JP3810080B2

JP3810080B2 - 血液凝固カスケードにおける疾患を検出および治療するための方法および手段

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Publication number: JP3810080B2
Application number: JP52755095A
Authority: JP
Inventors: ヨハネス・ヤコブスフオールベルク，; ヤン・アールトバン・モウリク，; ケンラートメルテンス，
Priority date: 1994-04-22
Filing date: 1995-04-21
Publication date: 2006-08-16
Anticipated expiration: 2021-08-16
Also published as: CA2188463C; JPH09512425A; EP0756638A1; EP0756638B1; DK0756638T3; AU697205B2; AU2319495A; DE69520569D1; WO1995029259A1; CA2188463A1; GR3036000T3; US6083905A; ES2157326T3; ATE200225T1; DE69520569T2

Description

本発明は血液凝固カスケードに欠陥を生じ、これが出血疾患または血栓疾患を起こすことがある、（遺伝的）疾患の検出および／または治療の分野に関する。本発明はより具体的には、そのような止血疾患を生じる遺伝的疾患の検出、および該疾患の治療、ならびに出血傾向の治療または修正に関する。
正常な止血の維持には、血液凝固に関与する促進−および抗−凝固機構の微妙なバランスが必要である。１つのタンパク質の機能不全で、出血傾向または血栓を生じる結果になりうる。凝固促進性タンパク質の１つの分子的欠失は、通常、出血傾向と関連し、これは代替療法により克服することができる。これは出血疾患である血友病Ａにより最も良く説明され、この疾患は活性化第IX因子による第Ｘ因子から第Ｘａ因子への転換に必須なコファクターである第VIII因子の機能不在と関連している（KaneおよびDavie.1988,Blood,vol.71,539-555）。出血傾向の診断は、当該技術分野で良く知られている簡単な研究室での試験により行われる。さらにより特異的なアッセイが開発され、これは幾つかの凝固促進性タンパク質の正しいレベルをモニターするために使用する、精製された凝固因子と共に発色基質を採用する。現在、出血傾向のある患者に観察される不全症の多くをモニターするために、適当な診断技術を利用できる。
最終的にＡＰＣにより凝固促進性の第ＶおよびVIII因子の不活性化を生じる抗凝固経路は、かなり詳細に説明されている（Esmon,C.T.1993.Thromb.Haemost.vol.70,29-35）。プロテインＳは第ＶおよびVIII因子の両方の不活性化に、コファクターとして関与しているが、第ＶおよびVIII因子の両方の開裂の触媒効率に対するプロテインＳの影響は比較的小さい（Koedamら、1988,J.Clin.Invest.vol.82,1236-1243;KalafatisおよびMann,1993,J.Biol.Chem.,vol.268,27246-27257）。抗凝固経路に関与する１つのタンパク質の機能不在は、通常血栓に関連している。抗−凝固経路に関与する幾つかのタンパク質の分子的欠失が、血栓の発生に関連することが判明した。ホモ接合体プロテインＣ欠失は、代替−療法で修正できる重篤な血栓の発生に関連していることが明らかである（Dreyfusら、1991,N.Eng.J.Med.vol.325,1565-1568）。ヘテロ接合体プロテインＣの欠失も、血栓の危険性の増加として証明されたが（Bertinaら、1982,Thromb.Haemost.vol.48,1-5）、少なくとも幾つかの症例では更なる因子が関与しているようである（Miletichら、1987,N.Eng.J.Med.vol.317,991-996）。プロテインＣと同様に、プロテインＳの欠失は、血栓の危険性の増加と関連している（Compら、1980,J.Clin.Invest.vol.74,2082-2088）。アンチ−トロンビンIII、フィブリノーゲンおよびプラスミノーゲンの比較的稀な遺伝的欠失も、血栓形成に関与していた。合わせて考えると、抗−凝固経路に関与する幾つかのタンパク質の欠失が、血栓形成の危険性の増加に関連している。しかし、上記に概説した欠失は血栓−塞栓疾患に罹患している10-30％以下の患者に関する説明を与える一方、残りの症例は説明されないままである（Heijboerら、1990,N.Eng.J.Med.22,1512-1516）。したがって、血栓−塞栓疾患に罹患している患者の診断は、症例の70−90％が不十分である。最近の進歩により、説明されない血栓の割合は40−60％に減少した。Dahlbackおよび共同研究者達は、多くの血栓を生じている患者において、ＡＰＣに対する耐性を観察した（Dahlbackら、1993,proc.Natl.Acad.Sci.USA.vol.90,1004-1008）。活性化部分トロンボプラスチン時間（activated partial thromboplastin time:APTT）で測定されるような、ＡＰＣによる凝固-時間の長期化に基づくアッセイが、欠陥を分析するために使用された。ＡＰＣを添加した時にＡＰＴＴの延長は観察されず、抗−凝固経路の欠陥を示した。他のグループは、深静脈性血栓に罹患している患者を対象として、ＡＰＣ−耐性の発生を確認し、そしてより広範な研究を行い、血栓症に罹患している患者の20−40％がＡＰＣに対する耐性を表すことを示した（Griffinら、1993,Blood,vol.82,1989-1993;Kosterら、1993,Lancet,vol.,342,1503-1506）。ＡＰＣ−耐性の表現型は静脈性血栓に羅患している患者に限るわけではない。幾つかの研究では、ＡＰＣ−耐性の発生率は正常な人口の約２−５％であることが証明された。ＡＰＣ−耐性の分子的基礎はかなり長い間不明なままである。最近の研究では、ＡＰＣ−耐性の表現型が精製された第Ｖ因子を病気の個体の血漿に加えることにより克服できたことを明らかにした（DahlbackおよびHildbrand、1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.vol.91,1396-1400）。この観察はＡＰＣ−耐性が第Ｖ因子に関連していることを示唆しているが、ＡＰＣに対する耐性の発生を分子レベルで十分に説明するものではない。
このような耐性に関する原因（１つ、または複数）が同定されれば、血栓疾患のより良い解明、ならびにそのような疾患のよりよい検出法、およびおそらく該疾患および血液凝固カスケードにおける他の疾患の新たな、そしてより良い治療法および予防法を導くだろう。
本発明は該耐性の有力な原因を同定し、そして該原因の検出法を与え、それは簡単な方法であり、かつその結果アッセイを行うことが簡単である。
1つの観点では、本発明は抗−凝固プロテインＣ系における先天的な欠陥を検出する方法を提供し、この方法は通常プロテインＣの制御下で該凝固因子を活性化プロテインＣが不活性化することを妨害する、１つ以上の凝固因子中の突然変異を同定することを含んで成る。特に本発明はそのような突然変異を、第Ｖおよび第VIII因子の、特に該タンパク質中のＡＰＣに関する開裂部位に検出する方法を提供する。
本発明の別の観点では、ＡＰＣの開裂部位で変異させ、かつ／またはＡＰＣ耐性を付与された突然変異した第Ｖ因子および第VIII因子タンパク質を提供する。
これまで、この凝固促進性タンパク質の不活性化を妨害する第VIII因子中のＡＰＣについて、開裂部位での突然変異の発生に注意が向けられたことはなかった。精製したタンパク質を使用した研究で、第VIII因子の不活性化はペプチド結合Arg⁵⁶²-Gly⁵⁶³、ならびにペプチド結合Arg³³⁶-Met³³⁷での開裂を通して起こることが示された。ＡＰＣによる第VIII因子の不活性化は、Arg⁵⁶²位での開裂と相関している（Fayら、1991,J.Biol.Chem.vol.266,20139-20145）。第VIII因子と同様に、コファクタータンパク質第Ｖ因子も、ＡＰＣにより不活性化される。ＡＰＣによる第Ｖ因子の不活性化は、ウシ第Ｖ因子について詳細に記載されている（KalafatisおよびMann,1993,J.Biol.Chem.,vol.268,27246-27257）。ＡＰＣによるウシ第Ｖ因子のタンパク質溶解的不活性化は、重鎖のペプチド結合Arg³⁰⁶-Gln³⁰⁷、Arg⁵⁰⁵-Gly⁵⁰⁶およびArg⁶⁶²-Gln⁶⁶³で起こる。ウシ第Ｖ因子の軽鎖は、ペプチド結合Arg¹⁷⁵²-Arg¹⁷⁵³またはArg¹⁷⁵³-Ala¹⁷⁵⁴で開裂するが、この部位での開裂が活性の損失に関連するかどうかは不明である（KalafatisおよびMann,1993,J.Biol.Chem.,vol.268,27246-27257）。ヒトおよびウシ第Ｖ因子の配列比較により、２つのタンパク質の間にかなりの相同性が明らかである（Guintoら、1992,J.Biol.Chem.vol.267.2971-2978）。この相同性に基づき、ＡＰＣ−開裂部位がヒト第Ｖ因子について定められた（第２図、表Ｉを参照にされたい）。第VIII因子と同様に、第Ｖ因子のＡＰＣ開裂部位における突然変異は、凝固促進活性の長期化を生じ、そしてそれ自体が血栓形成の発生の有力な危険因子を構成する。これまで、血栓−塞栓疾患とＡＰＣ基質中のＡＰＣ−感受性領域での遺伝的欠失との間の関連の可能性は明らかにされていない。特発性血栓塞栓疾患の多発という観点から、ＡＰＣ基質のＡＰＣ感受性領域での遺伝的欠失をモニターする方法は、明らかに血栓塞栓疾患の診断に望ましい。
