ES2599929T3 - Método diagnóstico in vitro para evaluar la enfermedad de von Willebrand y un mayor riesgo hemorrágico asociado con la enfermedad de von Willebrand y los trastornos adquiridos o congénitos de la función trombocítica - Google Patents
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Abstract
El método diagnóstico in vitro para determinar defectos cuantitativos o cualitativos del factor de von Willebrand caracterizado por: a) utilizar una muestra obtenida a partir de un individuo humano o un animal que comprende un fluido corporal que comprende trombocitos y factores hemostáticos, b) incubar al menos una parte de la muestra con un activador de la agregación de trombocitos, donde el activador de la agregación de trombocitos es un compuesto que es capaz de inducir la activación, agregación y aglutinación de trombocitos dependientes del VWF en un fluido obtenido a partir del cuerpo humano que contiene trombocitos y el VWF provocando la unión del VWF al receptor del VWF en los trombocitos, c) inducir la coagulación en la parte de la muestra que se ha incubado con un activador de la agregación de trombocitos, d) medir el cambio viscoelástico que ocurre después de inducir la coagulación en la parte de la muestra que se ha incubado con un activador de la agregación de trombocitos en un tromboelastógrafo, y e) comparar la cantidad de cambio viscoelástico determinado en el paso (d) con un valor de referencia, donde el valor de referencia se obtiene: i) dividiendo la muestra original del donante obtenida en el paso (a) en al menos dos muestras u obtener en el paso (a) al menos dos muestras a partir de un donante donde en al menos una muestra únicamente se llevan a cabo el paso (a) y los pasos (c) a (e) y se omite el paso (b) y donde la cantidad de cambio viscoelástico medida en la muestra en la cual se ha omitido el paso (b) es el valor de referencia; o ii) aplicando un método que comprende el paso (a) y los pasos (c) a (e) a una muestra procedente de un donante sano o a varias muestras procedentes de donantes sanos sin un mayor riesgo hemorrágico, donde la cantidad de cambio viscoelástico medida en la muestra o en las muestras en las que se omitió el paso (b) es el valor de referencia; o iii) aplicando un método que comprende los pasos (a) a (e) a una muestra procedente de un donante sano o a varias muestras procedentes de donantes sanos sin un mayor riesgo hemorrágico donde la cantidad de cambio viscoelástico medida en la muestra o en las muestras es el valor de referencia.
Description
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DESCRIPCION
Metodo diagnostico in vitro para evaluar la enfermedad de von Willebrand y un mayor riesgo hemorragico asociado con la enfermedad de von Willebrand y los trastornos adquiridos o congenitos de la funcion trombodtica
La invencion se refiere a un metodo in vitro para diagnosticar la enfermedad de von Willebrand (VWD, por sus siglas en ingles) y un mayor riesgo hemorragico asociado con la enfermedad de von Willebrand y/o defectos adquiridos o congenitos en la funcion trombodtica que reducen la interaccion del Factor de von Willebrand (VWF, por sus siglas en ingles) con los trombocitos. El metodo in vitro tambien se puede utilizar para diagnosticar riesgos hemorragicos adicionales. La prueba es adecuada para su uso como una prueba de cribado con sangre entera y tiene el beneficio adicional de ser adecuada como una prueba de diagnostico inmediato.
El VWF es una glucoprotema adhesiva multimerica presente en el plasma de los mairnferos, que tiene multiples funciones fisiologicas. Durante la hemostasia primaria, el VWF actua como un mediador entre receptores espedficos sobre la superficie de los trombocitos y componentes de la matriz extracelular tales como el colageno. Ademas, el VWF actua como una protema portadora y estabilizadora para el FVIII procoagulante. El VWF es sintetizado en las celulas endoteliales y los megacariocitos como una molecula precursora de 2813 aminoacidos. El polipeptido precursor, pre-pro-VWF, esta constituido por un peptido senal de 22 residuos, un propeptido de 741 residuos y el polipeptido de 2050 residuos que se observa en el VWF plasmatico maduro (Fischer et al., FEBS Lett. 351: 345-348, 1994). Tras la secrecion en el plasma por parte de las celulas endoteliales y de los megacariocitos, el VWF circula en forma de diversas especies con diferentes tamanos moleculares. Estas moleculas del VWF estan constituidas por oligo- y multimeros de la subunidad madura de 2050 residuos de aminoacido. El VWF se puede observar normalmente en el plasma como un dfmero y hasta multfmeros constituidos por 50-100 dfmeros (Ruggeri et al., Thromb. Haemost. 82: 576-584, 1999). La semivida in vivo del VWF humano en la circulacion humana es de aproximadamente 12 a 20 horas.
Se sabe que el VWF estabiliza el FVIII in vivo y, de esta manera, desempena una funcion crucial en la regulacion de los niveles plasmaticos del FVIII y, como consecuencia, es un factor esencial para controlar la hemostasia primaria y secundaria. Tambien se sabe que despues de la administracion intravenosa de preparados farmaceuticos que contienen el VWF a pacientes que padecen la enfermedad de von Willebrand (VWD) se puede observar un aumento en el FVIII:C endogeno de 1 a 3 unidades por mL en 24 horas, lo que demuestra el efecto estabilizador in vivo del VWF sobre el FVIII.
El VWF se puede preparar a partir de plasma humano, por ejemplo, tal como se describe en el documento EP05503991. El documento EP0784632 describe un metodo para aislarel VWF recombinante.
El trastorno hemorragico heredado mas frecuente en los seres humanos, con una prevalencia de aproximadamente un 0.8% a un 1.3% es el smdrome de von Willebrand o la enfermedad de von Willebrand (VWD), que puede tratarse mediante una terapia de sustitucion con concentrados que contienen el VWF de origen plasmatico o recombinante.
Existen cuatro tipos hereditarios de la VWD descritos, el tipo 1, el tipo 2, el tipo 3 y el tipo trombodtico. Estas son formas heredadas y adquiridas de la VWD. La mayona de los casos son hereditarios, pero se han descrito formas adquiridas de la VWD. La clasificacion de la Sociedad Internacional sobre la Trombosis y Hemostasia (ISTH, por sus siglas en ingles) depende de la definicion de los defectos cualitativos y cuantitativos.
VWD de tipo 1
La VWD de tipo 1 (60-80% de todos los casos de la VWD) es un defecto cuantitativo, pero puede que no presente una coagulacion claramente deficiente. La mayona de los pacientes consiguen llevar una vida casi normal. Pueden surgir complicaciones en forma de hemorragias tras la cirugfa (incluidos los procedimientos dentales), una perceptible facilidad para la aparicion de equimosis o menorragia (periodos abundantes). Se detecta una reduccion de los niveles del VWF (un 10-45% del normal, es decir 10-45 UI).
VWD de tipo 2
La VWD de tipo 2 (10-20%) es un defecto cualitativo y la tendencia a las hemorragias puede variar de un individuo a otro. Existen niveles normales del VWF, pero los multfmeros son anomalos estructuralmente o hay una ausencia de subgrupos de multfmeros grandes o pequenos. Existen cuatro subtipos principales: 2A, 2B, 2M y 2N.
VWD de tipo 2A
Esta es una anomalfa de la smtesis o proteolisis de los multimeros del VWF que desemboca en la presencia de unidades multimericas pequenas en la circulacion. La union al Factor VIII es normal. La VWD de tipo 2a da lugar a una actividad del cofactor ristocetina desproporcionadamente baja en comparacion con el antfgeno de von Willebrand.
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VWD de tipo 2B
Esta es un defecto de “aumento de la funcion” que da lugar a la union espontanea a los trombocitos y el rapido aclaramiento posterior de los trombocitos y los multimeros del VWF grandes. Puede ocurrir una trombocitopenia moderada. Los multimeros del VWF grandes estan ausentes de la circulacion y la union al Factor VIII es normal.
VWD de tipo 2M
Esta esta causada por una disminucion o ausencia de la union a la GPIb sobre los trombocitos. La union al Factor VIII es normal.
VWD de tipo 2N (de Normandia)
Esta es una deficiencia de la union del VWF al factor VIII. Este tipo presenta un nivel de antfgeno del VWF normal y resultados de la prueba funcional normales, pero tiene poco Factor VIII. Esto, probablemente, ha dado lugar a que algunos pacientes de 2N hayan sido diagnosticados erroneamente en el pasado como pacientes que padedan la hemofilia A.
VWD de tipo 3
El tipo 3 (1-3%) es la forma mas grave de la VWD, en la que no esta presente el VWF funcional y puede provocar hemorragias mucosas graves, no hay antigeno del VWF detectable y tambien puede provocar unos niveles del Factor VIII suficientemente bajos para dar lugar a hemartrosis (hemorragias en las articulaciones), como en casos de hemofilia moderada.
VWD de tipo trombodtica
La VWD de tipo trombodtica es un tipo autosomico dominante de la VWD provocado por el aumento de la funcion de las mutaciones de los receptores del VWF sobre los trombocitos; espedficamente, la cadena alfa del receptor glucoprotema Ib (GPIb). Esta protema es parte de un complejo mas grande (GPIb/V/IX) que forma el receptor del VWF completo sobre los trombocitos. La actividad de la ristocetina y la perdida de multfmeros del VWF grandes es similar al tipo 2B, pero las pruebas geneticas del VWF no revelaran mutaciones.
Ademas de los defectos cuantitativos o cualitativos del VWF, la ausencia de receptores espedficos sobre la superficie de los trombocitos u otras anomalfas trombodticas pueden afectar a la agregacion trombodtica dependiente del VWF. La molecula del VWF tiene sitios de union espedficos para los receptores de los trombocitos GpIb y GPIIb/IIIa, FVIIIC, colageno, sulfatidos, heparina y la protema botrocetina derivada del veneno de serpiente. La agregacion de los trombocitos es una consecuencia de los contactos entre trombocitos. Este contacto esta mediado por el fibrinogeno y el VWF y requiere la presencia de receptores sobre la superficie de los trombocitos. En su estado de reposo los trombocitos son no trombogenicos, pero exponen los receptores cuando se inicia la agregacion de los trombocitos y se activan los trombocitos. La carencia de los receptores correspondientes para el VWF o una activacion deficiente provoca hemorragias graves, tal como se observa en el smdrome de Bernard Soulier, un trastorno congenito con una deficiencia de la GPIb. Al contrario que la mutacion con “aumento de la funcion” de la GPIb en la VWD de tipo trombodtica, en el smdrome de Bernard Soulier una mutacion con “perdida de la funcion” en el receptor GPIb para el VWF provoca el fenotipo clfnico. El fenotipo clfnico es comparable al de la VWD, pero ni la cantidad ni la actividad del vWf vanan.
