형성 동안 샘플의 점성 및 전단-탄성의 변화이다.
본 발명의 의미에서 "점탄성 변화량"은 응고를 유도하기 전 및 응고가 유도된 후의 특정 시점에서 샘플의 점도 차이이다. 점탄성 변화량을 측정하는 바람직한 시점은 다양하며 또한 실제로 측정하는 변수에 좌우된다.
본 발명의 의미에서 "혈소판 응집 활성화제"는 VWF를 혈소판 상의 VWF-수용체에 결합시킴으로써 혈소판 및 VWF를 포함하는 인체로부터 유도되는 액체에서 VWF 의존적 혈소판 활성화 및 응집(aggregation 및 agglutination)을 유도할 수 있는 임의의 물질의 조성물 또는 임의의 화합물이다. 바람직한 혈소판 응집 활성화제는 리스토세틴 및 보트로세틴이다. 가장 바람직한 혈소판 응집 활성화제는 리스토세틴이다.
본 발명의 의미에서 혈소판 응집 활성화제와 함께 "항온처리"는 혈소판 응집 활성화제를 혈소판 및 VWF를 포함하는 샘플에 적어도 0.1분, 바람직하게는 적어도 1분, 가장 바람직하게는 적어도 5분 동안 가하는 것이다.
본 발명의 의미에서 "지혈 인자"는 일단 응고가 활성화된 후 피브리노겐으로부터 피브린을 생성하는 내인성 및 외인성 응고 케스케이드, 트롬빈, 피브리노겐의 성분들을 포함하는 응고 인자의 그룹이다.
본 발명의 의미에서 "응고 유도"는, 재석회화, 첨가된 항응고제에 대한 길항제 또는 피브리노겐으로부터 피브린의 형성을 야기하는 다른 물질의 첨가를 포함한, 사용되는 샘플 및 항응고제의 유형에 따른 응고 시스템의 유발 또는 활성화를 의미한다. 모든 비처리된 혈액에서 응고는 표면, 예를 들어 혈액이 항온처리되는 큐벳의 표면과 접촉됨으로써 이미 유도될 수 있다. 시트레이트처리된 혈액 또는 혈소판-풍부 혈장이 사용되는 경우, 응고는 칼슘을 첨가함으로써 유도될 수 있다. 헤파린처리된 혈액 또는 혈소판-풍부 혈장의 경우, 응고는 헤파리나제의 첨가에 의해 유도될 수 있다.
바람직하게는, 혈소판 응집 활성화제는 응집을 유도하기 전에 첨가된다. 그러나, 본 발명을 또한 동시적인 응고 유도 및 혈소판 응집 활성화제 첨가에 의해 실시될 수 있다. 덜 바람직하지만, 본 발명의 실시가능한 양태는 응고를 유도한 후 혈소판 응집 활성화제를 첨가하는 것을 포함한다.
본 발명의 의미에서 "응고 활성화제"는 하나 이상의 응고 인자를 활성화시키나 혈소판 및 지혈 인자를 포함하는 체액을 포함하는 각각의 유체에서 그 자신이 피브린의 형성을 야기하지 않는 물질이다. 응고를 실제로 유도하기 전에 이러한 활성화제와의 사전항온처리는 상당한 이점, 예를 들어 단지 표면 접촉 활성화와 대비해서 조절된 활성화에 의한 반응 시간의 단축 및 개선된 정확성을 제공한다. 바람직한 응고 활성화제는 카올린이다. 또한, 이는 추가의 차별적인 진단 정보에 대한 가능성을 제공한다.
바람직하게는, 응고 활성화제는 응고 유도 전에 첨가된다.
기능성 VWF가 샘플 중에 존재하고 혈소판 기능이 정상인 경우, 응고 과정의 유도 전, 동안 또는 후에 혈소판 응집 활성화제의 첨가는 혈소판 응집 및 혈소판 활성화를 야기한다. 이러한 사전-응집된 혈소판은 일단 응고가 유도된 후 응괴 형성 시 피브리노겐으로부터 형성되는 피브린과는 상이한 상호작용을 나타낸다. 이는, 혈소판 응집 활성화제가 첨가되지 않은 샘플과 비교하여, 샘플의 점탄성에 있어 많이 감소된 변화를 야기한다. 건강한 개체로부터의 이러한 샘플에서, 혈소판 응집 활성화제의 첨가 없이는 TEG에서 예를 들어 큰 MA를 측정하지만, 혈소판 응집 활성화제가 첨가된 경우에는 작은 MA를 측정한다.