第Ｖおよび第VIII因子の両方に存在する多数のＡＰＣ開裂−部位が、記載され、そして文献から引用されているが、本発明はコファクタータンパク質第Ｖおよび第VIII因子中のＡＰＣの新規開裂部位も含む。コファクタータンパク質ＶおよびVIII中のＡＰＣの開裂−部位に関する遺伝的分析には、活性化プロテインＣの開裂−部位を持つ第Ｖおよび第VIII因子のＤＮＡ−配列の選択的増幅、ならびに突然変異を生じた増幅断片のスクリーニングを必要とする。ＡＰＣ−開裂−部位での突然変異は、第Ｖおよび第VIII因子のＡＰＣ−開裂−部位を構成する、またはその周辺の1つのコドンの中の１つ以上の塩基対の欠失または置換と定義する。患者は突然変異についてホモ接合性またはヘテロ接合性のいずれかであることができる。ＲＮＡ−増幅法による第Ｖおよび第VIII因子の配列の選択的増幅は、本発明により網羅される。活性化プロテインＣの開裂−部位を持つ第Ｖおよび第VIII因子の配列の増幅用の出発材料は、ＲＮＡ、逆転写酵素活性によりＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含んで成る。ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡは、患者の組織または血液細胞に由来し、そして当該技術分野で一般的に周知な方法に従い単離される。第Ｖおよび第VIII因子中のＡＰＣの開裂−部位での突然変異の検出は、制限する訳ではないが、以下の幾つかの方法により行うことができる：
１．選択的ハイブリダイゼーション：ＡＰＣの開裂−部位に突然変異を含むＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡと、ＡＰＣの開裂−部位に突然変異を含まないＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡとの間を選択するオリゴヌクレオチド−プライマーを設計する。該オリゴヌクレオチドプライマーは、野生型第Ｖおよび第VIII因子配列に関して１つ以上の誤対合を含んでよい。野生型第Ｖおよび第VIII因子配列は、文献において多型性を含み存在すると定められる。形成されたハイブリッドの検出は、制限するけではないが、標識ハイブリダイゼーションプローブ（この標識は直接的または間接的のいずれかであることができ、直接とは金ゾル、放射性同位体、蛍光物質等を意味する；そして間接標識は酵素を含むか、またはアビジンまたはストレプトアビジンとビオチンとのようなリガンド−アンチリガンド相互作用を介するか、あるいは二重鎖を認識する抗体の使用を通すなど）の使用を含む、当業者が利用できる多くの方法の任意の１つに従い行える。
２．誤対合ＰＣＲ：もう１つのオリゴ−ヌクレオチドプライマーと結合している任意のオリゴ−ヌクレオチドプライマーは、突然変異を含むＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来する断片を選択的に増幅し、そして該開裂−部位に突然変異を持たないＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来する断片を増幅しない。また当業者により設計された、該開裂−部位に突然変異を持たないＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来する断片を選択的に増幅し、そして突然変異を持つＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来する断片を増幅しないオリゴ−ヌクレオチドプライマーも含む。該オリゴ−ヌクレオチドプライマーは、野生型第Ｖおよび第VIII因子配列に関して１つ以上の誤対合を含んでもよい。
３．ＰＣＲ−増幅、その後の制限分析：この方法には、該開裂−部位を含む第Ｖおよび第VIII因子のＤＮＡ配列の一部を持つ断片の増幅、続いて該開裂部位に突然変異を持つ患者に由来するＤＮＡ配列中に存在するか、または天然の第Ｖおよび第VIII因子配列に存在するいずれかのＤＮＡ−配列を認識する制限酵素を用いて消化することを含む。表IIに、第Ｖ因子のアミノ酸Arg⁵⁰⁶位、ならびに第VIII因子のアミノ酸Arg³³⁶およびArg⁵⁶²位で、ＡＰＣの開裂−部位の突然変異をモニターするために使用できるオリゴヌクレオチドプライマーを定めた。同様な手法で、第Ｖ因子のアミノ酸Arg³⁰⁶、Arg⁶⁷⁹およびArg¹⁷⁶⁵ならびに他のＡＰＣ開裂−部位での突然変異の発生をモニターすることを計画できる。
４．シークエンシング分析：この方法は、該開裂−部位の周辺の、およびそれを構成するＤＮＡ配列の直接的な分析を含む。この方法は、該開裂−部位をコードするＤＮＡ−またはＲＮＡ配列を直接的に決定するために、現在利用できる、または当業者には利用できるであろう任意の手法を含む。
ＡＰＣに関する該開裂−部位に突然変異を含むＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡと、ＡＰＣの開裂−部位に突然変異を含まないＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡとの間を識別する他の方法は、当該技術分野の平均的な技術者により確認できる。該開裂−部位での変化の選択的検出を導くそのような変異は、本発明に属すると考える。
実施例１は、第Ｖ因子のアミノ酸Arg⁵⁰⁶位での突然変異の検出に関する詳細を提供し、そして本発明に開示するようなＡＰＣの開裂−部位での突然変異の検出法の一般的な使用を説明する。
突然変異体因子が存在するという知見は、もちろん治療的にも説明できる。今回、なぜ特定の患者が血栓症にかかる高い危険性を有するのか、その原因が同定され、そして本発明により検出でき、欠失が検出された患者に正常な因子を提供することにより、あるいは患者に正常な因子も提供しながら遺伝子治療により正しい因子を患者に提供する（好ましくは部位−特異的相同的組換えを通して）ことのいずれかにより欠失を修正できることが明らかになった。
他方、今回、ＡＰＣ耐性を導く突然変異、あるいはむしろ突然変異の部位が同定され、該突然変異体を血栓疾患に直接的ではないかもしれないが、出血疾患の分野に大変限定的に、治療薬として使用できるようにもなった。
出血疾患の治療は通常、（部分的に）精製された凝固因子から成る調製物を用いた代替療法により行われている。最も普通の出血疾患は、第VIII因子の機能不在の結果による血友病Ａである。血友病Ａに罹患している患者の治療は、過去数年、劇的に改革された。初期には第VIII因子を含む寒冷沈降物が血友病Ａ患者の治療に使用された。寒冷沈降物に由来する第VIII因子の部分精製により得られた中程度の純度の濃縮物により、治療が改善される。さらなる改善は、ほとんど排他的に第VIII因子から成る第VIII因子調製物を得るために、第VIII因子およびフォンビルブラント因子に対するるモノクローナル抗体の使用により提供される（Hoyer,L.W.,1994,N.Eng.J.Med.Vol.330,38-47）。最近、第VIII因子のｃＤＮＡが導入された動物細胞から得られた組換え第VIII因子が治療に利用できるようになった。組換えＤＮＡ法は、第VIII因子を量的に無制限に生成するための好機を提供する。さらに組換えＤＮＡ法は、第VIII因子の機能的特性を最適にすることがてき、それにより血友病Ａに罹患している患者の治療が改善される。今回、本発明により、野生型第VIIIおよび第Ｖ因子よりもＡＰＣに対してより耐性な、第VIIIおよび第Ｖ因子から誘導されるタンパク質を提供できる。本発明により、好ましくは第VIII因子のアミノ酸Arg³³⁶および／またはArg⁵⁶²位でＡＰＣ−開裂−部位の修飾の結果、ＡＰＣによる不活性化に耐性の第VIII因子タンパク質を提供する。この種のタンパク質は当業者に周知な方法を使用することにより、例えばArg⁵⁶²をコードするコドンをIleコーディングコドンに置換した第VIII因子のｃＤＮＡを構築することにより成される。Arg⁵⁶²からIleへの突然変異を有する、ｃＤＮＡをコードする第VIII因子は、もちろん例えばＢ−ドメインの大部分の欠失を含む更なる修飾を含んでもよい（Mertensら、1993,Br.J.Haematol.vol.85,133-142）。真核または原核細胞中での修飾した第VIII因子のｃＤＮＡの発現は、当業者に周知な方法に従い行える。あるいは、修飾した第VIII因子のｃＤＮＡは、トランスジェニック動物中で発現されるか、または遺伝子治療法に使用できるレトロウイルスベクターに導入することができる。またＡＰＣの開裂−部位の少なくとも１つが修飾された、治療的に有用な第VIII因子−タンパク質を生成する別の方法がある。該タンパク質の精製は、モノクローナル抗体法または当業者が利用できる他の方法により行える。さらにＡＰＣ-開裂-部位で修飾された第VIII因子から成る、このような医薬的に有用なタンパク質は、当業者に周知な他の方法により精製できる。