Enfermedad de von Willebrand adquirida
La VWD adquirida es un trastorno hemorragico con resultados en el laboratorio similares a los de la VWD congenita. A diferencia de la forma congenita, la VWD adquirida normalmente se presenta en individuos que no tienen antecedentes personales ni familiares de trastornos hemorragicos. La VWD adquirida esta asociada con trastornos linfomieloproliferativos, inmunologicos y cardiovasculares, asf como tambien con tumores solidos y otras afecciones variadas. La VWD adquirida puede presentarse en pacientes con autoanticuerpos. En este caso la funcion del VWF no esta inhibida pero el complejo VWF-anticuerpo sufre un rapido aclaramiento de la circulacion. La VWD adquirida es probablemente la causa de muchos casos de trastornos hemorragicos adquiridos que no son diagnosticados debido a que se carece de pruebas espedficas para la VWD en la mayona de los laboratorios para analisis corrientes. Otra forma de la vWd ocurre en pacientes con estenosis de la valvula aortica, lo que desemboca en una hemorragia gastrointestinal (smdrome de Heyde).
En la actualidad, se requieren varias pruebas, muchas de las cuales son complejas y requieren mucho tiempo, para el diagnostico y la clasificacion de la VWD, ya que ninguna prueba unica es ideal. Algunas son pruebas de la coagulacion generales que evaluan un riesgo hemorragico general, como la determinacion de PTT, FVIII:C y el tiempo de hemorragia, mientras que otras pruebas estan relacionadas espedficamente con el VWF, como la determinacion del antfgeno del VWF (VWF:Ag).
En la actualidad, las pruebas de cribado corrientes de la coagulacion, por ejemplo, el recuento de trombocitos, el
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tiempo activado de tromboplastina parcial y el tiempo de hemorragia, no son sensibles para detectar las anomaKas de la coagulacion causadas por la VWD o los defectos de los trombocitos que reducen la interaccion entre el VWF y los trombocitos. El tiempo de hemorragia es bastante variable y no se correlaciona bien con la actividad del cofactor ristocetina (VWF:RCo) o el antigeno del VWF (VWF:Ag) en plasma. Por lo tanto, el tiempo de hemorragia no es una prueba de cribado util para la VWD.
Algunas pruebas mas complejas del VWF son el antigeno del VWF (WF:Ag), actividad del cofactor ristocetina (VWF:RCo), el ensayo de union al colageno (VWF:CBA), el analisis de la agregacion de trombocitos inducida por la ristocetina (RIPA, por sus siglas en ingles), el ensayo de union de VWF:FVIII y el analisis especialmente lento del patron de multfmeros del VWF. La protema VWF se cuantifica mediante el procedimiento del ensayo de inmunoadsorcion enzimatica (ELISA) o tecnologfas automaticas mas recientes. No refleja las propiedades activas, funcionales o adhesivas del VWF. En la actualidad, el ensayo del cofactor ristocetina es el unico ensayo funcional del VWF utilizado corrientemente que se realiza utilizando la aglutinacion de los trombocitos. Sin embargo, tiene varias limitaciones, incluidas una baja reproducibilidad y una baja correlacion entre laboratorios. Se ha desarrollado el VWF:CBA como un ensayo funcional alternativo, basado en la tecnica ELISA que ofrece la posibilidad de ser mas reproducible. El VWF:CBA es especialmente sensible a la perdida de multfmeros del VWF de peso molecular elevado. El ensayo de union del VWF:FVIII evalua la capacidad del VWF para unirse al FVIII y se utiliza para diagnosticar el tipo 2N. El procedimiento RIPA requiere plasma rico en trombocitos de un individuo para determinar la sensibilidad a la ristocetina con diversas concentraciones. La sensibilidad a la ristocetina depende tanto del nivel como de la funcion del VWF. El ensayo VWF:multimero conlleva la electroforesis en gel para detectar el VWF con diferentes pesos moleculares e identificar ciertas anomalfas estructurales del VWF. El analisis multimerico permitira la asignacion en los diferentes subtipos. Debido a la complejidad, tiempo y coste de la prueba unicamente un pequeno numero de laboratorios especializados la llevan a cabo. Asimismo, debido al tiempo transcurrido y a la manipulacion de la muestra cuando se envfan las muestras a los laboratorios especializados, a veces se obtienen resultados erroneos debido a la perdida de formas del VWF con un elevado peso molecular.
Ademas, el diagnostico de la VWD y la disfuncion de trombocitos tambien se puede llevar a cabo con el analizador automatico PFA100 (Siemens Medical Solution Diagnostics) que mide la hemostasia primaria en condiciones con un cizallamiento elevado aspirando muestras sangumeas no coaguladas con una presion negativa constante a traves de una abertura pequena. Se forma un tapon de trombocitos en la abertura y se determina el tiempo necesario para que se produzca el cese del flujo sangumeo (tiempo de cierre). Se ha demostrado que la funcion de los trombocitos y los niveles del VWF son elementos determinantes importantes del tiempo de cierre (E.J. Favaloro, Seminars in Thrombosis and hemostasis 32: 456-471, 2006). En los ensayos con el PFA100 no se induce la cascada de coagulacion plasmatica intrmseca ni la extrmseca, p. ej., la coagulacion plasmatica que conlleva la formacion de fibrina no tiene lugar.
El documento US 5 951 951 proporciona un metodo mejorado para medir el tiempo de coagulacion activado en muestras sangumeas con citrato que contienen trombocitos introduciendo un paso de recalcificacion previo a la prueba en el cual un anticoagulante garantiza que la coagulacion no comience prematuramente. Se propone anadir a la muestra sangumea con citrato simultaneamente (a) un agente restaurador de la funcion trombocftica, (b) un anticoagulante y (c) a al menos una parte de la muestra un agente activador de trombocitos. Despues de la recalcificacion previa a la prueba se induce la coagulacion anadiendo un agente coagulante. A continuacion, se puede medir la coagulacion de diversas maneras incluida la determinacion de un cambio en la viscosidad. La funcion del agente activador de trombocitos es que potencia, en condiciones normales, la capacidad de los trombocitos para participar de manera eficaz en la reaccion de coagulacion de la sangre y, de esta manera, acorta el tiempo de coagulacion. Por lo tanto, la adicion del agente activador de trombocitos da lugar, en muestras procedentes de donantes normales sanos, a un aumento en la viscosidad en comparacion con una muestra del mismo donante al cual no se le anade activador de trombocitos, mientras que en muestras procedentes de donantes con defectos trombodticos la adicion del agente activador de trombocitos da lugar a un acortamiento reducido del tiempo de coagulacion, p. ej., un aumento reducido de la viscosidad o sin cambio en absoluto, en comparacion con una muestra del mismo donante a la cual no se ha anadido activador de trombocitos. El metodo de prueba divulgado tiene el objeto de proporcionar un metodo para detectar defectos trombodticos.
El documento WO 99/41615 divulga un metodo para evaluar la actividad coagulante de la sangre midiendo la velocidad de la coagulacion de la sangre en presencia de ciertos iones metalicos. Una muestra de un donante se divide en al menos dos muestras y al menos a una de ellas se anaden iones metalicos. En una realizacion de la invencion, se mide un cambio en la viscosidad. En esta realizacion, la coagulacion plasmatica no se induce, sino que se anade un ion metalico a al menos una muestra y, posteriormente, se mide el cambio relativo de viscosidad entre las dos muestras. Antes de medir el cambio en la viscosidad, se puede anadir opcionalmente un activador de trombocitos. Sin embargo, este metodo no considera anadir un activador de trombocitos unicamente a una muestra y no a la otra muestra y comparar la diferencia en la cantidad de cambio viscoelastico provocado por este tratamiento diferencial.
En anos recientes, en la practica clmica se ha introducido la tecnica analftica de la tromboelastograffa. La tromboelastograffa (TEG, por sus siglas en ingles) es un metodo diagnostico que estudia mecanicamente la
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formacion o disolucion del coagulo en un sistema oscilante. En este, un recipiente (vaso) tiene un movimiento oscilante alrededor de una barra (husillo) medidora (TEG convencional) o el recipiente esta fijo y se confiere a la barra un movimiento rotatorio oscilante (ROTEG o ROTEM). Se registran las fuerzas mecanicas que surgen entre el recipiente y la barra. Tan pronto como la sangre o el plasma comienza a coagular, ocurre una variacion en la senal de medida inicial. Ambos disenos se denominaran en la presente TEG.
La TEG se emplea para estudiar la sangre o el plasma con el fin de determinar parametros de coagulacion relevantes (parametros TEG) tales como el periodo de tiempo hasta alcanzar una primera formacion significativa de un coagulo con una amplitud de 2 mm (tiempo de coagulacion o reaccion r), el periodo de tiempo hasta alcanzar un grosor del coagulo con una amplitud de 20 mm (valor k), la velocidad a la cual se forma el coagulo (angulo alfa), las propiedades mecanicas del coagulo con una amplitud maxima (MA, por sus siglas en ingles) o en cualquier otro punto temporal deseado, el periodo de tiempo hasta la MA (TMA, por sus siglas en ingles) o el periodo de tiempo hasta que la resistencia del coagulo ha disminuido de nuevo hasta un cierto valor debido a la fibrinolisis. Clmicamente, se emplea la TEG como una medida diagnostica, entre otros, para evaluar la coagulopatfa, por ejemplo, en la cirugfa cardfaca, en el trasplante de Idgado, en la cirugfa abdominal mayor y como una prueba casi de cabecera en el control de la coagulacion perioperativa.
La TEG esta disponible, ademas de las pruebas diagnosticas de coagulacion estandar (tiempo de tromboplastina, aPTT, recuento de trombocitos, ATIII, fibrinogeno, dfmeros D, tiempo de hemorragia) que requieren mucho mas tiempo, para la determinacion de los valores que proporcionan una informacion rapida sobre los patrones hemorragicos. Esto es especialmente importante si ocurren coagulopatfas en el transcurso de intervenciones quirurgicas importantes o despues de politraumatismos, debido a que los trastornos serios de la hemostasia pueden dar lugar rapidamente al desarrollo de dano tisular secundario y son a menudo resistentes a una terapia hemostatica convencional que utiliza un diagnostico de la coagulacion estandar que requiere mucho mas tiempo.
