ES2475492A1 - Composición para su utilización como plasma de control anormal de la coagulación en ensayos in vitro. - Google Patents

Abstract

Composición para su utilización como plasma de control anormal de la coagulación en ensayos in vitro. La presente invención se refiere al sector del análisis clínico de la sangre y, más en particular, se refiere a una composición que comprende plasma humano, solución isotónica tamponada y ácido ferúlico para utilizar en el control anormal de la coagulación en ensayos de hemostasia, coagulación y fibrinolisis. Además, la presente invención se refiere a la utilización de ácido ferúlico en la preparación de un control anormal de plasma en ensayos de hemostasia.

Description

Composici�n para su utilización como plasma de control anormal de la coagulación en ensayos

in vitro

La presente invención se refiere al sector del análisis cl�nico de la sangre y, más en particular, se refiere a una composición que comprende plasma humano, solución isot�nica tamponada y ácido fer�lico para utilizar en el control anormal de la coagulación en ensayos de hemostasia, coagulación y fibrinolisis. Además, la presente invención se refiere a la utilización de ácido fer�lico en la preparación de un control anormal de plasma en ensayos de hemostasia.

La hemostasia es el conjunto de mecanismos a través de los cuales los animales con un sistema vascular evitan desangrarse tras una herida. El mecanismo de la hemostasia tiene distintas funciones importantes: (a) mantener la sangre en estado fluido cuando circula dentro del sistema vascular, (b) detener la hemorragia en el lugar donde se ha producido una herida o haya pérdida de sangre a través de la formación de un coágulo, y (c) asegurar la eliminación del coágulo cuando la herida se ha curado. Habitualmente, en la hemostasia intervienen cinco elementos, a saber: los vasos sanguíneos, las plaquetas (componente celular), los factores de la coagulación, los inhibidores de la coagulación y el sistema fibrinol�tico. La hemostasia, pues, involucra un grupo de fuerzas que deben interactuar en un perfecto equilibrio, las fuerzas procoagulantes y anticoagulantes. Este equilibrio est� controlado por varias proteínas, algunas de ellas conocidas como factores de coagulación. Es un equilibrio muy delicado y en caso de desequilibrio, podría generar un estado protromb�tico o un trastorno hemorrágico.

Es muy importante medir de forma precisa el funcionamiento de la coagulación, porque si existen deficiencias, pudieran amenazar la vida. Este hecho adquiere especial interés en el caso de pacientes sometidos a terapia de coagulación en condiciones tromboembol�ticas.

El papel del laboratorio de hemostasia es detectar y conocer las alteraciones fisiológicas en enfermedades hemorrágicas y tromb�ticas. Para ello se utilizan diferentes ensayos tales como ensayos de hemostasia primaria, coagulom�tricos e inmunol�gicos, que permiten obtener información útil para guiar a los profesionales de la salud hacia un diagnóstico preciso y su tratamiento adecuado.

Los ensayos de hemostasia se pueden dividir en dos grupos diferentes: evaluación inicial de la hemostasia, en el que se pueden incluir el tiempo de protrombina (PT), el tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT), la determinación de la concentración de fibrin�geno y tiempo de trombina (TT); en el otro grupo se pueden incluir ensayos especiales tales como el tiempo de reptilasa (RT), el tiempo de coagulación activada (ACT), la determinación de la concentración de antitrombina (AT), de Proteína C, de Proteína S, de factor de von Willebrand, de plasmin�geno y de α2-antiplasmina (inhibidor de plasmina).

En los laboratorios de hemostasia, muestras de pacientes son analizadas para una gran variedad de cribados de hemostasia y ensayos especiales durante toda la jornada de trabajo. En estos ensayos, el control metodológico de las variables que intervienen en la eficiencia y eficacia de los ensayos de hemostasia son esenciales para un diagnóstico correcto. Dentro de estos controles de calidad internos seguidos por los laboratorios, el uso de plasmas de control juega un papel muy importante.