血友病Ａ患者の治療において、過去２０年間にわたって達成されたかなりの進歩という事実にもかかわらず、第VIII因子代替療法に付随する最大の問題が解決されていない。第VIII因子を用いて治療された血友病Ａ患者の約5-20％が、第VIII因子−活性を抑制する抗体を生じる（Ehrenforthら、1992,Lancet,vol.339,594-598）。このいわゆる第VIII因子−インヒビターは通常、第VIII因子に暴露されてから5-20日の間に生じ、深刻な臨床的合併症を起こす（Aledort,L.1994.Am.J.of.Haemat.vol.47,208-217）。医薬調製物を含む様々な第VIII因子で治療した患者を対象とした第VIII因子−インヒビターの発生率の診査では、大きな差異はないことが明らかである。これらの観察は、第VIII因子−インヒビターの発生は通常、投与された第VIII因子調製物とは無関係であることを示唆している。血友病Ａ患者を対象として、インヒビターの治療に関する幾つかの手法が確立された。低または中程度のレベルのインヒビターは通常、第VIII因子の高投与量で処置される（Hoyer,L.W.1994.N.Eng.J.Med.vol.330.38-47）。さらにインヒビターを生じた血友病Ａ患者の中には、ブタ血漿から単離された第VIII因子で成功裏に治療された者もいた（Hayら、1990,Blood.vol.76,882-886）。後者の治療法は、ブタ第VIII因子に対するインヒビター−発生の危険性が付随し、そしてまさにこのことがブタの第VIII因子を含む調製物で治療した数名の血友病Ａ患者で報告された。第VIII因子に対する阻害抗体のProtein-Ａ-Sepharoseによる体外吸着が、高レベルの第VIII因子−インヒビターを有する血友病Ａ患者で採用された（Nilssonら、1988,N.Eng.J.Med.vol.318,947-950）。この治療には特殊化された装置が必要であり、そして高レベルの第VIII因子−インヒビターを有する１１名の患者のうち９名について成功したことが報告された。記載された様々な治療法の成果が定まらず、さらなる治療法がインヒビターを有する血友病Ａ患者の治療に有用なことは明らかである。
インヒビターを有する血友病Ａ患者の治療のために、一般的に確立された別の方法は、いわゆる“第VIII因子バイパス剤”の投与により提供される。初期にはプロトロンビン−複合体濃縮物（ＰＣＣ）および活性化プロトロンビン複合体濃縮物（ＡＰＣＣ）が、インヒビターを有する血友病Ａ患者に使用された（Lusherら、1980,N.Eng.J.Med.vol.303,421-425;Sjamsoedinら、1981,N.Eng.J.Med.vol.305,717-721）。ＰＣＣを用いた治療は部分的にのみ有効であると考えられ、そして治療した患者の幾人かには心筋梗塞および播種性の脈管内凝固が付随した。ＡＰＣＣはＰＣＣと比較してより効果的であると考えられるが、ＰＣＣ中に存在する活性化凝固因子の投与が、ＡＰＣＣで処置した患者に観察される、フィブリノペプチドＡレベルの上昇により証明されるような血栓形成を生じることがある。活性化第VII因子は、インヒビターを有する血友病Ａ患者の治療に使用された（Hedner,UおよびW.Kisiel、1983.J.Clin.Invest.71,1836-1841;Hednerら、1988,Lancet,309,1193）。さらに、組織因子、ならびに第Ｘａ因子およびリン脂質混合物の両方が、第VIII因子−欠失のイヌのモデルで成功裏に使用された（O'Brienら、1988.J.Clin.Invest.vol.82,206-211;Gilesら、1988,Brit.J.Haematol.Vol.69,491-497）。この時点で、第VIIａ因子、組織因子および第Ｘａ因子とリン脂質との混合物の“第VIII因子バイパス剤”として効力は不明である。さらに、ＰＣＣおよびＡＰＣＣの両方が、症例の約30-50％に十分な治療を提供しない。明らかに第VIII因子バイパス剤として使用できる、さらなる医薬調製物の存在が必要である。
本発明は、第VIII因子バイパスを提供し、これは本発明の血栓症において危険因子として関与したタンパク質に基づく。これらのタンパク質は、制限するわけではないが、該タンパク質のＡＰＣ耐性を誘導するようにＡＰＣの開裂−部位で修飾した第Ｖ因子タンパク質、あるいは匹敵する生物活性を有する（種類においてであり、特に量ではない）そのようなタンパク質の断片、または誘導体である。
本出願において前述したアッセイは、ＡＰＣの開裂−部位で修飾されたコファクター分子第Ｖおよび第VIII因子を含む物質を確認するために使用できる。このような突然変異したタンパク質を有する患者に由来するそのような血漿の確認後、所定量のハイパーコアギュラント（hypercoagulant）コファクター−タンパク質を含む調製物を作成できる。あるいは、ＡＰＣ−開裂−部位で修飾したタンパク質は、真核または原核細胞および／またはトランスジェニック動物中で、修飾したタンパク質の発現が関与する組換えＤＮＡ法を通して得ることができる。また、遺伝子治療法（制限するわけではないがレトロウイルスベクターの使用を含む）が関与する方法による、Arg⁵⁰⁶のＡＰＣ−開裂−部位または他のＡＰＣ−開裂−部位で修飾された第Ｖ因子タンパク質の治療的使用も含まれる。該タンパク質の精製は、モノクローナル抗体法、血漿分画法または当業者に利用できる任意の他の方法により行うことができる。さらにＡＰＣ−開裂−部位で修飾された第Ｖ因子から成る、このような医薬的に有用なタンパク質は、非−修飾第Ｖ因子も含むタンパク質の混合物から精製できる。精製には、１つ以上のＡＰＣ開裂−部位で修飾された第Ｖ因子を特異的に認識するモノクローナル抗体、または当業者に周知な他の方法による精製を含むことができる。
第Ｖ因子−タンパク質は、アミノ酸位Arg³⁰⁶および/またはArg⁵⁰⁶および/またはArg⁶⁷⁹で修飾した。ＡＰＣ−開裂−部位に先立つアルギニン−残基を、Gln、Ileまたは任意の他のアミノ酸に変えることができる。アミノ酸置換Arg⁵⁰⁶-GlnまたはＡＰＣ−開裂-部位の他の修飾を含む第Ｖ因子の治療的使用は、インヒビターを持つ血友病Ａ患者の治療に有用になるだろう。静脈性血栓症の患者に観察されるような、血栓−形成を促進するアミノ酸置換Arg⁵⁰⁶-Glnを含む第Ｖ因子の能力に基づき、このタンパク質は“第VIII因子バイパス剤”として有用となるだろう。インヒビターを有する血友病Ａ患者の現在の治療効力の限界、および高い経費という観点から、該第Ｖ因子を含む医薬調製物がより効果的となることが証明される。この治療用調製物は、アミノ酸置換Arg⁵⁰⁶-Glnを含む精製された第Ｖ因子から成ることができる。あるいはこのような修飾された第Ｖ因子は、治療用調製物の成分でもよい。該調製物は、プロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）または活性化プロトロンビン複合体濃縮物（ＡＰＣＣ）のような、血漿に由来する任意の治療用調製物でよい。
要約すると、本発明は特定の血栓疾患を検出する手段および方法を提供し、そしてそのような疾患の原因（すなわちＡＰＣ耐性を）確認することにより、本発明は例えば遺伝子治療を通じて、該疾患を修正する手段も提供する。一方、反対の性質の疾患、出血性疾患を治療するための治療薬も提供し、それではＡＰＣ耐性を有する突然変異した第Ｖおよび第VIII因子を、その過剰な凝固促進活性のために使用できる。本発明はどのように得られたにせよ、そのような治療薬の誘導体および／または断片に広がることは明らかである。当業者は患者に投与すべき治療薬の投与量をどのように決定するかを知っており、その投与量は疾患の程度、治療する患者の体重、選択した治療薬の比活性等の多数の因子に依存する。当業者に直ぐに明らかでない場合は、投与量は当該技術分野で周知な方法により、特に選択した治療薬の投与量を増加させながら、齧歯類のような動物への投与、そして後に（健康な）ボランティアへの投与を含むいわゆる投与量設定試験（dose findind study）を通して得ることができる。一般的にヒトに与える投与量は、１日に、体重１kgあたり1−500、より好ましくは5−50単位の間であろう。本発明の薬剤を投与できる医薬組成物は、当該技術分野で周知である。この薬剤はタンパク質−様物質であり、したがってタンパク質に適することが知られている配合物は、本発明の薬剤に適する。これらは単独で、または他の治療薬と一緒に与えることができる。これらは、所定の凝固活性の量の微妙なバランスをとるために、正常な第VIIIおよび／または第Ｖ因子と一緒に与えることもできる。