이와는 대조적으로, 정량적 또는 정성적 결함을 갖는 VWF가 샘플 중에 존재하는 경우에는, 일단 혈소판 응집 활성화제가 첨가된 후, 적은 혈소판 응집이 일어나거나 혈소판 응집이 일어나지 않는다. 따라서, 응고가 유도되는 경우, 아직 응집되지 않아 응고 과정 동안 형성되는 피브린과 여전히 상호작용할 수 있는 보다 많은 또는 모든 혈소판이 여전히 이용가능하다. 따라서, VWF의 정성적 또는 정량적 결함은, 혈소판 응집 활성화제가 첨가되는 경우, TEG에서 예를 들어 큰 MA에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 상이한 유형의 VWD를 구분할 수 있다. 예를 들어, 도 3에 나타나는 바와 같이, 정상 혈액에 대한 혈전탄성그래피 분석이 수행되는 경우, 리스토세틴과의 사전항온처리 후의 최대 진폭은 리스토세틴과의 사전항온처리가 없을 때 얻어지는 최대 진폭의 약 20%에 달한다. VWD 유형 3 환자로부터의 혈액에서는, 거의 100%의 최대 진폭이 심지어 리스토세틴 사전항온처리로도 성취되며, VWD 유형 1 환자로부터의 혈액에서는 최대 진폭이 약 75%로 감소된다.
혈소판 응집 활성화제의 첨가 및 활성화제-VWF 컴플렉스의 혈소판에의 후속 결합은 혈소판의 응집 및 또한 이들의 활성화를 야기한다. 이러한 활성화는 VWF 컴플렉스의 상응하는 혈소판 수용체에의 결합에 의존적이다. 따라서, 혈소판 응집 활성화제에 대한 반응은 또한 상응하는 혈소판 수용체 또는 손상된 혈소판 기능의 결여에 의해 영향을 받는다. 따라서, 샘플을 혈소판 응집 활성화제로 처리한 후 TEG에서 예를 들어 큰 MA는 또한, 예를 들어 베르나르 술리에 증후군의 경우에서와 같이, 손상된 VWF 의존적 혈소판 응집을 야기하는 혈소판 결함에 의해 야기될 수 있다.
TEG에서 큰 MA와 같은 점탄성의 큰 변화가 본 발명의 방법을 실시함으로써 결정되는 경우, VWF 또는 손상된 VWF 의존적 혈소판 응집에 대한 정성적 또는 정량적 결함의 진단은 a) 점탄성의 큰 변화를 건강한 개체의 샘플에서의 점탄성의 미리 결정된 변화에 기초하는 참조 값과 비교하거나, b) 혈소판 응집 활성화제와 항온처리되지 않았으나 응고가 유도된 최초 샘플의 참조 부분과 비교하는 것에 기초할 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법은 VWF의 부재 또는 기능 손상 및 VWF 인자 관련된 혈소판 기능이상을 평가하는 신속한 방법을 제공하며, 또한 VWD 및 VWF와 혈소판의 상호작용을 감소시키는 혈소판 기능 장애를 진단하는 신속한 방법을 제공한다. 보다 놀랍게도, 본 시험이 혈소판 저장 푸울 질환 및 이상피브리노겐혈증을 앓는 환자를 결정할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 본 발명의 방법은 기타의 시간 소모적인 진단 방법을 회피하는 병상 진단 시험에 적합하다. 본 발명의 방법의 또 다른 이점은 시간 소모적인 원심분리 단계를 제거한다는 것이다. 본 시험은 105 μl과 같은 적은 혈액 용적으로 수행할 수 있으며, 이는 특히 소아 및 신생아를 진단하는데 매우 유리하다.
이러한 시험은 VWF 손상 또는 혈소판 기능 장애, 예를 들어 베르나르 술리에 증후군에 의한 출혈 위험이 결정될 필요가 있을 때, 예를 들어 수술 세팅 전 및 전후에 결과가 신속히 필요할 때에 특히 유리하다. 수개의 장애 및 동반질병 및 수개의 약물이 혈소판 기능을 손상시키는 것으로 공지되어 있다.
트롬브엘라스토그램에서 예시되는 바와 같은 점탄성 변화가 소정의 공여자에서 응고 및 피브린분해 시스템의 포괄적인 상태를 반영하므로, 또한 예를 들어 혈우병 A 또는 혈우병 B에서 특정 응고 인자의 선천적 결핍, 외상 또는 외과적 출혈에서 피브리노겐과 같은 응고 인자의 고갈 또는 약리학적 중재, 예를 들어 코우마린 처리가 당업자가 해석할 수 있는 점탄성 또는 트롬브엘라스토그램 [참조: Luddington, Clin. Lab. Haem. (2005) 27, 81-90]의 변화에 대한 특정한 특징적인 패턴에 반영될 것이다. 따라서, 본 발명의 방법의 이용은 VWF와 혈소판의 상호작용을 감소시키는 결핍된 VWF 또는 혈소판 수용체에 의한 증가된 출혈 위험의 진단을 가능하게 할 뿐만 아니라 응고 또는 피브린분해 시스템의 다른 이상에 대한 동시적 진단을 가능하게 한다.
따라서, 본 발명에 따른 방법의 수행은 또한 고섬유소용해, 혈액 손실에 의한 다인자 응고병증, 항응고제의 사용에 의한 출혈, 외상 관련된 저응고 상태, 임신 관련된 고응고 상태, 파종 혈관내 응고, 저혈소판증, FVIII, FIX, FXIII 및 피브리노겐과 같은 기능적 응고 인자의 결여를 야기하는 선천적 출혈 장애, 혈소판 저장 푸울 질환 및 이상피브리노겐혈증의 진단을 가능하게 한다.