El atractivo del metodo reside en su aspecto global, estando el resultado influenciado por factores de coagulacion y rutas fibrinolfticas, de trombocitos e inhibidores (Luddington, Clin. Lab. Haem. (2005) 27, 81-90). Esto proporciona la posibilidad de identificar los mecanismos principales que contribuyen a una hemostasia y coagulacion defectuosas en la muestra de una manera mas instructiva que las pruebas de cribado de la coagulacion mucho mas artificiales. Los parametros TEG estan influenciados por varios factores, especialmente los niveles de fibrinogeno, factor XIII y trombocitos sangumeos y componentes del sistema fibrinolftico tales como la plasmina, activadores de la plasmina e inhibidores de la plasmina. Por ejemplo, el fibrinogeno, como un sustrato de la coagulacion, se correlaciona con la estabilidad del coagulo. Esto puede apreciarse claramente en el tromboelastograma. Asimismo, la ausencia de factores de coagulacion como el FVIII o el FIX puede ser detectada con la tromboelastograffa.
El coagulo se forma por la interaccion de la fibrina con los trombocitos activados. Las hebras de fibrina y los agregados de trombocitos determinan tanto la resistencia mecanica del coagulo formado como las propiedades viscoelasticas de la muestra. Los trombocitos agregados asociados con el VWF y la fibrina contribuyen en aproximadamente un 80% a las propiedades viscoelasticas y la fibrina contribuye en aproximadamente un 20% (p. ej., la amplitud maxima medida segun la TEG) en muestras normales.
Tal como se ha expuesto anteriormente, la tromboelastograffa se usa en la actualidad para el analisis de varios defectos de la coagulacion, como la hemofilia A y B, trombocitopenia, trombopatfa, hipercoagulacion asf como tambien de defectos en el sistema fibrinolftico (remftase a la figura 1) (R.J. Luddington, Clin. Lab. Haem. 27: 81-90, 2005). El documento WO 2006/084648 describe la utilizacion de la TEG para diferenciar entre un estado de deficiencia de fibrinogeno y del Factor XIII.
Recientemente, un tromboelastograma de rotacion modificado (ROTEM®, Pentapharm, Munich, Alemania) ha evitado varias limitaciones de la TEG clasica. Se dispone de cuatro canales para medidas simultaneas. Cada prueba requiere 300 pL de sangre entera con citrato. La activacion de la coagulacion se puede realizar con distintos activadores posibilitando la evaluacion de diferentes rutas de activacion. Se pueden realizar cuatro ensayos ROTEM® estandar, denominados INTEM, EXTEM, NATEM y FIBTEM, de acuerdo con los protocolos proporcionados por el proveedor. INTEM y EXTEM representan ensayos en los cuales se desencadenan las rutas de coagulacion intrmseca o extrmseca. Se utiliza NATEM (TEM no activada) para evaluar la formacion del coagulo en sangre entera en ausencia de una activacion de la cascada de coagulacion que no sea la recalcificacion y la activacion por contacto espontaneo. Finalmente, se puede utilizar el ensayo FIBTEM para evaluar la funcion espedfica del fibrinogeno en la formacion del coagulo tras la inhibicion de los trombocitos por parte de la citocalasina D. En el caso de INTEM y EXTEM, se recalcifican 300 pL de sangre con citrato con 20 pL de CaCl2 0.2 M (reactivo star-TEM®, Pentapharm, GmbH, Munich, Alemania) y la cascada de coagulacion es activada por los fosfolfpidos de la tromboplastina parcial generados con cerebro de conejo mas acido elagico (reactivo in-TEM®, Pentapharm GmbH, Munich, Alemania) y tromboplastina de cerebro de conejo (reactivo ex-TEM®, Pentapharm GmbH, Munich, Alemania), respectivamente. En el caso de FIBTEM, se mezclan 300 pL de sangre con citrato con 20 pL de reactivo ex-TEM® mas 20 pL de una solucion de citocalasina D/DMSO, CaCl2 0.2 M (reactivo fib-TEM®, Pentapharm GmbH, Munich, Alemania).
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Se ha demostrado que ROTEM® es un dispositivo de analisis inmediato para un diagnostico rapido en diversos trastornos hemorragicos y para la evaluacion global del estado de coagulacion en pacientes con afecciones hipercoagulables. En particular, este metodo ofrece la posibilidad de ejemplificar la hipocoagulacion que se observa normalmente en trastornos tales como la hemofilia, diversas deficiencias de un factor de coagulacion y trastornos trombocfticos. Ademas, la sustitucion experimental ex vivo con varios componentes que promueven la hemostasia ha revelado que ROTEM® es util para ejemplificar la correccion de una capacidad hemostatica comprometida.
Sin embargo, la TEG no se ha utilizado hasta la fecha para diagnosticar un mayor riesgo hemorragico asociado con la VWD o defectos trombocfticos que reducen la interaccion del VWF con los trombocitos.
En la practica clrnica es necesario determinar el riesgo hemorragico de un paciente antes de llevar a cabo una cirugfa. Cuando una prueba de coagulacion general como, p. ej., el PTT, esta elevada e indica un mayor riesgo hemorragico, con el fin de determinar la causa del mayor PTT es necesario realizar varias pruebas adicionales que a menudo conllevan tambien alguna prueba que requiere mucho mas tiempo como, p. ej., el analisis de mulffmeros del VWF.
Si aun no se dispone de los resultados de estas pruebas, no se permite que los pacientes que no padecen indicaciones que pueden ser letales se sometan a la operacion quirurgica programada y la cirugfa se pospone a menudo hasta varias semanas.
Por lo tanto, existe una necesidad medica importante de una prueba para identificar el riesgo hemorragico de un paciente individual, asf como tambien su funcion del VWF, donde la prueba debeffa proporcionar resultados rapidos, siendo idealmente una prueba de analisis inmediato adecuada para analisis con sangre entera que requiera unicamente pequenas muestras sangumeas. El problema resuelto por la presente invencion era proporcionar una prueba de este tipo.
Sorprendentemente, en la presente invencion se descubrio que existe una manera de utilizar la determinacion de un cambio de la viscoelasticidad en una tromboelastograffa para evaluar deficiencias del VWF, incluidas tanto deficiencias cualitativas como cuantitativas de la VWD y el riesgo hemorragico asociado con la enfermedad de von Willebrand y los defectos de la funcion trombocftica adquiridos o congenitos que reducen la interaccion del VWF con los trombocitos. La presente invencion proporciona un ensayo rapido para la VWD y el defecto de la funcion trombocftica que incluye una prueba de analisis inmediato o de cabecera adecuada para el uso de la tromboelastograffa con sangre entera.
Aun mas sorprendentemente, se observo que la prueba es capaz de determinar que pacientes padecen enfermedades por defecto del almacenamiento de trombocitos y disfibrinogenemia. Aparentemente, la interaccion de los trombocitos requiere un proceso de multiples pasos y, aparentemente, participan diferentes mecanismos a traves de diferentes receptores. Las interacciones entre diversas protemas que se adhieren a trombocitos tales como el fibrinogeno o von VWF y sus respectivos receptores superficiales median en la interaccion entre los trombocitos y pueden desembocar en una diatesis hemorragica clmicamente manifiesta. Tambien se ha informado de esto en las protemas intracelulares secretadas desde los granulos de los trombocitos durante la activacion de los trombocitos.
Tambien se ha observado que la prueba se puede realizar con fluidos corporales, preferentemente sangre, en volumenes tan pequenos como 105 pL por prueba, lo que supone una enorme ventaja, especialmente en el diagnostico de pacientes pediatricos y recien nacidos. Por lo tanto, la invencion tambien engloba pruebas para determinar el riesgo hemorragico de un paciente dado debido a la VWD, defectos trombocfticos, enfermedades por defecto del almacenamiento de trombocitos y disfibrinogenemia en muestras sangumeas de 300 pL por prueba como maximo, preferentemente 200 pL por prueba como maximo y de la manera mas preferida 105 pL por prueba como maximo. Una realizacion sumamente preferida de la invencion consiste en determinar el riesgo hemorragico a partir de muestras sangumeas menores de 105 pL.
Figuras:
Figura 1:
La Figura 1 muestra un tromboelastograma normal comparado con tromboelastogramas de diversos defectos en la coagulacion.
Figura 2:
La Figura 2 muestra que incubando sangre con citrato con cantidades crecientes de ristocetina (hasta una concentracion final de 1.05 mg/mL, la amplitud maxima disminuye y el tiempo de coagulacion aumenta.
Figura 3:
La Figura 3 muestra que cuando se realiza un analisis tromboelastografico de sangre normal la amplitud maxima despues de una preincubacion con ristocetina alcanza tan solo aproximadamente un 20% de la amplitud maxima sin
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tal preincubacion con ristocetina. En sangre procedente de un paciente de la VWD de tipo 3, se alcanza una amplitud maxima de casi un 100% incluso con una preincubacion con ristocetina, y en sangre procedente de un paciente de la VWD de tipo 1 es de aproximadamente un 75%.
Figura 4:
La Figura 4 muestra que la relacion entre la amplitud maxima con una preincubacion con ristocetina y la amplitud maxima sin una preincubacion con ristocetina proporciona un parametro diagnostico para diferenciar entre individuos sanos y pacientes que padecen la VWD. El descenso de la amplitud maxima es una funcion de la concentracion de ristocetina tal como se observa en la figura 3 y la figura 2.
Figura 5:
La Figura 5 muestra la relacion entre la amplitud maxima para miembros de una familia en la que todos padecen la VWD de tipo 1. Los pacientes muestran una gran variacion en su manifestacion clmica que se correlaciona con la relacion observada entre las amplitudes.
Figura 6:
La Figura 6 muestra la normalizacion de la relacion entre las amplitudes maximas ([(amplitud maxima en una muestra sangumea procedente de un donante con ristocetina anadida)/(amplitud maxima en una muestra sangumea sin ristocetina anadida)]*100) despues de anadir Haemate (0.5 U/mL) in vitro a la sangre con citrato de un paciente de la VWD de tipo 3.
