BR102015005628A2 - composição, e, uso de ácido ferúlico - Google Patents

Abstract

composição, e, uso de ácido ferúlico. composição para uso como um plasma de controle de coagulação anormal em ensaios in vitro. a presente invenção refere-se ao campo da análise clinica de sangue, e em particular a uma composição que compreende plasma de humano, solução isotónica tamponada e ácido ferúlico para ser usada como o controle de coagulação anormal em ensaios de hemostasia, coagulação e fibrinólise. a presente invenção também se refere ao uso de ácido ferúlico na preparação de plasma de controle anormal em ensaios de hemostasia.

Description

“COMPOSIÇÃO, E, USO DE ÁCIDO FERÚLICO” [001] A presente invenção refere-se ao campo da análise clínica de sangue, e em particular a uma composição que compreende plasma de humano, solução isotônica tamponada e ácido ferúlico para ser usada como o controle de coagulação anormal em ensaios de hemostasia, coagulação e fibrinólise. A presente invenção também se refere ao uso de ácido ferúlico na preparação de plasma de controle de coagulação anormal em ensaios de hemostasia.

[002] A hemostasia é o grupo de mecanismos que evitam que os animais que têm um sistema vascular sangrem após uma lesão. O mecanismo de hemostasia tem uma variedade de funções importantes: (a) manter o sangue em um estado fluido quando ele flui através do sistema vascular, (b) interromper o sangramento no local de um ferimento ou sempre que houver perda de sangue, pela formação de um coágulo, e (c) garantir que o coágulo seja removido quando o ferimento foi cicatrizado. Tipicamente, cinco elementos estão envolvidos em hemostasia, a saber: os vasos sanguíneos, as plaquetas (componente celular), fatores de coagulação, inibidores de coagulação e o sistema fibrinolítico. A hemostasia por conseguinte envolve um grupo de forças que têm que interagir em perfeito equilíbrio - forças pró-coagulantes e forças anticoagulantes. Este equilíbrio é controlado por várias proteínas, algumas das quais são conhecidas como fatores de coagulação. E um equilíbrio muito delicado no qual qualquer desequilíbrio podería levar a quer um estado pró-trombótico quer a um distúrbio sanguíneo.

[003] E muito importante medir precisamente a função coagulante porque qualquer deficiência que esteja presente podería ameaçar a vida. Isto toma-se particularmente importante em pacientes que estão sob terapia de coagulação em condições tromboembólicas.

[004] A função do laboratório de hemostasia é detectar e reconhecer as mudanças fisiológicas em doenças hematológicas e trombóticas. Para realizá-la, vários ensaios são usados, como ensaios de hemostasia primária, ensaios coagulométricos e ensaios imunológicos, que permitirem que seja obtida informação útil com o propósito de ajudar os profissionais de saúde a realizarem uma diagnose precisa e planejarem um tratamento adequado para a mesma.

[005] Os ensaios de hemostasia podem ser divididos em dois grupos distintos: avaliação de hemostasia inicial, que pode incluir o tempo de pró-trombina (PT, prothrombin time), o tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT, activated partial thromboplastin time), determinação da concentração de fibrinogênio, e tempo de trombina (TT, thrombin time)', e o outro grupo, que pode incluir ensaios específicos como tempo de reptilase (RT, reptilase time), tempo de coagulação ativada (ACT, activated coagulation time), de determinação da concentração de antitrombina (AT, antithrombin), proteína C, proteína S, fator de von Willebrand, plasminogênio e a2-antiplasmina (inibidor de plasmina).

[006] Em laboratórios de hemostasia, as amostras de pacientes são analisadas para uma ampla variedade de testes de hemostasia e ensaios específicos durante todo o dia de trabalho. Nestes dias, controle metodológico das variáveis que influenciam a eficiência e a eficácia dos ensaios de hemostasia é essencial para uma diagnose correta. O uso de plasmas de controle desempenha uma função importante nestes controles de qualidade interna realizados pelos laboratórios.

