JP2015175850A - インビトロアッセイにおいて凝固異常コントロール血漿として用いるための組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】インビトロアッセイにおいて凝固異常コントロール血漿として用いるための組成物を提供すること。【解決手段】本発明は血液の臨床分析の分野に関するものであり、具体的には止血、凝固および繊維素溶解アッセイにおける凝固異常コントロールとして用いられる、ヒト血漿、緩衝された等張液およびフェルラ酸を含む組成物に関する。本発明は止血アッセイにおける異常コントロール血漿の調製におけるフェルラ酸の使用にも関する。【選択図】なし

Description

本発明は血液の臨床分析の分野に関するものであり、具体的には止血、凝固および繊維素溶解アッセイにおいて凝固異常コントロールとして用いられる、ヒト血漿、緩衝された等張液およびフェルラ酸を含む組成物に関する。本発明は止血アッセイにおける異常コントロール血漿の調製におけるフェルラ酸の使用にも関する。

止血は血管系を有する動物の、傷を負った後の出血を防ぐ一群のメカニズムである。止血メカニズムは以下のような種々の重要な機能を有する：（a）血管系を流れる際の血液を液体状に保つ、（ｂ）傷または失血がある場所で、塊を形成することにより出血を止める、（ｃ）傷が治ったら塊りを確実に除去する。一般的に、止血には5つの要素が含まれる。すなわち、血管、血小板（細胞成分）、凝固因子、凝固阻害因子および線溶系である。すなわち、止血は完璧なバランスで相互作用しなければならない凝固推進力および抗凝固力の一群の力を含む。このバランスは種々のタンパク質によって制御されており、凝固因子として知られている。これは、いかなるアンバランスも血栓形成促進性状態または血液疾患のいずれかにつながりかねないという非常に微妙なバランスである。

いかなる欠損の存在も生命を脅かすので、凝固機能を詳細に測定することは非常に重要である。これは、血栓塞栓性条件で凝固治療を受けている患者では特に重要である。

止血研究所の役割は、血液学的疾病および血栓性疾病における生理学的変化を検出し、認識することである。そのため、主要な止血アッセイ、血液凝固測定アッセイおよび免疫学的アッセイ等の種々のアッセイが用いられており、それにより医療従事者が詳細に診断し、そのための適切な治療を案出するのを助けるための有益な情報が得られている。

止血アッセイは、二つの異なる群に分けることができる。プロトロンビン時間（PT）、活性化部分トロンボプラスチン時間（aPPT）、フィブリノーゲン濃度の測定およびトロンビン時間（TT）を含み得る、初期止血アセスメント；およびレプチラーゼ時間（RT）、活性凝固時間（ACT）並びに抗トロンビン（AT）、プロテインC、プロテインS、フォンヴィレブランド因子、プラスミノーゲンおよびα２−抗プラスミン（プラスミン阻害因子）の濃度の測定を含み得る他の群である。

止血研究所では、患者の試料は作業日を通じて広範な種類の止血スクリーンおよび具体的なアッセイについて分析される。これらのアッセイにおいて、止血アッセイの効率と効力に影響する種々の要素の方法論的な制御が、正確な診断のために不可欠である。コントロール血漿の使用は、研究所で行われる内部品質コントロールに重要な役割を果たしている。

止血研究所で用いられている試薬および機器が正しく機能することを確実にするために、一定の時間間隔を置いて正常凝固時間レンジ中に一つのコントロール、そして異常レンジのなかでもう一つを用いることが高度に推奨される。いくつかの凝固アッセイについては、コントロール材料を試験すべき頻度についての推奨が発行されている。例えば、臨床および研究標準研究所（the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)）はPTおよびaPPTアッセイに関するガイドラインを発行している。当該文献は、もし試料が、多くの研究所で行われているような連続的な方式で処理される場合には、少なくとも、8時間毎またはもっと頻繁に、2つのレベルのコントロール材料を試験することを推奨している。CLSIからのこの文献は、コントロール試料は、試薬の変更、新たな試薬の追加、または重要な機器の変更に続く最初のアッセイで用いられるべきであることを示している。コントロールは、用いられている凝固計システムおよび用いられている試薬の両方における凝固アッセイの正確な分析および偏差のアセスメントを可能にする。

