JPH10508945A

JPH10508945A - 血栓性疾患の診断方法

Info

Publication number: JPH10508945A
Application number: JP8516310A
Authority: JP
Inventors: ジョンエイチグリフィン; サミュエルアイラパポート; ズンティーレ
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1994-11-13
Filing date: 1995-11-13
Publication date: 1998-09-02
Also published as: US6083757A; US5834223A; WO1996015457A1; US5705395A; EP0791177A4; AU4160396A; CA2205180A1; EP0791177A1

Abstract

(57)【要約】本発明は血栓性疾患を有し、または有するおそれのある被験者のその疾患の診断に有益なin vitro方法を提供する。詳しくは、本明細書に例示された疾患は活性化プロテインＣ(APC)耐性因子Ｖ及びVaと関連する。被験者を診断するために、試験サンプルの凝固時間が活性化プロテインＣ(APC)の存在下及び不在下で分析され、標準の基準サンプルと比較される。

Description

【発明の詳細な説明】血栓性疾患の診断方法本発明は国立健康協会からの助成金番号HL 27234、HL 31950、及びHL 21544により政府の支持によりなされた。政府は本発明に或る種の権利を有する。発明の背景 1.発明の分野本発明は一般に血液学及び血液凝固障害の分野、詳しくは血栓性疾患について被験者を診断し、スクリーニングする方法に関する。 2.関連技術の説明 1993年に、Dahlback及び共同研究者ら(Dahlback ら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA ，90:1004，1993)は、血漿の活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)を適当に延長するための活性化プロテインＣ(APC)の欠損を特徴とする家族性血栓閉塞症に関する従来認識されていなかったメカニズムを記載した。続いてAPTTの不十分なAPC 誘導延長が血栓閉塞症を有する患者のコホート中で著しく高い罹患率で見られ(Griffinら，Blood，82:1989，1993; Kosterら，Lancet，342:1503，1993; Svensson及びDahlback，N.Engl.J.Med.，330:517，1994）、ファミリー研究が伝染のその常染色体優性様式を確立した(Koster,上記文献; Svensson，上記文献）。その後まもなく、Dahlback及びHildebrand（Dahlback及びHildebrand Proc.Na tl.Acad.Sci．USA，91:1396，1994）は、APC 耐性が因子Ｖ(FV)分子の異常性に由来することを報告した。 Bertina ら及びGreengard ら(Bertinaら，Nature，369:64，1994; Greengard ら，Lancet，343:1361，1994）はFV異常性に関する分子基礎を最初に同定した。 APC 耐性の表現型は、グルタミンによるアミノ酸残基506 におけるアルギニンの置換をもたらすFV遺伝子中の単一点突然変異(FVR506Q)に関する異型接合性または同型接合性と関連することが示された。このR506Q 突然変異は因子Vaを不活化するのに必要とされるFV中のArg-506 でペプチド結合を開裂することからAPC を阻止する(Bertina，上記文献; Sun ら，Blood，83:3120，1994)。 APC 耐性FVは遺伝性栓友病の最も流行した原因であることが明らかであるので、種々の状況で使用し得る信頼できる迅速な凝固試験が血栓症の個人履歴または家系履歴を有する患者を評価するのに必要とされる。現在まで、APC 耐性の検出は、血漿がカルシウムイオン＋APC の存在下で凝固されるAPTT試験の凝固時間と、血漿がカルシウムイオン単独の存在下で凝固されるAPTT試験の凝固時間の比(A PC比)を得ることに基いていた。試験サンプルのAPC 比が対照集団について確立された範囲の下に低下する場合に、その試験は陽性と考えられる。この試験の使用が増加するにつれて、慎重な標準化が一致し、かつ再現性の結果を得るのに最も重要であることが明らかになった(Svensson,上記文献)。例えば、血小板不足血漿の調製中の血小板の活性化(Cooper ら，British Soc.for Ha ematology，33，1994)、及び凍結、解凍した血漿の使用(Girolami ら，Lancet,3 43:1288，1994; Jones 及びWinter，British Soc.for Haematology，32，1994) が試験結果を変化し得ることが報告されている。更に、その試験は患者の二つの重要なグループ：ワーファリン(Svensson,上記文献)の如き経口用血液凝固阻止薬を服用する患者、及びループス血液凝固阻止薬(Bokarewa ら，Blood Coagul F ibrinolysis，5:37，194; Hamptonら，N.Engl.J.Med.，331:130，1994)を使用する患者からの血漿には使用し得ない。