JP2002506515A

JP2002506515A - 蛋白質ｃ−系における障害の機能的検出法

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Publication number: JP2002506515A
Application number: JP54645098A
Authority: JP
Inventors: シュトッカークルト; ゲンペラー−メッシーナパトリツィア; ミュラークリスチャン
Original assignee: ペンタファルムアクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1997-04-25
Filing date: 1998-04-24
Publication date: 2002-02-26
Also published as: AU729843B2; CA2288080A1; US6426192B1; CA2288080C; EP0977995B1; AU6916698A; DE59812615D1; ATE290215T1; EP0977995A1; WO1998049562A1; ES2239388T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、蛋白質Ｃ−系における障害の検出法、殊に、活性化蛋白質Ｃによる分解に対する高められた安定性を有する活性化血液凝固因子Ｖの検出法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】蛋白質Ｃ−系における障害の機能的検出法本発明は、蛋白質Ｃ−系（蛋白質Ｃ、蛋白質Ｓ、ＦＶ）における障害の敏感な機能検出法、特に活性化蛋白質Ｃ（ＡＰＣ）による分解に対する高められた安定性を有する活性化血液凝固因子Ｖ（ＦＶａ）の検出法である。血管損傷後の血液停止（止血）は、組織、血球血液成分（血小板）及び血液の蛋白質（血漿凝固因子、カルシウムイオン）の間の相互作用から起こり、これは先ず、止血性血小板塞栓物の形成（一次止血）及び終局的に、凝固、即ち不溶性フィブリンから成る網状体の形成によりその硬化を起こす。１Ｌ当たり６０〜７０ｍｇの血液の生理的カルシウム含量が、血液凝固反応の最適経過に基本的に重要である。創傷治癒中のフィブリン凝塊の酵素的分解及び閉鎖した血管の再疎通のために、フィブリン溶解系が係わっている。これらの相互に絡み合う系は、活性化因子及び抑制化因子によって調節され、健康な生体中に変化し易い平衡で存在している。この平衡の障害は、一方で、高められた出血性素因に、他方で、血栓症傾向をもたらす。止血障害は、多くの病気及び治療の原因又は付随症状である。その際、平衡は、出血にとっても、血栓症にとっても、都合良く障害されうる。本発明にとって、第１図に記載の血液凝固段階の抜粋部分が重要である。血液凝固をもたらす反応段階に関する詳細な概要は、H.R.Roberts,Overview of the Coagulation Reactions,In:K.A.High and H.R.Roberts(Eds.)Molecular Basis o f Thrombosis and Hemostasis,pp.35〜50,Marcel Dekker:New York,Basel,Hong Kong(1995)に存在する。血管壁の損傷後に、血液は組織細胞と接触し、組織細胞はその表面に５００００ダルトンの大きさの糖蛋白質を発現させ、この糖蛋白質は、いわゆる組織トロンボプラスチン又は組織因子（ＴＦ）として、血液凝固系を、外因性手段を介して活性化させる。組織構造に付着する血小板は、燐脂質（血小板因子３、血小板トロンボプラスチン）を振り捨て、この燐脂質は内因性血液凝固系を活性化させる。ＴＦは、血漿中に存在する因子（Ｆ）ＶＩＩと共に錯体を形成させ、この錯体は、酵素前駆体ＦＸ及びＦＩＸを活性化させて、セリンプロテアーゼＦＸａ及びＦＩＸａにする。内因性手段を介して、ＦＩＸａは、その補因子、ＦＶＩＩＩａと一緒に、カルシウムイオン及び燐脂質の存在下に、同様に、有効化されたＦＸのための活性化因子を形成させる。ＦＸａは、ＦＶａ、カルシウムイオン及び燐脂質と共に、錯体（プロトロンビナーゼ錯体）を形成させ、この錯体は、酵素前駆体プロトロンビンを触媒的活性トロンビンに転換させる。この酵素トロンビンは、フィブリノゲンを、限定蛋白質加水分解により、フィブリン単量体に変換させ、この単量体は自発的に重合してフィブリンになる。因子Ｖａ及びＶＩＩＩａは、非酵素性血漿蛋白質であり、これは、ＦＩＸ又はＦＸａによるＦＸ又はプロトロンビンの活性化を強く促進させる。補因子、ＦＶａのプロトロンビン活性化への触媒的作用は、第１表に説明されている。それから明らかなように、ＦＸａ、燐脂質及びカルシウムイオンによるプロトロンビンの活性化は、ＦＶａの存在によってのみ、ほぼ２５０倍促進される。カルシウムイオン及び燐脂質の存在は、血液凝固段階の殆どの反応にとって、不可欠の前提である。錯体化、沈殿又はイオン交換によるカルシウムイオンの除去は、血液の凝固能力を完全に無効にさせる。この特性は、通例、新規に採取した血液をカルシウムイオンの錯体化のためにクエン酸ナトリウムと混合させ、遠心分離させ、上澄みの凝固不可能な血液から、沈降粒子をデカント除去することによって、分析又は治療目的のために血液血漿を取得するために利用される。