Figura 7:
La Figura 7 muestra el aumento de la actividad del cofactor ristocetina y de VWF:Ag y el correspondiente descenso de la relacion entre las amplitudes maximas ([(amplitud maxima en una muestra sangumea procedente de un donante con ristocetina anadida)/(amplitud maxima en una muestra sangumea sin ristocetina anadida)]*100) despues de la administracion de DDAVp a tres pacientes de la VWD de tipo 1 (pac. 1 a pac. 3) en tres puntos temporales (antes, 30 min despues y 180 min despues de la administracion de DDAVP).
Figura 8:
La Figura 8 muestra la relacion entre las amplitudes maximas ([(amplitud maxima en una muestra sangumea procedente de un donante con ristocetina anadida)/(amplitud maxima en una muestra sangumea sin ristocetina anadida)]*100), la actividad del cofactor ristocetina y VWF-Ag antes y despues de la administracion de un concentrado del VWF a un paciente de la VWD de tipo 2 antes y despues de la sustitucion con un concentrado del VWF (33 U/kg de Haemate®).
Figura 9:
La Figura 9 presenta muestras en las que se determino que la relacion entre las amplitudes maximas era igual o superior a un 15% ([(amplitud maxima en una muestra sangumea procedente de un donante con ristocetina anadida)/(amplitud maxima en una muestra sangumea sin ristocetina anadida)]*100 > 15%). Los pacientes se clasificaron en tres grupos de acuerdo con la clasificacion del laboratorio de referencia (grupo 1: pacientes con la VWD (1: VWD de tipo 1, 2: VWD de tipo 2, 3: VWD de tipo 3, M: fenotipo moderado de la VWD de tipo 1, grupo 2: O: pacientes con otros trastornos hemorragicos clasificados, grupo 3: pacientes sin la VWD, N: sin la VWD, E: VWD equvoca)).
Figura 10:
La Figura 10 presenta muestras en las que se determino que la relacion entre las amplitudes maximas era inferior a un 15% ([(amplitud maxima en una muestra sangumea procedente de un donante con ristocetina anadida)/(amplitud maxima en una muestra sangumea sin ristocetina anadida)]*100 < 15%). Los pacientes se clasificaron en tres grupos de acuerdo con la clasificacion del laboratorio de referencia (grupo 1: pacientes con la VWD (1: VWD de tipo 1, 2: VWD de tipo 2, 3: VWD de tipo 3, M: fenotipo moderado de la VWD de tipo 1, grupo 2: O: pacientes con otros trastornos hemorragicos clasificados, grupo 3: pacientes sin la VWD, N: sin la VWD, E: VWD equvoca)).
Compendio de la invencion
La invencion se refiere a un metodo in vitro para diagnosticar la enfermedad de von Willebrand y el riesgo hemorragico asociado con la enfermedad de von Willebrand y los trastornos de la funcion trombocftica. El metodo es adecuado para su uso como un metodo de cribado con sangre entera y tiene el beneficio adicional de ser adecuada como una prueba de diagnostico inmediato. El metodo de la invencion es superior para predecir el riesgo hemorragico en comparacion con los metodos diagnosticos conocidos como el recuento de trombocitos, el tiempo
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activado de tromboplastina parcial y el tiempo de hemorragia.
Descripcion detallada de la invencion
La invencion se refiere a la medida de los cambios viscoelasticos y a la comparacion de la cantidad de cambios viscoelasticos en muestras sangumeas despues de inducir la coagulacion. La cantidad total del cambio viscoelastico en una muestra procedente de una persona sana despues de inducir la coagulacion se debe en parte de la reticula de fibrina que se forma despues de inducir la coagulacion plasmatica y en parte de la agregacion de los trombocitos activados (que son activados durante la coagulacion por la trombina), el VWF y la reticula de fibrina.
La idea central de la invencion es que la incubacion de una muestra sangumea procedente de un donante sano que comprende trombocitos y el VWF con un activador de la agregacion de trombocitos antes de la coagulacion plasmatica proporciona suficiente trombina y fibrina para unir entre sf los trombocitos en la muestra lo que provocara una preagregacion casi completa de los trombocitos. Sin embargo, esta preagregacion tiene como prerrequisito que la interaccion entre el VWF y los trombocitos sea normal, lo que significa que el donante no tiene un mayor riesgo hemorragico.
Debido a que los trombocitos preagregados no contribuyen a la cantidad total de cambio viscoelastico de manera similar a los trombocitos no preagregados, si entonces se induce la coagulacion en la muestra en la cual los trombocitos se han preagregado y se genera la reticula de fibrina, se observa unicamente una cantidad reducida de cambio viscoelastico en comparacion con la cantidad de cambio viscoelastico en una muestra que no se ha incubado con un activador de la agregacion de trombocitos. Esta cantidad menor de cambio viscoelastico en la muestra que se ha incubado con un activador de la agregacion de trombocitos se comparara despues con un valor de referencia o con la cantidad de cambio viscoelastico en una muestra similar procedente del mismo donante que no se ha incubado con un activador de la agregacion de trombocitos. Una diferencia grande entre ambas cantidades de cambios viscoelasticos da lugar a un diagnostico segun el cual el donante no presenta un aumento de riesgo hemorragico.
Por el contrario, en una muestra procedente de un donante con un mayor riesgo hemorragico debido a una interaccion comprometida entre el VWF y los trombocitos, la preagregacion de los trombocitos y el VWF tambien se ve comprometida y tiene lugar en menor grado o no tiene lugar en comparacion con una muestra procedente de un donante sano. Cuando entonces se inicia la coagulacion (ya que la preagregacion no tuvo lugar o tuvo lugar en menor grado) los trombocitos aun pueden contribuir a la cantidad total de cambio viscoelastico. Por lo tanto, en una muestra procedente de un donante con un mayor riesgo hemorragico, se mide una cantidad de cambio viscoelastico normal, grande despues de inducir la coagulacion tambien en una muestra que se ha incubado con un activador de la agregacion de trombocitos. Esta cantidad de cambio viscoelastico normal, grande en la muestra que se ha incubado con un activador de la agregacion de trombocitos se comparara entonces con un valor de referencia o con la cantidad de cambio viscoelastico en una muestra similar procedente del mismo donante que no se ha incubado con un activador de la agregacion de trombocitos. La diferencia pequena entre ambas cantidades de cambio viscoelastico da lugar a un diagnostico segun el cual el donante presenta un aumento de riesgo hemorragico.
A modo de ejemplo no limitante, los valores de referencia se pueden determinar en donantes sanos sin un riesgo hemorragico mas elevado, determinando la cantidad de cambio viscoelastico despues de inducir la coagulacion ya sea i) incubando con un activador de la agregacion de trombocitos (=REFH+) o ii) no incubando con un activador de la agregacion de trombocitos (=REFH-).
Por ejemplo, los valores de referencia tambien pueden determinarse utilizando muestras de donantes que proceden de donantes con un mayor riesgo hemorragico.
Dependiendo de como se determine el valor de referencia, la interpretacion sera diferente tal como se muestra en la Tabla 1 para muestras de referencia generadas a partir de donantes sin un mayor riesgo hemorragico (REFH+ o REFH-).
Tabla 1: Efecto de la adicion de un activador de la agregacion de trombocitos en el cambio viscoelastico dependiendo del riesgo hemorragico de un donante de acuerdo con el metodo de la presente invencion
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- Muestra
- Incubacion con un activador de la agregacion de trombocitos Cantidad de cambio viscoelastico medida en la muestra del donante despues de inducir la coagulacion Diferencia de la cantidad de cambio viscoelastico entre una muestra del donante con activador de la agregacion de trombocitos anadido (valor A o valor C) y i) muestra del donante sin activador de la agregacion de trombocitos anadido (valor B o valor D) o ii) referencia REFH- Diferencia de la cantidad de cambio viscoelastico entre una muestra del donante con activador de la agregacion de trombocitos anadido (valor A o valor C) y iii) referencia REFH+ Diagnostico del riesgo hemorragico
- Donante 1
- Si Pequena (= valor A) Grande (= valor A respecto al valor B o a la referencia REFH-) Pequena (= valor A respecto a la referencia REFH+) Sin mayor riesgo hermorragico en el donante
- No
- Grande (= valor B)
- Donante 2
- Si Grande (= valor C) Pequena (=valor C respecto al valor D o a la referencia REFH-) Grande (= valor C respecto a la referencia REFH+) Mayor riesgo hemorragico en el donante
- No
- Grande (=valor D)
Por lo tanto, un aspecto de la invencion es un metodo diagnostico in vitro para determinar defectos cualitativos y/o cuantitativos del factor de von Willebrand caracterizado por
a) utilizar una muestra obtenida a partir de un individuo humano o un animal que comprende un fluido corporal que comprende trombocitos y factores hemostaticos,
b) incubar al menos una parte de la muestra con un activador de la agregacion de trombocitos, donde el activador de la agregacion de trombocitos es un compuesto que es capaz de inducir la activacion, agregacion y aglutinacion de trombocitos dependientes del VWF en un fluido obtenido a partir del cuerpo humano que contiene trombocitos y el VWF provocando la union del VWF al receptor del VWF en los trombocitos,
c) inducir la coagulacion en la parte de la muestra que se ha incubado con un activador de la agregacion de trombocitos,
d) medir el cambio viscoelastico que ocurre despues de inducir la coagulacion en la parte de la muestra que se ha incubado con un activador de la agregacion de trombocitos en un tromboelastografo, y
e) comparar la cantidad de cambio viscoelastico determinado en el paso (d) con un valor de referencia, donde el valor de referencia se obtiene:
i) dividiendo la muestra original del donante obtenida en el paso (a) en al menos dos muestras u obtener en el paso (a) al menos dos muestras a partir de un donante donde en al menos una muestra unicamente se llevan a cabo el paso (a) y los pasos (c) a (e) y se omite el paso (b) y donde la cantidad de cambio viscoelastico medida en la muestra en la cual se ha omitido el paso (b) del metodo de la reivindicacion 1 es el valor de referencia; o
ii) aplicando un metodo que comprende el paso (a) y los pasos (c) a (e) a una muestra procedente de un donante sano o a varias muestras procedentes de donantes sanos sin un mayor riesgo hemorragico, donde la cantidad de cambio viscoelastico medida en la muestra o en las muestras en las que se omitio el paso (b)
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es el valor de referencia; o
iii) aplicando un metodo que comprende los pasos (a) a (e) a una muestra procedente de un donante sano o a varias muestras procedentes de donantes sanos sin un mayor riesgo hemorragico donde la cantidad de cambio viscoelastico medida en la muestra o en las muestras es el valor de referencia.