凝固因子を含む患者サンプルへの活性化プロテインＣの添加及び添加されたAP Cにより影響される酵素活性の測定により診断し得る血栓閉塞病があることが認められていたが、このような疾患はAPC による分解に対し耐性である因子VaまたはVIIIaに関係しない(Dahlback，WO93/10261)。加えて、この試験は上記患者の二つのグループ、例えば、ワーファリンの如き経口用血液凝固阻止薬を服用する患者、及びループス血液凝固阻止薬を使用する患者を試験するための方法を含んでいない。技術上の制限のために、APC 耐性FVまたはFVa を検出するための特異的凝固試験に対する要望がある。本発明はこの要望を満足し、かつ従来技術の試験に関連する問題の多くを解消する。本発明のアッセイは、凝固がカルシウム単独で開始される時、及び凝固がカルシウム＋APC で開始される時に、試験サンプルの凝固時間が測定される１段階の組織因子依存性FVアッセイに基いている。その試験は血漿の特別な取扱いを必要とせず、凍結、解凍された血漿について行うことができ、かつ患者の現行の治療レジメ（例えば、ワーファリン、ヘパリン）にかかわらず、FV耐性APC を試験することが指示されるあらゆる患者により使用し得る。発明の要約本発明はAPC 耐性因子ＶまたはVaの検出のための新規かつ特異的な凝固試験を提供する。その試験は、凝固が開始された後に、試験サンプルの凝固時間が測定される１段階の凝血原依存性因子Ｖアッセイに基いている。その試験は血栓性疾患、例えば、栓友病を有する被験者及び血栓性疾患、例えば、栓友病を有するおそれのある被験者の両方に有益である。本発明は、活性化プロテインＣ(APC)耐性因子ＶまたはVaと関連する血栓性疾患を有する被験者または血栓性疾患を有するおそれのある被験者を診断するためのin vitro方法であって、被験者からの標本を含む凝固因子、凝血原試薬及び因子Ｖ不足血漿を含む第一試験サンプルをカルシウム及びAPC と接触させ、被験者からの標本を含む凝固因子、凝血原試薬及び因子Ｖ不足血漿を含む第二試験サンプルをカルシウムと接触させ、そして第一試験サンプル及び第二試験サンプルについて凝固時間を分析することを特徴とする方法を提供する。凝血原試薬は組織因子であり、リン脂質試薬を含むことが好ましい。図面の簡単な説明図１は正常なプールされた基準血漿の希釈液のAPC の有無の場合のFVアッセイで得られた一次プロット及び二次プロットを示す。図1AはAPC を使用して（▲）また使用しないで（○）行われたFVアッセイに関してプールされた正常な基準血漿の濃度（％）のlog に対し凝固時間のlog をプロットすることにより得られた基準曲線（一次プロット）を示す。(Y)試験サンプルで得られた仮説上の凝固時間、これは工程(a)及び(b)によりプールされた正常な基準血漿の均等希釈液(X) に変換される。図1Bはプールされた正常な基準血漿の濃度（％）のlog に対する APC の有無の場合のFVアッセイで得られた凝固時間の差のlog のプロットを示す。両方のプロット中の線はデータの線形回帰線である。（◆）図1Aのデータから誘導された凝固時間差；（◇）正常被験者からの仮説上の結果；（■）異型接合性FV R506Q被験者からの仮説上の結果。図２は39人の対照被験者からの結果の二次プロットを示す。A)FVアッセイが対照被験者からの血漿の希釈液についてAPC の有無の場合に行われた時に得られた凝固時間差がプールされた正常な基準血漿のそれらの夫々の均等希釈液に対しプロットされる。（◆）プールされた正常な基準血漿；（◇）対照被験者のうちの 37人；（■、○）FV R506Qに関して異型接合体であることがその後に発見された二人の対照被験者。下部の破線はFV R506Qに関して異型接合体からの血漿の希釈液で得られたデータの回帰線である。10の異なる日におけるプールされた正常な基準血漿の希釈液のアッセイから得られた二次プロットの平均回帰線が実線により示される。点線は平均回帰線の傾斜の95％信頼限界を示す。B)正常対照被験者（レーン３）及び図1Aに示された異常な結果を有する二人の対照被験者（レーン１及び２）からのFVのPER 増幅された167-bpＤＮＡ断片のMnl Ｉ消化産物の２％アガロースゲル。レーン４は100-bpＤＮＡラダー(ladder)標準物質である。図３はワーファリンによる血液凝固阻止薬治療を受けている21人のランダムに選ばれた患者からの二次プロットを示す。（◇）APC に対する応答が正常とは異ならなかった20人の患者（図2Aと比較のこと）；（■）FV R506Qに関して異型接合性であることが後に示された患者。その他の記号は図２の記号の説明に記載されたとおりである。図４は遊離プロテインＳ不足を有する15人の患者からの結果の二次プロットを示す。（◇）APC に対する応答が正常被験者とは異ならなかった13人の患者；（ ■）APC に対する応答がFV R506Qに関する異型接合性と一致した患者；ワーファリン治療の有る場合（○）または無い場合（○）に関する第二異型接合体患者全体。その他の記号は図２に関する記号の説明に記載されたとおりである。図５はループス血液凝固阻止薬を使用する29人の患者からの結果の二次プロットを示す。A)（◇）APC に対する応答が正常被験者とは異ならなかった24人の患者；（○，■，□、▲、●）APC に対する応答がFV R506Qに関する異型接合性と一致した患者。その他の記号は図２の記号の説明に記載されたとおりである。B) レーン１−３、4Aからの３種の異型接合体のＤＮＡ分析；レーン４、正常被験者。図６は21人の患者からの結果の二次プロットを示す。A)（◆）プールされた正常な基準血漿；（◇）APC に対する応答が正常とは異ならなかった11人の患者。