JP4414530B2

JP4414530B2 - 凝固系における欠損箇所を見出す方法

Info

Publication number: JP4414530B2
Application number: JP35708199A
Authority: JP
Inventors: アネリー・ジーゲムント; トーマス・ジーゲムント
Original assignee: シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・プロダクツ・ゲーエムベーハー
Priority date: 1998-12-17
Filing date: 1999-12-16
Publication date: 2010-02-10
Anticipated expiration: 2019-12-16
Also published as: EP1010982A1; ATE317980T1; CA2292000C; DE19858278A1; CA2292000A1; JP2000180450A; US6183980B1; EP1010982B1; ES2255218T3; DE59913123D1

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、凝固系、フィブリン溶解系および補体系における欠損を特定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血栓症および出血は、今日、特に先進国において病気および死亡の最も頻度の高い原因の一つである。最もよく知られているのは心筋梗塞、脳卒中および肺塞栓である。血栓塞栓症または出血を乗り切っても、患者の体力はほとんどの場合において限られ、一方では麻痺、血栓症後症候群（post-thrombotic syndrom）または器官障害のような続発性症候が起こり、そして他方では健康状態を向上させ且つ別の合併症を防止する回復期、理学療法および薬物治療など、引き続いて行う治療に労力および費用がかかる。
【０００３】
特に血栓症の原因についての研究において、近年大きな進歩が為されており、これらにはＡＰＣ抵抗性、抗凝血性狼瘡、高ホモシスチン血症およびプロトロンビン変異体Ｇ２０２１０Ａの発見が含まれる。それにもかかわらず、全ての場合の約５０％において原因を検出できない。出血の最も重要な止血学的原因は知られており、これらには種々の様式の血友病、フォン・ウィルブランド・ユルゲンス症候群および個々の血液凝固因子のごく稀な突然変異が包含される。
【０００４】
そのような欠損が存在する場合、止血平衡が乱れ、凝血促進性因子と抗凝血性因子の比率が偏ってしまう。血液凝固促進性因子の分泌を増加させる欠損、例えばプロトロンビン変異体Ｇ２０２１０Ａ、プロテインＣ、プロテインＳもしくはＡＴ III欠乏のような阻害剤の放出不全、またはプロテインＣの活性型に対して抵抗性のある最もよく知られた形態における、修飾された受容体による阻害の抑制（APC resistance: Bertina RM, Clin Chem; 43(9): 1678-83）は、通常は血栓症を引き起こす。これらに、形成された血餅の崩壊を減少させるフィブリン溶解系における欠損が追加される。
【０００５】
治療を実施する医師が患者の個々の危険性を判断し、これに対して対応し得るように、そのような欠損を特定することが研究所の課題である。種々の診断方法がここで用いられている。全体試験は凝固系の幾つかの成分の相互作用を決定する。プロトロンビン時間（ＰＴ）は外因性の凝固系の状態を決定し、部分的プロトロンビン時間（ａＰＴＴ）は内因性の凝固系の状態を決定する。修正した全体試験は更にプロテインＣ系の分析および抗凝血性狼瘡の診断において用いられる。これらに対して、それぞれ個々の成分のみを測定して、定性的および定量的両方の分析をする個別試験がある。修正した個別試験は、後天性阻害体の問題において用いられる。選択し得る様々な方法があるにもかかわらず、しばしば正確な診断ができないことがある。「陽性」と「陰性」の決定の境界が明確ではなく、または例えば抗凝血剤のような薬物が試験結果に持続的に影響を与えるのである。
【０００６】
ＤＮＡ分析によって先天的な欠損を正確に診断できる。これは、特第Ｖ因子状態（ＡＰＣ抵抗性の状態）またはプロトロンビン変異体Ｇ２０２１０Ａのような個々の突然変異に基づく欠損に適する。異質な欠損が存在する場合、遺伝子分析は非常に困難となる。言うまでもなく、他の問題がＤＮＡ分析に関連して生じる。ごくわずかな研究所だけがそのような調査を実施し得るが、またこれには高い費用がかかる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、労力と費用を節約するために、ＤＮＡ分析の前に患者のグループを選択することを目的とする。ここで最もよく知られた例は、プロテインＣに対する抵抗性である。ＡＰＣ抵抗性を調べる種々の試験がある。陽性の結果が得られた場合、遺伝子分析を実施して、第Ｖ因子の状態が非常の高い頻度の形態で存在するかどうかを見出すことができる。そのような「陽性」と「陰性」の分別は、第二の確実な利点を有する。知られていない欠損を調査するのであれば、患者のグループを選別し、「潜在的な陽性」として選択して、そして遺伝子配列によって分析することができる。現在まで、これらのグループは病歴によって選択されていた。
【０００８】
プロトロンビン変異体Ｇ２０２１０Ａはこれらの問題の非常によい例である。この点突然変異は、プロトロンビンレベルの増加に関連し、血栓の危険性の増加を引き起こす（Poortn, Blood 1996年; 88(10): 3698-703）。刊行物では、心筋梗塞（Rosendahl, Blood 1997年; 90(5): 1747-50）および静脈血栓（Brown, Br.J. Haematol; 98(4): 907-9）の危険性の増加を示唆している。しかし、突然変異キャリアと野生型とを識別することは、２つのグループを分別し得ないために、プロトロンビンレベルを用いてできないと説明することもまた可能だった（Poortn, Blood 1996年; 88(10): 3698-703; 更に本発明者の結果を参照）。経口抗凝血剤治療を受けている患者が除外されてきたのである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
驚くべきことに、本発明者らは、突然変異体のキャリアと野生型遺伝子のキャリアとの分別を非常によく達成し得ることを見出した。これは、個別試験の結果を関連する調査試験の結果と相関させることによって達成される。共に関係する試験は、当業者に知られている。個別試験と調査試験との関係をあらわすには比率が好ましい。感受性、特異性およびカットオフが識別に重要なパラメータである。実施例からわかるように、カットオフを変化させることによって感受性を犠牲にして特異性を増加させることができる。より低い感受性を利用して、特異性を増加させることが好ましい。好ましくは最大１００％の感受性、特に好ましくは９５〜１００％の感受性、更に好ましくは８０〜９５％の感受性を利用して、特異性を増加させる。本発明の技術的原理に基づき、当業者は、簡単な実験により適当なカットオフ値を決定することによって感受性と特異性の所望の比を設定することができる。
【００１０】
従って、更に低凝血性または高凝血性状態を引き起こし、これらは影響されるパラメータの活性におけるそれ自身しばしば問題にならないようなごくわずかな変化によって識別されるため、後天性疾患もまた診断することができる。
【００１１】
図１は、４６人の血液供与者（野生型）および５４人の血栓症患者における従来技術による方法（第II因子濃度の測定）による突然変異キャリアの決定を示している。
図２は、同じ試料群における下記の式：
比率＝第II因子濃度[N.の％]／プロトロンビン時間(PT)[N.の％]
による本発明に従う突然変異キャリアの決定（比率法）を示している。
図３は、同じ試料群における本発明による突然変異キャリアの決定を示している。
【００１２】
下記の実施例は、本発明を説明することを意図するが、特許請求の範囲を制限するものではない。
【００１３】
【実施例】
実施例１
プロトロンビン変異体Ｇ２０２１０Ａを例とする。
ここで利用可能なデータは次のようにして決定した。
４６人の血液供与者と５３人の血栓症患者を、ＥＤＴＡ血液からのＰＣＲ（ＤＮＡの単離および増幅、マイクロタイターストリップ中での標識プローブを用いた変異体特異的ハイブリダイゼーション；Medizinische Diagnostische Produkt GmbH）によって、突然変異キャリア（４０）と野生型（５９）のグループに分けた。クエン酸血液から第II因子の濃度（第II因子試験キット，Dade Behring Marburg GmbH; ACL, Instrumentation Laboratory）およびプロトロンビン時間（免疫プラスチンＩＳ, Immuno GmbH, BCT Dade Behring Marburg GmbH）をこの２つのグループについて決定した。
【００１４】
第II因子の濃度分布を図１に示す（従来技術による方法）。
下記の式による比の分布を図２に示す（本発明による方法）。
比率＝第II因子濃度[％N.]／プロトロンビン時間(PT)[％N.]
本発明による方法の利点を説明するために、２つの方法の統計学的評価を下記に示す。第１段階において、１００％、９５％および９０％の感受性値を条件として、カットオフおよび特異性を各場合において２つの方法について決定した。
【００１５】
【表１】