Por lo tanto, en una muestra procedente de un paciente del VWF de tipo 1, la cantidad de cambio viscoelastico segun se determina en el paso (d) es menor en comparacion con la cantidad de cambio viscoelastico que se mide si se aplica el mismo metodo a otra muestra obtenida de la misma manera que en el paso (a) a partir del mismo paciente del VWF de tipo 1 pero a la que no se ha anadido activador de la agregacion de trombocitos.
Una diferencia grande entre i) la cantidad de cambio viscoelastico medida en una muestra que se ha incubado con un activador de la agregacion de trombocitos y ii) la cantidad de cambio viscoelastico de una muestra de referencia que no se ha incubado con un activador de la agregacion de trombocitos da lugar a un diagnostico en el que el donante de la muestra no presenta un aumento de riesgo hemorragico;
mientras que una diferencia reducida entre i) la cantidad de cambio viscoelastico medida en una muestra que se ha incubado con un activador de la agregacion de trombocitos y ii) la cantidad de cambio viscoelastico de una muestra de referencia que no se ha incubado con un activador de la agregacion de trombocitos da lugar a un diagnostico en el que el donante presenta un mayor riesgo hemorragico.
Una diferencia pequena entre i) la cantidad de cambio viscoelastico medida en una muestra que se ha incubado con un activador de la agregacion de trombocitos y ii) la cantidad de cambio viscoelastico de la muestra de referencia que tambien se ha incubado con un activador de la agregacion de trombocitos da lugar a un diagnostico en el que el donante de la muestra no presenta un aumento de riesgo hemorragico;
mientras que una diferencia grande entre i) la cantidad de cambio viscoelastico medida en una muestra que se ha incubado con un activador de la agregacion de trombocitos y ii) la cantidad de cambio viscoelastico de la muestra de referencia que tambien se ha incubado con un activador de la agregacion de trombocitos da lugar a un diagnostico en el que el donante presenta un mayor riesgo hemorragico.
Preferentemente, el paso (b) del metodo anterior se lleva a cabo antes del paso (c) del metodo anterior.
Opcionalmente, se puede anadir un activador de la coagulacion cuando se lleva a cabo el metodo de la invencion. Preferentemente el activador de la coagulacion se anade antes o despues de la adicion de un activador de la agregacion de trombocitos en el paso b) pero antes de inducir la coagulacion en el paso c).
A diferencia del metodo divulgado en el documento US 5 951 951, el metodo de la invencion no requiere la adicion de un anticoagulante. Por lo tanto, en una realizacion preferida de la invencion, no se anade anticoagulante a la muestra.
El fluido corporal original puede estar diluido y su composicion puede cambiar siempre y cuando todavfa comprenda trombocitos y factores hemostaticos.
Preferentemente, en el paso e) del metodo se determina la relacion entre la cantidad de cambio viscoelastico de la muestra que se ha incubado con un activador de la agregacion de trombocitos y el valor de referencia tal como se ha detallado anteriormente.
Se pueden utilizar multiples parametros que pueden ser determinados mediante la TEG y que evaluan los cambios viscoelasticos para llevar a cabo el metodo de la invencion, tal como la determinacion de la amplitud maxima (MA), el area bajo la curva, la velocidad a la cual se forma el coagulo (angulo alfa), la amplitud en puntos temporales definidos, parametros de derivacion. Se prefiere determinar el area o la amplitud maxima en el paso e) del metodo de la invencion en ambas partes de la muestra original y se prefiere aun mas determinar la relacion entre las amplitudes maximas o las areas bajo la curva de ambas partes de la muestra en el paso (f).
El “cambio viscoelastico” en el sentido de la invencion es cualquier cambio de la viscosidad y la elasticidad de cizalladura de la muestra durante el proceso de coagulacion y la formacion del coagulo.
La “cantidad de cambio viscoelastico” en el sentido de la invencion es la diferencia entre la viscosidad de la muestra antes de la induccion de la coagulacion y despues de un cierto punto temporal despues de haber inducido la coagulacion. El punto temporal preferido para medir la cantidad de cambio viscoelastico puede variar y depende tambien del parametro que de hecho se este midiendo.
El “activador de la agregacion de trombocitos” en el sentido de la invencion es cualquier composicion de materia o cualquier compuesto que es capaz de inducir la activacion, agregacion y aglutinacion de trombocitos dependiente del VWF en un fluido obtenido a partir del cuerpo humano que contiene trombocitos y el VWF al hacer que el VWF se una a los receptores del VWF en los trombocitos. Los activadores preferidos de la agregacion de trombocitos son
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la ristocetina y la botrocetina. El activador mas preferido de la agregacion de trombocitos es la ristocetina.
“Incubar” con un activador de la agregacion de trombocitos en el sentido de la invencion es anadir el activador de la agregacion de trombocitos a una muestra que comprende trombocitos y el VWF durante al menos 0.1 min, preferentemente durante al menos 1 min, de la manera mas preferida durante al menos 5 min.
Los “factores hemostaticos” en el sentido de la invencion son un grupo de factores de coagulacion que incluyen componentes de la cascada de coagulacion intrmseca y extrmseca, la trombina y el fibrinogeno que generan fibrina a partir del fibrinogeno una vez que se ha activado la coagulacion.
“Inducir la coagulacion” en el sentido de la invencion se refiere a cualquier manera de desencadenar o activar el sistema de coagulacion dependiendo del tipo de la muestra y del anticoagulante utilizado que comprende la recalcificacion, adicion de antagonistas de anticoagulantes anadidos o de cualesquiera sustancias diferentes que conllevan la generacion de fibrina a partir del fibrinogeno. En sangre entera no tratada, la coagulacion puede haberse inducido previamente por el contacto con superficies como, por ejemplo, la superficie de la copa en la que se incuba la sangre. Si se utiliza sangre con citrato o plasma rico en trombocitos, la coagulacion se puede inducir mediante la adicion de calcio. En el caso de sangre con heparina o plasma rico en trombocitos, la coagulacion se puede inducir mediante la adicion de heparinasa.
Preferentemente, se anade un activador de la agregacion de trombocitos antes de inducir la agregacion. Sin embargo, la invencion tambien se puede llevar a la practica induciendo simultaneamente la coagulacion y la adicion de un activador de la agregacion de trombocitos. Una realizacion menos preferida pero que es todavfa una realizacion factible de la invencion comprende anadir el activador de la agregacion de trombocitos despues de haber inducido la coagulacion.
Los “activadores de la coagulacion” en el sentido de la invencion son sustancias que activan uno o mas factores de coagulacion pero que por sf solos no conllevan la generacion de fibrina en el fluido respectivo que comprende un fluido corporal que comprende trombocitos y factores hemostaticos. Una preincubacion con tales activadores antes de inducir de hecho la coagulacion ofrece ventajas significativas tales como la reduccion de los tiempos de reaccion mediante la activacion controlada frente a unicamente una activacion por contacto superficial y una mejor precision. Un activador preferido de la coagulacion es el caolrn. Ademas, proporciona la posibilidad de obtener informacion diagnostica diferencial adicional.
Preferentemente, se anade un activador de la coagulacion antes de inducir la coagulacion.
Si en la muestra esta presente el VWF funcional y la funcion trombocftica es normal, la adicion de un activador de la agregacion de trombocitos antes, durante o despues de inducir el proceso de coagulacion conlleva la agregacion de trombocitos y la activacion de trombocitos. Estos trombocitos preagregados muestran una interaccion diferente con la fibrina que se forma a partir del fibrinogeno en la formacion del coagulo una vez que se induce la coagulacion. Esto conlleva a un cambio muy reducido de la viscoeslasticidad en la muestra en comparacion con una muestra a la cual no se ha anadido activador de la agregacion de trombocitos. En tales muestras procedentes de individuos sanos, se mide, por ejemplo, una MA grande en una TEG sin un activador anadido o agregacion de trombocitos, pero una MA pequena si se ha anadido un activador de la agregacion de trombocitos.
En cambio, si en la muestra esta presente el VWF con defectos cuantitativos o cualitativos, menos trombocitos, o ninguno, se agregan una vez que se ha anadido un activador de la agregacion de trombocitos. Por lo tanto, cuando se induce la coagulacion, siguen estando disponibles mas trombocitos, o todos, que aun no se han agregado y que todavfa pueden interaccionar con la fibrina que se forma durante el proceso de coagulacion. Por lo tanto, el defecto cualitativo o cuantitativo del VWF puede determinarse, por ejemplo, mediante una MA grande en una TEG si se ha anadido un activador de la agregacion de trombocitos.
El metodo de la presente invencion tambien es capaz de diferenciar entre diferentes tipos de la VWD. Por ejemplo, tal como se muestra en la Figura 3, cuando se lleva a cabo un analisis tromboelastografico de sangre normal, la amplitud maxima despues de una preincubacion con ristocetina alcanza unicamente aproximadamente un 20% de la amplitud maxima sin tal preincubacion con ristocetina. En sangre procedente de un paciente de la VWD de tipo 3, se alcanza una amplitud maxima de casi un 100% incluso con una preincubacion con ristocetina, y en sangre procedente de un paciente de la VWD de tipo 1, la amplitud maxima se reduce hasta aproximadamente un 75%.
La adicion de activadores de la agregacion de trombocitos y la posterior union de los complejos activador-VWF a los trombocitos conlleva la agregacion de los trombocitos y tambien su activacion. Esta activacion depende de la union de los complejos del VWF a sus correspondientes receptores en los trombocitos. Asf pues, la respuesta a dichos activadores de la agregacion de trombocitos tambien se ve afectada por la ausencia de los correspondientes receptores de trombocitos o una funcion trombocftica deficiente. Por lo tanto, por ejemplo, una MA grande en una TEG despues de tratar la muestra con un activador de la agregacion de trombocitos tambien puede estar causada por defectos en los trombocitos que conllevan una agregacion de trombocitos dependiente del VWF deficiente como,
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p. ej., en el caso del smdrome de Bernard Soulier.