その図の左下部分に見られる全てのその他の記号は、APC に対する応答がFV R50 6Qに関する異型接合性と一致した10人の患者からの血漿の２種以上の希釈液で得られた凝固時間差を表す。B)レーン１−４、6Aからの10種の異型接合体のうちの４種のＤＮＡ分析。レーン５は正常被験者に関する結果を示す。発明の詳細な説明本発明は試験サンプルの凝固時間のAPC 依存性差異に基く新規な凝血原試薬依存性因子Ｖ凝固アッセイを提供する。そのアッセイは正常被験者及びAPC 耐性FV に関して異型接合性または同型接合性である被験者を区別するのに有益である。第一実施態様において、本発明は活性化プロテインＣ(APC)耐性因子ＶまたはV aと関連する血栓性疾患を有する被験者または血栓性疾患を有するおそれのある被験者を診断するためのin vitro方法であって、被験者からの標本を含む凝固因子、凝血原試薬及び因子Ｖ不足血漿を含む第一試験サンプルをカルシウム及びAP C と接触させ、被験者からの標本を含む凝固因子、凝血原試薬及び因子Ｖ不足血漿を含む第二試験サンプルをカルシウムと接触させ、そして第一試験サンプル及び第二試験サンプルについて凝固時間を分析することを特徴とする方法を提供する。被験者はヒトであることが好ましい。本発明の方法はAPC 耐性因子ＶまたはVaと関連する血栓性疾患を有する被験者並びにこのような疾患のおそれのある被験者を診断するのに有益である。このような疾患のおそれのある被験者として、例えば、血栓症の家系履歴を有する被験者、妊婦、敗血症患者、抗リン脂質抗体症候群（例えば、ループス血液凝固阻止薬抗体、抗カルジオリピン抗体）を有する被験者及び手術を受けている患者が挙げられる。本明細書に使用される“血栓性疾患”は破損血管または破損されていない血管中の血餅を特徴とする疾患を表す。血餅それ自体は血栓と称される。血栓性疾患として、血栓閉塞症が挙げられるが、これに限定されず、この場合、血餅または血餅の片が破損され、血流により別の部位に輸送され、潜在的に循環を損なう。また、血栓性疾患として、遺伝性の血栓性疾患及び非栓友病（血栓症にかかりやすくする全身性鬱血の疾患）が挙げられる。 APC 耐性因子ＶまたはVaの遺伝子型は最も頻繁にはFV遺伝子中の単一点突然変異であり、この場合、アミノ酸残基位置506 にあるアルギニンがグルタミンで置換される。このR506Q 突然変異は、因子Vaの不活化に必要とされるR506にあるペプチド結合を通常開裂することからAPC を阻止する。それ故、“APC 耐性因子ＶまたはVaと関連する血栓性疾患”という用語は先に定義された血栓性疾患を表し、その疾患はAPC 耐性を生じるFVまたはFVa 中の点突然変異により少なくとも一部引き起こされ、または併発される。本発明の方法において試験サンプルとして使用される凝固因子を含む標本は、当該因子を含むあらゆる標本であってもよく、血漿サンプルであることが好ましい。本明細書に使用される“凝血原試薬”は、血餅形成を開始または刺激することができるあらゆる試薬を表す。本発明の凝血原試薬として、固有の凝固経路のアクチベーター、例えば、因子Xa^-、因子IXa、因子XIa 及び因子XIIaからなる群から選ばれた凝固因子が挙げられる。固有の経路によりその系を活性化するその他の凝血原試薬として、カリクレイン、APTT（活性化部分トロンボプラスチンタイム、即ち、リン脂質及び接触アクチベーターを含む試薬）が挙げられる。ラッセルのクサリヘビ毒物(RVVタイム)がまた凝血原試薬として使用し得る。凝血原試薬として本発明の方法に使用される接触アクチベーターとして、当業者に知られている微粉砕シリカ粒子、エラグ酸、スルファチド、カオリン等が挙げられる。凝血原試薬は組織因子または組織トロンボプラスチンであることが好ましい。組織因子の如き凝血原は、例えば、ウサギ脳またはウシ脳からの粗天然抽出物であってもよく、または精製もしくは組換え組織因子試薬であってもよい。凝血原試薬の最適濃度は、使用される試薬に応じて、当業者により決定し得る。凝血原試薬は本来外傷組織から典型的に放出されたリン脂質の如きリン脂質を含んでもよく、または精製もしくは組換え凝血原試薬の場合には、リン脂質が試験サンプル中に外在的に含まれていてもよい。当業者は凝血原リン脂質試薬を容易に同定し得る。このようなリン脂質凝血原試薬は試験サンプル中に約５〜100 μM、最も好ましくは約10〜50μM の濃度で存在することが好ましい。試験サンプル中に含まれる因子Ｖ不足血漿は市販の源から入手でき、または例えば、抗FV抗体による血漿の免疫吸着により得られる。血漿の如き標本は、試験成分を添加する前に、例えば、生理的平衡緩衝液（例えば、食塩加トリス緩衝液）中で希釈されることが好ましい。試験標本がアッセイの時点で血液凝固阻止薬（例えば、ヘパリンまたはワーファリン）治療を受けている被験者、またはループス血液凝固阻止薬を使用する被験者から得られる場合、標本が希釈されることが好ましい。好ましい希釈は約1:2 から1:300 まで、最も好ましくは約1:6 から 1:100 までである。試験標本の幾つの希釈液が調製され、希釈曲線が得られることが好ましい。本発明の方法は試験サンプルへのカルシウムの添加を含む。カルシウム(Ca²⁺) は遊離の錯生成されていない形態のCa²⁺イオンを与える血漿可溶性塩の形態であってもよく、即ち、強いCa²⁺キレート剤は避けられるべきである。試験サンプル中のCa²⁺の最終濃度は約0.5 mMから50mMまでであることが好ましく、約５mMから 15mMまでであることが最も好ましい。