점탄성 변화를 결정함으로써 폰 빌레브란트 질환, 및 폰 빌레브란트 질환 및 후천적 또는 선천적 혈소판 기능 결함과 연관된 출혈 위험을 평가하기에 적합한 시약 및 키트의 사용도 또한 본 발명의 부분이다.
가장 놀랍게도, 통상의 VWF 진단으로는 상이한 환자 사이의 차등 출혈 위험을 진단할 수 없는 경우에서조차, 본 발명의 방법은, 실시예 4(a)에 나타난 바와 같이, 공지된 방법보다 예측적인 방식으로 소정의 환자의 출혈 성향을 예측한다는 것이 밝혀졌다. 실시예 4(b)에 나타난 바와 같이, VWD를 갖는 것으로 잘못 진단된 개체(아마도 일반적 현상인 저장 및 수송 동안의 VWD 다량체의 손실에 기인)가 본 발명의 시험관내 진단 방법으로 건강하고 증가된 출혈 위험을 갖지 않는 것으로 정확히 진단되었다. 따라서, 본 발명의 방법은 적어도 일부의 경우 통상의 VWD 진단 방법보다 신뢰성이 있고 확실하다.
또한, 본 발명의 방법은 VWD 또는 혈우병 A 환자에 DDAVP의 투여 또는 VWD 또는 혈우병 A 환자에 VWF 농축물의 투여와 같은 상이한 치료 요법의 실패에 대해 성공을 모니터링하는데 이용될 수 있다는 것이 밝혀질 수 있었다(실시예 5).
아마도 본 발명의 방법의 가장 흥미를 돋우는 특징 중의 하나는, 본 발명의 방법이 VWD 및/또는 VWF의 혈소판에 대한 결합에 영향을 끼치는 혈소판 결함을 진단하는 민감하고 특이적인 시험 방법을 제공할 뿐만 아니라 증가된 출혈 위험(이러한 위험은 때때로 분명하지 않은 발병기준을 갖는 추가의 원인 때문이다)을 갖는 환자를 확인한다는 것이다.
이는 본 발명의 방법이 응고 시스템의 혈장 및 세포 성분들이 존재하고 인위적으로 분리(많은 다른 응고 시험 시스템에서의 사례)되지 않은 전체 혈액에서 개체의 출혈 위험을 결정하기 때문일 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법은 소정의 개체에서 출혈 위험을 믿을 수 있게 예측하는 신속한 방법이며, 또한 이러한 출혈 위험에 대한 가능한 원인들을 축소시킨다.
본 발명의 방법은 우선적으로는 실시예에 기술된 바와 같이 수행된다.
환자로부터의 혈소판 및 지혈 인자를 포함하는 유체, 예를 들어 전혈 또는 항응고처리된 혈액(예를 들어, 시트레이트처리된 혈액 또는 시트레이트처리된 혈소판 풍부 혈장 또는 헤파린처리된 혈소판 풍부 혈장)은 임의로 응고 활성화제로서 작용하는 표준화된 작용제, 예를 들어 카올린, 또는 조직 인자는 포함하는 바이알에 옮겨지지만, 제시간에 실제로 응고를 유도하지는 않는다.
바람직하게는, 성분들은 거꾸로 하여 혼합되고, 임의로 2개 이상의 분취물로 나뉜다. 소정량의 혈소판 응집 활성화제가 하나의 분취물에 가해진다. 리스토세틴이 사용되는 경우, 최종 농도는 바람직하게는 0.01 내지 100 mg/ml, 보다 바람직하게는 0.1 내지 3 mg/ml 또는 보다 더욱 바람직하게는 0.3 mg/ml 내지 1.5 mg/ml이다.
분취물은 바람직하게는 10 내지 37 ℃에서 0 내지 360분, 보다 바람직하게는 약 실온에서 5분, 또는 37 ℃에서 10분 동안, 바람직하게는 혼합하면서 항온처리된다.
이어서, 양쪽 분취물은 점탄성 변화의 측정을 가능하게 하는 용기, 예를 들어 TEG 검정 컵에 옮겨진다.
이어서, 바람직하게는, 응고가 유도되며, 응고는 혈소판 응집 활성화제의 첨가와 동시에 또는 덜 바람직하지만 첨가 전에 유도될 수 있다.
점탄성 변화는 TEG가 점탄성 변화를 결정하는데 이용되는 경우 양쪽 분취물에서 측정되며, 검정은 최대 진폭에 도달될 때까지 우선적으로 수행된다.
리스토세틴과 같은 혈소판 응집 활성화제의 첨가가 없는 임의 샘플이 대조 측정물로서 사용된다.
TEG가 점탄성 변화를 결정하기 위한 검정인 경우, 혈소판 응집 활성화제, 예를 들어 리스토세틴에 반응한 혈소판 활성화는, 비제한적 예로서, 첨가된 혈소판 활성화제가 없는 대조군(MA) 및 혈소판 활성화제 리스토세틴이 첨가된 샘플(MA리스토세틴)에서의 최대 진폭으로부터 결정될 수 있다; 이는 비율(MA리스토세틴/MA)*100로서 표현될 수 있다. 변화율(%)은 개별 피험자의 반응을 평가하기 위해 측정되므로, 특정 용량의 리스토세틴에 대한 상대적 반응 표시를 제공한다.