生理学的量のカルシウム塩の添加、いわゆるカルシウム再添加により、クエン酸塩血漿の凝固能力は再び取得される。抗凝固性蛋白質Ｃ系は、血管損傷及び止血の箇所からの活性化血液凝固因子の非制御移動を阻止する。血漿性凝固系の場合と同様に、蛋白質Ｃ系の活性化の場合にも、細胞結合受容体、トロンボモジュリン（ＴＭ）及び非酵素性補因子、蛋白質Ｓ及び付随成分燐脂質及びカルシウムイオンが関与している。止血箇所から移動するトロンビンは、ＴＭに結合され、それによって、そのフィブリノゲン凝固特性を失い、酵素前駆体蛋白質Ｃのための特異的活性化因子になる。活性化蛋白質Ｃ（ＡＰＣ）は、セリンプロテイナーゼであり、これは蛋白質Ｓによって効力を与えられ、凝固因子ＦＶａ及びＦＶＩＩＩａを分割し、不活性化させる。この補因子の不活性化により、凝固過程は強く遅延化され、ＦＶａの不活性化によってのみ、第１表によれば、２５０倍の遅延が行なわれる。蛋白質Ｃ−系の現下の記載に関しては、K.Suzuki,Protein C,In:K.A.High and H.R.Roberts(Eds.)Mo lecular Basis of Thrombosis and Hemostasis,pp.393〜424,Marcel Dekker:New York,Basel,Hong Kong（１９９５）が参照される。蛋白質Ｃ系の生物学的重要性は、１９９３年に、B. ダールベック（Dahlbaeck）によって説明され、彼は、血栓症傾向を有する患者の場合に、特に健康な被験者の場合と違って、活性化部分的トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ、内因性凝固系のための診断的機能制御）は、活性化蛋白質Ｃの添加後に、延長しないことを認めた。彼は、彼の観察を、”活性化蛋白質Ｃに対する耐性”（ＡＰＣ耐性）と定義づけた。この耐性の原因は、全症例の９７％において、因子Ｖ−遺伝子における点突然変異である。この遺伝子的に継承された欠陥を、正常人口の約５％中に認められて、差当っては説明できないか、又はしばしば繰り返し出現する血栓塞栓症を有する若年患者で、少なくとも２０％中に認められる。突然変異が存在する場合には、活性化凝固因子Ｖはもはや分離されず、従って不活性化されない。血液凝固系のこの極めて重要な抗凝固性成分が機能しない結果として、冠状動脈心臓病、静脈血栓症又は血栓塞栓症が発症し得る。従って、ヘテロ接合体欠陥キャリアーは、正常な人間に比べて５〜１０倍も高い血栓症リスクを有し、ホモ接合体欠陥キャリアーは５０〜１００倍高いリスクを有する。蛋白質Ｃ系中における他の遺伝的又は後天的欠損又は欠陥（蛋白質Ｃ又は蛋白質Ｓの質的又は量的欠損）は、同様に高血栓症傾向と結びついている。先天的又は後天的ＡＰＣ−耐性の検出は、機能試験によって、又はＤＮＡ−平面（遺伝子型）上の突然変異の直接検出によって行なうことができる。機能的検出は、ダールベック（Dahlbaeck）による、ＡＰＴＴの変法によって行なうことができ(PCT/SE92/00310;WO 93710261)、そこでは、血小板不含の血漿検体の凝固の発現を、或る時は活性化蛋白質Ｃ（ＡＰＣ）を添加せずに、塩化カルシウムによって、また或る時はＡＰＣを添加して、塩化カルシウムによって行なうことができる。試験混合物中に生じるトロンビン量は、天然基質フィブリノゲーンの血餅への変換を経て（凝固時間）、又は色素原基質からの発色団の遊離を経て測光的に測定される。因子Ｖ−突然変異の存在は、ＡＰＣによって凝固時間が僅かしか延長されないことによって明らかに認められ、他方でＡＰＣは正常血漿のＡＰＴＴを著しく延長させる。ＡＰＣ含有検体の凝固時間をＡＰＣ不含検体の凝固時間で割ることにより、診断的に重要な比例数（比率）が明らかとなる。健康では２．０以上の比率、ヘテロ接合体欠陥キャリアーでは１．３〜２．０の比率、ホモ接合体欠陥キャリアーでは１．３以下の比率が見られる。しかし、この試験系は、カルシウムイオンの存在での凝固の活性化に基づくので、カルシウム依存性血漿凝固因子（ＦＩＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ）の量的及び質的異常は、結果を誤らせ得る。蛋白質Ｓの欠損又は機能障害は、誤った正の値をもたらし、ループス抗凝固物質（Lupus Antikoagulans）の存在は、誤った負の値をもたらす。注意せずに調製された血漿検体中の血小板の存在は結果に影響し、また、最終的に、経口抗凝固剤又はヘパリンでの治療は、血漿検体の試験結果に影響することがあり得る。ダールベックの研究に関連して、本来の試験系の改良又は変更に研究が集中した。即ち、例えばＡＰＣ−耐性の特異的機能測定に関しては、検査すべき検体を試験法で使用する前に、ＦＶ−欠損血漿と、２０：８０の比率で混合させることが推奨される(Behringwerke EPO711838A1)。使用されるＦＶ−欠損血漿は、因子ＶＩＩＩの正常濃度を含有しなければならず、それというのも、さもないと、患者検体中のＦＶＩＩＩの高すぎる又は低すぎる濃度によって、結果の誤りが生じるからである。この方法で、カルシウム依存性血漿凝固因子の異常による障害を減少することができ得る（Witt I.,Kraus M.APC-Resistenz:Klinik,Pathophysio logie und Diagnostik.Haemostaseologie，１９９６；１６：６０〜６７）。