Es extremadamente recomendable utilizar un control en el rango de tiempo de coagulación normal y otro en el rango anormal, en intervalos regulares para asegurar el funcionamiento correcto de los reactivos y dispositivos utilizados en el laboratorio de hemostasia. Existen recomendaciones publicadas en relación con la frecuencia de ensayo de los materiales de control para algunos ensayos de coagulación. Por ejemplo, el CLSI (siglas en inglés del Instituto de Estándares de Laboratorios Cl�nicos) ha publicado documentos de guía en relación con los ensayos PT y aPTT. En dicho documento, se recomienda ensayar, como mínimo, dos niveles de materiales de control cada 8 horas, o más frecuentemente si ocurre un procesado de muestras de forma continua, tal como ocurre en muchos laboratorios. Este documento de CLSI también indica que el primer ensayo realizado después de cambios o incorporación de nuevos reactivos o de un cambio importante de instrumentos debe ser con la muestra de control. Los controles permiten evaluar la precisión y la desviación analítica de los ensayos de coagulación en el sistema empleado de coagul�metro y reactivos utilizados.

Existe literatura publicada en relación con la preparación de plasma de control de la coagulación y actualmente est�n comercialmente disponibles algunos de ellos. Sin embargo, la mayoría de los métodos descritos requieren mucho tiempo e incluyen etapas costosas para absorber factores proteicos críticos del plasma para obtener las propiedades de coagulación anormales. Un método para preparar plasma de control anormal de coagulación comprende la incubaci�n de plasma normal con hidróxido de aluminio y su posterior centrifugaci�n. El sedimento contiene varios factores de coagulación y el sobrenadante resultante se puede emplear como plasma de control patológico. Los tiempos de coagulación anormales se consiguen mediante la eliminación de los factores de coagulación del plasma. Sin embargo, el plasma de control de la coagulación obtenido de esta manera no es completamente satisfactorio, porque se obtienen resultados anormales en algunos ensayos, pero en otros la actividad est� en el rango normal, por ejemplo, factor VIII, XI y XII, as� como en otros ensayos de hemostasia tales como TT y RT.

Otro método para generar un control anormal de la coagulación es diluir el plasma normal. Dicho método se describe en una guía internacional (NCCLS H30-A2), en la que se menciona como preparar un plasma de control anormal para la determinación de fibrin�geno según el método Clauss. Además, se describe que se puede diluir un conjunto de plasmas normales con tampón barbital para obtener plasma con un resultado anormal (bajo contenido en fibrin�geno). El resultado final de la dilución de un conjunto de plasmas normales resulta anormal para la mayoría de los ensayos de hemostasia. Sin embargo, este plasma de control de la coagulación no es anormal, por ejemplo, para TT y RT. El mismo resultado se obtiene mediante la dilución de plasma normal con otras soluciones tal como una solución de albúmina al 4%.

La presente invención da a conocer un plasma de control anormal de la coagulación que supera todos los inconvenientes mencionados anteriormente. El plasma de control anormal de la presente invención garantiza resultados en el rango anormal en un gran número de ensayos de hemostasia, incluyendo TT, RT y la determinación de actividad de los factores específicos de la coagulación. Los presentes inventores han descubierto, sorprendentemente, que mediante la adición de ácido fer�lico en una solución isot�nica a un plasma normal se puede obtener un plasma de control anormal que puede ser utilizado de forma eficaz en la mayoría de los ensayos de hemostasia.

Sin estar asociados a ninguna teoría en particular, es posible que esta propiedad del ácido fer�lico se obtenga por una propiedad característica anticoagulante de dicha sustancia. No obstante, el hecho de que una sustancia posea propiedades anticoagulantes, no indica que sea apropiada para generar un plasma anormal. Por ejemplo, la warfarina es uno de los anticoagulantes más utilizados en sanidad para tratar los pacientes con riesgo tromb�tico y lleva más de 50 años utilizándose como medicamento. Sin embargo, este compuesto no es útil para ser añadido en un plasma y generar un control anormal de la coagulación, ya que su mecanismo de acción se basa en la inhibición de la síntesis de los factores de coagulación dependientes de la vitamina K. Como anticoagulante requiere de un sistema in vivo completo.