0.75 mg/ml의 리스토세틴 농도에서, 15%의 비율이 증가된 출혈 위험을 갖는 환자를 결정하는 바람직한 컷-오프이다 비율(MA리스토세틴/MA)*100이 15% 이상인 경우, 환자는 증가된 출혈 위험을 갖고 VWD 또는 다른 출혈 특이체질을 겪으며, 생명-위협적인 상태가 즉각적인 수술을 요구하지 않는다면 추가의 진단 전에는 수술을 받지 말아야 한다. 비율(MA리스토세틴/MA)*100이 15% 미만인 경우, 증가된 출혈 위험이 없으며, 환자는 수술을 받을 수 있다.
15%의 비율은 비제한적인 것으로서 단지 예시를 위한 것임을 알아야 한다. 점탄성 변화를 결정하는 기술에 따라, 측정되는 개별 변수에 따라, 당업자는 예를 들어 VWD 환자 및 건강한 환자로부터의 샘플에 기초하는 비율을 측정하여 건강한 상태로부터 병리학적 상태를 구분할 수 있다.
본 발명의 목적은, 0.85 이상, 0.80 이상, 0.75 이상, 0.70 이상, 0.65 이상, 0.60 이상, 0.55 이상, 0.50 이상, 0.45 이상, 0.40 이상, 0.35 이상, 0.30 이상, 0.25 이상, 0.20 이상, 0.15 이상, 0.10 이상, 또는 0.05 이상의 (혈소판 응집 활성화제가 첨가된 공여자로부터의 체액 샘플에서의 점탄성 변화)/(혈소판 응집 활성화제가 첨가되지 않은 동일한 체액 샘플에서의 점탄성 변화)의 값이 출혈 위험의 지시자로서 판단되는 시험관내 진단 방법이다. 출혈 위험은 VWD 때문일 수 있으나 상기 개요된 것뿐만 아니라 다른 원인들을 가질 수 있다.
VWD가 없는 환자는 실시예 2에서 기술되는 바와 같이 리스토세틴과의 항온처리 후 최대 진폭에 있어 상당한 감소를 나타낸다. 거의 모든 혈소판이 비활성화되며 후속적인 응고 유도후 응괴 강도에 대한 혈소판 기여가 검출되지 않는다. 이와는 대조적으로, VWD를 갖는 환자에 대한 응괴 강도는 리스토세틴 항온처리에 의해 변화되지 않거나 단지 약간 변화된다.
TEG 이외에 또한 점탄성 변화에 대한 다른 검정이 이용될 수 있다. 예를 들어, 혈소판 인자 분석기 PFA100(Siemens Medical Solutions)이 또한 하기 각각의 적합한 프로토콜에 따라 유사한 방식으로 사용될 수 있다. 또한, 점탄성 응괴 검출에 적합한 다른 유동학 기구, 예를 들어 소노클롯(Sonoclot) 분석기(Sienco) 또는 ReoRox 또는 비스코(Visco) 분석기(MediRoxAB)가 사용될 수 있다.
요약하면, 본 발명의 시험관내 진단 방법은 스크리닝 시험으로서 특히 적합하다. 이러한 초기의 스크리닝 시험에서의 양성 결과 이후, 대부분의 경우 VWF 다량체 측정 또는 혈소판 기능 시험 등과 같은 추가의 구체적인 실험실 시험이 뒤따를 것이다.
실시예
실시예
1:
건강한 환자로부터의 시트레이트-안정화된 혈액을 표준화된 카올린 시약을 포함하는 바이알에 옮기고 거꾸로 하여 혼합하였다. 카올린 시약은 헤모스코프 코포레이션(Haemoscope Corporation)에서 구입하였다. 혼합물을 잘 혼합하고, 2개의 500 μL 분취물로 나누었다. 15 mg mL-1 농도의 리스토세틴의 상이한 양을 일부(one part)의 활성화된 혈액 분취물에 가하고, 양쪽 샘플을 10분 동안 혼합기에서 항온처리하였다. 300 μL 의 양쪽 분취물을 TEG 검정 컵에 채우고, 20 μL의 0.2 M CaCl2를 가하였다. 적어도 최대 진폭에 도달될 때까지 로템(Rotem) 분석기를 사용하여 TEG 트레이싱(tracing)을 수행하였다. 도 2는 수득된 4개의 구별되는 TEG 패턴을 나타낸다. 최종 리스토세틴 농도에 따라, 최대 진폭의 감소 및 응고 시간의 증가가 관측되었다.
실시예
2:
분석기 및 시약은 헤모스코프 코포레이션으로부터의 것이다. 1.3 mL의 혈액을 3.18% 삼나트륨 시트레이트(1:9의 항응고제 대 혈액)에 수집하였다. 1 mL의 시트레이트-안정화된 혈액을 표준화된 카올린 시약을 포함하는 바이알에 옮기고, 거꾸로 하여 혼합하였다. 혼합물을 잘 혼합하고, 2개의 500 μL 분취물로 나누었다. 15 mg mL-1 농도의 25 μL 리스토세틴을 일부의 활성화된 혈액 분취물에 가하고, 양쪽 샘플을 10분 동안 혼합기에서 항온처리하였다. 360 μL 의 양쪽 분취물을 TEG 검정 컵에 채우고, 20 μL의 0.2 M CaCl2를 가하였다. 적어도 최대 진폭에 도달될 때까지 TEG 트레이싱을 수행하였다. 도 3은 수득된 3개의 구별되는 TEG 패턴을 나타낸다. 도 1a는 정상의 건강한 사람에 대한 TEG 프로필을 나타내고, 도 1b 및 1c는 VWD 유형 3 및 유형 1을 갖는 환자의 TEG 프로필을 나타낸다.