Si se determina un cambio grande en la viscoelasticidad, como una MA grande en una TEG, llevando a la practica el metodo de la invencion, un diagnostico de los defectos cualitativos o cuantitativos del VWF o una agregacion de trombocitos dependiente del VWF deficiente puede basarse en a) la comparacion del cambio grande en la viscoelasticidad haciendo referencia a un valor basado en un cambio predeterminado de viscoelasticidad en muestras de individuos sanos o b) por comparacion con una parte de referencia de la muestra original que no se ha incubado con un activador de la agregacion de trombocitos y en la cual tambien se ha inducido la coagulacion.
Por lo tanto, el metodo de la invencion ofrece una manera rapida de evaluar la ausencia o funcion deficiente del VWF y la disfuncion trombocftica relacionada con el factor VWF y esto ofrece un metodo rapido para diagnosticar la VWD y los trastornos de la funcion trombocftica que reducen la interaccion del VWF con los trombocitos. De manera aun mas sorprendente se observo que la prueba es capaz de determinar que pacientes padecen enfermedades por defecto del almacenamiento de trombocitos y disfibrinogenemia. El metodo de la invencion es adecuado como analisis de cabecera lo que obvia la necesidad de otros metodos diagnosticos que requieren mucho mas tiempo. Otra ventaja del metodo de la invencion es que elimina la necesidad de pasos de centrifugacion que requieren mucho tiempo. La prueba se puede realizar con volumenes de sangre de tan solo 105 jL, lo que supone una enorme ventaja, especialmente para diagnosticar recien nacidos y pacientes pediatricos.
Una prueba de este tipo es especialmente util cuando es necesario determinar un riesgo hemorragico debido a la deficiencia del VWF o trastornos de la funcion trombocftica, como el smdrome de Bernard Soulier, cuando los resultados se necesitan rapidamente como, por ejemplo, en un contexto pre- y perioperativo. Existe constancia de varios trastornos y enfermedades asociadas, asf como tambien varios farmacos, que afectan a la funcion trombocftica.
Al igual que el cambio en la viscoelasticidad, segun esta ejemplificado en un tromboelastograma, refleja el estado global del sistema coagulante y fibrinolftico en un donante concreto, las deficiencias congenitas en ciertos factores de coagulacion, como en la hemofilia A o hemofilia B, la disminucion de factores de coagulacion como el fibrinogeno, como en el traumatismo o en la hemorragia quirurgica, o la intervencion farmacologica, como el tratamiento con cumarina, tambien estaran reflejadas en ciertos patrones caractensticos del cambio en la viscoelasticidad o el tromboelastograma (Luddington, Clin. Lab. Haem. (2005) 27, 81-90) que el experto en la tecnica sera capaz de interpretar. Asf pues, el uso del metodo de acuerdo con la presente invencion no solamente hace posible el diagnostico de un mayor riesgo hemorragico debido a receptores de trombocitos o al VWF deficientes que reducen la interaccion del VWF con los trombocitos, sino que tambien hace posible el diagnostico simultaneo de otras anomaftas del sistema coagulante o fibrinolftico.
Por lo tanto, la puesta en practica del metodo de acuerdo con la presente invencion tambien permite diagnosticar la hiperfibrinolisis, la coaguiopatfa multifactorial debida a la perdida de sangre, la hemorragia debida al uso de anticoagulantes, el estado hipocoagulante asociado con el traumatismo, el estado hipocoagulante asociado con el embarazo, la coagulacion intravascular diseminada, la trombocitopenia, los trastornos hemorragicos congenitos que ocasionan la carencia de factores de coagulacion funcionales como el FVIII, FIX, FXIII y el fibrinogeno, enfermedades por defecto de almacenamiento de trombocitos y disfibrinogenemia.
El uso de reactivos y kits adecuados para evaluar la enfermedad de von Willebrand y el riesgo hemorragico asociado con la enfermedad de von Willebrand y los defectos en la funcion trombocftica congenitos o adquiridos determinando los cambios viscoelasticos tambien es parte de la presente invencion.
De manera sumamente sorprendente, se descubrio que incluso en casos en los que el diagnostico convencional del VWF no es capaz de diagnosticar un riesgo hemorragico diferencial entre diferentes pacientes, el metodo de la invencion tal como se muestra en el Ejemplo 4 (a) predice la propension hemorragica en un paciente concreto de una manera mas predictiva que los metodos conocidos. Tal como se muestra en el Ejemplo 4 (b), los individuos de los que se habfa diagnosticado erroneamente que padedan la VWD (probablemente debido a la perdida de mulftmeros de la VWD durante el almacenamiento y el transporte, lo que es un fenomeno comun), con el metodo diagnostico in vitro de la invencion se diagnostico correctamente que estaban sanos y no presentaban un mayor riesgo hemorragico. Por lo tanto, el metodo de la invencion es, al menos en algunos casos, mas fiable y robusto que los metodos convencionales de diagnostico de la VWD.
Tambien se podna mostrar (Ejemplo 5) que el metodo de la invencion se puede utilizar para monitorizar el exito o el fracaso de diferentes pautas terapeuticas como la administracion de DDAVP o pacientes de la VWD o la hemofilia A o la administracion de concentrados del VWF a pacientes de la VWD o la hemofilia A.
Tal vez uno de los rasgos mas intrigantes del metodo de la invencion es que no solamente ofrece un metodo de prueba sensible y especftico para diagnosticar la VWD y/o defectos trombocfticos que podnan afectar a la union del VWF a los trombocitos, sino que ademas identifica pacientes con un mayor riesgo hemorragico, donde dicho riesgo se debe a veces a causas adicionales con una patogenesis un tanto confusa.
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Esto podna deberse al hecho de que el metodo de la invencion determina el riesgo hemorragico de un individuo con sangre entera, donde los componentes plasmaticos y celulares del sistema coagulante estan presentes y no han sido separados artificialmente como es el caso en muchos otros sistemas de prueba de la coagulacion.
Por lo tanto, el metodo de la invencion es un metodo rapido para predecir de manera fiable un riesgo hemorragico en un individuo concreto y tambien restringe las posibles causas de tal riesgo hemorragico.
El metodo de la invencion se lleva a cabo preferentemente tal como se describe en los ejemplos.
Un fluido que comprende trombocitos y factores hemostaticos, como la sangre entera o sangre anticoagulada (por ejemplo, sangre con citrato o plasma rico en trombocitos con citrato o sangre con heparina o plasma rico en trombocitos con heparina) procedente de un paciente se transfiere a un vial que contiene opcionalmente un agente estandarizado que actua como un activador de la coagulacion, p. ej., caolm o factor tisular, pero sin de hecho inducir la coagulacion en este momento temporal.
Preferentemente, los componentes se mezclan por inversion y, opcionalmente, se dividen en al menos dos alfcuotas. Se anade una cantidad de un activador de la agregacion de trombocitos a una de las alfcuotas. Si se utiliza ristocetina, la concentracion final esta comprendida preferentemente entre 0.01 y 100 mg/mL mas preferentemente entre 0.1 y 3 mg/mL o incluso mas preferentemente entre 0.3 mg/mL y 1.5 mg/mL.
Las alfcuotas se incuban preferentemente durante 0-360 min a entre 10 y 37 °C, mas preferentemente 5 min a aproximadamente temperatura ambiente o 10 min a aproximadamente 37 °C, preferentemente, a la vez que se mezclan.
A continuacion, ambas alfcuotas se transfieren a un recipiente que permite la determinacion del cambio viscoelastico, p. ej., copas de ensayo de TEG.
Preferentemente, despues se induce la coagulacion, pero la coagulacion tambien puede inducirse simultaneamente o, de manera menos preferida, antes de la adicion de un activador de la agregacion de trombocitos.
El cambio viscoelastico se mide en ambas alfcuotas, si se utiliza la TEG para determinar el cambio viscoelastico, el ensayo se ejecuta preferentemente hasta que se alcanza la amplitud maxima.
La muestra opcional sin adicion de un activador de la agregacion de trombocitos como la ristocetina se utiliza como una medida de control.
Si la TEG es el ensayo con el que se determina el cambio viscoelastico, la activacion de trombocitos en respuesta al activador de la agregacion de trombocitos, por ejemplo, la ristocetina, se puede determinar, a modo de ejemplo no limitante, a partir de las amplitudes maximas en el control sin anadir activador de trombocitos (MA) y la muestra con el activador de trombocitos ristocetina anadido (MARistocetina): la cual se puede entonces expresar como la relacion (MARistocetina/MA)*100. Se determina el cambio porcentual para evaluar las respuestas de un sujeto individual, con el fin de proporcionar de esta manera una indicacion de la respuesta relativa a cierta dosis de ristocetina. Se observo que con una concentracion de ristocetina de 0.75 mg/mL, una relacion de un 15% es un valor de corte preferido para identificar pacientes que presentan un mayor riesgo hemorragico.
Si la relacion (MARistocetina/MA)*100 es igual o superior a un 15%, los pacientes presentan un mayor riesgo hemorragico y parecen la VWD u otra diatesis hemorragica y no debenan someterse a una cirugfa antes de un diagnostico adicional si una afeccion no potencialmente letal requiere cirugfa inmediata.
Si la relacion (MARistocetina/MA)*100 es inferior a un 15%, no existe un mayor riesgo hemorragico y los pacientes pueden someterse a cirugfa.
Se debe sobreentender que esta relacion de un 15% no es limitante y se utiliza unicamente como un ejemplo. Dependiendo de la tecnica para determinar el cambio viscoelastico, dependiendo del parametro individual medido, el experto en la tecnica puede determinar una relacion en funcion de las muestras, por ejemplo, a partir de pacientes con la VWD y a partir de pacientes sanos que diferencie los estados patologicos de los estados sanos.
Un objeto de la invencion es un metodo diagnostico in vitro donde un valor del (cambio viscoelastico en una muestra de un fluido corporal procedente de un donante con activador de la agregacion de trombocitos anadido)/(cambio viscoelastico en una muestra del mismo fluido corporal sin activador de la activacion de trombocitos anadido) igual o superior a 0.15 se interpreta que es un indicador de un riesgo hemorragico. El riesgo hemorragico puede deberse a la VWD pero tambien puede tener otras causas como se ha senalado anteriormente.