本発明の方法に使用される活性化プロテインＣ(APC)はヒト源または非ヒト源から誘導されてもよい。試験サンプル中のAPC の濃度は約10ng/ml から50μg/ml まで、好ましくは約100ng/mlから10μg/mlまで、最も好ましくは約200ng/mlから１μg/mlまでである。本発明の方法は上記の第一試験サンプル（これはAPC を含む）、及び第二試験サンプル（これはAPC を含まない）について行われる。当業者は、APC の存在または不在のみを異にする２種の試験サンプルが得られるように、試験サンプル調製が第一試験サンプル及び第二試験サンプルを生成するように改良し得る種々の方法を容易に確かめることができる。例えば、標本、凝血原試薬及び因子Ｖ不足血漿を含む単一の初期試験サンプルが生成でき、初期サンプルの二つの別々のアリコートに、カルシウムまたはカルシウム＋APC が添加される。また、共通の初期試験サンプルの調製が避けられ、APC の存在のみを異にする二つの平行の試験サンプルが別々に調製される。試験サンプルは、サンプルの夫々の凝固時間を測定し、それらを互いに比較し、また外部標準サンプル（例えば、本明細書に記載された疾患を有しない正常被験者またはそのおそれのない正常被験者）について得られた正常基準インターバル値と比較することにより分析される。凝固時間の結果を分析するのに幾つかの方法がある。例えば、APC の存在下の試験サンプル及びAPC の不在下の試験サンプルに関する凝固時間の差が測定でき、結果が“凝固時間差”として表される。凝固時間差は実施例で説明される。簡単に言えば、試験血漿を生理平衡緩衝液( 例えば、食塩加トリス緩衝液(TBS))中で希釈し（例えば、1:20、1:40及び1:80）、続いて適当な試薬を添加して凝固を開始させる。凝固時間を測定し、好ましくは二重サンプルの平均として記録する。好ましくは、毎回、アッセイが行われ、夫々のアッセイ条件に関する基準曲線が、例えば、プールされた正常基準血漿の緩衝液中の希釈(即ち、1:10〜1:100)に対する凝固時間のlog/log プロットとして作成される。 APC の存在下の試験サンプルとAPC の不在下の試験サンプルの凝固時間の比がまた測定でき、結果が比として表される。加えて、上記のような、試験サンプルの凝固時間の比が基準血漿の凝固時間の比と平行に測定し得る。これらの比が標準化され、血液凝固阻止薬、例えば、ワーファリンの存在下で試験された標準血漿サンプル、及び標準正常血漿サンプルと比較される。上記凝固時間の比較は、試験される標本からの試験サンプルと同じ条件下で同じ試験サンプル添加を受けた正常個体からのサンプルについて得られた標準値とともに常に測定される。標準値と較べて正常ではないサンプル凝固時間の知見はその疾患を患っている被験者の指示として、またはその疾患になるおそれがあるものとして解され、特に増進された凝固時間は血栓性疾患の指示またはこのような疾患になるおそれとして解される。詳しくは、因子ＶまたはVaのArg506Gln(R506Q)突然変異について異型接合性である被験者と較べて、更に長い凝固時間が本明細書に記載されたAPC 耐性因子ＶまたはVa疾患を有しない被験者からの正常試験サンプルで観察される。同様に、同型接合性突然変異を有する被験者と較べて、更に長い凝固時間が異型接合性突然変異を有する被験者について観察される。血液が凝固するのに必要とされる時間の長さは、凝血原試薬及び因子Ｖ不足血漿、カルシウム及びAPC を含む、凝固因子の濃度に依存し、換言すれば、試験サンプルの希釈に依存する。本発明のアッセイに使用するための物質はキットの調製に理想的に適している。このようなキットは一つ以上の容器装置、例えば、バイアル、チューブ等を密に閉じ込めて収容するように区画化されているキャリヤー装置を含み、容器装置の夫々がその方法に使用される別々の要素の一つを含む。本発明のキットは活性化プロテインＣ(APC)耐性因子ＶまたはVaと関連する血栓性疾患を有し、または有するおそれがある被験者のその疾患の診断に有益であり、そのキットは凝血原試薬を含む第一容器、因子Ｖ不足血漿を含む第二容器、及び活性化プロテインＣ(APC)を含む第三容器を含む一つ以上の容器をその中に密に閉じ込めて収容するように区画化されているキャリヤー装置を含む。更に別の容器が必要によりCaCl₂の如きカルシウム試薬またはその他の試薬を溶解もしくは希釈するのに適した希釈剤を含んでもよい。以下の実施例は本発明を説明することを目的とするものであり、本発明を限定することを目的とするものではない。それらは使用し得るものの代表例であるが、当業者に知られているその他の操作がまた使用し得る。実施例１物質及び方法１．試験血漿サンプル静脈血液4.5 mlを、3.2 ％のクエン酸ナトリウム0.5 mlを含むシリコン処理したBDバキュテナー(Vacutainer)管に収集した。血小板不足血漿を室温で15分間にわたって3,000 rpmで遠心分離により調製した。試験されるまで、血漿サンプルを-70 ℃〜-80 ℃のキャップしたプラスチック管中で凍結保存した。血漿を下記の源から得た。(1)UCSD メディカル・センターの研究所サービスのスタッフ及び研究所のスタッフからの39人の無症候のボランティア；(2)ワーファリンによる経口用血液凝固阻止薬を受けているランダムに選択した患者；(3)a )正常血漿との1:1混合後に修正できなかった延長されたAPTT、b)因子VIII、IX、 XI、及びXII に関するアッセイにおいて血漿の希釈の増加につれて次第に増加する見掛け凝固活性、及びc)異常な希薄ラッセルのクサリヘビ毒物試験の組み合わせにより測定して経口用血液凝固阻止薬活性を受けている29人の患者；(4)既知の遊離プロテインＳ不足の15人の患者；(5)血栓症の履歴を有し、ループス血液凝固阻止薬または抗トロンビン、プロテインＣもしくはプロテインＳの不足について証拠のない21人の患者。