실시예
3:
실시예 2의 절차에 따라, 건강한 환자 및 VWD를 갖는 환자로부터의 혈액 샘플을 시험하였다. 모든 VWD 샘플은 표준 기준을 사용하여 VWD를 갖는 것으로 진단된 환자로부터 유도되었다. VWD 혈장 이외에, 다수의 정상 샘플도 수집되었으며, 비교 조사에 사용되었다. 리스토세틴에 반응한 혈소판 활성화는 대조군(MA) 및 리스토세틴 활성화된 트레이스(MA리스토세틴)에서 최대 진폭으로부터 결정된다: MA리스토세틴/MA*100. 각각의 피험자의 반응을 평가하기 위해 변화율 (%)을 계산하였으며, 특정 용량의 리스토세틴(0.71 mg/ml 및 1.05 mg/ml 최종 농도)에 대한 상대적 반응의 표시를 제공한다. 리스토세틴의 첨가 없이 카올린 유도된 샘플이 대조군 측정으로 작용한다. VWD가 없는 환자는 실시예 2에서 기술되는 바와 같이 리스토세틴과의 항온처리 후 상당히 감소된 최대 진폭을 나타낸다. 거의 모든 혈소판이 비활성화되며, 응괴 강도에 대한 더 이상의 혈소판 기여가 검출되지 않는다. 이와는 대조적으로, VWD를 갖는 환자에 대해서는 응괴 강도가 리스토세틴 항온처리에 의해 변화되지 않거나 단지 약간 변화된다.
실시예
4:
a) VWD의 진단은 문제가 있으며, 이는 특히 유형 1 VWD에 대해서 그렇다. 이러한 피험자 중 많은 피험자가 출혈 증상을 나타내지 않아 인식되지 않는다. 가족 구성원들에 대한 조사는 질환에 대한 다양한 발현(penetrance) 및 표현(expressivity)이 있음을 제시한다. 병에 걸린 가족 구성원들 사이의 출혈 증상 및 실험실 결과 모두에 대한 다양성은 VWD 돌연변이에 대한 다양한 발현 및 표현을 나타낸다 [참조: Miller CH, Graham JB, Goldin LR, Elston RC. Genetics of classic von Wilebrand's disease. I. Phenotypic variation within families. Blood 1979: 54: 117-36].
본 발명자들는 VWD 유형 1에 걸린 가족의 4명의 구성원들을 조사하였다. 상세한 출혈 및 가족력은 개인 면담에 의해 각각의 피험자로부터 얻었다. 환자들은 임상 표현과 서로 관련이 있는 상이한 혈전탄성그래피(TEG) 패턴을 나타낸다. 최고의 비율을 갖는 환자 H는 불규칙과다월경, 발치후 출혈 및 피부 출혈 증상을 나타낸다. 이와는 대조적으로 3명의 다른 환자들에 대해서는 두드러진 출혈 표현이 보고되지 않았다.
따라서, 본 발명의 진단 방법은 종래의 진단 검정보다 가족 구성원 H의 출혈 위험을 예측하는데 있어 뛰어났다. 어떠한 상관관계도 응고 스크리닝 시험, 프로트로빈 시간 및 활성화된 트롬보플라스틴 시간에 대해 밝혀진 바 없었다.
b) 모든 사전분석적 변수들이 VWD의 확인에 대해 실질적인 문제를 일으킨다. 또한, VWF, 특히 고분자량 VWF는 수집 및 수송 인공물에 대해 매우 민감하다. 나트륨 시트레이트 혈장의 저온 수송 및/또는 저장이 샘플의 서브세트에 있는 HMV VWF의 손실을 초래할 것이다. 이들의 경우, 실험실 시험 결과가 반복 확인 없이 수용되는 경우 VWD에 대한 착오 또는 잘못된 결론이 나올 수 있다.
놀랍게도, 시험된 103개의 샘플에서, 본 발명의 진단 방법은, 다량체 측정에 기초한 통상의 진단이 VWD를 갖는 환자인 것으로 잘못 분류한 2개의 경우에서 정확히 VWD의 부재를 검출하였다는 것을 본 발명자들이 밝혀내었다. 양 환자는 다량체 패턴에 기초한 종래의 진단에 따라 유형 2A로 분류되었으나, 본 발명의 시험관내 진단 방법은 TEG 비율이 정상 범위에 있기 때문에 출혈 위험/VWD에 대한 힌트가 없은 것으로 확인하였다. 이어서, 환자들의 제2 샘플을 다시 시험하여 다량체 패턴에 어떠한 비정상도 없는 것으로 밝혀졌다.