本発明を、以下の実施例でより詳細に説明する。
実施例１
静脈性の血栓−塞栓に罹患している患者の第Ｖ因子のアミノ酸Arg⁵⁰⁶位での活性化プロテインＣの開裂−部位での突然変異の同定
対比静脈造影および／または肺血管造影により確認された、特発性の血栓−塞栓が発現した（再発）27名の患者を、第Ｖ因子のアミノ酸Arg⁵⁰⁶位で突然変異の発生について調査した。分析した患者にはいずれも、アンチトロンビンIII、プロテインＣ、プロテインＳまたはプラスミノーゲンの後天的、または先天的欠失が無かった。血液凝固およびフィブリン溶解の日常的なスクリーニングでは、異常は無かった。末梢血リンパ球を血液からFicoll-Paque密度勾配遠心により単離した。ＲＮＡを末梢血リンパ球から、ＲＮＡｚｏｌＢ法を使用して単離し（WAK化学、バッドホーンブルグv.d.H.、独国）、そしてｃＤＮＡは本質的に以前に記載されたように調製した(Cuypersら、1992,J.Clin.Microbiol.vol.30,3220-3224)。患者は以下のオリゴ−ヌクレオチドプライマーを使用して第Ｖ因子のアミノ酸Arg⁵⁰⁶位での突然変異の存在について分析された：5'ＴＧＴＡＡＧＡＧＣＡＧＡＴＣＣＣＴＧＧＡＣＴＣＧ3'（プライマー506-1；センス；ヒト第Ｖ因子のヌクレオチド1576-1600、ヌクレオチド１は第Ｖ因子の開始−コドンの第一ヌクレオチドに対応する）；5'ＣＡＴＣＡＣＧＴＴＴＣＡＣＣＴＣＡＴＣＡＧＣ3'（プライマー506-2；アンチ−センス；ヒト第Ｖ因子のヌクレオチド1708-1730。オリゴ−ヌクレオチドプライマー506-１は、天然の第Ｖ因子配列について、下線を引いた２つの誤対合を含む。２つの誤対合は隣のArg⁵⁰⁶をコードするＣＧＡコドンと一緒に、オリゴヌクレオチドプライマー506-1および506-2を用いた増幅の際に、制限酵素NruIの制限-部位を導入する（表IIを参照にされたい）。静脈性血栓−塞栓に罹患している数名の患者から単離したｃＤＮＡの、オリゴヌクレオチド−プライマー506-1および506-2を使用するPCRによる増幅で、アミノ酸Arg⁵⁰⁶位にＡＰＣ開裂−部位を含む第Ｖ因子の一部をコードする154塩基対(bp)の断片を得た。アミノ酸Arg⁵⁰⁶位での突然変異の発生は、増幅した断片を制限酵素NruIにより消化してモニターした。
図３、レーン２では、NruIで消化できる増幅断片を表し、130bpの断片を生じる。NruIは増幅したPCR-断片を消化できるので、この個体（個体Ａ）にはアミノ酸Arg⁵⁰⁶での突然変異は存在しない。図３、レーン４において、NruIにより一部消化された増幅断片を表すが、この個体（個体Ｂ）の第Ｖ因子の１つの対立遺伝子のアミノ酸Arg⁵⁰⁶位に、突然変異が存在することを示す。個体Ｂのアミノ酸Arg⁵⁰⁶位での突然変異の存在を確認するために、以下の方法を採用した。第Ｖ因子ｃＤＮＡのより大きい部分を増幅するために、オリゴヌクレオチド−プライマーを設計した；5'ＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＣＡＧＧＧ3'（プライマー506-5;センス、ヒト第Ｖ因子のヌクレオチド1414-1435）および5'ＣＡＴＣＡＣＧＴＴＴＣＡＣＣＴＣＡＴＣＡＧＧ3'（プライマー506-2アンチセンス；ヒト第Ｖ因子のヌクレオチド1708-1730）。プライマー506-2および506-5を用いたPCRによる増幅は、316塩基対(bp)の断片を生じ、これはアミノ酸Arg⁵⁰⁶位にＡＰＣ開裂-部位を含む第V因子の一部をコードする。アミノ酸Arg⁵⁰⁶位での突然変異の発生は、増幅した断片を直接シークエンシングすることによりモニターした（図４）。明らかに個体Ｂにおいて、コドンArg⁵⁰⁶内に突然変異が存在する;このコドンの第二塩基対で“Ｇ”および“Ａ”の両方が観察されるので、個体Ｂでは第Ｖ因子の遺伝子の１つの対立遺伝子中にArg⁵⁰⁶(CGA)からGln(CAA)への置換を生じている。直接的シークエンシングを個体Ａにも使用し、これではオリゴヌクレオチド−プライマー506-1および506-2を用いた増幅から生じる154bp断片の消化時に、異常な制限パターンは示さなかった（図３;レーン２を参照にされたい）。個体Ａの直接的シークエンシングは、第Ｖ因子のアミノ酸Arg⁵⁰⁶位での突然変異を明らかにしなかった（図４；左パネル）。これらの結果は明らかに、ここで使用した様々なアッセイがヒト第Ｖ因子のアミノ酸Arg⁵⁰⁶位での突然変異を検出できることを示している。
次に、血液凝固第Ｖ因子の活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）感受性領域内の点突然変異の発生について、特発性（再発）血栓塞栓を記録した27名のすべての患者を分析した。オリゴヌクレオチドプライマー506-1および506-2を用いた増幅を使用して、NruI消化ならびに増幅した断片の直接的シークエンシングの後、これらの患者の10名がＧからＡへの１つの転移を表し、そしてArg⁵⁰⁶からGln⁵⁰⁶への突然変異についてヘテロ接合性であることが見られた。記載したこの方法は、血栓塞栓疾患に罹患している患者の約35％に分子欠失を定めることができ、これは本発明に記載された方法が使用できる前には診断できなかった。
得られた結果は、血栓塞栓疾患に罹患している患者の第Ｖ因子のＡＰＣ−開裂部位での突然変異発生のモニタリングが、特発性血栓塞栓症の診断に大きな突破口となることを示している。
これまでの章に記載したように、10名の個体はArg⁵⁰⁶からGlnへの突然変異についてヘテロ接合性であることが判明した。シークエンシング分析では、調査したすべての場合で１つのヌクレオチド“Ｇ”から“Ａ”への置換が存在することが明らかになった。
表IIIに示したオリゴヌクレオチドプライマーに基づき、この１つの塩基−対置換の存在をモニターするためのアッセイを開発した。研究したすべての患者のゲノムＤＮＡを、標準的方法を使用して単離した。オリゴヌクレオチド−プライマー506-5および506-6を用いたPCRによる増幅では、調査した患者で206bpの断片を生じる。オリゴヌクレオチド−プライマー506-5および506-7を用いたPCR-増幅で、調査したすべての患者で206bpの断片を生じる。最後に、Arg⁵⁰⁶からGln置換に特異的なオリゴヌクレオチド−プライマー506-5および506-8を用いたPCR-増幅で、Arg⁵⁰⁶からGln置換についてヘテロ接合性である10名の患者だけが206bpの断片を生じる。Arg⁵⁰⁶からGlnへの突然変異を持たない患者については、これらのオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCR増幅の後に生成物は観察されない。
結論として、第Ｖ因子のアミノ酸Arg⁵⁰⁶位での突然変異を診断できる数種の方法を記載した。これらの手法の、血栓-塞栓疾患に罹患している患者への適用能は、これらアッセイの血栓-塞栓疾患の診断への利用性を明らかに示している。
実施例２；活性化プロテインＣの開裂部位に突然変異が有る、または無い第Ｖ因子を含む血漿中のトロンビン生成。
実施例１に記載した方法の利用性は、血栓-塞栓疾患に罹患している患者の診断に限定されるのではなく、健康な血液提供者に由来する血漿の凝固促進性の可能性の評価も含む。凝固促進性と抗−凝固経路の間のバランスを評価するために、簡単な試験法を開発した。これは過剰な抗−凝固活性化プロテインＣの存在下での、凝固促進性トロンビンの生成に基づく。このアッセイは以下のように行われた。最初に50μlのクエン酸を加えた、血小板が少ない（platelet-poor）血漿を、350μlの希釈緩衝液（50mM Tris（pH7.3）および0.1％（重量／容量）のウシ血清アルブミン（シグマ化学社：Sigma Chemical Co.,セントルイス、米国））を含むプラスチック試験管に加えた。次に400μlのAPTT試薬（クロモジェニックス社:Chromogenix AB.、メルンダル、スウェーデン）をリン脂質源として加え、そして凝固系を活性化するためにコロイドシリカを加えた。この混合物を37℃で５分間インキューベーションした後、400μlの予め暖めたTris/アルブミン希釈緩衝液（25mM CaCl₂および1μg/mlの精製ヒト活性化プロテインＣを含む）を加えた（Kisiel,1979,J.Clin.Invest.vol.64,761-769）。