血漿サンプルは数日から数年まで変化する期間にわたって凍結貯蔵されていた。２．プールされた正常基準血漿 15〜20人の健康なドナーからクエン酸緩衝剤入りの血液凝固阻止薬（0.06モル /Lのクエン酸ナトリウム＋0.04モル/Lのクエン酸）の1/10容積で収集した静脈血液から得られた血漿をプールすることにより、この血漿を調製した。それを-70 ℃で小さいアリコート中で貯蔵した。夫々のドナーからの血漿のプロトロンビンタイム及び活性化部分トロンボプラスチンタイムは、UCSDメディカル・センターの特別凝固研究所のルーチンコントロールでプールされた基準血漿に使用されたドナーからの個々の血漿サンプルのhe平均の２標準偏差以内であった。３．APC 耐性に関する組織因子依存性FVアッセイそのアッセイは、組織因子で活性化され、Ca²⁺単独及びCa²⁺＋APC で凝固される希釈された試験血漿サンプルの凝固時間を１段階FVアッセイで測定することに基いている。試験血漿を、0.1 ％のウシ血清アルブミンを含む食塩加トリス緩衝液(TBS/BSA)、pH7.5 中で1/20、1/40及び1/80に希釈し、氷の上で保存した。夫々の血漿希釈について、４つの凝固キュベットを調製し、夫々が希釈サンプル40 μl、再生されたウサギ脳トロンボプラスチン(Sigma Diagnostic，St.Louis,MO) 40μl 及び再生されたヒト免疫吸着FV不足血漿(Baxter，Miami，FL)40 μl を含んでいた。37℃で３分間のインキュベーション後に、2.5 μg/mlのAPC(Enzyme R esearch Laboratories，South Bend，IN)を含む温めたCaCl₂40 μl で凝固を二つのキュベット中で開始させた。凝固時間をST-4半自動化コアグロメーター(Dia gnostica Stago，Parsippani，New Jersey)で測定し、二重サンプルの平均として記録した。夫々の試験サンプルについて、アッセイを最初に1/40希釈で行い、次いで1/40希釈の凝固時間により決めて、1/20または1/80の第二希釈で行った。異常な結果を得た場合、試験を全ての三つの希釈で行った。毎日アッセイを行い、夫々のアッセイ条件に関する基準曲線をプールした正常基準血漿のTBS/BSA 中の1/10〜1/80希釈に対し凝固時間のlog/log プロットとして作成した。４．ＤＮＡ分析によるFV R506Q突然変異の検出酸性クエン酸塩デキストロース中に収集した静脈血液10mlから通常のハイペーク(Hypaque)勾配技術によりリンパ球に富む層を得、使用するまで-20 ℃で細胞ペレットとして貯蔵した。ゲノムＤＮＡをＤＮＡ抽出キット(Bio-synthesis，Lo usville，TX)で製造業者の指示に従って細胞ペレットから抽出した。アミノ酸Arg-506 をコードする配列を含むFVの267-塩基対(bp)断片をBertina ら(Bertina，上記文献）のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)方法の改良により得た。P CR 反応混合100 μl はＤＮＡ約１μg、２種のプライマー、PR-6967 およびPR99 020(Bertina,上記文献）夫々20 pモル、４種のデオキシヌクレオチドトリホスフェート夫々20 nモル、10X PCR 緩衝液(Perkin-Elmer，Branchburg，NJ)10μl およびTaq ポリメラーゼ(Gibco，Grand Island，NY)2.5Uを含んでいた。ＤＮＡを9 7℃で２分間変性し、自動化ＤＮＡ熱サイクラー(Perkin Elmer Cetus，Branchbu rg，NJ)中でPCR の30サイクルにかけた。夫々のサイクルは95℃で１分間の変性、50℃で１分間のアニーリング、および72℃で１分間の延長からなっていた。最後のサイクル後に、延長を72℃で７分間にわたって完結させた。次いで生成物を４℃に冷却し、更に処理するまで-20 ℃で貯蔵した。 PCR 産物の精製をQIAquick Spin PCR 精製キット(Qiagen，Chatsworth，CA)の使用により製造業者の指示に従って行った。精製ＤＮＡを10mMのTris-Cl、１mM のエチレンジアミンテトラ酢酸、pH8.0（TE 緩衝液）15μl 中で溶離し、精製ＤＮＡ11μl を製造業者の指示に従ってMnl Ｉ(Biolabs，Berly，MA)で消化した。次いで全消化物を２％アガロースゲル(Bertina，上記文献)で電気泳動にかけた。実施例２試験結果の分析の標準化図１は正常なプールされた基準血漿の希釈液のAPC の有無の場合のFVアッセイで得られた一次プロット及び二次プロットを示す。図1AはAPC を使用して（▲）、また使用しないで（○）行われたFVアッセイに関してプールされた正常な基準血漿の濃度（％）のlog に対し凝固時間のlog をプロットすることにより得られた基準曲線（一次プロット）を示す。(Y)試験サンプルで得られた仮説上の凝固時間、これは工程(a)及び(b)によりプールされた正常な基準血漿の均等希釈液(X )に変換される。図1Bはプールされた正常な基準血漿の濃度（％）のlog に対するAPC の有無の場合のFVアッセイで得られた凝固時間の差のlog のプロットを示す。両方のプロット中の線はデータの線形回帰線である。