실시예
5:
a) 시험관내 요법 조절(VWF 농축물)
VWD 유형 3을 갖는 환자의 시트레이트 처리된 혈액을 상이한 양의 헤메이트(대체 요법을 위한 시판되는 VWF 농축물)와 함께 항온처리하였다. 혼합물을 잘 혼합하고, 2개의 500 μL 분취물로 나누었다. 15 mg mL-1 농도의 25 μL 리스토세틴을 일부의 활성화된 혈액 분취물에 가하고, 양쪽 샘플을 10분 동안 혼합기에서 항온처리하였다. 300 μL 의 양쪽 분취물을 재석회화를 위한 20 μL의 star-TEM 시약 및 20 μl의 ex-TEM 시약을 포함하는 ROTEM® 분석기의 TEG 검정 컵에 가하였다. 첨가된 조직 인자에 의한 외인적 응고 케스케이드를 개시한다. 적어도 최대 진폭에 도달될 때까지 TEG 트레이싱을 기록하기 위해 ROTEM® 분석기를 사용하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, 비율이 표준화되며, 시험관내에서 해메이트를 가한 후 건강한 환자로부터는 어떠한 유의한 차이도 없다.
b) 생체내 요법 조절(DDAVP)
VWD의 요법은 출혈 에피소드를 완화시키거나 출혈 에피소드를 방지하는 것이 필수적일 수 있다. 유형 1 VWD를 갖는 대부분의 개체는 일반적으로 내부의 저장된 VWF가 방출되게 작용하는 DDAVP(Desmopressin acetate)를 사용하여 효과적으로 관리된다. DDAVP의 시도를 수행한 후 후속적인 혈액 샘플링 및 시험에 의한 반응을 모니터링하는 것이 통례이다. 모든 환자들은 DDAVP의 투여 전 높은 진폭 비율을 가졌으며, DDAVP는 TEG 비율([(리스토세틴이 첨가된 공여자로부터의 혈액 샘플에서의 최대 진폭)/(리스토세틴이 첨가되지 않은 혈액 샘플에서의 최대 진폭)]*100)을 표준화할 수 있었다. 본 방법은 DDAVP에 대한 비반응자들로부터 반응자를 구분하는 단순하고 신속한 수단이다. 본 방법의 이점은 즉각적인 시험 수득 시간에 접근한다는 것이다. 혈액 샘플링 후 즉시 결과가 이용가능하다. 이와는 대조적으로, VWF:CB 결과는 일반적으로 혈액을 샘플링한 지 수일 후 얻어진다. 진폭 비율, VWF:Ag 및 VWF-RCo에 대한 값이 3개의 시점(DDAVP의 투여 전, 투여 30분 후 및 투여 180분 후)에서 도시된다(도 7). 이는 생체내에서 본 발명의 시험관내 진단 방법이 VWD에 의한 출혈 위험을 감소시키기 위해 DDAVP를 사용하여 치료적 중재의 성공을 모니터링하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
c) 생체내 요법 조절(VWF 농축물)
중간 정도 내지 심각한 인자 VIII 및 폰 빌레브란트 인자 결핍을 갖는 환자는 일반적으로 치료를 필요로 한다. 혈장 유도된 농축물의 주입을 통한 정상적 VWF의 제공이 인자 VIII 및 VWF 결핍을 보정할 수 있다. 리스토세틴과의 사전항온처리를 갖는 TEG 검정 및 이를 갖지 않는 TEG 검정을 투여 전후에 수행하였다. VWF의 대체 효과는 도 8에서 나타난 바와 같이 TEG 시험에서 최대 진폭의 비율([(리스토세틴이 첨가된 공여자로부터의 혈액 샘플에서의 최대 진폭)/(리스토세틴이 첨가되지 않은 혈액 샘플에서의 최대 진폭)]*100)에 대한 상당한 감소로 나타날 수 있었다. 따라서, 본 발명자들는 혈장 VWF:Ag 및 VWF-리스토세틴 보조인자 활성에 대한 기선값을 양쪽 변수에 대해 각각 10% 및 11%로부터 139% 및 66%로 증가시켰다. 이는 생체내에서 본 발명의 시험관내 진단 방법이 VWD에 의한 출혈 위험을 감소시키기 위해 VWF를 대체하는 치료적 중재의 성공을 모니터링하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예
6:
본 발명자들는 본 검정의 수행 및 VWD의 실험실 진단에 대한 이의 유용성을 평가하였다. 103명의 환자 (58명의 여성, 45명의 남성: 평균 나이 11.9 ± 11.2)를 본 조사에 등록하였다. INTEM 검정에 의해 검출될 수 있는 기존의 혈우병 장애를 갖는 환자는 본 조사에서 배제하였다. VWD 분류는 VWF:Ag, vWF:CB 및 VWF 다량체 패턴에 기초하여 기준 실험실(reference laboratory)에 의해 수행되었다. 3개의 서브그룹에 있어, 최대 진폭 비율([(리스토세틴이 첨가된 공여자로부터의 혈액 샘플에서의 최대 진폭)/(리스토세틴이 첨가되지 않은 혈액 샘플에서의 최대 진폭)]*100)에 대한 결과가 도 9 및 10에 나타나 있다.