凝固コントロール血漿の調製については、文献が発行されており、それらのうちのいくつかの血漿は現在市場で入手可能である。しかし、記載された方法の大部分は時間がかかり、費用の高い、凝固異常の特徴を得るための決定的な血漿タンパク質因子の吸収の工程を含んでいる。凝固異常コントロール血漿を調製するための方法の一つは、正常血漿を水酸化アルミニウムと一緒にインキュベートし、結果物の上清を病理学的コントロール血漿として用いることができるというものである。沈殿物は種々の凝固因子を含んでおり、結果物の上清は病理学的コントロール血漿として用いることができる。異常な凝固時間は血漿から凝固因子を除去することによって達成される。しかし、こうして得られた凝固コンロトール血漿は完全に申し分ないというものでもない。いくつかのアッセイで異常な結果が得られたとしても、その一方で、他の、例えば因子VIII、XIおよびXIIについて、ならびに他のTTやRTのような止血アッセイでは、活性は正常な範囲にあるからである。

異常凝固コントロールを作製する他の方法は、正常血漿を希釈することである。該方法は国際ガイド(NCCLS H30-A2)に記載されており、クラウス法によってフィブリノーゲンを測定するための異常コントロール血漿の調製法に言及している。該文献も、いかにして一連の正常血漿をバービタル緩衝液で希釈して異常な結果（低フィブリノーゲン含量）を有する血漿を得ることができるかを記載している。一連の正常血漿をバービタル緩衝液で希釈した最終結果は止血アッセイの大部分で異常である。しかし、該凝固コントロール血漿は例えばTTおよびRTについては異常ではない。同じ結果は、正常血漿を他の溶液、例えば４％アルブミン溶液で希釈することによって得ることができる。

本願発明は、前述の欠点を全て克服する凝固異常コントロール血漿を開示する。本願発明の異常コントロール血漿は、TT及びRTを含む多くの止血アッセイにおける異常レンジ、及び具体的な凝固因子の活性の測定の両方における結果を確かなものにする。本願発明者らは驚くべきことに、正常血漿に、等張液中のフェルラ酸を添加することによって、大部分の止血アッセイにおいて効果的に用いることができる異常コントロール血漿を得ることができることを発見した。

特に何らの理論に結びつけることなしに、このフェルラ酸の特性はその独特の抗凝血性特性によって得ることができる。しかしながら、ある物質が抗凝血性特性を有することは、異常血漿を製造するのに適していることを意味するものではない。例えば、ワルファリンは血栓のリスクのある患者を取り扱う医療において最も広く用いられている抗凝血剤の一つであり、５０年以上に渡って薬品として用いられてきた。しかし、この化合物は、作用機構がビタミンKに依存する凝固因子産生の阻害に基づくものであるので、血漿に添加して凝固異常コントロールを製造するのには適していない。抗凝血剤として、ワルファリンは完全にインビトロの系を必要とする。

ヘパリンやエチレンジアミン四酢酸（EDTA）のような他の抗凝血剤は実際正常血漿に添加して止血アッセイで異常時間を作ることができる。しかし、本願発明の発明者らはヘパリンやEDTAでは同様の結果は得ていない。これらの抗凝血剤はいずれも止血アッセイに矛盾する効果を及ぼすので、異常血漿の製造には適していない。すなわち、あるアッセイにおける異常時間を得るための最適濃度は他のアッセイにおいて不十分または過度になってしまうのである。例えば、ヘパリンはaPTTアッセイを延長するが、PTアッセイには影響を及ぼさないか、低い程度であり、ヘパリンはRTアッセイを延長しないか、またはRTに関しては異常血漿を製造しない。EDTAについても同様であり、ある濃度で、RTアッセイを延長するが、PT、aPPT及びTTアッセイには影響しないか、あってもほんの少しである。

したがって、本発明は、フェルラ酸、緩衝された等張液及びヒト血漿を含む、止血アッセイにおいて凝固異常コントロール血漿として用いるための組成物を開示する。

本発明の組成物において、「ヒト血漿」は赤血球、白血球及び血小板が除去された血液の液体部分をいう。加えて、本願発明の前記組成物中で用いられるヒト血漿は、種々のアッセイにおいて正常な凝固時間を有し、凝固アッセイで正常コントロールとして用いることができるものである。当該血漿は当分野で公知のいかなる方法、例えば血漿分離交換法で得ることができる。

本願発明の組成物の止血アッセイにおける凝固異常コントロールへの付加的な利点は、当該組成物は、凍結または凍結乾燥することができ、一度解凍または再構成しても安定なことである。