（◆）図1Aのデータから誘導された凝固時間差；（◇）正常被験者からの仮説上の結果；（■）異型接合性FV R506Q被験者からの仮説上の結果。図1Aは組織因子依存性FVアッセイ（実施例１に記載された）について得られた基準曲線の例を示す。この一次プロットに見られるように、APC を用いて行われたアッセイに関する基準曲線の傾きはCa²⁺単独を用いて行われたアッセイの傾きよりも常に大きかった。それ故、APC の有無の場合のFVアッセイの間の凝固時間の差のlog をプールされた正常な基準血漿の希釈のlog に対してプロットした（図1B）。この二次プロットに見られるように、プールされた正常な基準血漿の希釈が増大するにつれて、即ち、試験血漿中のFVの濃度が低下するにつれて、凝固時間の差が約５秒から約20秒に増加した。下記の操作を採用して、試験血漿中のFVの基礎レベル及びアッセイに使用した試験血漿の希釈の両方とは独立の試験結果を得た。 (1)図1Aのｙ軸にＹとして表される、APC を使用しない因子Ｖアッセイにおける試験血漿の希釈液の凝固時間をそのアッセイの基準曲線に配置し(図1Aの工程( a))、図1Aの横軸にＸとして表される、プールされた正常な基準血漿の均等希釈に変換した(図1Aの工程(b))。 (2)次いでプールされた正常な基準血漿のこの均等希釈に関する値を二次プロットの横軸に配置した（図1BでＸとして表される）。次いでこれを使用して(図1 Aの工程(c))、正常試験サンプルのこの希釈について予想されるAPC による凝固時間差を示した(例えば、図1Bの(◇))。APC 耐性FV R506Qに関する異型接合体では、この差が正常血漿について予想されるよりも明らかに短くあるべきである（例えは、図1Bの(■))。 APC の単一バッチ（これは-80℃で小さいアリコート中で貯蔵され、ほんの１回解凍された）を使用して、ここに示されたデータを得た。毎日アッセイを行って作成した、プールされた正常血漿基準曲線は非常に類似した一次プロット及び二次プロットを生じた。それ故、データの表示を明瞭にするために、10の異なる日に一次プロット及び二次プロットについて得られた凝固時間を使用して、線形回帰により平均の一次プロット及び二次プロットをつくった。異なる日に試験サンプルで得られた結果をこれらの平均の一次プロット及び二次プロットに関して分析した。これらの平均プロットの使用が、同日の基準プロットの使用により誘導された試験結果の解釈とは異なる試験結果の解釈を導くような実例はなかった。実施例３対照被験者からの試験結果 39人の対照被験者から得られた血漿サンプルの夫々の２種または３種の希釈液に関してAPC の有無の場合のFVアッセイを行って得られた凝固時間差が二次プロット図2Aに示される。図2A)FV アッセイが対照被験者からの血漿の希釈液についてAPC の有無の場合に行われた時に得られた凝固時間差がプールされた正常な基準血漿のそれらの夫々の均等希釈液に対しプロットされる。（◆）プールされた正常な基準血漿；（◇）対照被験者のうちの37人；（■、○）FV R506Qに関して異型接合体であることがその後に発見された二人の対照被験者。下部の破線はFV R506Qに関して異型接合体からの血漿の希釈液で得られたデータの回帰線である。 10の異なる日におけるプールされた正常な基準血漿の希釈液のアッセイから得られた二次プロットの平均回帰線が実線により示される。点線は平均回帰線の傾斜の95％信頼限界を示す。図2B）正常な対照被験者（レーン３）及び図1Aに示された異常な結果を有する二人の対照被験者（レーン１及び２）からのFVのPCR 増幅された167-bpＤＮＡ断片のMnl Ｉ消化産物の２％アガロースゲル。レーン４は10 0-bpＤＮＡラダー標準物質である。 39人のうちの37人の対照被験者について得られた凝固時間差は平均二次プロットの回帰線の近くに分布される。対照的に、２人の個体からの血漿は正常血漿について予想されたよりも著しく短い凝固時間差を生じた（図2A、■及び○）。これらの個体の両方が健康上の問題の履歴のない30才台である。その後のＤＮＡ分析は、これらの被験者の両方がFV R506Q突然変異に関して異型接合体であることを確かめた（図2B）。図2Bに見られるように、正常なＤＮＡ断片のMnl Ｉ消化は 163-bpの単一バンド（レーン３）を生じ、一方、FV R506Q異型接合体からのＤＮＡ断片のMnl Ｉ消化は変異体FV分子中のMnl Ｉ制限部位の損失から生じる200-bp の付加的なバンドを生じる（レーン１及び２）。実施例４試験結果に関するヘパリンの効果 0.5 U/mlの最終濃度のヘパリンを正常対照被験者の２人からの血漿及びFV R50 6Q突然変異に関する２人の上記異型接合体からの血漿に添加した。２人の正常被験者からの血漿の1/40希釈における凝固時間差は以下のとおりであった。ヘパリンを含まない血漿について、13.6秒及び14.5秒；ヘパリンを含む血漿について、 14.0秒及び16.0秒。２人の異型接合体被験者に関する相当する値は、夫々6.6 秒及び8.3 秒；並びに7.9 秒及び7.4 秒であった。こうして、外在性ヘパリンのこの血漿濃度（これはヘパリンによる連続の静脈内治療について推奨された血漿レベルを越える）は、試験結果の解釈を変えなかった。実施例５ APC 耐性因子Ｖに関して同型接合性の２人の患者からの試験結果血漿サンプルをＤＮＡ分析でAPC 耐性FVについて同型接合性であることが先にわかった２人の患者から入手することができた。