도 9 및 10에 도시되는 바와 같이, 결과는 하기와 같다:
a) TEG 비율 < 15%
-> 정상적인 건강한 개체로부터 56개의 샘플(이중 xyz는 "미정의" VWD 진단 결과를 가짐)
-> vWD 유형 1(약한 표현형)을 갖는 환자로부터 1개의 샘플
b) TEG 비율 ≥ 15%
-> VWD 유형 3을 갖는 환자로부터 1개의 샘플
-> VWD 유형 2A를 갖는 환자로부터 4개의 샘플
-> VWD 유형 2B를 갖는 환자로부터 2개의 샘플
-> VWD 유형 1을 갖는 환자로부터 3개의 샘플
-> VWD 유형 1(약한 표현형)을 갖는 환자로부터 10개의 샘플
-> VWD를 갖지 않는 개체로부터 26개의 샘플
진폭 비율에 대한 15%의 컷오프 값에 따라, VWD 검출에 대한 민감도는 95%([(진정 양성의 수/(진정 양성의 수 + 거짓 양성의 수)]: 20/21 = 95.2 %)이고, VWD에 대한 특이성은 68%([(진정 음성의 수/(진정 음성의 수 + 거짓 양성의 수)]: 56/82 = 68.3%)였다.
그러나, TEG 비율이 15% 이상이나 기준 실험실에 의해 VWD로 분류되지 않은 26명의 개체 중에서, 거의 절반이 다른 특징분석되지 않은 출혈 장애를 지시하는 임상 내력을 가졌다. 지금까지, 하기의 출혈 장애로 배정될 수 있었다:
-> 1명의 환자가 심한 위장 출혈을 갖는 미분류된 혈소판 기능 결함을 갖고,
-> 1명의 환가가 림프-증식 증후군에 의해 야기되는 심한 위장 출혈을 갖고,
-> 1명의 환자가 혈소판 저장 푸울 질환을 갖고,
-> 1명의 환자가 이상피브리노겐혈증을 갖고,
-> 5명의 환자가 미정의 VWD로 분류되고,
-> 2명의 환자가 반복적인 출혈 에피소드, 비출혈 및 연장된 출혈 시간을 갖고,
-> 3명의 개체가 심각한 출혈 에피소드의 가족력을 갖는다.
따라서, 출혈 장애에 대한 특이성 및 민감성은 더욱 높은 것으로 추측될 수 있다.
출혈 체질의 진단과 관련하여, 민감성은 적어도 95%(검출되지 않았던 VWD 유형 yxz을 갖는 1명의 환자가 추가 시험시 증가된 출혈 위험을 갖지 않는 것으로 밝혀질 수 있기 때문)이고 잠재적 특이성은 82%(56/68 = 82.3%)인 것으로 보인다. 또한, 실제 특이성은 15명의 나머지 "거짓양성" 개체가 추가 시험시 증가된 출혈 위험을 갖는 것으로 판명되는 경우 더욱 높아질 수 있다.
따라서, 본 발명의 시험관내 진단 방법은 VWD 또는 VWF와 혈소판의 상호작용에 영향을 끼치는 혈소판 질환과 연관된 출혈 위험을 검출하는데 적합할 뿐만 아니라, 출혈 위험을 검출하는데 적합한 일반적 시험이기도 하다.
Claims (27)
- a) 혈소판 및 지혈 인자를 포함하는 체액을 포함하는 사람 개체 또는 동물로부터의 샘플을 수득하는 단계,
b) 상기 샘플의 적어도 일부를 혈소판 응집 활성화제와 함께 항온처리하는 단계,
c) 단계 (b) 후, 이와 동시에 또는 이전에 수행할 수 있는 단계로서, 혈소판 응집 활성화제와 항온처리된 상기 샘플 일부에서 응고를 유도하는 단계,
d) 혈소판 응집 활성화제와 항온처리된 상기 샘플 일부에서 응고를 유도한 후 발생하는 점탄성 변화를 측정하는 단계,
e) 단계 (d)에서 결정된 점탄성 변화량을 참조값과 비교하는 단계를 포함하는, 환자에서 출혈 위험을 결정하기 위한 시험관내 진단 방법으로서,
여기서, 단계 (d)에서 결정된 점탄성 변화량은, 동일한 방법을 혈소판 응집 활성화제가 첨가되지 않은 동일한 공여자로부터 단계 (a)에서와 동일한 방식으로 수득된 또 다른 샘플에 적용하는 경우 측정된 점탄성 변화량과 비교하였을 때 이보다 낮은, 시험관내 진단 방법. - 제1항에 있어서, 상기 체액이 전혈, 항응고처리된 혈액 또는 혈소판-풍부 혈장인, 시험관내 진단 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 참조 샘플을
a) 제1항의 방법의 단계 (a)에서 수득되는 최초 공여 샘플을 2개 이상의 샘플로 나누거나 제1항의 방법의 단계 (a)에서 공여자로부터 2개 이상의 샘플을 수득함으로써 수득하거나(이때 하나 이상의 샘플에서 단지 제1항의 방법의 단계 (a) 및 단계 (c) 내지 (e)를 수행하고 제1항의 방법의 단계 (b)는 생략하며, 여기서, 제1항의 방법의 단계 (b)가 생략된 상기 샘플에서 측정된 점탄성 변화량은 참조 값이다),
b) 제1항의 방법의 단계 (a) 및 단계 (c) 내지 (e)를 포함하는 방법을 한 명의 건강한 공여자로부터의 하나의 샘플 또는 증가된 출혈 위험이 없는 건강한 공여자들로부터의 수개의 샘플에 적용시킴으로써 수득하거나(이때 제1항의 단계 (b)가 생략된 상기 샘플 또는 샘플들에서 측정된 점탄성 변화량은 참조 값이다),
c) 제1항의 방법의 단계 (a) 내지 (e)를 포함하는 방법을 한 명의 건강한 공여자로부터의 하나의 샘플 또는 증가된 출혈 위험이 없는 건강한 공여자들로부터의 수개의 샘플에 적용시킴으로써 수득하는(이때 상기 샘플 또는 샘플들에서 측정된 점탄성 변화량은 참조 값이다), 시험관내 진단 방법. - 제3항에 있어서, 제3항의 대안 b) 또는 c)에서 수득된 상기 참조 값이 건강한 공여자들로부터 수득된 수개의 샘플에서 측정된 점탄성 변화량의 평균값인, 시험관내 진단 방법.