ヘパリンの障害的影響は、ヘパリン−拮抗剤、例えばヘキサジメトリンブロミド（ポリブレン）の添加により減少され得るが、この場合には、ＡＰＣが存在する場合の凝固時間の誤りだけが修正される。これに反して、ＡＰＣを添加しないＡＰＴＴは延長されたままであり、従って、この場合に、ＡＰＣ−比率を評価に引用することはできない。更に、ＡＰＴＴ−延長も引き起こすループス抗凝固物質の存在は、もはや検出不可能である。従って、この場合には、ループス抗凝固物質についての付加的な試験を放棄することはできない。５０％以上の異常なＡＰＴＴが存在する場合には、ＡＰＣ−比率の計算を行なうことはできない。エクスナー（Exner（PCT/AU95/00474;WO96/04560））は、ダールベック−特許の変法を記載している。この場合には、蛇毒の使用によって、内因性因子Ｖ及びＸが活性化され、それによって、高められた感受性が達成されるということである。この試験原則もカルシウムイオンの存在を必要とするので、この試験変法を用いても全てのＡＰＣ−耐性血漿を同定し、正常血漿と区別することはできない。公知技術水準により使用され、カルシウム再添加の反応混合物中で操作される機能試験は、前記の理由から、今なお、１００％の確実でＡＰＣ耐性を診断することはできない。なお血漿検体は境界範囲にあり、即ち、正常血漿と、ヘテロ接合体の後天的又は遺伝的ＦＶ−突然変異の患者の血漿との間の区別、及びヘテロ接合体と、ホモ接合体の突然変異キャリアーの間の区別は、しばしば不可能である。従って、経済的、技術的及び時間的に経費のかかる、ＰＣＲ（Polymerase C hain reaction）を用いるゲノム分析の使用によってのみ決定的に解明することができるだけである。ところで意外にも、文献中にカルシウム−燐脂質− 及びＦＶ−依存性として記載されている、一定の蛇毒からのプロトロンビン活性化因子のＦＶ−依存性は、カルシウムイオンの不存在下に、カルシウムイオンが存在下におけるよりも強力であることが判明した。更に、カルシウムイオンの代わりに、むしろ、カルシウム−錯化剤、例えばキレート化剤エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を試験混合物に添加する場合に（例１）、因子Ｖａの刺激性補因子作用が、特に明らかに現われることが判明した。最後に、前記の蛇毒活性化因子は、試験混合物中のカルシウムイオンの不存在下に、後天的又は先天的ＡＰＣ−耐性の特異的な診断的検出のために著しく好適であることが判明した。この方法は、原則的には、血漿検体を蛋白質Ｃ−活性化因子及び／又はＡＰＣと共に恒温保持し、カルシウム非依存性で、しかしＦＶ−依存性のプロトロンビン活性化因子の添加により、しかしカルシウムイオンを添加せずに、凝固を起こさせ、凝固時間を測定し、対照血漿の凝固時間と比較することよりなる。凝固時間は、正常血漿では延長されるが、ＡＰＣ耐性を有する血漿では延長されず、従って、血漿検体の凝固時間と対照血漿の凝固時間との比較から、ＡＰＣ−耐性の存在又は不存在について容易に推論することができる。この際、ＡＰＣ−耐性のない対照血漿は、若干の正常血漿、正常及び／又はヘテロ接合体及び／又はホモ接合体血漿の混合物又は単一血漿から成って良い（＝正常血漿）。血漿検体の凝固時間と対照血漿のそれとの比較は、蛋白質Ｃ−活性化因子又はＡＰＣを、対照血漿に添加して、又はそれを添加しないでも行なうことができる。更に、対照血漿として、検査すべき血漿検体の一部を使用することもできる。凝固時間の測定装置は、対照血漿を用いて、対照血漿の凝固時間が、例えば約８０〜１４０秒間であるように調整することができる。この際、対照血漿中の突然変異因子Ｖと正常因子Ｖとの間の比率は、例えば２０：８０〜８０：２０であってよい。対照血漿での装置の調整は、例えば毎月一回、又は血漿検体の測定と平衡してその都度行なうことができる。しかし、装置を、凝固時間の測定のために調整することは必要ではない。通例、血漿検体の凝固時間を測定し、例えば、表で表わした値の形で、試験キットに添付される対照血漿の実験値と比較することで全く充分である。そうして、比較値から、ホモ接合体、ヘテロ接合体又は正常の血液血漿を推論するとができる。これは、公知技術水準により必要である測定法と比較して、著しい簡素化である。検査すべき血漿検体の一部を同時に対照血漿としても使用する場合には、ａ）血漿検体の一部を、蛋白質Ｃ−活性化因子及び／又はＡＰＣと共に恒温保持し、試験系中へ、カルシウム非依存性のプロトロンビン活性化因子を添加し、しかしＣａ²⁺−イオンを添加せずに凝固を起こさせ、ｂ）血漿検体の他の一部で、蛋白質Ｃ−活性化因子及び／又はＡＰＣを添加せずに、試験系中へカルシウム非依存性のプロトロンビン活性化因子を添加し、しかしＣａ²⁺−イオンを添加せずに凝固を起こさせ、ｃ）凝固時間を測定し、かつ前段のａ）及びｂ）のそれぞれの検体部分から成る両方の凝固時間の比較から、又は両方の凝固時間の商から、蛋白質Ｃ−系における障害を検出することができる。この方法の感度は、カルシウム−錯化剤の添加により著しく高められ、突然変異化ＦＶに対するその特異性は、ＦＶ不含血漿で血漿検体を希釈することによって上昇させることができる。本発明による方法を、試薬、助剤及び装置に関して標準条件下で実施する場合に、ＡＰＣ−添加及びＡＰＣ−不添加の各１回づつの試験の実施を放棄し、かつ比率の計算を放棄することができる。この場合には、凝固時間又は基質分解から、直接、血漿検体中のＦＶの特性を推論することができる。