[007] E elevadamente recomendável usar, em intervalos regulares, um controle na faixa de tempo de coagulação normal e outro na faixa anormal para garantir o funcionamento apropriado dos reagentes e dispositivos utilizados no laboratório de hemostasia. Têm sido publicadas recomendações relacionadas com a frequência com a qual os materiais de controle devem ser testados para alguns ensaios de coagulação. Por exemplo, o “Clinicai and Laboratory Standards Institute (CLSI)” tem publicado normas de procedimento relacionadas com os ensaios de PT e aPTT. Os ditos documentos recomendaram testar, pelo menos, dois níveis de materiais de controle a cada 8 horas, ou mais frequentemente se as amostras são processadas em uma maneira contínua como é o caso em muitos laboratórios. Este documento da CLSI também indica que a amostra de controle deve ser usada no primeiro ensaio que é realizado após uma mudança de reagente ou a inclusão de novos reagentes ou após uma mudança significativa de aparelho. Os controles permitem a avaliação da precisão e do desvio analíticos de ambos os ensaios de coagulação no sistema coagulômetro utilizado e nos reagentes usados.

[008] Tem sido publicada literatura relacionada com a preparação de plasma de controle de coagulação, e alguns destes plasmas estão atualmente disponíveis para comercialização. Entretanto, os métodos descritos são, em sua maioria, demorados e incluem etapas caras para a absorção de fatores proteicos plasmáticos críticos para se obterem as propriedades de coagulação anormal. Um método para preparar plasma de controle de coagulação anormal compreende incubar plasma normal com hidróxido de alumínio e então centrifugar o dito plasma. O sedimento contém vários fatores de coagulação e os sobrenadante resultante pode ser usado como plasma de controle patológico. Os tempos de coagulação anormal são alcançados pela remoção dos fatores de coagulação do plasma. Entretanto, o plasma de controle de coagulação assim obtido não é completamente satisfatório, porque resultados anonnais são obtidos em alguns ensaios enquanto que em outros, por exemplo fatores VIII, XI e XII, e também em outros ensaios de hemostasia como TT e RT, a atividade está dentro da faixa normal.

[009] Outro método para produzir um controle de coagulação anormal é diluir o plasma normal. O dito método é descrito no guia internacional (NCCLS H30-A2), que menciona como preparar um plasma de controle anormal para determinar fibrinogênio de acordo com o método de Clauss. O dito documento também descreve como uma série de plasmas normais pode ser diluída com um tampão barbital para obter plasma que tem um resultado anormal (teor baixo de fibrinogênio). O resultado final da diluição de uma série de plasmas anormais é anormal na maioria dos ensaios de hemostasia. Entretanto, o dito plasma de controle de coagulação não é anormal, por exemplo, para TT e RT. O mesmo resultado é obtido pela diluição do plasma normal com outras soluções, como uma solução de albumina 4%.

[0010] A presente invenção revela um plasma de controle de coagulação anormal que supera todas as desvantagens anteriormente mencionadas. O plasma de controle de anormal da presente invenção garante tanto os resultados na faixa anormal em um grande número de ensaios de hemostasia, incluindo TT e RT, quanto a determinação da atividade de fatores de coagulação específicos. Os presentes inventores descobriram de modo surpreendente que pela adição de ácido ferúlico em uma solução isotônica ao plasma normal, é possível obter um plasma de controle anormal que pode ser usado eficazmente na maioria dos ensaios de hemostasia.

[0011] Sem se vincular a alguma teoria em particular, é possível que esta propriedade do ácido ferúlico seja obtida por meio de uma sua propriedade anticoagulante característica. Entretanto, o fato de que uma substância tenha propriedades anticoagulantes não significa que ela é adequada para produzir plasma anormal. Por exemplo, warfarina é um dos anticoagulantes mais amplamente usados em cuidados da saúde para tratar pacientes sob risco para trombose, e tem sido usada como um medicamento durante mais que 50 anos. Entretanto, este composto não é adequado para ser adicionado ao plasma e produzir uma controle de coagulação anormal porque seu mecanismo de ação é baseado em inibição da síntese de fatores de coagulação que dependem da vitamina K. Como um anticoagulante, a warfarina necessita de um sistema in vitro completo.