止血アッセイにおける凝固異常コントロールのための組成物を得るためには、２以上の健康なヒトのドナーからの血漿を含む正常血漿のプールを用いるのが好ましい。当該血漿プールは好ましい容器中で穏やかに混合することによって調製することができる。本発明の組成物における正常血漿の濃度は１５％（ｖ／ｖ）〜７５％（ｖ／ｖ）の範囲内である。

本発明の止血アッセイにおける凝固異常コントロールのための組成物中に存在する緩衝された等張液の主な役割は、生理的ｐＨ、すなわち６．５〜８．５の間、の前後にｐＨを維持するためだけではなく、フェルラ酸と組み合わせた場合に異常凝固時間が得られるように血漿を希釈することができるようにするためである。本願発明の等張液は当分野で公知のいかなる等張液でもよい。好ましくは、本願発明の等張液は、ｐＨを、６．５〜８．５の間である生理的ｐＨの値前後に維持する緩衝液である（例えば、Tris, HEPES, MOPS または CHAPSである）。本発明の組成物における等張液の量は、４０％（ｖ／ｖ）〜７０％（ｖ／ｖ）の範囲内にある。

一方で、本発明の組成物におけるフェルラ酸の量は約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約１％（ｗ／ｖ）の範囲内にある。

また、止血アッセイにおける凝固異常コントロールのための本発明の組成物は、任意選択的に凝固因子安定剤を含んでいてもよい。凝固因子安定剤は当該組成物に付加的な安定性を与えることができる。当該凝固因子安定剤は好ましくはグリシンであり、より好ましくは、当該グリシンは本発明の止血アッセイにおける凝固異常コントロールのための組成物中に、約０．１％（ｗ／ｖ）〜約４％（ｗ／ｖ）の量で存在する。

止血アッセイにおける凝固異常コントロールのための本発明の組成物は、任意選択的に、タンパク質安定剤又はタンパク質添加物および／またはバルク剤（bulking agent）および防腐剤を含んでいてもよい。当該安定剤の主な役割は、凍結乾燥されたときにタンパク質の機能を維持することである。当該安定剤は当業者に公知のいかなる安定剤であってもよい。

最後に、本発明は止血アッセイにおける凝固異常コントロールの調製におけるフェルラ酸の使用を開示する。

本発明は説明的な実施例および以下の図面を参照してさらに詳細に記載されるが、本発明を限定するものではない。

図１はＰＴ止血アッセイにおけるコントロール試料についてのフェルラ酸の効果を示す。 図２はＰＴ止血アッセイにおけるコントロール試料についてのヘパリンの効果を示す。 図３はＰＴ止血アッセイにおけるコントロール試料についてのＥＤＴＡの効果を示す。 図４はａＰＴＴ止血アッセイにおけるコントロール試料についてのフェルラ酸の効果を示す。 図５はａＰＴＴ止血アッセイにおけるコントロール試料についてのヘパリンの効果を示す。 図６はａＰＴＴ止血アッセイにおけるコントロール試料についてのＥＤＴＡの効果を示す。 図７はＴＴ止血アッセイにおけるコントロール試料についてのフェルラ酸の効果を示す。 図８はＴＴ止血アッセイにおけるコントロール試料についてのヘパリンの効果を示す。 図９はＴＴ止血アッセイにおけるコントロール試料についてのＥＤＴＡの効果を示す。 図１０はＲＴ止血アッセイにおけるコントロール試料についてのフェルラ酸の効果を示す。 図１１はＲＴ止血アッセイにおけるコントロール試料についてのヘパリンの効果を示す。 図１２はＲＴ止血アッセイにおけるコントロール試料についてのＥＤＴＡの効果を示す。

実施例１ 止血アッセイのための異常血漿コントロール組成物の調製

種々の止血アッセイにおいて異なった抗凝血剤の効果を評価するため、異なった血漿組成物を調製した。用いたのはクエン酸塩化した正常ヒト血漿（クエン酸１６ｍＭ）であり、−７０℃で保存し、３７℃のバスで解凍した。その後、ＨＥＰＥＳを最終濃度４０ｍＭまで添加し、１ＮのＮａＯＨを用いてｐＨを７．４〜７．６に調整した。種々の血漿組成物を調製した。最初の組成物には抗凝血剤は添加せず、コントロールとして用いた。分析しながら抗凝血剤の濃度を増加させて他の成分：フェルラ酸 (0.5 %, 1 % and 1.5 %), ヘパリン (0.1 IU/mL, 0.5 IU/mL and 1 IU/mL) および EDTA (0.5mg/mL, 1mg/mL, 1.5 mg/mL)に添加した。それぞれの血漿組成物を、Q 止血分析器 (Q Haemostasis Analyzer、Diagnostic Grifols, Spain)で前記PT, aPTT, TTおよびRTアッセイについてDiagnostic Grifolsの試薬DG-PT、DG-APTT Synth, DG-TT L HumanおよびGD-Fibroclotinを用いて分析した。

