JP2000180450A - 凝固系における欠損箇所を見出す方法 - Google Patents

凝固系における欠損箇所を見出す方法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、凝固系、フィブリン溶解系およ
び補体系における欠損を見出す方法に関する。 【解決手段】 この方法は、 ａ）分析パラメータを決定する、 ｂ）反応段階ａ）を包含する反応系の部分的範囲を決定
する、 ｃ）ａ）およびｂ）について測定される値の相関関係を
確立することにより、多段階・多因子生化学反応系の選
択された個々の因子（分析パラメータ）の欠損を検出す
るものである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、凝固系、フィブリ
ン溶解系および補体系における欠損を特定する方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】血栓症および出血は、今日、特に先進国
において病気および死亡の最も頻度の高い原因の一つで
ある。最もよく知られているのは心筋梗塞、脳卒中およ
び肺塞栓である。血栓塞栓症または出血を乗り切って
も、患者の体力はほとんどの場合において限られ、一方
では麻痺、血栓症後症候群（post-thrombotic syndro
m）または器官障害のような続発性症候が起こり、そし
て他方では健康状態を向上させ且つ別の合併症を防止す
る回復期、理学療法および薬物治療など、引き続いて行
う治療に労力および費用がかかる。
【０００３】特に血栓症の原因についての研究におい
て、近年大きな進歩が為されており、これらにはＡＰＣ
抵抗性、抗凝血性狼瘡、高ホモシスチン血症およびプロ
トロンビン変異体Ｇ２０２１０Ａの発見が含まれる。そ
れにもかかわらず、全ての場合の約５０％において原因
を検出できない。出血の最も重要な止血学的原因は知ら
れており、これらには種々の様式の血友病、フォン・ウ
ィルブランド・ユルゲンス症候群および個々の血液凝固
因子のごく稀な突然変異が包含される。
【０００４】そのような欠損が存在する場合、止血平衡
が乱れ、凝血促進性因子と抗凝血性因子の比率が偏って
しまう。血液凝固促進性因子の分泌を増加させる欠損、
例えばプロトロンビン変異体Ｇ２０２１０Ａ、プロテイ
ンＣ、プロテインＳもしくはＡＴ III欠乏のような阻害
剤の放出不全、またはプロテインＣの活性型に対して抵
抗性のある最もよく知られた形態における、修飾された
受容体による阻害の抑制（APC resistance: Bertina R
M, Clin Chem; 43(9): 1678-83）は、通常は血栓症を引
き起こす。これらに、形成された血餅の崩壊を減少させ
るフィブリン溶解系における欠損が追加される。
【０００５】治療を実施する医師が患者の個々の危険性
を判断し、これに対して対応し得るように、そのような
欠損を特定することが研究所の課題である。種々の診断
方法がここで用いられている。全体試験は凝固系の幾つ
かの成分の相互作用を決定する。プロトロンビン時間
（ＰＴ）は外因性の凝固系の状態を決定し、部分的プロ
トロンビン時間（ａＰＴＴ）は内因性の凝固系の状態を
決定する。修正した全体試験は更にプロテインＣ系の分
析および抗凝血性狼瘡の診断において用いられる。これ
らに対して、それぞれ個々の成分のみを測定して、定性
的および定量的両方の分析をする個別試験がある。修正
した個別試験は、後天性阻害体の問題において用いられ
る。選択し得る様々な方法があるにもかかわらず、しば
しば正確な診断ができないことがある。「陽性」と「陰
性」の決定の境界が明確ではなく、または例えば抗凝血
剤のような薬物が試験結果に持続的に影響を与えるので
ある。
【０００６】ＤＮＡ分析によって先天的な欠損を正確に
診断できる。これは、特第Ｖ因子状態（ＡＰＣ抵抗性の
状態）またはプロトロンビン変異体Ｇ２０２１０Ａのよ
うな個々の突然変異に基づく欠損に適する。異質な欠損
が存在する場合、遺伝子分析は非常に困難となる。言う
までもなく、他の問題がＤＮＡ分析に関連して生じる。
ごくわずかな研究所だけがそのような調査を実施し得る
が、またこれには高い費用がかかる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って、労力と費用を
節約するために、ＤＮＡ分析の前に患者のグループを選
択することを目的とする。ここで最もよく知られた例
は、プロテインＣに対する抵抗性である。ＡＰＣ抵抗性
を調べる種々の試験がある。陽性の結果が得られた場
合、遺伝子分析を実施して、第Ｖ因子の状態が非常の高
い頻度の形態で存在するかどうかを見出すことができ
る。そのような「陽性」と「陰性」の分別は、第二の確
実な利点を有する。知られていない欠損を調査するので
あれば、患者のグループを選別し、「潜在的な陽性」と
して選択して、そして遺伝子配列によって分析すること
ができる。現在まで、これらのグループは病歴によって
選択されていた。
【０００８】プロトロンビン変異体Ｇ２０２１０Ａはこ
れらの問題の非常によい例である。この点突然変異は、
プロトロンビンレベルの増加に関連し、血栓の危険性の
増加を引き起こす（Poortn, Blood 1996年; 88(10): 36
98-703）。刊行物では、心筋梗塞（Rosendahl, Blood 1
997年; 90(5): 1747-50）および静脈血栓（Brown, Br.