Otros compuestos con actividad anticoagulante, como la heparina o el ácido etilendiaminotetraac�tico (EDTA), s� que pueden ser añadidos a plasma normal y generar tiempos anormales en los ensayos de hemostasia. Sin embargo, los presentes inventores no han obtenido resultados similares con los anticoagulantes heparina o EDTA. Ambos anticoagulantes no son idóneos para generar un plasma anormal, ya que presentan un efecto desigual sobre los ensayos de hemostasia. Es decir, la concentración óptima para obtener un tiempo anormal en un ensayo es insuficiente o excesiva para otro ensayo. Por ejemplo, en el caso de la heparina, provoca un alargamiento del ensayo aPTT pero no afecta al ensayo PT o lo hace en menor medida. Además, la heparina no provoca el alargamiento del ensayo RT, o sea no genera un plasma anormal para RT. Un caso similar ocurre con el EDTA, a una concentración determinada, puede provocar un alargamiento en el ensayo de RT pero no afectar, o hacerlo de una manera muy suave, a los resultados de los ensayos de PT, aPTT y TT.

Por lo tanto, la presente invención da a conocer una composición que comprende ácido fer�lico, solución isot�nica tamponada y plasma humano para su utilización como control anormal de la coagulación en ensayos de hemostasia.

En la composición de la presente invención, el término plasma humano se refiere a la parte líquida de la sangre a la que se le han extraído los hemat�es, los glóbulos blancos y las plaquetas. Además, el plasma humano que se utiliza en la composición de la presente invención es un plasma que tiene un tiempo normal de coagulación en los distintos ensayos y, por tanto, es posible su utilización como control normal en ensayos de coagulación. Dicho plasma se puede obtener por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante plasmaf�resis.

Una ventaja adicional de la composición para el control anormal de la coagulación en ensayos de hemostasia de la presente invención es que dicha composición se puede congelar o liofilizar, y permanece estable después que se descongela o reconstituye.

Para lograr una composición para el control anormal de la coagulación en ensayos de hemostasia es preferible que se utilice un conjunto (“pool”) de plasma normal que contiene plasma de 2 o más donantes humanos sanos. Dicho conjunto de plasma se puede preparar mediante mezclado suave en un recipiente adecuado. La concentración de plasma normal en la composición de la presente invención est� en el intervalo de 15% a 75% (v/v).

La solución isot�nica tamponada presente en la composición para el control anormal de la coagulación en ensayos de hemostasia de la presente invención tiene como función fundamental mantener un pH alrededor del fisiológico, entre 6,5 y 8,5, pero además permite diluir el plasma para conseguir, junto con el ácido fer�lico, un tiempo de coagulación anormal. La solución isot�nica de la presente invención puede ser cualquier solución isot�nica conocida en la técnica anterior. Preferentemente, la solución isot�nica de la presente invención es un tampón que mantiene un pH alrededor del valor fisiológico entre 6,5 y 8,5 (por ejemplo, Tris, HEPES, MOPS o CHAPS). La cantidad de solución isot�nica en la composición de la presente invención est� en el intervalo de 40 a 70% (v/v).

Por otra parte, la cantidad de ácido fer�lico en la composición de la presente invención est� en el intervalo de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 1% (p/v).

Adem�s, opcionalmente la composición para el control anormal de la coagulación en ensayos de hemostasia de la presente invención puede comprender un agente estabilizador de factores de coagulación. Un estabilizador de factores de coagulación puede proporcionar una estabilidad adicional a dicha composición. Preferentemente, dicho estabilizador de factores de coagulación es glicina, y más preferentemente, dicha glicina est� presente en la composición para el control anormal de la coagulación en ensayos de hemostasia de la presente invención en una cantidad de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 4% (p/v).

La composición para el control anormal de la coagulación en ensayos de hemostasia de la presente invención también puede comprender opcionalmente un agente estabilizante de

prote�nas o aditivo proteico y/o agente de carga, y un conservante. Dicho agente estabilizante tiene como función principal conservar la funcionalidad de las proteínas una vez liofilizadas las mismas. Dicho agente estabilizante puede ser cualquier agente estabilizante conocido por un experto en la materia.

Por último, la presente invención da a conocer el uso de ácido fer�lico en la preparación de un control anormal de la coagulación en ensayos de hemostasia.