- 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)를 단계 (b) 이후에 수행하는, 시험관내 진단 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 활성화제를 첨가하는, 시험관내 진단 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 활성화제를 단계 (b) 전에 첨가하거나, 단계 (b) 이후이나 단계 (c)에서 응고를 유도하기 전에 첨가하는, 시험관내 진단 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제3항에 따른 상기 참조 값으로 결정된 점탄성 변화량에 대한 혈소판 응집 활성화제와 함께 항온처리된 상기 샘플의 상기 점탄성 변화량의 비율을 제1항의 방법의 단계 (e)에서 결정하는, 시험관내 진단 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 항에 있어서, 폰 빌레브란트 인자(von Wilebrand Factor:VWF)의 정성적 및/또는 정량적 결함을 결정하는, 시험관내 진단 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, VWF와 혈소판과의 상호작용을 감소시키는 혈소판 기능이상을 결정하는, 시험관내 진단 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 점탄성 변화를 혈전탄성그래피(thromboelastography)로 측정하는, 시험관내 진단 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 점탄성 변화를 혈전탄성그래피의 변수 중 어느 하나를 결정함으로써 측정하는, 시험관내 진단 방법.
- 제12항에 있어서, 혈전탄성그래피의 상기 변수가 최대 진폭인, 시험관내 진단 방법.
- 제13항에 있어서, 제3항에 따른 상기 참조 값으로 결정된 최대 진폭에 대한 혈소판 응집 활성화제와 함께 항온처리된 샘플의 최대 진폭의 비율을 방법의 단계 (e)에서 결정하는, 시험관내 진단 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈소판 응집 활성화제가 리스토세틴 및 보트로세틴을 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 시험관내 진단 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 혈소판 응집 활성화제가 리스토세틴인, 시험관내 진단 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 리스토세틴 농도가 0.1 mg/ml 내지 1.5 mg/ml인, 시험관내 진단 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 수술 전 또는 치료 동안 환자의 출혈 위험을 예측하기 위한, 시험관내 진단 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 또는 섬유소용해 시스템의 다른 결핍, 예를 들어 VWF의 다른 결핍 또는 VWF와 혈소판과의 상호작용을 감소시키는 혈소판 수용체의 결핍을 예측하기 위한, 시험관내 진단 방법.
- 제19항에 있어서, 고섬유소용해, 혈액 손실에 의한 다인자 응고병증, 항응고제의 사용에 의한 출혈, 외상 관련된 저응고 상태, 임신 관련된 고응고 상태, 파종 혈관내 응고, 저혈소판증, FVIII, FIX, FXIII 및 피브리노겐과 같은 기능적 응고 인자의 결여를 야기하는 선천적 출혈 장애, 이상피브리노겐혈증 및 혈소판 저장 푸울 질환(platelet storage pool diseases)을 진단하기 위한, 시험관내 진단 방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 체액 심플이 시험당 최대 105 μl인, 시험관내 진단 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, (혈소판 응집 활성화제가 첨가된 공여자로부터의 체액 샘플에서의 점탄성 변화)/(혈소판 응집 활성화제가 첨가되지 않은 동일한 체액 샘플에서의 점탄성 변화)의 값이 0.15 이상인 경우 출혈 위험에 대한 지시자인 것으로 해석하는, 시험관내 진단 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 시험관내 진단 방법의 스크리닝 시험으로의 용도.
- 제1항 내지 제22항의 시험관내 진단 방법의 요법 조절(therapy control)을 위한 용도.
- 제24항에 있어서, 상기 요법이 DDAVP의 투여를 포함하는 요법 조절을 위한 용도.
- 제24항에 있어서, 상기 요법이 VWF 농축물의 투여를 포함하는 요법 조절을 위한 용도.
- 제1항 내지 제22항의 방법을 수행하기 위한 키트의 용도.
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