J. Haematol; 98(4): 907-9）の危険性の増加を示唆し
ている。しかし、突然変異キャリアと野生型とを識別す
ることは、２つのグループを分別し得ないために、プロ
トロンビンレベルを用いてできないと説明することもま
た可能だった（Poortn, Blood 1996年; 88(10): 3698-7
03; 更に本発明者の結果を参照）。経口抗凝血剤治療を
受けている患者が除外されてきたのである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】驚くべきことに、本発明
者らは、突然変異体のキャリアと野生型遺伝子のキャリ
アとの分別を非常によく達成し得ることを見出した。こ
れは、個別試験の結果を関連する調査試験の結果と相関
させることによって達成される。共に関係する試験は、
当業者に知られている。個別試験と調査試験との関係を
あらわすには比率が好ましい。感受性、特異性およびカ
ットオフが識別に重要なパラメータである。実施例から
わかるように、カットオフを変化させることによって感
受性を犠牲にして特異性を増加させることができる。よ
り低い感受性を利用して、特異性を増加させることが好
ましい。好ましくは最大１００％の感受性、特に好まし
くは９５〜１００％の感受性、更に好ましくは８０〜９
５％の感受性を利用して、特異性を増加させる。本発明
の技術的原理に基づき、当業者は、簡単な実験により適
当なカットオフ値を決定することによって感受性と特異
性の所望の比を設定することができる。
【００１０】従って、更に低凝血性または高凝血性状態
を引き起こし、これらは影響されるパラメータの活性に
おけるそれ自身しばしば問題にならないようなごくわず
かな変化によって識別されるため、後天性疾患もまた診
断することができる。
【００１１】図１は、４６人の血液供与者（野生型）お
よび５４人の血栓症患者における従来技術による方法
（第II因子濃度の測定）による突然変異キャリアの決定
を示している。図２は、同じ試料群における下記の式： 比率＝第II因子濃度[N.の％]／プロトロンビン時間(PT)
[N.の％] による本発明に従う突然変異キャリアの決定（比率法）
を示している。図３は、同じ試料群における本発明によ
る突然変異キャリアの決定を示している。
【００１２】下記の実施例は、本発明を説明することを
意図するが、特許請求の範囲を制限するものではない。
【００１３】
【実施例】実施例１ プロトロンビン変異体Ｇ２０２１０Ａを例とする。ここ
で利用可能なデータは次のようにして決定した。４６人
の血液供与者と５３人の血栓症患者を、ＥＤＴＡ血液か
らのＰＣＲ（ＤＮＡの単離および増幅、マイクロタイタ
ーストリップ中での標識プローブを用いた変異体特異的
ハイブリダイゼーション；Medizinische Diagnostische
ProduktGmbH）によって、突然変異キャリア（４０）と
野生型（５９）のグループに分けた。クエン酸血液から
第II因子の濃度（第II因子試験キット，Dade Behring M
arburg GmbH; ACL, Instrumentation Laboratory）およ
びプロトロンビン時間（免疫プラスチン ＩＳ, Immuno
GmbH, BCT Dade Behring Marburg GmbH）をこの２つの
グループについて決定した。
【００１４】第II因子の濃度分布を図１に示す（従来技
術による方法）。下記の式による比の分布を図２に示す
（本発明による方法）。 比率＝第II因子濃度[％N.]／プロトロンビン時間(PT)
[％N.] 本発明による方法の利点を説明するために、２つの方法
の統計学的評価を下記に示す。第１段階において、１０
０％、９５％および９０％の感受性値を条件として、カ
ットオフおよび特異性を各場合において２つの方法につ
いて決定した。
【００１５】
【表１】
【００１６】第２段階において、１００％の特異性を用
いた。
【表２】 本発明による方法の利点は、得られた値から明確に見出
すことができる。
【００１７】実施例２ 実施例１と同じ条件を適用した。差を得てからその分布
を図３に示す。 差［Ｎ.の％］＝プロトロンビン時間(PT)[N.の％］−
第II因子の濃度[N.の％] 本発明による方法の利点を説明するために、２つの方法
の統計学的評価を下記に示す。第１段階において、１０
０％、９５％および９０％の感受性値を条件として、カ
ットオフおよび特異性を各場合において、２つの方法に
ついて決定した。
【００１８】
【表３】
【００１９】第２段階において、１００％の特異性を用
いた。
【表４】 本発明による方法の利点は、得られた値から明確に見出
すことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】４６人の血液供与者（野生型）および５４人の
血栓症患者における従来技術による方法による突然変異
キャリアの決定を示している。
【図２】同じ試料群における本発明の比率法による突然
変異キャリアの決定を示している。
【図３】同じ試料群における本発明による突然変異キャ
リアの決定を示している。

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 次の段階： ａ）分析パラメータを決定する、 ｂ）反応段階ａ）を包含する反応系の部分的範囲を決定
    する、 ｃ）ａ）およびｂ）について測定される値の相関関係を
    確立するを包含する、多段階・多因子生化学反応系の選
    択された個々の因子（分析パラメータ）の欠損を検出す
    る方法。
  2. 【請求項２】 多段階・多因子生化学反応系がフィブリ
    ン溶解系である、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 多段階・多因子生化学反応系が凝固系で
    ある、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 多段階・多因子生化学反応系が補体系で
    ある、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 相関関係が、比率、積、差および総計か
    らなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項
    に記載の方法。
  6. 【請求項６】 分析パラメータが、第II因子、第Ｖ因
    子、第VII因子、第Ｘ因子、第XI因子および第XII因子か
    らなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項
    に記載の方法。
  7. 【請求項７】 反応ｂ）がプロトロンビン時間および部
    分プロトロンビン時間からなる群から選択される、請求
    項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 “欠損キャリア”と“正常集団”の識別
    が適切なカットオフによって達成される、請求項１〜７
    のいずれか１項に記載の方法。
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