更に長い凝固時間がAPC を用いるFVアッセイで常に得られた、異型接合体とは対照的に、これらの２種の同型接合体からの血漿はAPC を用いないFVアッセイよりもAPC を用いるFVアッセイでわずかに短い時間を一貫して生じた（表１）。実施例６ワーファリンで治療された患者からの試験結果図３はワーファリンによる血液凝固阻止薬治療を受けている21人のランダムに選ばれた患者からの結果の二次プロットを示す。（◇）APC に対する応答が正常とは異ならなかった20人の患者（図2Aと比較のこと）；（■）FV R506Qに関して異型接合性であることが後に示された患者。その他の記号は図２について記載されたとおりである。ワーファリンを受けている21人のランダムに選ばれた患者からの血漿の希釈液でAPC 耐性に関する組織因子依存性FVアッセイで得られた凝固時間差が図３に示される。21人の患者のうちの20人で、これらの値は平均二次プロットの回帰線の近くに分布された。深部静脈血栓症の幾つかのエピソードを経験していた１人の患者からの血漿の希釈液は、正常血漿について予想されたよりも極めて短い凝固時間差を生じた。この患者からの血液サンプルのその後のＤＮＡ分析はFV R506Q 突然変異に関する異型接合性を明らかにした。実施例７プロテインＳ不足の患者からの試験結果図４は遊離プロテインＳ不足の15人の患者からの結果の二次プロットを示す。（◇）APC に対する応答が正常被験者とは異ならなかった13人の患者；（■）AP C に対する応答がFV R506Qに関する異型接合性と一致した患者；ワーファリン治療の有る場合（○）または無い場合（○）に関する第二異型接合体患者全体。その他の記号は図２に関する記号の説明に記載されたとおりである。貯蔵された血漿サンプルをUCSDメディカル・センターの特別凝固研究所により遊離プロテインＳ抗原の不足を有することがわかった15人の患者から入手することができた。これらの患者のうちの13人からの血漿が正常試験結果を示したが、２人の患者からの血漿は正常血漿について予想されたよりも著しく短い凝固時間差を生じた。これらの患者の１人では、ワーファリンが最初のサンプルを入手した時点で一時的に中断されており、第二サンプルを入手した時点で再度開始されていた。両方のサンプルからのデータが図４に示され、ワーファリンによる治療がAPC 耐性に関する組織因子依存性FVアッセイに影響しないという更なる証拠を与える。この患者のその後のＤＮＡ分析はFV R506Q突然変異に関する異型接合性を確認した。実施例８ループス血液凝固阻止薬を用いる患者からの試験結果血漿ループス血液凝固阻止薬活性を有する29人の患者をAPC 耐性FVについて試験した。図５はループス血液凝固阻止薬による29人の患者からの結果の二次プロットを示す。A)（◇）APC に対する応答が正常被験者とは異ならなかった24人の患者；（○，■，□、▲、●）APC に対する応答がFV R506Qに関する異型接合性と一致した患者。その他の記号は図２について記載されたとおりである。B)レーン１−３、4Aからの３種の異型接合体のＤＮＡ分析；レーン４、正常被験者。 24人の患者からの血漿では、凝固時間差が正常血漿について予想されたものと同様であった。これらの24人の患者のうちの12人が血栓症の履歴を有していた。５人の患者からの血漿では、凝固時間差が正常血漿について予想されたものよりも著しく短かった。これらの患者のうちの４人が血栓症の履歴を有し、少なくとも２人が試験した時にワーファリンで経口血液凝固阻止薬治療を受けていた。ルーチンの手術前評価におけるループス血液凝固阻止薬治療の発見が本発明者らを APC 耐性FVについて血漿を試験するように導いた時に、血栓症の履歴のない患者は90才以上の老人であった。血液サンプルをこの患者及び血栓症の履歴のあるAP C耐性患者のうちの２人からＤＮＡ分析のために入手することができた。３人の患者の全てがFV R506Q突然変異に関して異型接合体であることがわかった（図5B ）。実施例９血栓症の履歴を有する患者及び血栓症に関する増大されたリスクに関して先の研究上証拠のない患者からの試験結果貯蔵された血漿は、重大な血栓症の履歴及びループス血液凝固阻止薬治療またはプロテインＣ、Ｓ、もしくは抗トロンビンの不足に関する先の陰性試験を有していた21人の患者から入手することができた。図６は21人の患者からの結果の二次プロットを示す。A)（◆）プールされた正常な基準血漿；（◇）APC に対する応答が正常とは異ならなかった11人の患者。その図の左下部分に見られる全てのその他の記号は、APC に対する応答がFV R506Qに関する異型接合性と一致した10 人の患者からの血漿の２種以上の希釈液で得られた凝固時間差を表す。B)レーン１−４、6Aからの10種の異型接合体のうちの４種のＤＮＡ分析。レーン５は正常被験者に関する結果を示す。これらの血漿のうちの４種では、正常血漿について予想されたよりも著しく短い凝固時間差がAPC に応答して見られた（図6A）。これらの患者のうちの４人がＤＮＡ分析について利用でき、４人全員がFV R506Q突然変異に関して異型接合体であることがわかった（図6B）。以上は説明を意味するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。実際に、当業者は、無用の実験をしないで、本明細書の教示に基いて、更に別の実施態様を容易に推考し、生じることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ラパポートサミュエルアイアメリカ合衆国カリフォルニア州 92037 ラジョラルックアウトドライヴ 7887 (72)発明者レズンティーアメリカ合衆国カリフォルニア州 92126 サンディエゴフランダースプレイス 10444