この方法の利点は、Ｃａ²⁺−依存性でプロトロンビン活性化をもたらす競合− 又は障害反応、因子ＶＩＩＩの高められた又は低められた濃度、一定の血漿成分に対する特異的抑制抗体、例えばループ抗凝固物質は、経口抗凝固化及びヘパリン化の患者の血小板、血漿の存在が、カルシウムイオンの不在により阻止されることにある。更に、本発明による方法の特別な１つの利点は、ＦＶの構造的変化及び殊に常例的な突然変異ＦＶ：Ｑ⁵⁰⁶（ＦＶ障害）の特異的で機能的な検出にある。この割合は、標準的な場合には、カルシウムイオンの不在及び場合によりキレート化剤、例えばＥＤＴＡの存在で、プロトロンビン活性化の際に、ＡＰＣの存在下での（例３及び５）及び適当な蛋白質Ｃ−活性化因子の存在下での（例２及び４）血漿凝固時間の測定により及びこの血漿凝固時間と対照血漿のそれとの比較により得ることができる。好適な蛋白質Ｃ−活性化因子としては、例えばペンタファルム杜（Firma Pentapha urt F.Stocker und Lars G.Svendsen，ＥＰ０２０３５０９Ｂ１）が使用される。この際、２つの方法（ＡＰＣ又は蛋白質Ｃ−活性化因子）の特異性は大きいので、ＡＰＣ−耐性因子Ｖのホモ接合体キャリアー、ＡＰＣ−耐性因子Ｖのヘテロ接合体キャリアー及び正常母集団は、極めて良好な近置で区別することができる。更に、得られた値により、ヘテロ接合体キャリアーが多かれ少なかれ、ＡＰＣ −耐性化ＦＶを有するか否かを確認することもできる。本発明による方法は、血液凝固分析の種々の技法に極めて良好に適応することができる。即ち、測定すべき値の検出のために、色素原、発蛍光団、電流原(amperogene)基質又は他の公知技術水準による測定法を使用することもできる。それに応じて、試験混合物の組成は、キレート化剤の特性又は量の変化により、目的に応じたｐＨ−値の調整により、凝固系（ＰＣ−系を含む）の特定の阻止剤の添加により、方法的及び技術的要求に適応させることができる。蛋白質Ｃ−活性化因子として、原則的に、市販のプクス（Agkistroden contortrix）及びその亜種アグキストロドン・ピシボルス（ Agkistroden piscivorus）及びその亜種アグキストロドン・ビリネアトウス（Ag kistroden bilineatus）及びその亜種又はアグキストロドン・ハリス（Agkistro den halys）及びその亜種の蛇毒からの蛋白質Ｃ−活性化因子又は場合により精製画分を使用することもできる。この方法で、因子Ｖの異常ばかりでなく、蛋白質Ｃ又は蛋白質Ｓの異常も原則的に検出することができるので、相応する欠損血漿、例えばＦＶ−、蛋白質Ｃ− 又は蛋白質Ｓ−欠損血漿を添加することが有利であり得て、この際、この試験法は欠損血漿の存在量に敏感には反応せず、従って（検出した値を実際に移動することなく）、例えば１％の少量から、例えば９９％の多量までの欠損血漿を添加することができる。 ≧５０％の欠損血漿を使用することが有利である。燐脂質の添加は、本発明による方法の実施には必要ではない。しかし血漿は、その調製過程により、様々な痕跡量の燐脂質を含有するので、燐脂質添加は、この試験結果の変動幅を制限することがありうる。本発明により使用されるカルシウム非依存性のプロトロンビン活性化因子として、ＦＶ−依存性の蛇毒酵素を、粗製毒の形でも及び精製された毒画分の形でも使用することができる。プロトロンビン活性化因子は、その本発明による機能を、カルシウムを添加せずにも、有効に発揮することができるというその能力に関連して、カルシウム非依存性である。実際的な使用を考慮して、プロトロンビン活性化因子−調製物にも、自体公知の安定化添加剤を添加することができる。本発明によるプロトロンビン活性化因子−製剤の調製のための好適な蛇毒又は精製蛇毒画分は、カルシウムを添加しなくても能力を発揮する、優性のＦＶ−依存性プロトロンビン活性化作用を有する毒である。本発明により、コブラ属(Elapide ngattung)のノテヒス（Notechis）、トロピデヒス（Tropidechis）、クリプトフィス（Cryptophys）、ホプロセファルス（Hoplocephalus）及びプソイデヒス（P seudechis）、例えばノテヒス・スクタツス・スクタツス（Notechis scutatus s cutatus）、ノテヒス・アテル・ニゲル（Notechis ater niger）、ノテヒス・アテル・フムフレイシ（N otechis ater humphreysi）、ノテヒス・アテル・セルベンチイ（Notechis ater serventyi）、ノテヒス・フリンデルス（Notechis flinders）、ノテヒス・オクシデンタリス（Notechis occidentalis）、トロピデヒス・カリナツス（Tropi dechis carinatus）、クリプトヒス・ニグレセンス（Cryptophis nigrescens）、ホプロセファルス・ステフェンシイ（Hoplocephalus stephensii）及びプソイデヒス・ポルフィリアクス（Pseudechis porphyriacus）からの蛇毒が有利に使用される（例６）。蛇毒からのプロトロンビン活性化因子の他に、原則的に天然又は組換えゲノムを有する微生物から得られる活性化因子を使用することもできる。その大きな普及の故に、本発明により特に有利なキレート化剤は、ＥＤＴＡであるが、種々のＣａ²⁺−キレート化剤及びカルシウム沈殿剤の調査により、ＥＤＴＡとは構造的に異なった他の物質、例えばシトレート、オキサレートも使用できることが判った（例７）。