A continuación, se describe en más detalle la presente invención en referencia a ejemplos ilustrativos, que no constituyen una limitación de la presente invención, y en referencia a las figuras en las que:

La figura 1 muestra el efecto del ácido fer�lico con respecto a muestras de control en el ensayo de hemostasia PT. La figura 2 muestra el efecto de la heparina con respecto a muestras de control en el ensayo de hemostasia PT. La figura 3 muestra el efecto del EDTA con respecto a muestras de control en el ensayo de hemostasia PT. La figura 4 muestra el efecto del ácido fer�lico con respecto a muestras de control en el ensayo de hemostasia aPTT. La figura 5 muestra el efecto de la heparina con respecto a muestras de control en el ensayo de hemostasia aPTT. La figura 6 muestra el efecto del EDTA con respecto a muestras de control en el ensayo de hemostasia aPTT. La figura 7 muestra el efecto del ácido fer�lico con respecto a muestras de control en el ensayo de hemostasia TT. La figura 8 muestra el efecto de la heparina con respecto a muestras de control en el ensayo de hemostasia TT. La figura 9 muestra el efecto del EDTA con respecto a muestras de control en el ensayo de hemostasia TT. La figura 10 muestra el efecto del ácido fer�lico con respecto a muestras de control en el ensayo de hemostasia RT.

La figura 11 muestra el efecto de la heparina con respecto a muestras de control en el ensayo de hemostasia RT. La figura 12 muestra el efecto del EDTA con respecto a muestras de control en el ensayo de hemostasia RT.

EJEMPLOS EJEMPLO 1. Preparación de las composiciones control anormal de plasma para los ensayos de hemostasia

Para evaluar el efecto de diferentes anticoagulantes en diferentes ensayos de hemostasia, se prepararon diferentes composiciones de plasma. Se utilizó plasma normal humano citratado (16 mM de citrato) conservado a una temperatura inferior a -70 �C y se descongel� en baño a 37 �C. A continuación, se a�adi� HEPES hasta una concentración final de 40 mM y el pH fue ajustado hasta 7,4 -7,6 con NaOH 1N. Se prepararon diferentes composiciones de plasma. A la primera no se a�adi� ningún anticoagulante y se utilizó como control. En las otras, se añadieron concentraciones crecientes de los anticoagulantes analizados: ácido fer�lico (0,5% 1% y 1,5%), heparina (0,1 UI/mL, 0,5 UI/mL y 1 UI/mL) y EDTA (0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 1,5 mg/mL). Cada composición de plasma fue analizada para los ensayos PT, aPTT, TT y RT mencionados anteriormente en Q Haemostasis Analyzer (Diagnostic Grifols, España) usando los reactivos DG-PT, DG-APTT Synth, DG-TT L Human y DG-Fibroclotin de Diagnostic Grifols.

EJEMPLO 2. Efecto de las composiciones que comprenden anticoagulantes en el ensayo de PT.

En las figuras 1-3 se muestran los resultados obtenidos en el ensayo de PT con los diferentes anticoagulantes, en las que se relaciona el tiempo obtenido en el ensayo de PT, según la concentración de anticoagulante presente en el plasma. En triángulos se representa el control (plasma sin anticoagulante) y en cuadrados las composiciones que tienen ácido fer�lico, heparina y EDTA. Se puede observar que el ácido fer�lico (figura 1) y el EDTA (figura 3) generan una disminución en el % de actividad de PT de manera proporcional a la cantidad de anticoagulante presente en el plasma. En cambio, la heparina (figura 2) no provoca un resultado diferente al del plasma sin anticoagulante. Es decir, en las concentraciones ensayadas, la

heparina no afecta el ensayo PT. En cambio, el ácido fer�lico y el EDTA añadidos en un plasma normal, s� que generan una disminución en el % de actividad de PT.

EJEMPLO 3. Efecto de las composiciones que comprenden anticoagulantes en el ensayo de aPTT.

Los mismos plasmas preparados en el Ejemplo 1 fueron ensayados en el ensayo de aPTT (figuras 4-6). En este ensayo, todos los anticoagulantes añadidos al plasma, a saber ácido fer�lico (figura 4), heparina (figura 5) y EDTA (figura 6), provocan un alargamiento del aPTT. Además, el alargamiento en el resultado del ensayo, es proporcional a la cantidad de anticoagulante presente en el plasma analizado.

EJEMPLO 4. Efecto de las composiciones que comprenden anticoagulantes en el ensayo de TT. Los mismos plasmas preparados en el Ejemplo 1 fueron ensayados en el ensayo de TT. En las figuras 7-9 se muestran los resultados de TT obtenidos al ensayar los plasmas preparados. De los tres anticoagulantes analizados, el EDTA (figura 9) no alarga el resultado del ensayo; es decir, no genera un TT anormal. En cambio, tanto la heparina (figura 8) como el ácido fer�lico (figura 7), s� que generan un TT anormal.