定期的に、45μlの試料を取り出した。これらを直ちに５μlの0.25M EDTAと混合し、さらなるトロンビンの形成を停止させた。続いて試料をTris/アルブミン緩衝液で5-20倍に希釈し、発色体基質S2238（クロモジェニックス社、メルンダル、スウェーデン）の水溶液（1.0mM終濃度）と混合した。405nmの吸収を分光光度的にモニターした。吸収増加の割合をトロンビンのモル濃度に換算するために、このアッセイを精製したヒトトロンビンでキャリブレーションした（Mertensら、1985,Thromb.Haemostasis vol.54,654-660）。図５はこのアッセイで生成したトロンビンを表し、使用した血漿試料は第Ｖ因子の遺伝子型がArg⁵⁰⁶/Arg⁵⁰⁶、Arg⁵⁰⁶/Gln⁵⁰⁶およびGln⁵⁰⁶/Gln⁵⁰⁶とすでに証明された3名の明らかな血液提供者に由来し、実施例１に記載のＰＣＲ法を使用した。図５から証明されるように、このアッセイ系のトロンビン生成は、第Ｖ因子のアミノ酸506位でのArgからGlnへの突然変異の存在に完全に依存した。さらに、トロンビン生成の程度はこの突然変異についてホモ接合性およびヘテロ接合性の提供者の血漿間で明らかに区別された。これらのデータは、活性化プロテインＣの開裂部位で突然変異を持つ第Ｖ因子が、ヒト血漿の全体的な凝固促進性の可能性に大いに貢献する、通常にはない強力な凝固促進性物質であることを示す。
実施例３：ヒト血漿に由来する第Ｖ因子−含有画分の調製。
現在の血漿分画スキームにおいて、第Ｖ因子を故意に濃縮させた画分を調製するための特別な工程は計画されなかった。血漿から第Ｖ因子を精製する方法は、従来の沈殿法およびクロマトグラフィー法の両方により（スズキら、1982,J.Biol.Chem.,vol.257,6556-6564）、ならびに免疫アフィニティークロマトグラフィーにより（Katzmannら、1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.vol.78,162-166）、よく確立された。しかし工業的規模については、これらの方法の利用性は、緊急に必要とされている第VIII因子および免疫グロブリンのような生成物を犠牲にして第Ｖ因子を生成するので限界がある。
第Ｖ因子の単離は、好ましくは通例の血漿分画スキームに適合すべきであるので、様々な通常の血漿画分が第Ｖ因子の有力な供給源として評価された。画分は、市販されている第Ｖ因子欠失血漿（バクスター:Baxter、デューディンゲン、スイス）およびヒト組織トロンボパスチン（Thromborel(商標)-S、ベーリング:Behring、マールブルグ、独国）を使用して、古典的な１−段階凝固アッセイを使用して第Ｖ因子の活性について分析した（Biggs,1976,ヒトの血液凝固、止血および血栓（Human blood coagulation,haemostasis and thrombosis）、第２版、Blackwell、オックスフォード、第310-364頁）。試験した分画法は、アルブミンおよび免疫グロブリンの通常のエタノール分画に先立ち、寒冷沈降法および陰イオン交換法から成っていた（Brummelhuis、血漿タンパク質分画法（Methods of plasma protein fractionation）、（J.M.Curling編集）、1980、アカデミック出版、ロンドン、第117-128頁）。6つの異なる画分の分析は、第１工程で、最初の第Ｖ因子の活性の約80％が寒冷沈降血漿中に回収されたことを示した。第２工程で、第Ｖ因子の活性の実質的な量（少なくとも50％）が、プロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）の調製に使用スル陰イオン交換樹脂（DEAE-SephadexA-50）（ファルマシア:Pharmacia、ウプサラ、スウェーデン）に吸着したことが示された。記載されたように洗浄および溶出した後（Brummelhuis、同上）、生成したＰＣＣは様々な濃度の（５から20％の間）初の第Ｖ因子の活性を含むことが判明した。寒冷沈降血漿の10ml部分を使用する小規模の実験で、第Ｖ因子の収量が(1)DEAE-Sephadexの量を寒冷沈降血漿1kgあたり少なくとも1.5gに増加させること、(2)寒冷沈降血漿を希釈して吸着工程中のイオン強度を下げること、(3)溶出前の洗浄条件のイオン強度を下げること、または(4)これらの改良を組み合わせることにより、向上できることが示された。
ＰＣＣ調製の改良法を使用することにより、この血漿画分中に初の第Ｖ因子の最高30％まで得ることが可能であると思われた。第Ｖ因子活性およびタンパク質含量をアッセイすることによるこの画分の純度の評価は（Bradford,1976,Anal.Biochem.vol 72,248-254）、0.4単位/mgの比活性であることを示し、これは25-倍の精製度に相当する。したがってＰＣＣ調製の改良法で、第VIII因子、アルブミンまたは免疫グロブリン生成物の調製を妨害することなく、第Ｖ因子が濃縮された血漿画分を提供する。この部分的に精製された第Ｖ因子を上記に参照した従来の、または免疫アフィニティー法により、さらに所望の純度に精製するための供給材料として役立たせることができる。
実施例４：第Ｖ因子の506位がArgまたはGlnである血漿について選択した供給血漿から調製した第Ｖ因子−含有画分中のトロンビンの生成。
部分精製した第Ｖ因子の調製のために、血液をクエン酸塩−含有の標準抗凝固物中に集めた。細胞を遠心（5,000gで15分間）により集め、そして上清血漿を凍結し、そして-30℃未満で使用するまで保存した。個人の血漿試料は、実施例２に記載した方法によりスクリーニングし、そしてトロンビン生成プロフィールから明らかな表現型に従い、３つ基準に分類した（図５を参照にされたい）。すべての場合で、同提供者からの末梢血リンパ球を単離して、実施例１に記載したようにPCR分析により遺伝子型を確認した。血漿を次に４℃で解凍し、そして寒冷沈降物を遠心(2,000gで5分間)により集めた。同じ表現型の寒冷沈降血漿をプールし、そしてDEAE-Sephadex A-50(ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン)を１kgの血漿あたり1.5gの乾燥重量で加えた。混合物を室温で30分間撹拌し、そして陰イオン交換樹脂を回収するためにカラムに移した。カラムは154mMのNaClを含む10mMクエン酸三-ナトリウム(pH7.0)の緩衝液を使用して洗浄し、そして第Ｖ因子が濃縮されたＰＣＣ−画分を、0.7MのNaClを含有する同緩衝液で溶出した。この工程で、ヘテロ接合体提供者からの第Ｖ因子のArg⁵⁰⁶、Gln⁵⁰⁶型または、これら２つの混合物を含む３つの異なるＰＣＣ−画分を得た。
３つのＰＣＣ画分のトロンビン生成の可能性を評価するために、ＰＣＣを0.2から0.3単位/mlの間の第Ｖ因子活性に、50mMTris(pH7.3)および0.1％（重量／容量）ウシ血清アルブミンを含む緩衝液で希釈した。さらに凝固系を活性化するために、トロンビン生成は400μlの希釈ＰＣＣ、400μlのＡＰＴＴ試薬および400μlのTris/アルブミン緩衝液(25mMのCaCl₂、1μg/mlの精製ヒト活性化プロテインＣおよび1/2000-希釈トロンボプラスチン試薬(Tromborel(商標)、ベーリング、マールブルグ、独国)を使用して、実施例２に詳細に記載した同方法により評価した。実施例２に記載した方法を使用して、定期的間隔で試料を定量するために取り出し、そしてトロンビン生成プロフィールを作成した（図６を参照にされたい）。図６から明らかなように、トロンビン生成は、第Ｖ因子のアミノ酸506位のArgからGln突然変異の存在に大きく依存した。さらにトロンビン生成の程度は、突然変異についてホモ接合性およびヘテロ接合性の提供者に由来するＰＣＣの間で明らかに異なっていた。
これらのデータは、活性化プロテインＣの開裂部位に突然変異を持つ第Ｖ因子の強力な凝固促進作用は、完全な血漿に限られるのではなく、ＰＣＣのような第Ｖ因子−濃縮血漿画分中でも等しく現れることを実証している。第Ｖ因子−含有血漿画分の調製の第１工程として、該突然変異について供給血漿をスクリーニングすることは、したがって活性化プロテインＣの存在中でのトロンビン生成に関して大きく異なる医薬調製物を導く。図６から明らかなようにこの知見は、ＰＣＣの効力を向上させるために望まれるような、ＰＣＣの凝固促進性の可能性を減らし、これが現在知られているＰＣＣの血栓形成性を減少するか、または第VIII因子または他の凝固因子に対する阻害抗体を持つ患者の治療において、ＰＣＣの凝固促進性を増大させるために有利である。