[0012] Outros compostos anticoagulantes, com heparina ou ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA, ethylenediaminetetraacetic acid), podem ser de fato adicionados ao plasma normal e produzir tempos anormais nos ensaios de hemostasia. Entretanto, os presentes inventores não obtiveram resultados similares com os anticoagulantes heparina ou EDTA. Nenhum destes anticoagulantes é adequado para produzir plasma anormal porque têm efeitos inconsistentes sobre os ensaios de hemostasia. Em outras palavras, a concentração ótima para obter um tempo anormal em um ensaio é insuficiente ou excessiva para outro ensaio. Por exemplo, a heparina prolonga o ensaio de aPTT, também não influencia o ensaio de PT, ou o faz em uma extensão menor. Além disso, a heparina não prolonga o ensaio de RT, ou mais exatamente não produz plasma anormal para RT. O caso é similar com EDTA, que, em uma determinada concentração, pode prolongar o ensaio de RT, também não influencia os resultados dos ensaios de PT, aPTT e TT, ou o faz de modo muito diminuto.

[0013] Portanto, a presente invenção revela uma composição que compreende ácido ferúlico, solução isotônica tamponada e plasma de humano para uso como um plasma de controle de coagulação anormal em ensaios de hemostasia.

[0014] Na composição da presente invenção, o termo ‘plasma de humano’ refere-se à parte líquida do sangue do qual as hemácias, os leucócitos e as plaquetas foram removidos. Em adição, o plasma de humano usado na composição da presente invenção é um que tem um tempo de coagulação normal nos vários ensaios e é por conseguinte capaz de ser usado como um controle normal em ensaios de coagulação. O dito plasma pode ser obtido por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica, por exemplo por plasmaférese.

[0015] Uma vantagem adicional da composição da presente invenção para controle de coagulação anormal é que a dita composição pode ser congelada ou liofílizada e permanece estável quando descongelada ou reconstituída.

[0016] Para se obter uma composição para controle de coagulação anormal em ensaios de hemostasia, é preferível usar um acervo de plasma normal contendo plasma de dois ou mais doadores humanos saudáveis. O dito acervo de plasma pode ser preparado por misturação cuidadosa em um recipiente adequado. A concentração de plasma normal na composição da presente invenção está na faixa de 15% v/v a 75% v/v.

[0017] A função principal da solução isotônica tamponada presente na composição da presente invenção para controle de coagulação anormal em ensaios de hemostasia é a manutenção de um pH ao redor do pH fisiológico, isto é, entre 6,5 e 8,5, mas também permite que o plasma seja diluído de modo a se obter um tempo de coagulação anormal, quando combinado com ácido ferúlico. A solução isotônica da presente invenção pode ser qualquer solução isotônica conhecida na técnica. Preferencialmente, a solução isotônica da presente invenção é um tampão que mantém um pH ao redor do pH fisiológico entre 6,5 e 8,5 (por exemplo Tris, HEPES, MOPS ou CEÍAPS). A quantidade de solução isotônica na composição da presente invenção está na faixa de 40% v/v a 70% v/v.

[0018] Por outro lado, a quantidade de ácido ferúlico na composição da presente invenção está na faixa de aproximadamente 0,01% p/v a aproximadamente 1% p/v.

[0019] Em adição, a composição da presente invenção para controle de coagulação anormal em ensaios de hemostasia pode opcionalmente compreender um estabilizador de fator de coagulação. Um estabilizador de fator de coagulação pode conceder à dita composição estabilidade adicional. O dito estabilizador de fator de coagulação é preferencialmente glicina, mais preferencialmente, a dita glicina está presente na composição para controle de coagulação anormal em ensaios de hemostasia da presente invenção em uma quantidade de aproximadamente 0,1% p/v a aproximadamente 4% p/v.