EJEMPLO 5. Efecto de las composiciones que comprenden anticoagulantes en el ensayo de RT.

Los mismos plasmas preparados en el Ejemplo 1 fueron ensayados en el ensayo de RT. En referencia a los resultados del ensayo de RT (figuras 10-12), el único anticoagulante que no genera un resultado anormal tras ser añadido a un pool de plasma normal es la heparina (figura 11). En ninguna de las concentraciones ensayadas, la heparina provoca un alargamiento del RT. Los plasmas que contienen los anticoagulantes ácido fer�lico (figura 10) y EDTA (figura 12), s� que generan un resultado anormal para RT.

A raíz de los resultados mostrados en los ejemplos y figuras anteriores, se puede apreciar el poder anticoagulante del ácido fer�lico y su capacidad, tras ser añadido a un plasma normal, de provocar resultados anormales en todos los ensayos de hemostasia. Además, genera un alargamiento en los tiempos de los tests de una manera equilibrada, haciéndolo as� adecuado para la fabricación de plasma de control anormal.

Si bien la invención se ha descrito con respecto a ejemplos de realizaciones preferentes, éstos no se deben considerar limitativos de la invención, que se definir� por la interpretación más amplia de las siguientes reivindicaciones.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Composici�n para su utilización como plasma de control anormal de la coagulación en ensayos in vitro, comprendiendo dicha composición: plasma humano, solución isot�nica tamponada y ácido fer�lico, caracterizada porque dicho plasma humano se ha obtenido mediante métodos conocidos de extracción de plasma humano y porque dicha solución isot�nica tamponada tiene un pH entre 6,5 y 8,5.

2. 2.

   Composici�n, según la reivindicación 1, caracterizada porque el plasma humano es un plasma que presenta un valor de tiempo normal de coagulación en diferentes ensayos de coagulación.

3. 3.

   Composici�n, según la reivindicación 1 � 2, caracterizada porque el plasma humano es un conjunto (“pool”) de plasma normal que contiene plasma de 2 o más donantes humanos sanos.

4. 4.

   Composici�n, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la concentración del plasma humano est� en el intervalo de 15% a 75% (v/v).

5. 5.

   Composici�n, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la cantidad de dicha solución isot�nica est� en el intervalo de 40 a 70% (v/v).

6. 6.

   Composici�n, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la cantidad de ácido fer�lico est� en el intervalo de 0,01% a 1% (p/v).

7. 7.

   Composici�n, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque además comprende un agente estabilizador de factores de coagulación.

8. 8.

   Composici�n, según la reivindicación 7, caracterizada porque el estabilizador de factores de coagulación es glicina.

9. 9.

   Composici�n, según la reivindicación 8, caracterizada porque la glicina est� presente en dicha composición en una cantidad de 0,1% a 4% (p/v).

10. 10.

    Composici�n, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque además comprende un agente estabilizante de proteínas y un conservante.

11. 11.

    Uso de ácido fer�lico en la preparación de un control anormal de la coagulación en ensayos in vitro.

    OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

    N.� solicitud: 201430343

    ESPA�A

    Fecha de presentación de la solicitud: 13.03.2014

    Fecha de prioridad:

    INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

    51 Int. Cl. : C12Q1/37 (2006.01) C07C65/28 (2006.01)

    DOCUMENTOS RELEVANTES

    Categor�a

    56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas

    A

    WEE, J. J. et al. Identification of anticoagulant components in Korean Red Ginseng. Journal of Ginseng Research. Diciembre 2010, Vol. 34, N� 4, páginas: 355-362. ISSN 1226-8453 <Doi:10.5142/jgr.2010.34.4.355> 1-11

    A

    WANG, S. et al. The anticoagulant ability of ferulic acid and its applications for improving the blood compatibility of silk fibroin. Biomedical Materials. Diciembre 2008, Vol. 3, N� 4, páginas 044106 (5 pp.). ISSN 1748-605X (impreso) <Doi:10.1088/1748-6041/3/4/044106> 1-11

    A

    LEE, M. H. et al. Tissue factor inhibitory sesquiterpene glycoside from Eriobotrya japonica. Archives of Pharmacal Research. Junio 2004, Vol. 27, N� 6, páginas: 619-623. ISSN 0253-6269. 1-11