実施例５：活性化プロテインＣの開裂部位に突然変異を持つ第Ｖ因子は、第VIII因子インヒビターバイパス活性を表す。
血漿を重篤な血友病Ａおよび第VIII因子と対するインヒビターを持つ患者から集めた。この抗−第VIII因子の力価は、いわゆる“ベセスダアッセイ（Bethesda assey）”を使用して測定し（Kasperら、1975,Thromb.Diath.Haemorrh.vol.34,869-872）、40ベセスダ単位であることが分かった。このような、この高力価は第VIII因子を用いた通常の代替療法では禁止されている。100μlの患者血漿に、部分精製した第Ｖ因子を最終濃度が0.5単位/mlになるように供給した。この第Ｖ因子は、実施例４に詳細に記載したように、アミノ酸506位にArgからGlnの突然変異が存在するために選択された血漿から精製した。混合物を次に、50mMのTris(pH7.3)および0.1％（重量／容量）のウシ血清アルブミンを含む緩衝液を使用して、400μlに希釈した。トロンビン生成は実施例２に詳細に記載した同方法により、400μlのＡＰＴＴ試薬および400μlのTris/アルブミン緩衝液(25mM、そして1/8000倍希釈のトロンボプラスチン試薬を含む)を使用して評価した（実施例４を参照にされたい）。実施例２に記載した方法を使用して、定期的にトロンビンの定量のために試料を取り出し、そしてトロンビン生成プロフィールを作成した（図７を参照にされたい）。図７から明らかなように、第Ｖ因子の添加無し、またはアミノ酸506位がArgの第Ｖ因子を添加した後には、わずか少量のトロンビン生成が検出されただけであった。しかしアミノ酸506位でArgからGlnへの突然変異を有する第Ｖ因子の存在で、トロンビン生成は正常な、血友病ではない血漿中と同じであった。これは第Ｖ因子のArg⁵⁰⁶→Gln変異体を含んで成る医薬調製物が、第VIII因子バイパス活性を表し、そしてそれ自体が凝固血管の修正に利用性を持つことを示している。
実施例６：活性化プロテインＣの開裂部位ニ突然変異を有する第VIII因子分子の構築。
実施例２および４に示すように、活性化プロテインＣの開裂部位に突然変異を有するコファクター分子は、正常な健康な血液提供者の血漿中で生じることができ、そして変異体コファクターは精製前に提供者の血漿をスクリーニングすることにより選択的に得ることができる。そのような変異体を得ることは、正常な提供者群でのそれらの存在率から、限界があるかもしれない。そのような限界は、その変異体を組換えＤＮＡ法を使用して生成することにより克服できる。この方法の例は以下の記載により与えられるが、それは活性化プロテインＣの開裂部位Arg⁵⁶²で置換を含む第VIII因子ｃＤＮＡの構築および発現を概略している。この記載は平均的な当業者が、同様な置換をコファクター分子第VIII因子中の他の開裂部位で作成するための例である（図１を参照にされたい）。すでに第VIII因子ｃＤＮＡのＢ−ドメイン欠失形態をコードするプラスミドpCLB-BPVdB695を記載した(Mertensら、Br.J.Haematol.vol.85,133-142)。Arg⁵⁶²がIleに置換している第VIII因子ｃＤＮＡを調製するために、ポリメラーゼ連鎖反応を利用した。1206bp断片は、プラスミドpCLB-BPVdB695を鋳型として使用して、以下のオリゴヌクレオチド−プライマーを使用して増幅した：F8-547S 5'ＣＴＧＧＴＡＡＡＡＧＡＣＴＴＧＡＡＴ 3'（第VIII因子ｃＤＮＡのヌクレオチド547-565）;センスおよびF8-1732AS 5' ＣＴＧＧＴＴＴＣＣＡＴＴＴＴＧＡＴＣＴＡＣ 3&apos（第VIII因子のｃＤＮＡのヌクレオチド1732-1753;アンチセンス誤対合に下線を付した）。さらに306bpの断片は、プラスミドpCLB-BPVdB695を鋳型として使用して、以下のオリゴヌクレオチド−プライマーを使用して増幅した：F8-1732S 5' ＧＴＡＧＡＴＣＡＡＡＡＴＧＧＡＡＡＣＣＡＧ 3'（第VIII因子のヌクレオチド1732-1753;センス誤対合に下線を付した）およびF8-2020AS 5' ＧＴＧＴＴＴＧＡＡＧＧＴＡＴＡＴＣＣ 3'（第VIII因子のヌクレオチド2020-2038）;アンチセンス。反応条件は次の通りである：2' 90℃、20' 50℃、3' 72℃;45" 90℃で37回、90" 50℃、3' 72℃;5' 65℃、1mMのdNTPs、10倍のPfu-ポリメラーゼ反応緩衝液、50pMolのプライマーH1およびH2ならびに2.5UのPfu-ポリメラーゼ（ストラタジーン:Stratagene、ケンブリッジ、英国）の存在下。306bp断片および1206bp断片を、低融点アガロースゲル電気泳動法で精製し、続いてフェノール抽出した。精製した断片は、オリゴヌクレオチド-プライマーF8-547SおよびF8-2020ASを使用して、上記の反応条件を使用して、1491bp断片を増幅するための鋳型とした。生成した1491bp断片をApalI(853位)およびKpnI(1811位)で消化し、そして生成したApalI−KpnIを、pCLB-BPVdB695の対応するApaI−KpnI断片と置き換えるために使用した。生成したプラスミドをpCLB-BPVdB695RI562と命名し、そしてArg⁵⁶²→Ile突然変異を含むApalI−KpnI断片の配列を、オリゴヌクレオチド−シークエンシングにより確認した。C127細胞を、10％ウシ胎児血清、100U/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンを補充したIscove's培地で維持した。C127細胞のサブコンフルエントな単層を、本質的に記載されているように（GrahamおよびVan der Eb、1973,Virology vol.52,456-467）、リン酸−カルシウムを使用してトランスフェクションした。プラスミドpCLB-BPVdB695RI562(20μg)を、pGKhyg（１μg；Ten Rieleら、1990,Nature vol.348,649-651）でコートランスフェクションした。トランスフェクション、そしてトランスフェクションした細胞を200μg/mlのヒグロマイシンで選択した後、個々のクローンを単離し、そして選択培地で増殖させた。第VIII因子の分泌は、第Ｘａ因子の発色基質を使用して（Coatest Factor VIII、クロモジェニックス、メルンダル、スウェーデン）、第VIII因子が第Ｘａ因子の第IXa−依存性転換のためのコファクターとして機能する能力を測定することによりモニターした。第VIII因子抗原は、すでに特性が決定されたモノクローナル抗体（Lentingら、1994,J.Biol.Chem.vol 269,7150-7155）を使用して決定した。第VIII因子の軽鎖に対するモノクローナル抗体CLB-CAg12を固相として使用し、一方ペルオキシダーゼ−標識モノクローナル抗体CLB-CAg117(これも第VIII因子の軽鎖に対する)は、結合した第VIII因子の量を定量するために使用した。40名の健康な提供者のプールに由来する正常血漿を標準として使用した。有意な第VIII因子量を生産するpCLB-BPVdB695RI562でトランスフェクトした細胞から派生したクローンを、使用するまで液体窒素中で保存した。pCLB-BPVdB695RI562でトランスフェクトした細胞から派生した１つのクローンを、コンフルエントになるまで成長させ、そして続いて上記に概説したようにコファクター活性および抗原を測定した。アミノ酸Arg⁵⁶²位で修飾された第VIII因子−タンパク質は、56mU/mlのコファクター-活性を表した。抗原レベルを、続いて72mU/mlと決定した。
これらのデータは、活性化プロテインＣの開裂部位で修飾されたコファクタンー分子が、真核細胞中で発現できることを示す。これらの変異体コファクター分子は、すでに確立されているように(Mertensら、1993,Br.J.Haematol.vol.85,133-142)、免疫−アフィニティークロマトグラフィー法により最も都合よく精製される。精製後、修飾されたコファクタータンパク質を、止血疾患を打ち消すための治療用調製物中に配合できる。
実施例７：活性化プロテインＣの開裂部位に突然変異を有する第Ｖ因子分子の構築