Los pacientes sin la VWD muestran un descenso significativo de la amplitud maxima despues de la incubacion con la ristocetina como se ha descrito en el ejemplo 2. Casi todos los trombocitos estan desactivados y no se detecta una contribucion adicional de los trombocitos a la fortaleza del coagulo despues de la induccion posterior de la coagulacion. Por el contrario, para los pacientes con la VWD la fortaleza del coagulo no esta afectada, o solo
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ligeramente, por la incubacion con la ristocetina.
Resumiendo, el metodo diagnostico in vitro de la invencion es especialmente adecuado como una prueba de cribado. Un resultado positivo en esta prueba de cribado inicial estara seguida, en la mayona de los casos, por pruebas de laboratorio mas espedficas como las pruebas de determinacion de multimeros del VWF o de la funcion 5 trombocftica, etc.
Ejemplos:
Ejemplo 1:
Se transfirio sangre estabilizada con citrato procedente de un paciente sano a un vial que contema un reactivo de caolm estandarizado y se mezclo por inversion. El reactivo de caolm se adquirio de Haemoscope Corporation. La 10 mezcla se mezclo bien y se dividio en dos almuotas de 500 pL. Se anadieron diferentes cantidades de ristocetina con una concentracion de 15 mg mL-1 a una parte de las almuotas de sangre activada y ambas muestras se incubaron en un mezclador durante 10 min. Las copas de ensayo de la TEG se rellenaron con 300 pL de ambas almuotas y se anadieron 20 pL de CaCl2 0.2 M. Se permitio la ejecucion de los rastreos de la TEG al menos hasta que se alcanzo la amplitud maxima utilizando un analizador Rotem. La figura 2 muestra cuatro patrones de la TEG 15 distintos obtenidos. Dependiendo de la concentracion de ristocetina final, se observaron un descenso de la amplitud maxima y un aumento del tiempo de coagulacion.
Ejemplo 2:
El analizador y los reactivos procedieron de Haemoscope Corporation. Se recogieron 1.3 mL de sangre en citrato de trisodio al 3.18% (relacion 1:9 entre el anticoagulante y la sangre). Se transfirio un mililitro de sangre estabilizada con 20 citrato a un vial que contema un reactivo de caolm estandarizado y se mezclo por inversion. La mezcla se mezclo
bien y se dividio en dos almuotas de 500 pL. Se anadieron 25 pL de ristocetina con una concentracion de 15 mg mL- 1 a una parte de las almuotas de sangre activada y ambas muestras se incubaron en un mezclador durante 10 min. Las copas de ensayo de la TEG se rellenaron con 360 pL de ambas almuotas y se anadieron 20 pL de CaCl2 0.2 M. Se permitio la ejecucion de los rastreos de la TEG al menos hasta que se alcanzo la amplitud maxima. La figura 3 25 muestra tres patrones de la TEG distintos obtenidos. La fig. 1 a muestra los perfiles de la TEG de una persona sana
normal y la figura 1 b y la 1c muestran los perfiles de la TEG de pacientes con la VWD de tipo 3 y de tipo 1.
Ejemplo 3:
De acuerdo con el procedimiento del ejemplo 2, se realizaron pruebas con muestras sangumeas procedentes de pacientes sanos y procedentes de pacientes con la VWD. Todas las muestras de la VWD se obtuvieron a partir de 30 pacientes de los que se habfa diagnosticado que padedan la VWD utilizando criterios estandar. Ademas del plasma de la VWD, tambien se recogieron varias muestras normales y se utilizaron para los estudios comparativos. La activacion de los trombocitos en respuesta a la ristocetina se determino a partir de las amplitudes maximas en el trazado del control (MA) y en la activacion con ristocetina (MARistocetina):MARicocetina/MA*100. Se calculo el cambio porcentual para evaluar las respuestas de un sujeto individual, para proporcionar de esta manera una indicacion de 35 la respuesta relativa a cierta dosis de ristocetina (concentracion final de 0.71 mg/mL y 1.05 mg/mL). La muestra inducida con caolm sin anadir ristocetina actuo como la medida de control. Los pacientes sin la VWD muestran un descenso significativo de la amplitud maxima despues de la incubacion con la ristocetina tal como se ha descrito en el ejemplo 2. Casi todos los trombocitos estan desactivados y no se detecta una contribucion adicional de los trombocitos a la fortaleza del coagulo. Por el contrario, para los pacientes con la VWD la fortaleza del coagulo no 40 esta afectada, o solo ligeramente, por la incubacion con la ristocetina.
Ejemplo 4:
a) El diagnostico de la VWD sigue siendo problematico y esto es particularmente cierto para la VWD de tipo 1. Muchos de estos sujetos no muestran las manifestaciones hemorragicas y, por tanto, no son reconocidos. Los estudios de los miembros de las familias muestran que existe una penetrancia y una expresividad 45 variables de la enfermedad. La variabilidad tanto de las manifestaciones hemorragicas como de los
resultados de los laboratorios entre miembros afectados de una familia indica una penetrancia y una expresividad variables de las mutaciones de la VWD (Miller CH, Graham JB, Goldin LR, Elston RC. Genetics of classic von Willebrand disease. I. Phenotypic variation within families. Blood 1979: 54: 117-36).
Los autores investigaron cuatro miembros de una familia que estaban todos ellos afectados con la VWD de 50 tipo 1. Para cada individuo se obtuvieron los antecedentes familiares y hemorragicos detallados mediante
una entrevista personal. Los pacientes mostraron diferentes patrones tromboelastograficos (TEG) que se correlacionan con sus presentaciones clmicas. El paciente H que presenta la relacion mas elevada muestra meno-metrorragia, hemorragia despues de una extraccion dental y smtomas hemorragicos cutaneos. Por el contrario, hasta la fecha no se han comunicado manifestaciones hemorragicas para los otros tres
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Por lo tanto, el metodo diagnostico de la invencion fue superior a los ensayos diagnosticos clasicos para predecir el riesgo hemorragico de un miembro H de la familia. No se observo correlacion para las pruebas de cribado de la coagulacion tiempo de protrombina y tiempo activado de tromboplastina parcial.
b) Muchas variables preanaltticas provocan problemas sustanciales para la identificacion de la VWD. Ademas, el VWF y en particular el VWF de peso molecular elevado, es muy sensible a los artefactos de recogida y transporte. Un transporte a baja temperatura y/o el almacenamiento de plasma con citrato de sodio dara lugar a la perdida de HMW VWF (siglas en ingles de factor de von Willebrand de peso molecular elevado) en un subconjunto de muestras. En estos casos, podra ocurrir una identificacion erronea o una conclusion falsa de la VWD cuando los resultados de las pruebas de laboratorio se acepten sin una confirmacion repetida.
Sorprendentemente, en 103 muestras con las que se realizaron pruebas, los autores observaron que el metodo diagnostico in vitro de la invencion detectaba correctamente la ausencia de la VWD en dos casos en los que un diagnostico convencional basado en la determinacion del multimero dio lugar a la clasificacion erronea en la que los pacientes teman la VWD. Ambos pacientes fueron clasificados de acuerdo con el diagnostico convencional basado en el patron del multfmero como tipo 2A, mientras que el metodo diagnostico in vitro de la invencion no identifico signos de un riesgo hemorragico/VWD ya que las relaciones de la TEG estaban en el intervalo normal. Posteriormente, se realizaron pruebas de nuevo con una segunda muestra de los pacientes y en ese momento no mostro anomalfas en el patron del multimero.
Ejemplo 5:
a) Control de la terapia in vitro (concentrado del VWF)
Se incubo sangre con citrato de un paciente con la VWD de tipo 3 con diferentes cantidades de haemate, un concentrado comercial del VWF para la terapia de sustitucion. La mezcla se mezclo bien y se dividio en dos almuotas de 500 pL. Se anadieron 25 pL de ristocetina con una concentracion de 15 mg mL-1 a una parte de las almuotas de sangre activada y ambas muestras se incubaron en un mezclador durante 10 min. Se anadieron 300 pL de ambas almuotas a las copas de ensayo de la TEG de un analizador ROTEM® que conteman 20 pL de reactivo star-TEM para la recalcificacion y 20 pL del reactivo exTEM. El factor tisular anadido desencadena la cascada de coagulacion extrmseca. Se utilizo un analizador ROTEM® para registrar los trazados de la TEG al menos hasta alcanzar la amplitud maxima. Tal como se muestra en la figura 6, la relacion esta normalizada y no es significativamente diferente entre pacientes sanos despues de anadir Haemate in vitro.
b. ) Control de la terapia in vivo (DDAVP)
En la VWD la terapia puede ser necesaria para aliviar un episodio hemorragico o para prevenir un episodio hemorragico. Por lo general, la mayona de los individuos con el tipo 1 de la VWD son tratados eficazmente utilizando DDAVP (siglas en ingles de acetato de desmopresina), que actua para liberar el VWF endogeno almacenado. Es habitual llevar a cabo un experimento con DDAVP y a continuacion monitorizar la respuesta mediante una posterior obtencion de muestras sangumeas y pruebas. Todos los pacientes tuvieron una relacion elevada entre las amplitudes antes de la administracion del DDAVP y el DDAVP fue capaz de normalizar la relacion de la TEG ([(amplitud maxima en una muestra sangumea procedente de un donante con ristocetina anadida)/(amplitud maxima en una muestra sangumea sin ristocetina anadida)]*100). El metodo es una herramienta simple y rapida para discriminar los que responden de los que no responden al DDAVP. La ventaja de este metodo es el tiempo de prueba entre cercano e inmediato obtenido. El resultado esta disponible muy poco despues de la obtencion de muestras sangumeas. Por el contrario, el resultado VWF:CB se obtiene, por lo general, algunos dfas despues de la obtencion de muestras sangumeas. Los valores para la relacion entre las amplitudes, el VWF:Ag y el VWF:RCo se muestran en la figura 7 para tres puntos temporales (antes, 30 min despues y 180 min despues de la administracion del DDAVP). Esto muestra que tambien se puede utilizar in vivo el metodo diagnostico in vitro de la invencion para monitorizar el exito de una intervencion terapeutica con el DDAVP para reducir un riesgo hemorragico debido a la VWD.
c. ) Control de la terapia in vivo (concentrado del VWF).