    A

    MONIEN, B. H. et al. Novel chemo-enzymatic oligomers of cinnamic acids as direct and indirect inhibitors of coagulation proteinases. Bioorganic & Medicinal Chemistry. Diciembre 2006, Vol. 14, N� 23, páginas: 7988-7998. ISSN 0968-0896. <Doi:10.1016/j.bmc.2006.07.066> 1-11

    A

    HENRY, B. L. et al. Characterization of the plasma and blood anticoagulant potential of structurally and mechanistically novel oligomers of 4-hydroxycinnamic acids. Blood Coagulation & Fibrinolysis. Enero 2009, Vol. 20, N� 1, páginas: 27-34. ISSN 0957-5235 <Doi:10.1097/MBC.0b013e328304e077> NIH Public Acces Author Manuscript. [en línea] 8 Junio 2010 [recuperado el 23.06.2014] Recuperado de internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2882113/ 1-11

    A

    HENRY, B. L. et al. Sulfated, low molecular weight lignins inhibit a select group of heparin-binding serine proteases. Biochemical and Biophysical Research Communications. Enero 2012, Vol. 417, N� 1, páginas: 382-386. ISSN 0006-291X (impreso) ISSN1090-2104 (electrónico) <Doi:10.1016/j.bbrc.2011.11.122> 1-11

    A

    CHANG, Y. W. et al. Platelet function analyzer (PFA-100(R)) offers higher sensitivity and specificity than thromboelastography (TEG(R)) in detection of platelet dysfunction. Acta Anaesthesiologica Taiwanica. Septiembre 2009, Vol. 47, N� 3, páginas: 110-117. ISSN 1875-4597 <Doi:10.1016/S1875-4597(09)60036-9> 1,11

    Categor�a de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

    El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones □ para las reivindicaciones n�:

    Fecha de realización del informe 23.06.2014

    Examinador E. Rela�o Reyes Página 1/5

    INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

    N� de solicitud: 201430343

    Documentaci�n mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) C12Q, C07C Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de

    b�squeda utilizados) INVENES, EPODOC,WPI, EMBASE, BIOSIS, MEDLINE, COMPDX, INSPEC, XPESP, XPESP2

    Informe del Estado de la Técnica Página 2/5

    OPINI�N ESCRITA

    N� de solicitud: 201430343

    Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 23.06.2014

    Declaraci�n

    Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

    Reivindicaciones Reivindicaciones 1-11 SI NO

    Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

    Reivindicaciones Reivindicaciones 1-11 SI NO

    Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

    Base de la Opinión.-

    La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

    Informe del Estado de la Técnica Página 3/5

    OPINI�N ESCRITA

    N� de solicitud: 201430343

    1. Documentos considerados.-

    A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

    Documento

    Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

    D01

    WEE, J. J. et al. Journal of Ginseng Research. Diciembre 2010, Vol. 34, N� 4, páginas: 355-362. 12.2010

    D02

    WANG. S. et al. Biomedical Materials. Diciembre 2008, Vol. 3, N� 4, páginas 044106 (5 pp.). 12.2008

    D03

    LEE, M. H. et al. Archives of Pharmacal Research. Junio 2004, Vol. 27, N� 6, páginas: 619-623. 06.2004

    D04

    MONIEN, B. H. et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry. Diciembre 2006, Vol. 14, N� 23, páginas: 7988-7998. 12.2006

    D05

    HENRY, B. L. et al. Blood Coagulation & Fibrinolysis. Enero 2009, Vol. 20, N� 1, páginas: 27-34. NIH Public Acces Author Manuscript. [en línea] 8 Junio 2010. 08.06.2010

    D06

    HENRY, B. L. et al. Biochemical and Biophysical Research Communications. Enero 2012, Vol. 417, N� 1, páginas: 382-386. 01.2012

    D07

    CHANG, Y. W. et al. Acta Anaesthesiologica Taiwanica. Septiembre 2009, Vol. 47, N� 3, páginas: 110-117. 09.2009

    En D01 se analizan los componentes con capacidad anticoagulante del ginseng rojo coreano, demostrando que el ácido fer�lico aumenta el tiempo de trombina. Para realizar las mediciones, se utiliza plasma junto con el ácido fer�lico.