[0020] A composição da presente invenção para controle de coagulação anormal em ensaios de hemostasia também pode opcionalmente compreender uma estabilizador de proteínas ou um aditivo proteico e/ou um agente encorpante, e um conservante. A função principal do dito estabilizador é conservar a funcionalidade das proteínas quando elas têm sido liofilizadas. O dito estabilizador pode ser qualquer estabilizador conhecido por uma pessoa versada na técnica.

[0021] Finalmente, a presente invenção revela o uso de ácido ferúlico na preparação de um controle de coagulação anormal em ensaios de hemostasia.

[0022] A presente invenção será descrita com mais detalhes abaixo com referência aos exemplos ilustrativos, que não limitam a presente invenção, e aos desenhos, nos quais: [0023] Figura 1 mostra o efeito de ácido ferúlico com respeito às amostras de controle no ensaio de hemostasia como PT, [0024] Figura 2 mostra o efeito de heparina com respeito às amostras de controle no ensaio de hemostasia como PT, [0025] Figura 3 mostra o efeito de EDTA com respeito às amostras de controle no ensaio de hemostasia como PT, [0026] Figura 4 mostra o efeito de ácido ferúlico com respeito às amostras de controle no ensaio de hemostasia como aPTT, [0027] Figura 5 mostra o efeito de heparina com respeito às amostras de controle no ensaio de hemostasia como aPTT, [0028] Figura 6 mostra o efeito de EDTA com respeito às amostras de controle no ensaio de hemostasia como aPTT, [0029] Figura 7 mostra o efeito de ácido ferúlico com respeito às amostras de controle no ensaio de hemostasia como TT, [0030] Figura 8 mostra o efeito de heparina com respeito às amostras de controle no ensaio de hemostasia como TT, [0031] Figura 9 mostra o efeito de EDTA com respeito às amostras de controle no ensaio de hemostasia como TT, [0032] Figura 10 mostra o efeito de ácido ferúlico com respeito às amostras de controle no ensaio de hemostasia como RT, [0033] Figura 11 mostra o efeito de heparina com respeito às amostras de controle no ensaio de hemostasia como RT, e [0034] Figura 12 mostra o efeito de EDTA com respeito às amostras de controle no ensaio de hemostasia como RT.

Exemplos [0035] Exemplo 1. Preparação de composições de controle de plasma anormal para ensaios de hemostasia.

[0036] Para avaliar o efeito de anticoagulantes diferentes em vários ensaios de hemostasia, foram preparadas composições de plasma diferentes. Foi feito uso de plasma normal citrado de humano (16 mM de citrato), armazenado a uma temperatura abaixo de -70°C e descongelado em um banho a 37°C. HEPES foi então adicionado até uma concentração final de 40 mM e o pfl foi ajustado para entre 7,4 e 7,6 com o uso de NaOFI IN. Foram preparadas várias composições de plasma. Não foi adicionado anticoagulante à primeira composição, que foi utilizada como um controle. Concentrações crescentes dos anticoagulantes sendo analisados foram adicionadas às outras composições: ácido ferúlico (0,5%, 1% e 1,5%), heparina (0,1 UI/mL, 0,5 UI/mL r 1 UI/mL) e EDTA (0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 1,5 mg/mL). Cada composição de plasma foi analisada para os ensaios de PT, aPTT, TT e RT anteriormente mencionados em um “Q Haemostasis Analyzer” (Diagnostic Grifols, Espanha) com o uso dos reagentes DG-PT, DG-APTT Synth, DG-TT L Human e GD-Fibroclotin da Diagnostic Grifols.

[0037] Exemplo 2. Efeito das composições compreendendo anticoagulantes no ensaio de PT.

[0038] As Figuras 1 a 3 mostram os resultados obtidos no ensaio de PT com os vários anticoagulantes e o gráfico do tempo obtido no ensaio de PT como uma função da concentração do anticoagulante presente no plasma. O controle (plasma que não tem anticoagulante) é mostrado por triângulos e as composições que compreendem ácido ferúlico, heparina e EDTA são mostradas por quadrados. Pode ser visto que ácido ferúlico (Figura 1) e EDTA (Figura 3) produzem uma redução na percentagem de atividade de PT que é proporcional à quantidade de anticoagulante presente no plasma. Em contraste, heparina (Figura 2) não causa nenhum resultado diferente daquele do plasma que não tem anticoagulante. Isto significa que, nas concentrações testadas, heparina não tem efeito sobre o ensaio de PT. Por outro lado, ácido ferúlico e EDTA adicionados ao plasma normal produzem uma redução na percentagem de atividade de PT.