Claims

【特許請求の範囲】１．活性化プロテインＣ(APC)耐性因子ＶまたはVaと関連する血栓性疾患を有する被験者または血栓性疾患を有するおそれのある被験者のin vitro診断方法であって、 a.被験者からの標本を含む凝固因子、凝血原試薬及び因子Ｖ不足血漿を含む第一試験サンプルをカルシウム及びAPC と接触させ、 b.被験者からの標本を含む凝固因子、凝血原試薬及び因子Ｖ不足血漿を含む第二試験サンプルをカルシウムと接触させ、そして c.第一試験サンプル及び第二試験サンプルについて凝固時間を分析することを特徴とする診断方法。２．標本が血漿である請求の範囲第１項に記載の方法。３．標本を希釈する請求の範囲第１項に記載の方法。４．血栓性疾患が栓友病である請求の範囲第１項に記載の方法。５．血栓性疾患が因子Ｖ突然変異によるものである請求の範囲第１項に記載の方法。６．突然変異が因子Ｖの位置506 におけるアルギニンからグルタミンへの変化である請求の範囲第５項に記載の方法。７．凝血原試薬が組織因子を含む請求の範囲第１項に記載の方法。８．凝血原試薬が更にリン脂質を含む請求の範囲第７項に記載の方法。９．凝血原試薬が固有の凝固経路のアクチベーターを含む請求の範囲第１項に記載の方法。 10．アクチベーターが因子Xa、因子IXa、因子XIa 及び因子XIIaからなる群から選ばれた凝固因子である請求の範囲第９項に記載の方法。 11．凝血原試薬が更にリン脂質を含む請求の範囲第９項に記載の方法。 12．活性化プロテインＣ(APC)耐性因子ＶまたはVa突然変異と関連する血栓性疾患を有する被験者のin vitro診断方法であって、 a.被験者からの標本を含む凝固因子、凝血原試薬及び因子Ｖ不足血漿を含む第一試験サンプルをカルシウム及びAPC と接触させ、 b.被験者からの標本を含む凝固因子、凝血原試薬及び因子Ｖ不足血漿を含む第二試験サンプルをカルシウムと接触させ、そして c.第一試験サンプル及び第二試験サンプルについて凝固時間を分析することを特徴とする診断方法。 13．第一試験サンプル及び第二試験サンプルの凝固時間の分析が凝固時間を同じ条件下で試験した正常標準サンプルの凝固時間と比較することを含み、標準サンプルと比較して一種以上の試験サンプルの短い凝固時間が因子ＶまたはVa突然変異の指標である請求の範囲第12項に記載の方法。 14．突然変異が因子Ｖの位置506 におけるアルギニンからグルタミンへの変化である請求の範囲第12項に記載の方法。 15．突然変異が異型接合性突然変異である請求の範囲第14項に記載の方法。 16．突然変異が同型接合性突然変異である請求の範囲第14項に記載の方法。 17．標本が血漿である請求の範囲第12項に記載の方法。 18．標本を希釈する請求の範囲第12項に記載の方法。 19．血栓性疾患が栓友病である請求の範囲第12項に記載の方法。 20．凝血原試薬が組織因子を含む請求の範囲第12項に記載の方法。 21．凝血原試薬が更にリン脂質を含む請求の範囲第20項に記載の方法。 22．凝血原試薬が固有の凝固経路のアクチベーターを含む請求の範囲第12項に記載の方法。 23．アクチベーターが因子Xa、因子IXa、因子XIa 及び因子XIIaからなる群から選ばれた凝固因子である請求の範囲第22項に記載の方法。 24．更にリン脂質を含む請求の範囲第22項に記載の方法。 25．活性化プロテインＣ(APC)耐性因子ＶまたはVaと関連する血栓性疾患を有し、または有するおそれがある被験者のその疾患の診断に有益なキットであって、そのキットが凝血原試薬を含む第一容器、因子Ｖ不足血漿を含む第二容器、及び活性化プロテインＣ(APC)を含む第三容器を含む一つ以上の容器をその中に密に閉じ込めて収容するように区画化されているキャリヤー装置を含むことを特徴とするキット。 26．凝血原試薬が更にリン脂質を含む請求の範囲第25項に記載のキット。 27．凝血原試薬が組織因子を含む請求の範囲第25項に記載のキット。 28．凝血原試薬が固有の凝固経路のアクチベーターを含む請求の範囲第25項に記載のキット。 29．アクチベーターが因子Xa、因子IXa、因子XIa 及び因子XIIaからなる群から選ばれた凝固因子である請求の範囲第28項に記載のキット。 30．キットが更にカルシウムを含む容器を含む請求の範囲第25項に記載のキット。 31．活性化プロテインＣ(APC)耐性因子ＶまたはVa突然変異と関連する血栓性疾患を有する被験者のその疾患の診断に有益なキットであって、そのキットが凝血原試薬を含む第一容器、因子Ｖ不足血漿を含む第二容器、及び活性化プロテインＣ(APC)を含む第三容器を含む一つ以上の容器をその中に密に閉じ込めて収容するように区画化されているキャリヤー装置を含むことを特徴とするキット。 32．突然変異が因子Ｖの位置506 におけるアルギニンからグルタミンへの変化である請求の範囲第31項に記載のキット。 33．突然変異が異型接合性突然変異である請求の範囲第32項に記載のキット。 34．突然変異が同型接合性突然変異である請求の範囲第32項に記載のキット。 35．凝血原試薬が更にリン脂質試薬を含む請求の範囲第31項に記載のキット。 36．凝血原試薬が組織因子を含む請求の範囲第31項に記載のキット。 37．凝血原試薬が固有の凝固経路のアクチベーターを含む請求の範囲第31項に記載のキット。 38．アクチベーターが因子Xa、因子IXa、因子XIa及び因子XIIaからなる群から選ばれた凝固因子である請求の範囲第37項に記載のキット。 39．更にカルシウムを含む容器を含む請求の範囲第31項に記載のキット。