【００１６】
第２段階において、１００％の特異性を用いた。
【表２】

本発明による方法の利点は、得られた値から明確に見出すことができる。
【００１７】
実施例２
実施例１と同じ条件を適用した。差を得てからその分布を図３に示す。
差［Ｎ.の％］＝プロトロンビン時間(PT)[N.の％］− 第II因子の濃度[N.の％]
本発明による方法の利点を説明するために、２つの方法の統計学的評価を下記に示す。第１段階において、１００％、９５％および９０％の感受性値を条件として、カットオフおよび特異性を各場合において、２つの方法について決定した。
【００１８】
【表３】

【００１９】
第２段階において、１００％の特異性を用いた。
【表４】

本発明による方法の利点は、得られた値から明確に見出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】４６人の血液供与者（野生型）および５４人の血栓症患者における従来技術による方法による突然変異キャリアの決定を示している。
【図２】同じ試料群における本発明の比率法による突然変異キャリアの決定を示している。
【図３】同じ試料群における本発明による突然変異キャリアの決定を示している。

Claims

次の段階：
ａ）第II因子の濃度を決定する、
ｂ）プロトロンビン時間を決定する、
ｃ）比率および差からなる群から選択される、ａ）およびｂ）について測定される値の相関関係を確立する
を包含する、凝固系の第II因子の欠損を検出する方法。
プロトロンビンレベルの増加をもたらす第II因子の点突然変異を検出する、請求項１記載の方法。
プロトロンビン変異体Ｇ２０２１０Ａを検出する、請求項１または２記載の方法。