キレート化剤には、特にＥＧＴＡ（エチレンビス− （オキシエチレンニトリロ）−テトラ酢酸）、デスフェロキサミン（Desferoxam in）、テトラサイクリン、ＢＡＰＴＡ（１，２−ビス−（２−アミノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸）及びれらその塩及びキン−２（２−［（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）−メチル］−６−メトキシ−８ −アミノキノリン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸４カリウム塩が挙げられる。過剰のカルシウムの除去のために、他の方法、例えばスルフェート又はカルボネートでの沈殿、吸着等、又はＦＶ依存性プロトロンビン活性化因子にＥＤＴＡ −効果を与える方法を使用することもできる。ＦＶ−依存性でＡＰＣ−感受性のプロトロンビン活性化の検出のために、血漿凝固時間の測定は、手動又は自動で、機械的に、電磁的に又は測光的に行なうことができる。本発明による試験混合物中で生成されるトロンビンを、測光的、蛍光測定的又は電流測定的に、好適な合成、色素原もしくは発蛍光団又は電流原基質の使用下で測定することもできる（例８）。止血学における合成基質に関する概観的抄録については、Witt I.Test Systems with synthetic peptide substra tes in haemostaseology,Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.,１９９１，２９：３５５−３７４が参照される。色素原基質として、例えば、Firma Pentapharm AG から市場で得られるＴｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−ＡｃＯＨ(Pefac hrom TH)が好適である。本発明により、ヘパリン化血漿による障害的影響は、ヘパリン−拮抗剤、例えばポリブレン、プロタミン塩又はヘパリン分解酵素を使用して回避することができる。ヘパリン−拮抗剤を用いても、それを使用しなくても、例えば公知技術水準に反して、ホモ接合体ＦＶ−欠陥、ヘテロ接合体ＦＶ−欠陥と正常血漿との間を、明らかに区別することができる（例９）。本発明による方法における恒温保持相を、試験混合物に因子Ｖ−活性化因子を添加することによって、著しく短縮することができる。因子Ｖ−活性化因子として、例えばビペラ・ルセリ（Vipera russelli）からのＲＶＶ−Ｖ又は例えば蛇ボトロプス・アトロックス（Bothrops atrox）、ボトロプス・ヤララカ（Bothro ps jararaca）、ナジャ・ｎ・オキシアナ（Naja n.oxiana）、エキスカリナツス（Echiscarinatus）、エキス・ムルチスクアナツス（Echis multisquanatus）、ビペラ・ウルシニ（Vipera ursini）、ビペラ・レベチナ（Vipera lebetina）、ヘマカツス・ヘマカツス（Haemachatus haemachatus）、ナジャ・ｍ・モサンビカ（Naja m.Mossambica）、ナジャ・ニベア（Naja nivea）、ナジャ・ニグリコリス（Naja nigricollis）、ナジャ・ｈ・ハイエ（Naja h.haje）、ナジャ・ｎ・カオウチア（Naja n.kaouthia）、ナジャ・メラノロイカ（Naja melanoleuca ）、プソイデヒス・アウストラリス（Pseudechis australis）、プソイドナジャ・ｔ・テキステリス（Pseudonaja t.textilis）、ノテヒス・アテル（Notechis ater）、オキシウラヌス・スクテラツス（Oxyuranus scutellatus）又はラウペ・ロノミア・アケロウス（Raupe Lonomia achelous）の蛇毒からの因子Ｖ−活性化因子も使用することができる。検体の採取及び状態に適応した調製及び安定化後のＡＰＣ−耐性の測定は、実際には２段階であるが、殆ど分離不可能な段階で有利に経過する。その２段階は、恒温保持相と及びプロトロンビン活性化相と称される。この際、検体として、例えばシトレート−安定化血漿検体が好適である。しかし、安定剤、例えばオキサレート又はＥＤＴＡを使用することもできる。恒温保持相は、有利にＦＶ−欠損血漿の存在で行なわれる一方で、自体公知の方法、例えばＲＶＶ−Ｖ（Vipera russelliから）を用いて得ることのできる検体からのＦＶの活性化が行なわれる。ＡＰＣ又は蛋白質Ｃ−活性化因子を用いる又はそれを用いないこの活性化反応は、恒温保持相に入り、この際、必要な試剤は、有利に恒温保持相の開始時に添加される。プロトロンビン活性化相は、ＦＶ−依存性蛇毒又は相応する蛇毒の精製画分の添加で開始する。検体へのキレート化剤（例えばＥＤＴＡ）の添加により、特異性を上昇させることができる。そのようなキレート化剤は、典型的であるが必ずしも強制的ではなく、ＦＶ−依存性蛇毒酵素と一緒で初めて添加される。本発明による方法は、１又は数種の前記の成分の重複的、順次的又は全く連続的な添加を伴う変法も除外しないことが認められる。恒温保持相の時間は、特に、適用されるＡＰＣ−系の活性化の問題設定及びその特性に依存する。