[0039] Exemplo 3. Efeito das composições compreendendo anticoagulantes no ensaio de aPTT.

[0040] Os mesmos plasmas preparados no Exemplo 1 foram testados no ensaio de aPTT (Figuras 4 a 6). Neste ensaio, todos os anticoagulantes adicionados ao plasma, isto é ácido ferúlico (Figura 4), heparina (Figura 5) e EDTA (Figura 6) prolongaram o ensaio de PT. Além disso, a prolongação no resultado do ensaio é proporcional à quantidade de anticoagulante presente no plasma.

[0041] Exemplo 4. Efeito das composições compreendendo anticoagulantes no ensaio de TT.

[0042] Os mesmos plasmas preparados no Exemplo 1 foram testados no ensaio de TT. As Figuras 7 a 9 mostram que os resultados de TT obtidos quando se testam os plasmas preparados. Dos três anticoagulantes analisados, EDTA (Figura 9) não prolonga o resultado do ensaio, mas não gera um TT anormal. Em contraste, tanto heparina (Figura 8) quanto ácido ferúlico (Figura 7) produzem um TT anormal.

[0043] Exemplo 5. Efeito das composições compreendendo anticoagulantes no ensaio de RT.

[0044] Os mesmos plasmas preparados no Exemplo 1 foram testados no ensaio de RT. Referindo-se aos resultados do ensaio de RT (Figuras 10 a 12), o único anticoagulante que não produz um resultado anormal após ser adicionado a um acervo de plasma normal é heparina (Figura 11). Heparina não prolonga o RT em nenhuma das concentrações testadas. Plasmas que contêm os anticoagulantes ácido ferúlico (Figura 10) e EDTA (Figura 12) produzem um resultado de RT anormal.

[0045] Com base nos resultados mostrados nos exemplos e nas figuras precedentes, são evidentes o poder anticoagulante de ácido ferúlico e sua capacidade para causar resultados anormais em todos os ensaios de hemostasia após sua adição ao plasma normal. Além disso, ácido ferúlico prolonga os ensaios em uma maneira equilibrada, tomando-o assim adequado para a produção de plasma de controle anormal.

[0046] Embora a invenção tenha sido descrita com respeito às modalidades preferidas, estas não devem ser interpretadas como sendo limitadoras da invenção, que será definida pela interpretação mais ampla das seguintes reivindicações.

Claims (11)

1. Composição para uso como um plasma de controle de coagulação anormal em ensaios in vitro, a dita composição compreendendo plasma de humano, solução isotônica tamponada e ácido ferúlico, a dita composição caracterizada pelo fato de que o dito plasma de humano tem sido obtido por métodos de extração de plasma de humano e pelo fato de que a dita solução isotônica tamponada tem um pH entre 6,5 e 8,5.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o plasma de humano é um que tem um valor de tempo de coagulação normal em vários ensaios de coagulação.

3. Composição de acordo com quer a reivindicação 1 quer a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o plasma de humano é um acervo de plasma normal que contém plasma de dois ou mais doadores humanos saudáveis.

4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a concentração do plasma de humano está na faixa de 15% v/v a 75% v/v.

5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a quantidade de dita solução isotônica está na faixa de 40% v/v a 70% v/v.

6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a quantidade de ácido ferúlico está na faixa de 0,01% p/v a 1% p/v.

7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de adicionalmente compreender um estabilizador de fator coagulante.

8. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o estabilizador de fator de coagulação é glicina.

9. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a glicina está presente na dita composição em uma quantidade de 0,1% p/v a 4% p/v.

10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de adicionalmente compreender um estabilizador de proteína e um conservante.

11. Uso de ácido ferúlico, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um controle de coagulação anormal em ensaios in vitro.