実施例２ ＰＴアッセイにおける抗凝血剤を含む組成物の効果

図１〜３は種々の抗凝血剤でのＰＴアッセイで得られた結果を示し、血漿中に存在する抗凝血剤の濃度の関数としてのＰＴアッセイで得られた時間をプロットしたものである。コントロール（抗凝血剤を含まない血漿）は三角で示し、フェルラ酸、ヘパリンおよびＥＤＴＡを含む組成物は四角で示した。フェルラ酸（図１）およびＥＤＴＡ（図３）は、血漿中に存在する抗凝血剤の量に比例してＰＴ活性の百分率が減少しているのが見られる。対照的に、ヘパリン（図２）は抗凝血剤を含まない血漿の結果と異なる結果を引き起こさなかった。これは、試験された濃度では、ヘパリンはＰＴアッセイに影響を及ぼさないことを意味している。一方、正常血漿に添加されたフェルラ酸とＥＤＴＡはＰＴ活性の百分率を減少させた。

実施例３ aPPTアッセイにおける、抗凝血剤を含む組成物の効果

実施例１で調製したのと同じ血漿をaPPTアッセイで試験した（図４〜６）。このアッセイでは、血漿に添加した抗凝固剤、すなわち、フェルラ酸（図４）、ヘパリン（図５）およびＥＤＴＡ（図６）のいずれもPTアッセイを延長した。また、アッセイの結果における延長は、血漿中に存在する抗凝血剤の量に比例している。

実施例４ TTアッセイにおける、抗凝血剤を含む組成物の効果

実施例１で調製したのと同じ血漿をTTアッセイで試験した。図７〜９は調製した血漿を試験した時のTTの結果を示す。分析した３つの抗凝血剤のうち、ＥＤＴＡ（図９）はアッセイの結果を延長せず、つまり、異常TTを生成しなかった。対照的に、ヘパリン（図８）およびフェルラ酸（図７）は異常TTを生成した。

実施例５ RTアッセイにおける、抗凝血剤を含む組成物の効果

実施例１で調製したのと同じ血漿をRTアッセイで試験した。RTアッセイの結果について（図１０〜１２）、正常血漿プールに添加した後に異常な結果を生成しなかったのはヘパリン（図１１）だけだった。ヘパリンは試験したどの濃度でもRTを延長していない。抗凝血剤、フェルラ酸（図１０）およびＥＤＴＡ（図１２）を含む血漿は異常なRT結果を生成した。

実施例及び前記図面に示される結果に基づいて、正常な血漿に添加された後の、全ての止血アッセイにおけるフェルラ酸の抗凝血力および異常結果を引き起こす能力は明らかである。加えて、フェルラ酸はアッセイをバランスよく延長するので、異常コントロール血漿の製造に適している。

本発明は好ましい実施態様について記載されているが、これらは本発明に対する限定と考えるべきではなく、請求項のより広い解釈によって定義される。

Claims (11)

1. インビトロアッセイにおいて凝固異常コントロール血漿として用いるための組成物であって、ヒト血漿、緩衝された等張液およびフェルラ酸を含み、当該ヒト血漿が公知のヒト血漿抽出法で得られたものであり、緩衝された等張液のｐＨが６．５と８．５の間である、組成物。
2. 前記ヒト血漿が、種々の凝固アッセイにおいて正常な凝固時間値を有するものである、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ヒト血漿が２以上の健常なヒトドナーからの血漿を含む正常血漿プールである、請求項１または２に記載の組成物。
4. ヒト血漿の濃度が、１５％（v/v）〜７５％（v/v）の範囲内である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 当該等張液の量が、４０％（v/v）〜７０％（v/v）の範囲内である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
6. フェルラ酸の量が、０．０１％（w/v）〜１％（w/v）の範囲内である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
7. さらに凝固因子安定剤を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 前記凝固因子安定剤がグリシンである、請求項７に記載の組成物。
9. グリシンが、０．１％（w/v）〜４％（w/v）の量で当該組成物中に存在する、請求項８に記載の組成物。
10. さらにタンパク質安定剤および防腐剤を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
11. インビトロアッセイにおける異常凝固コントロールの調製におけるフェルラ酸の使用。

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