その時間は、典型的には１〜４０分間の範囲であるが３０分間以下が有利である。蛋白質Ｃ−系中の障害の検出のために使用することのできる、本発明によるキットは、ＡＰＣ又は蛋白質Ｃ−活性化因子、例えばプロタック、プロトロンビン活性化因子及び場合により因子Ｖ−活性化因子、例えばＲＶＶ−Ｖを含有する。更に、このキットに、燐脂質、因子Ｖ−欠損血漿、Ｃａ−錯化剤、例えばＥＤＴＡ及び使用される検出法に応じて、１又は数種の対照血漿及びヘパリン−拮抗剤を添加することができる。次に、本発明を実施例につき詳説する。この際、略語として次のものを使用する：ＡＰＣ：活性化蛋白質ＣＲＶＶ−Ｖ：ビペラ・ルセリ（Vipera russelli）からのＦＶ活性化因子・コントロトリクス（Agkistrodon contortrix contortrix）からの蛋白質Ｃ活性化因子ここで、使用される検査人間の血漿検体の安定化の方法は重要ではなく、その訳は、シトレート−安定化検体を用いるだけでは代表的な結果は得られないからである。血漿検体は、全てＡＰＣ−耐性について、ＤＮＡ−平面上の突然変異の直接検出を用いて検査した。例１：ノテヒス・スクタツス・スクタツス（Notechis scutatus scutatus）− 毒からのプロトロンビン活性化因子のＦＶ−依存性凝固時間を、凝固計ＫＣ４(Amelung,Lemgo,Deutschland)で測定した。ＦＶ欠損血漿４０μｌ、血漿検体（＋ＦＶ）１０μｌ又はＦＶ−欠損血漿（−ＦＶ）５０μｌを、５０ｍＭヘペス（Ｈｅｐｅｓ）（ｐＨ７．５）５０μｌと共に３７℃ で１分間恒温保持した。ＣａＣｌ₂（２５ｍＭ）中のノテヒス・スクタツス・スクタッス−毒からのプロトロンビン活性化因子（５μｇ／ｍｌ）５０μｌの添加、添加剤なしの又はＥＤＴＡ（１０〜４０ｍＭ）中のプロトロンビン活性化因子５μｇ／ｍｌの添加により、凝固を引き起こした（第２表）。全試剤を５０ｍＭヘペス（ｐＨ７．５）中に溶かした。凝固時間を、ＦＶの存在で及びＦＶの不存在で測定する。ＦＶの存在及びＦＶの不存在での凝固時間から、率（比率）を得る。得られる結果は、カルシウムイオンの添加が試験系のＦＶ−依存性を悪化させることを示している。試験系のＦＶ−依存性は、カルシウムイオンの不添加又はＥＤＴＡの添加で、著しく強化される。凝固時間を、凝固計ＫＣ４ micro(Amelung,Lemgo,Deutschland)で測定した。ＦＶ欠損血漿４０μｌ、血 μｌ、ＲＶＶ−Ｖ（１Ｕ／ｍｌ）及びケファリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を２０分間３７℃で恒温保持した。ＥＤＴＡ（１５ｍＭ）中のノテヒス・スタツス・スタツス−毒からのプロトロンビン活性化因子（５μｇ／ｍｌ）５０μｌの添加により、凝固を引き起こした。全試剤を５０ｍＭヘペス（ｐＨ７．５）中に溶かした。血漿検体の凝固時間を、ＡＰＣ−耐性のない血漿プールからの血漿検体の凝固時間又はＡＰＣ−耐性のな体対血漿プールの両方の凝固時間から、比（商）を得る。得られる結果は、全体的に、ヘテロ接合体ＦＶ−欠陥を有する血漿対ホモ接合体ＦＶ−欠陥を有する血漿に関する血漿プールの商が、正常血漿とＦＶ−欠陥のそれとの間のみならず、ヘテロ接合体ＦＶ−欠陥とホモ接合体ＦＶ−欠陥との間の欠陥血漿内でも区別され得るように低下することを示している。例３：ＡＰＣを用いるＡＰＣ−耐性の測定凝固時間を、凝固計ＫＣ４ micro(Amelung,Lemgo,Deutschland)で測定した。ＦＶ欠損血漿４０μｌ、血漿検体１０μｌ及びＡＰＣ（１０μｇ／ｍｌ）５０μ ｌ、ＲＶＶ−Ｖ（１０Ｕ／ｍｌ）及びケファリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を３７℃ で８分間恒温保持した。ＥＤＴＡ（１５ｍＭ）中のノテヒス・スクタツス・スクタツス−毒からのプロトロンビン活性化因子（５μｇ／ｍｌ）５０μｌの添加により、凝固を引き起こした。全試剤を５０ｍＭヘペス（ｐＨ７．５）中に溶かした。血漿検体の凝固時間を、ＡＰＣ−耐性の無い血漿プールからの血漿検体の凝固時間と比較する。ＡＰＣを用いた血漿検体の凝固時間及び血漿プール中の血漿の測定された凝固時間から比率を得る（第４表）。得られる結果は、ＡＰＶＣの外因性添加により、血漿プール又は正常血漿の凝固時間が延長されるが、一方で、ヘテロ接合体ＦＶ−欠陥、殊にホモ接合体ＦＶ −欠陥を有する血漿の凝固時間は、著しくかつ、健康な血漿及びＦＶ−欠陥の血漿のみならず、ヘテロ接合体ＦＶ−欠陥とホモ接合体ＦＶ−欠陥との間も区別できる程度に短時間で沈澱することを示している。凝固時間を、凝固計ＫＣ４(Amelung,Lemgo,Deutschland)で測定した。ＦＶ欠損血漿４０μｌ、血漿検体ＲＶＶ−Ｖ（１Ｕ／ｍｌ）及びケファリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を３７℃で２０分間恒温保持した。ＣａＣｌ₂（２５ｍＭ）（第５表Ａ）中、添加剤なし（第５表Ｂ）又はＥＤＴＡ（１５ｍＭ）（第５表Ｃ）中で、ノテヒス・スクタツス・スクタツス−毒からのプロトロンビン活性化因子（５μｇ／ｍｌ）５０μｌの添加により凝固を引き起こした。全試剤を５０ｍＭヘペス（ｐＨ７．５）中に溶かした。凝固時間を、プロタッ存在及び不存在での凝固時間から、比率（率）を得る。得られる結果は、この比率が、カルシウムイオンの添加により、正常血漿検体で著しく減少され、正常な血漿検体とヘテロ接合体ＦＶ−欠陥の血漿検体との間では殆ど区別され得ないことを示している。