Los pacientes con una deficiencia entre moderada y grave del factor VIII y del factor de von Willebrand normalmente requieren tratamiento. Proporcionar el VWF normal a traves de la infusion de concentrados obtenidos a partir del plasma puede corregir la deficiencia del factor VIII y el VWF. Se realizaron ensayos de TEG con y sin una preincubacion con ristocetina antes y despues de la administracion. El efecto de la sustitucion del VWF se puede apreciar en el descenso significativo de la relacion entre las amplitudes maximas en la prueba de TEG ([(amplitud maxima en una muestra sangumea procedente de un donante con ristocetina anadida)/(amplitud maxima en una muestra sangumea sin ristocetina anadida)]*100) tal como se muestra en la figura 8. En consecuencia, los autores obtienen un aumento en los valores de la lmea base en plasma de VWF:Ag y actividad del VWF-cofactor de
ristocetina desde un 10% y un 11% respectivamente hasta un 139% y un 66% para ambas variables. Esto muestra que tambien se puede utilizar in vivo el metodo diagnostico in vitro de la invencion para monitorizar el exito de una intervencion terapeutica que sustituye el VWF para reducir un riesgo hemorragico debido a la VWD.
Ejemplo 6:
5 Los autores evaluaron el rendimiento de este ensayo y su utilidad para el diagnostico en el laboratorio de la VWD. En el estudio participaron 103 pacientes (58 mujeres, 45 hombres; edad mediana 11.9 ± 11.2). Se excluyeron del estudio los pacientes con trastornos hemofflicos preexistentes que pueden ser determinados por el ensayo INTEM. La clasificacion de la VWD fue realizada por un laboratorio de referencia basandose en el VWF:Ag, vWF:CB y patron del multfmero del VWF. En la figura 9 y 10 se muestran, para los tres subgrupos, los resultados de las relaciones 10 entre las amplitudes maximas ([(amplitud maxima en una muestra sangumea procedente de un donante con ristocetina anadida)/(amplitud maxima en una muestra sangumea sin ristocetina anadida)]*100).
- Clasificacion
- Numero
- VWD
- 21
- Tipo 3 1
- Tipo 2A 4
- Tipo 2B 2
- Tipo 1 3
- Fenotipo moderado de tipo 1 11
- Eqmvoca (no VWD pero en el lfmite) 17
- Normal (no VWD) 61
- Otra
- Defecto de la funcion trombocftica no clasificado 1
- Hemorragia abdominal 1
- Enfermedad por defecto del almacenamiento de trombocitos 1
- Disfibrinogenemia
- Total
- 103
15
Tal como se representa en las figuras 9 y 10, el resultado fue el siguiente:
a) relacion de la TEG < 15%
^ 56 muestras procedentes de individuos sanos normales (xyz de ellos con un resultado diagnostico de VWD “eqmvoca”)
^ 1 muestra procedente de un paciente con la vWD de tipo 1 (fenotipo moderado)
b) relacion de la TEG > 15%
^ 1 muestra procedente de un paciente con la VWD de tipo 3
^ 4 muestras procedentes de pacientes con la VWD de tipo 2A
^ 2 muestras procedentes de pacientes con la VWD de tipo 2B
^ 3 muestras procedentes de pacientes con la VWD de tipo 1
^ 10 muestras procedentes de pacientes con la VWD de tipo 1 (fenotipo moderado)
^ 26 muestras procedentes de individuos sin la VWD
5
10
15
20
25
De acuerdo con un valor de corte de un 15% para la relacion de las amplitudes, la sensibilidad para detectar la VWD fue de un 95% ([(numero de verdaderos positivos/(numero de verdaderos positivos + numero de falsos negativos)]: 20/21 = 95.2%), la especificidad para la VWD fue de un 68% ([(numero de verdaderos negativos/(numero de verdaderos negativos + numero de falsos positivos)]: 56/82 = 68.3%).
Sin embargo, entre los 26 individuos que presentaban una relacion de la TEG > 15% pero que no fueron clasificados como VWD por el laboratorio de referencia, casi la mitad teman antecedentes clmicos que indicaban otros trastornos hemorragicos no caracterizados. Hasta el momento, los siguientes trastornos hemorragicos pudieron asignarse a:
^ un paciente tiene un defecto de la funcion trombodtica no clasificado con fuerte hemorragia gastrointestinal,
^ un paciente tiene fuerte hemorragia gastrointestinal provocada por un smdrome linfoproliferativo,
^ un paciente tiene una enfermedad por defecto del almacenamiento de trombocitos,
^ un paciente tiene una disfibrinogenemia,
^ cinco pacientes se clasifican como VWD equvoca
^ dos pacientes tienen episodios hemorragicos repetidos, epistaxis y tiempos hemorragicos prolongados
^ tres individuos tienen antecedentes familiares de graves episodios hemorragicos
De manera que se puede asumir que la especificidad y sensibilidad para los trastornos hemorragicos es mucho mas elevada.
Con respecto al diagnostico de una diatesis hemorragica, la sensibilidad parece ser de al menos un 95% (ya que el unico paciente con la VWD de tipo xyz que no se detecto puede que no hubiera mostrado un mayor riesgo hemorragico al ser examinado adicionalmente) y una especificidad potencial de un 82% (56/68 = 82.3%). Asimismo, la especificidad real podna ser incluso superior si, tras un examen adicional, resultara que los 15 individuos restantes que son “falsos positivos”, tienen un mayor riesgo hemorragico.
Por lo tanto, el metodo diagnostico in vitro de la invencion es adecuado para detectar no solamente riesgos hemorragicos asociados con la VWD o enfermedades trombodticas que afectan a la interaccion del VWF con los trombocitos, sino que es una prueba general adecuada para detectar riesgos hemorragicos.
Claims (14)
- 51015202530354045REIVINDICACIONES1. El metodo diagnostico in vitro para determinar defectos cuantitativos o cualitativos del factor de von Willebrand caracterizado por:a) utilizar una muestra obtenida a partir de un individuo humano o un animal que comprende un fluido corporal que comprende trombocitos y factores hemostaticos,b) incubar al menos una parte de la muestra con un activador de la agregacion de trombocitos, donde el activador de la agregacion de trombocitos es un compuesto que es capaz de inducir la activacion, agregacion y aglutinacion de trombocitos dependientes del VWF en un fluido obtenido a partir del cuerpo humano que contiene trombocitos y el VWF provocando la union del VWF al receptor del VWF en los trombocitos,c) inducir la coagulacion en la parte de la muestra que se ha incubado con un activador de la agregacion de trombocitos,d) medir el cambio viscoelastico que ocurre despues de inducir la coagulacion en la parte de la muestra que se ha incubado con un activador de la agregacion de trombocitos en un tromboelastografo, ye) comparar la cantidad de cambio viscoelastico determinado en el paso (d) con un valor de referencia, donde el valor de referencia se obtiene:i) dividiendo la muestra original del donante obtenida en el paso (a) en al menos dos muestras u obtener en el paso (a) al menos dos muestras a partir de un donante donde en al menos una muestra unicamente se llevan a cabo el paso (a) y los pasos (c) a (e) y se omite el paso (b) y donde la cantidad de cambio viscoelastico medida en la muestra en la cual se ha omitido el paso (b) es el valor de referencia; oii) aplicando un metodo que comprende el paso (a) y los pasos (c) a (e) a una muestra procedente de un donante sano o a varias muestras procedentes de donantes sanos sin un mayor riesgo hemorragico, donde la cantidad de cambio viscoelastico medida en la muestra o en las muestras en las que se omitio el paso (b) es el valor de referencia; oiii) aplicando un metodo que comprende los pasos (a) a (e) a una muestra procedente de un donante sano o a varias muestras procedentes de donantes sanos sin un mayor riesgo hemorragico donde la cantidad de cambio viscoelastico medida en la muestra o en las muestras es el valor de referencia.
- 2. El metodo diagnostico in vitro de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el fluido corporal es sangre entera, sangre anticoagulada o plasma rico en trombocitos.
- 3. El metodo diagnostico in vitro de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, donde el valor de referencia obtenido en el apartado (ii) o (iii) alternativo de la reivindicacion 1 es un valor promedio de las cantidades de cambio viscoelastico medidas en varias muestras obtenidas a partir de donantes sanos.
- 4. El metodo diagnostico in vitro de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, donde se anade un activador de la coagulacion.
- 5. El metodo diagnostico in vitro de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, donde se anade un activador de la coagulacion antes del paso (b) o despues del paso (b) pero antes de inducir la coagulacion en el paso (c).
- 6. El metodo diagnostico in vitro de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, donde se mide el cambio viscoelastico determinando cualquiera de los parametros de la tromboelastograffa.
- 7. El metodo diagnostico in vitro de acuerdo con la reivindicacion 6, donde el parametro de la tromboelastograffa es la amplitud maxima.
- 8. El metodo diagnostico in vitro de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, donde el activador de la agregacion de trombocitos se selecciona a partir del grupo que comprende la ristocetina y la botrocetina.
- 9. El metodo diagnostico in vitro de acuerdo con la reivindicacion 8, donde el activador de la agregacion de trombocitos es la ristocetina.
- 10. El metodo diagnostico in vitro de acuerdo con la reivindicacion 9, donde la concentracion de ristocetina esta comprendida entre 0.1 mg/mLy 1.5 mg/mL.
- 11. El metodo diagnostico in vitro de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10 para predecir el riesgo hemorragico de18un paciente antes de la cirugfa o durante la terapia.
- 12. El metodo diagnostico in vitro de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 11, donde la muestra del fluido corporal es, como maximo, de 105 pL por prueba.
- 13. El metodo diagnostico in vitro de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 12, donde un valor del (cambio 5 viscoelastico en una muestra de un fluido corporal procedente de un donante con activador de la agregacion detrombocitos anadido)/(cambio viscoelastico en una muestra del mismo fluido corporal sin activador de la activacion de trombocitos anadido) igual o superior a 0.15 se interpreta que es un indicador de un riesgo hemorragico.
- 14. El uso del metodo diagnostico in vitro de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13 para el control de la terapia, donde la terapia comprende la administracion del DDAVP.10 15. El uso del metodo diagnostico in vitro de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13 para el control de la terapia,donde la terapia comprende la administracion de un concentrado del VWF.
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