実施例１に示すように、活性化プロテインＣの開裂部位に突然変異を有するコファクター分子は、血栓−塞栓疾患に罹患している患者、ならびに正常な健康な血液提供者の血漿中に生じうる。実施例４において、血漿から得た、そのような修飾されたコファクターは、修飾分子と比較した時にトロンビン−生成の増加を示すことが明らかである。さらに実施例５において、置換Arg⁵⁰⁶→Glnを持つ第Ｖ因子分子は、“第VIII因子バイパス剤”として機能できることが示されている。そのような変異体を得ることは、正常な提供者群中でのその存在率から限界があるかもしれない。そのような限界は、その変異体を組換えＤＮＡ法を使用して生成することにより克服できる。この方法の例は以下の記載により提供されるが、それは活性化プロテインＣの開裂部位Arg⁵⁰⁶に置換を含む第Ｖ因子ｃＤＮＡの構築を概略する。この記載は平均的な当業者が、同様な置換をコファクター分子第Ｖ因子中の他の開裂部位に作成するための例である。第Ｖ因子のｃＤＮＡは本質的に記載されているように（Jennyら、1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol,84,4846-4850）単離する。第Ｖ因子のｃＤＮＡの5'末端を、第Ｖ因子の開始−コドンで重複するNspI部位に挿入した二本鎖合成リンカー（5' ＡＡＴＧＴＣＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧ3'、センス；5' ＧＴＧＧＣＴＴＴＧＴＣＧＡＣＡＴＴ3'、アンチセンス）を使用することにより修飾する。第Ｖ因子のｃＤＮＡの3'末端は以下のように修飾される:588bpの断片を増幅するために、オリゴヌクレオチド-プライマーFV-7（5' ＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＴＴＴＴＴＧＡＡＴＧＴＴＣＡ 3'ヌクレオチド6679-6697;アンチ−センス）を、オリゴヌクレオチド−プライマーFV-8（5' ＧＴＧＧＣＴＡＧＡＴＡＴＡＴＴＡＧＧＡＴＣ 3' ヌクレオチド6109-6130;センス）と共に使用する。反応条件は：2' 90℃、20' 55℃、3" 72℃；45" 90℃で37回、90" 55℃、3' 72℃；5' 65℃、1mM dNTPs、10倍のPfu-ポリメラーゼ反応緩衝液、50pMolのプライマーFV-7およびFV-8ならびに2.5UのPfu-ポリメラーゼ（ストラタジーン、ケンブリッジ、英国）の存在下。生成した断片をXhoIおよびNotIで消化し(第Ｖ因子のヌクレオチド6137-6697)、そして生成した断片をSphI-XhoI断片（第Ｖ因子のヌクレオチド5134-6137）、第Ｖ因子のｃＤＮＡの修飾5'末端を含むSalI-SphI断片(ヌクレオチド1-5134)、およびXhoIおよびNotI（ファルマシア-LKB、ウプサラ、スウェーデン）で消化したベクターpBPVと一緒にライゲーションに使用する。生成した構築物をpCLB-PBVFVと命名する。
第Ｖ因子のArg⁵⁰⁶でＡＰＣ−開裂部位に突然変異を含む第Ｖ因子のｃＤＮＡを構築するために、オリゴヌクレオチド−プライマー506-11(5' ＣＴＧＴＡＴＴＣＣＴＴＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧ 3' ヌクレオチド1591-1612;アンチ-センス)を、オリゴヌクレオチド−プライマーFV-2(5'ＴＴＧＣＡＡＧＣＴＧＧＧＡＴＧＣＡＧＧＣＴ 3';ヌクレオチド946-967;センス)と共に使用して、666bp断片を増幅する。反応条件は：2' 90℃、20' 55℃、3' 72℃;45" 90℃で37回、90" 55℃、3' 72℃;5' 65℃、1mMのdNTPs、10倍のPfu-ポリメラーゼ反応緩衝液、50pMolのプライマー506-11およびFV-2ならびに2.5UのPfu-ポリメラーゼ（ストラタジーン、ケンブリッジ、英国）の存在下。同様に、オリゴヌクレオチド−プライマー506-12(5' ＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣＡＡＧＧＡＡＴＡＣＡＧ 3';ヌクレオチド1591-1612;センス)およびオリゴヌクレオチド−プライマー506-2(5' ＣＡＴＣＡＣＧＴＴＴＣＡＣＣＴＣＡＴＣＡＧＧ 3';ヌクレオチド1708-1730;アンチセンス)を、上記の反応条件を使用して139bp断片を増幅するために使用する。オリゴヌクレオチド−プライマー505-2およびFV-2を使用して784bp断片を増幅するために、139bp断片および666bp断片の両方を使用する。生成した断片をKpnI(ヌクレオチド位1674)およびPstI(ヌクレオチド位1068)で消化し、そしてArg⁵⁰⁶→Gln突然変異を含む第Ｖ因子断片を、プラスミドpCLB-BPV-FVの対応する断片と置き換えるために使用する。生成したプラスミドをpCLB-BPVFVRQ506と命名し、そしてArg⁵⁰⁶→Gln突然変異を含むPstI-KpnI断片の配列をオリゴヌクレオチド−シークエンシングで確認する。
これらのデータは、活性化プロテインＣの開裂部位で修飾された第Ｖ因子分子が構築でき、そして真核細胞発現ベクター中にクローン化できることを示している。これらの変異体コファクター分子は、記載された方法(Kaneら、1990,Biochemistry vol.29,6762-6768)により、最も都合よく真核細胞中で発現する。修飾されたタンパク質の精製は、好ましくは免疫−アフィニティークロマトグラフィー法により、第Ｖ因子についてすでに確立されているように行われる（Katzmannら、1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.vol.78,162-166）。
【図面の簡単な説明】
図１は第VIII因子中のトロンビンおよびＡＰＣについてそれぞれ、活性化および不活性化部位を示す。棒の上に、第VIII因子中のトロンビンに関する開裂−部位を表す。このタンパク質の凝固促進機能を妨害するアミノ酸Arg³⁷²およびArg¹⁶⁸⁹位での突然変異は、血友病Ａを生じることが示された。棒の下に、Arg³³⁶およびArg⁵⁶²位でのＡＰＣ開裂部位を示した。この部位の突然変異は、第VIII因子の凝固促進活性を長期化し、血栓形式傾向を生じるようである。
図２は第Ｖ因子中のトロンビンおよびＡＰＣについてそれぞれ、活性化および不活性化部位を示す。棒の上に、トロンビンに関する開裂−部位を表す。未だ、第Ｖ因子のこれらアミノ酸位で突然変異は示されていない。棒の下に、アミノ酸Arg³⁰⁶、Arg⁵⁰⁶、Arg⁶⁷⁹およびArg¹⁷⁶⁵位のＡＰＣ開裂部位を示した。
これらの部位の突然変異は、第Ｖ因子の凝固促進性を長期化し、血栓形成傾向を生じるようである。
図３は第Ｖ因子のアミノ酸Arg⁵⁰⁶位に突然変異を持たない患者（個体Ａ）、および突然変異を持つ患者（個体Ｂ）の分析を示す。レーン１.個体ＡのｃＤＮＡに由来するオリゴヌクレオチド−プライマー506-1および506-2で増幅した154bp断片。レーン２．NruIで消化した後の個体Ａの同断片。レーン３．個体ＢのｃＤＮＡに由来するオリゴヌクレオチド−プライマー560-1および506-2で増幅した154bp断片。レーン４．NruIで消化した後の個体Ｂの同断片。レーン５．100bpラダー。
図４は、患者の第Ｖ因子のｃＤＮＡの配列分析を与える。個体Ｂに由来する第Ｖ因子のｃＤＮＡ、Arg⁵⁰⁶からGlnへの突然変異についてヘテロ接合体を右パネルに示す。ヘテロ接合性は、第Ｖ因子のコドンArg⁵⁰⁶(CGA/CAA)の第二塩基対で、“Ｇ”および“Ａ”の両方の発生が記録される（矢印で示すように）。左のパネルでは、突然変異を持たない個体Ａの配列分析を示す。矢印は、コドンArg⁵⁰⁶（CGA/CGA）の第二塩基対で観察された１つの“Ｇ”を示す。
図５は、アミノ酸506位の活性化プロテインＣの開裂部位に、突然変異が有る、または無い第Ｖ因子を含む血漿中のトロンビン生成を示す。血漿は、第Ｖ因子の遺伝型がArg⁵⁰⁶/Arg⁵⁰⁶、Arg⁵⁰⁶/Gln⁵⁰⁶およびGln⁵⁰⁶/Gln⁵⁰⁶の３名の異なる提供者から得た。
図６は、第Ｖ因子の遺伝型がArg⁵⁰⁶/Arg⁵⁰⁶、Arg⁵⁰⁶/Gln⁵⁰⁶およびGln⁵⁰⁶/Gln⁵⁰⁶について選択された提供者の血漿からのプロトロンビン複合体濃縮物として調製した、部分精製第Ｖ因子中のトロンビン生成を表す。
図７は、重篤な血友病Ａおよび第VIII因子に対して高力価インヒビターを有する患者の血漿中のトロンビン形成を表す。トロンビン形成は、外因性の第Ｖ因子の存在により完全に正常化されているが、ただし外因性の第Ｖ因子は活性化プロテインＣの開裂部位にArg⁵⁰⁶からGlnへの突然変異を有する。
表Ｉ：第VIIIおよび第Ｖ因子中のＡＰＣ開裂−部位。ヒト第VIII因子中の開裂−部位は、ＡＰＣ消化第VIII因子の開裂生成物のアミノ酸シークエンシングにより確認された。ヒト第Ｖ因子中の開裂−部位は、ウシ第Ｖ因子との相同性に基づいている。ＡＰＣによるウシ第Ｖ因子の消化により生成したタンパク質溶解断片のアミノ酸シークエンシングを、正しい開裂−部位を決定するために使用した。第Ｖおよび第VIII因子のアミノ酸１は、シグナルペプチド後の第一アミノ酸に対応する。第Ｖおよび第VIII因子のヌクレオチド１は、開始−コドンの第一ヌクレオチドに対応する。
ヒト第VIII因子（アミノ酸配列Ｓｅｒ³²⁸−Ａｓｐ³⁴⁵；ヌクレオチド１０３９−１０９０）：