感受性は、ＥＤＴＡの添加により、正常、ヘテロ接合体及びホモ接合体血漿検体の間で、驚異的にも強く高められる（第２図）。例５：ＡＰＣを用いるＡＰＣ−耐性の測定凝固時間を、凝固計ＫＣ４ micro(Amelung,Lemgo,Deutschland)で測定した。ＦＶ欠損血漿４０μｌ、血漿検体１０μｌ及びＡＰＣ（１０μｇ／ｍｌ）５０μ ｌ、ＲＶＶ−Ｖ（１０Ｕ／ｍｌ）及びケファリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を３７℃ で８分間恒温保持した。ＥＤＴＡ（１５ｍＭ）中で、ノテヒス・スクタツス・スクタツス−毒からのプロトロンビン活性化因子（５μｇ／ｍｌ）５０μｌの添加により、凝固を引き起こした。全試剤を５０ｍＭヘペス（ｐＨ７．５）中に溶かした。血漿検体の凝固時間を、ＡＰＣの存在及び不存在下に測定する。ＡＰＣの存在及び不存在での凝固時間から、比（比率）を得る（第６表）。得られる結果は、ＡＰＶＣの外因性添加により、試験系の感受性が損失されずに、恒温保持は短縮され得ることを示している。正常血漿は、いずれの場合にもヘテロ接合体から分離され得る。この例においても、再び、カルシウムイオンの添加は放棄される。例６：蛇毒からのＦＶ依存性又は非依存性プロトロンビン活性化因子凝固時間を、凝固計ＫＣ４ micro(Amelung,Lemgo,Deutschland)で測定した。ＦＶ欠損血漿４０μｌ、血 μｌ、ＲＶＶ−Ｖ（１Ｕ／ｍｌ）及びケファリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を３７℃ で２０分間恒温保持した。ＥＤＴＡ（１５ｍＭ）中で、ＦＶ−依存性又はＦＶ− 非依存性プロトロンビン活性化因子を有する蛇の非精製蛇毒（５〜５０μｇ／ｍｌ）５０μｌ又はＥＤＴＡ（１５ｍＭ）中の精製プロトロンビン活性化因子５μ ｇ／ｍｌの添加により凝固を引き起こした。全試剤を５０ｍＭヘペス（ｐＨ７．５）中に溶かした。凝固時率（第５表）を得る。結果は、精製したＦＶ依存性プロトロンビン活性化因子と同様に又はＦＶ−依存性プロトロンビン活性化因子を有する粗製蛇毒が、ＡＰＣ−耐性の測定に使用できることを示している。ＦＶ−依存性プロトロンビン活性化因子は、ＡＰＣ−耐性を有する血漿検体と正常血漿との間を、それで区別することができる比率を示す。例７：試験系への種々のキレート化剤の影響凝固時間を、凝固計ＫＣ４(Amelung,Lemgo,Deutschland)で測定した。ＦＶ欠損血漿４０μｌ、血漿検体ＲＶＶ−Ｖ（１Ｕ／ｍｌ）及びケファリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を３７℃で２０分間恒温保持した。ＥＤＴＡ（１５ｍＭ）、シトレート又はオキサレート中で、ノテヒス・スクタツス・スクタツス−毒からのプロトロンビン活性化因子（５μ ｇ／ｍｌ）５０μｌの添加により凝固を引き起こした。全試剤を５０ｍＭヘペス（ｐＨ７．５）中に溶かした。凝固時間を、プロタッ在及び不存在での凝固時間から、比（比率）を得る（第８表）。結果は、種々のキレート化剤の添加がＦＶ−依存性を強めることを示している。例８：色素原基質を用いるＡＰＣ耐性の測定１分間当たりの吸光度変化を、４０５ｎｍで測光的に測定する(Perkin Elmer UV/VIS LAMBDA BIO 10)。欠損血漿４０μｌ、血漿検体１０μｌ及びＡＰＣ（１０μｇ／ｍｌ）５０μｌ、ＲＶＶ−Ｖ（１０Ｕ／ｍｌ）及びケファリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を３７℃で８分間恒温保持した。第２段階で、３７℃で８分間後に、前記の活性化混合物５０μｌを、５０ｍＭヘペス（ｐＨ７．５）７５０μｌ、Ｔｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−ＡｃＯＨ（Pefachrom TH）（４ｍＭ）１００μｌ及びノテヒス・スクタツス・スクタツス−毒からのプロトロンビン活性化因子（５μｇ／ｍｌ）１００μｌに添加し、吸光度変化を４０５ｎｍで測定した（第９表）。全試剤をヘペス（５０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１５ｍＭ）中で、ｐＨ７．５で溶かした。ＡＰＣの存在及び不存在で測定する。ＡＰＣの不存在（ −ＡＰＣ）及び存在（＋ＡＰＣ）での吸光度変化／分から再び比率を得る。色素原基質の変換は、正常血漿において、ＡＰＣの存在でより強く減少され、それというのも、ここでは、正常ＦＶが、ＡＰＣによって分解され、従って、色素原基質を分解するトロンビンが僅かに生成されるからである。従って、正常血漿におけるＡＰＣの存在での吸光度変化／分は、ＡＰＣ−耐性が存在する場合よりも低い。得られる結果は、本発明によるＡＰＣ−耐性の色素原測定も可能であり、正常血漿はいずれの場合でもヘテロ接合体から区別され得ることを示している。この例においても、再び、カルシウムイオンの添加は放棄される。例９：試験系へのヘパリンの影響凝固時間を、凝固計ＫＣ４ micro(Amelung,Lemgo,Deutschland)で測定した。ＦＶ欠損血漿４０μｌ（ポリブレンの存在又は不存在で）、血漿検体１０μｌ及（１Ｕ／ｍｌ）及びケファリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）を３７℃で２０分間恒温保持した。ＥＤＴＡ（１５ｍＭ）中で、ノテヒス・スクタツス・スクタツス−毒からのプロトロンビン活性剤（５μｇ／ｍｌ）５０μｌの添加により凝固を引き起こした。全試剤をヘペス５０ｍＭ（ｐＨ７．５）中に溶かした。凝固時間を、プ第１０表）。結果は、前記の試験の治療的濃度のヘパリンは、比率に影響を及ぼさないことを示している。ＦＶ−欠損血漿中へのポリブレンの添加は、比率に影響を及ぼさないが、それによって凝固時間は延長される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者クリスチャンミュラースイス国ライナッハツィーラッカーシュトラーセ 50