    D02 anticipa la capacidad anticoagulante del ácido fer�lico, que inhibe la formación de coágulos en sangre y aumenta el tiempo parcial de tromboplastina parcialmente activada. La determinación de la actividad anticoagulante se realiza con sangre, solución salina y ácido fer�lico.

    En D03 se aíslan los compuestos procedentes de Eriobotrya japonica con capacidad inhibitoria del factor tisular, siendo el ácido fer�lico un inhibidor leve del mismo.

    D04 divulga un estudio sobre la capacidad anticoagulante de varios pol�meros de derivados del ácido 4-hidroxicin�mico, entre ellos dehidropol�meros de ácido fel�rico. Dichos compuestos aumentan el tiempo de protrombina y de la tromboplastina parcialmente activada, e inhiben la trombina y el factor Xa de la coagulación. Cabe destacar, que en el presente artículo se anticipan composiciones que comprenden plasma junto con el pol�mero derivado del ácido fer�lico, as� como el uso de una solución isot�nica tamponada a pH 7,4 en la disolución de reactivos.

    En D05 se investiga la actividad anticoagulante del dehidropol�mero sulfatado del ácido fel�rico, demostrando que aumenta el tiempo de protrombina y de tromboplastina parcialmente activada, as� como la formación de fibrina. Además, se informa sobre la capacidad anticoagulante de la forma no sulfatada.

    D06 mide la capacidad inhibidora del dehidropol�mero sulfatado del ácido fel�rico sobre la catepsina G, plasmina, trombina, la elastasa leucocitaria humana, y los factores de la coagulación IXa, Xa y XIa.

    En D07 se divulga el uso de inhibidores de la agregación plaquetaria añadidos a sangre normal, para determinar la sensibilidad de dos técnicas en la detección de problemas en la coagulación.

    Informe del Estado de la Técnica Página 4/5

    OPINI�N ESCRITA

    N� de solicitud: 201430343
12. 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

    La presente solicitud tiene por objeto, una composición que comprende: del 15 al 75% plasma humano con tiempo normal de coagulación; del 40 al 70% de solución isot�nica tamponada de pH 6.5-8.5; del 0.01 al 1% de ácido fer�lico; del 0,1 al 4% de glicina, as� como un agente estabilizante de proteínas y un conservante (reivindicaciones de la 1 a la 10). También es objeto de la invención, el uso del ácido fer�lico en la preparación de un control anormal de la coagulación para ensayos in vitro (reivindicación 11).

    1.NOVEDAD Y ACTIVIDAD INVENTIVA (Art. 6.1 Y 8.1 LP)

    1.1. REIVINDICACIÓN 11

    El objeto de la solicitud, según la reivindicación 11, es el uso del ácido fer�lico en la preparación de un control patológico de la coagulación en ensayos in vitro.

    Aunque D01 y D02 divulgan la capacidad anticoagulante del ácido fer�lico, no se anticipa que esta actividad inhibidora sea de amplio espectro, característica que le confiere una ventaja en su uso como control patológico. Además, aunque en los documentos D04, D05 y D06 s� se muestra que dicha propiedad se encuentra en diferentes pol�meros derivados del ácido fer�lico, ninguno de ellos induce a investigar la actividad inhibitoria del ácido fer�lico.

    En consecuencia, se considera que la reivindicación 11 cumple los requisitos de novedad y actividad inventiva (art. 6.1 y 8.1 LP).

    1.2.REIVINDICACIONES DE LA 1 A LA 10

    La reivindicación 1 tiene por objeto una composición que comprende plasma humano, solución isot�nica tamponada a pH 6,5-8,5 y ácido fer�lico.

    Ninguno de los documentos citados, divulga la composición objeto de la reivindicación 1. Además, aunque tanto el plasma como la solución isot�nica tamponada, son componentes habituales en los procesos de medición de la coagulación, ninguno de los documentos de D01 a D06, llevarían al experto a la materia a la utilización del ácido fer�lico como control patológico en la medición de los procesos de coagulación, y por tanto a la obtención de la composición reivindicada.

    Por este motivo, se entiende que la reivindicación 1 tiene novedad y actividad inventiva (art. 6.1 y 8.1 LP).

    Las reivindicaciones de la 2 a la 10 son dependientes de la reivindicación 1, y como ella presentan novedad y actividad inventiva (art. 6.1 y 8.1 LP).

    Informe del Estado de la Técnica Página 5/5