Claims

【特許請求の範囲】１．蛋白質Ｃ−系中の障害の定性的及び／又は定量的検出のために、血漿検体を蛋白質Ｃ−活性化因子及び／又はＡＰＣと共に恒温保持し、試験混合物に、Ｃａ²⁺ −イオンを添加しないで、カルシウム非依存性プロトロンビン活性化因子を添加することにより凝固を引き起こし、凝固時間を測定し、対照血漿検体の蛋白質Ｃ−活性化因子及び／又はＡＰＣの存在又は不存在での凝固時間と比較し、それから蛋白質Ｃ−系中の障害を検出することを特徴とする、蛋白質Ｃ−系中の障害の定性的及び／又は定量的検出法。２．対照血漿として、正常血漿を使用する、請求項１に記載の方法。３．対照血漿として、検査すべき血漿検体の一部を使用する、請求項１に記載の方法。４．蛋白質Ｃ−系中の障害を、血漿検体の凝固時間と対照血漿との間の商の形成によって検出する、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。５．測定を、合成基質を用いて、色素原又は発蛍光団又は電流原的に実施する、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。６．有利に、シトレート、オキサレート又はＥＤＴＡで予備処理された血漿検体を使用する、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。７．蛋白質Ｃ−活性化因子として、アグキストロドン・コントルトリクス及びその亜種、アグキストロドン・ピシボルス及びその亜種、アグキストロドン・ビリネアツス及びその亜種及び／又はアグキストロドン・ハリス及びその亜種の蛇毒又は少なくとも１種のその毒画分を使用する、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。用する、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。９．プロトロンビン活性化因子として、カルシウム非依存性のプロトロンビン活性化因子活性を有する蛇毒を、粗製蛇毒又は精製された粗製蛇毒画分の形で、又は天然又は組換えゲノムを有する微生物からのカルシウム非依存性プロトロンビン活性化因子を使用する、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。１０．カルシウム非依存性のプロトロンビン活性化因子活性を有する蛇毒として、エラピダエ種、有利に、ノテヒス・スクタツス・スクタツス、ノテヒス・アテル・ニゲル、ノテヒス・アテル・フムフレイシ、ノテヒス・アテル・セルベンチイ、ノテヒス・フリンデルス、ノテヒス・オクシデンタリス、トロピデヒス・カリナツス、クリプトフィス・ニグレセンス、ホプロセファルス・ステフェンシイ及び／又はプソイデヒス・ポルフィリアクスの蛇毒を使用する、請求項９に記載の方法。１１．燐脂質、蛋白質Ｃ、キレート化剤又はキレート化剤−類似体、欠損血漿、例えば因子Ｖ−、蛋白質Ｃ−又は蛋白質Ｓ−欠損血漿、蛋白質Ｃ、蛋白質Ｓ、因子ＶＩＩＩ、因子Ｖ−活性化因子及び／又はヘパリン拮抗剤を試験混合物に加える、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。１２．欠損血漿、例えば因子Ｖ−、蛋白質Ｃ−及び／又は蛋白質Ｓ−欠損血漿を、血漿検体に対する比で、９９％対１％〜５０％対５０％の量で使用する、請求項１１に記載の方法。１３．因子Ｖ−活性化因子として、ビペラ・ルセリイからのＲＶＶ−Ｖを使用する、請求項１１に記載の方法。１４．ヘパリン拮抗剤として、ヘキサジメチリンブロミド、プロタミンスルフェート又はヘパリン分解酵素を使用する、請求項１１に記載の方法。１５．キレート化剤として、シトレート、オキサレート、ＥＧＴＡ及び／又は有利にＥＤＴＡを使用する、請求項１１に記載の方法。１６．特に、ＦＶ障害の症例で、血漿検体中の活性化蛋白質Ｃによる分解に対して高い安定性を有する活性化血液凝固因子Ｖの定性的検出及び／又は定量的測定のための、請求項１から１５までのいずれか１項に記載の方法の使用。１７．請求項１から１５までのいずれか１項に記載の方法の実施のための試験キット。１８．特に、ＦＶ障害又は蛋白質Ｃ−又は蛋白質Ｓ−系における障害の症例で、血漿検体中の活性化蛋白質Ｃによる分解に対して高い安定性を有する活性化血液凝固因子Ｖの定性的検出及び／又は定量的測定のための試験キット。１９．ＡＰＣ又は蛋白質Ｃ−活性化因子、特にプロタック、プロトロンビン活性化因子及び場合により因子Ｖ−活性化因子を含有する、請求項１７又は１８に記載の試験キット。２０．燐脂質、因子Ｖ−欠損血漿、Ｃａ−錯化剤、殊にＥＤＴＡ及び場合により１又は数種の対照血漿を含有する、請求項１７から１９までのいずれか１項に記載の試験キット。