ヒト第VIII因子（アミノ酸配列Ｃｙｓ⁵⁵⁴−Ａｒｇ⁵⁷¹；ヌクレオチド１７１７−１７６８）：

ヒト第Ｖ因子（アミノ酸配列Ｉｌｅ²⁹⁸−Ｇｌｎ³¹⁵；ヌクレオチド９７６−１０２７）：

ヒト第Ｖ因子（アミノ酸配列Ｃｙｓ⁴⁹⁸−Ｇｌｕ⁵¹⁵；ヌクレオチド１５７６−１６２７）：

ヒト第Ｖ因子（アミノ酸配列Ｐｒｏ⁶⁷¹−Ｇｌｕ⁶⁸⁸；ヌクレオチド２０９５−２１４６）：

ヒト第Ｖ因子（アミノ酸配列Ｇｌｕ¹⁷⁵⁷−Ｓｅｒ¹⁷⁷⁴；ヌクレオチド５３５３−５４０４）：

表II：第Ｖ因子のアミノ酸Arg⁵⁰⁶位、ならびに第VIII因子のArg³³⁶位およびArg⁵⁶²位のＡＰＣ開裂-部位で突然変異を検出するために使用したオリゴヌクレオチドプライマーの一覧表。第Ｖおよび第VIII因子の野生型配列に関して、オリゴヌクレオチド−プライマー中の誤対合に下線を付している。野生型の第Ｖおよび第VIII因子配列に由来する適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて命名したプライマーのＰＣＲ増幅後、制限−部位を持つ断片を生成する。特定のコドンでの突然変異の存在は、この制限−部位を破壊し、したがってＡＰＣに関する開裂−部位で突然変異をモニターするために使用できる。
ヒト第VIII因子（アミノ酸配列Ｓｅｒ³²⁸−Ａｓｐ³⁴⁵；ヌクレオチド１０３９−１０９０）：

オリゴヌクレオチドプライマー３３６−１（センス：ヌクレオチド１０３９−１０６４）：

オリゴヌクレオチドプライマー３３６−２（センス：ヌクレオチド１０３９−１０６３）：

オリゴヌクレオチドプライマー３３６−３（アンチ−センス：ヌクレオチド１１８０−１２０１）：

オリゴヌクレオチドプライマー５６２−５（センス：ヌクレオチド１７１７−１７４１）：

オリゴヌクレオチドプライマー５２６−６（アンチ−センス：ヌクレオチド２０２０−２０３８）：

ヒト第Ｖ因子（アミノ酸配列Ｃｙｓ⁴⁹⁸−Ｇｌｕ⁵¹⁵；ヌクレオチド１５７６ー１６２７）：

オリゴヌクレオチドプライマー５０６−１（センス：ヌクレオチド１５７６−１６００）：

オリゴヌクレオチドプライマー５０６−２（アンチ−センス：ヌクレオチド１７０８−１７３０）：

表III：Arg⁵⁰⁶からGln置換を診断するための、第Ｖ因子ｃＤＮＡおよびゲノム配列の両方に由来するオリゴヌクレオチドプライマー。第Ｖ因子遺伝子のイントロン10のヌクレオチド１−８に由来するプライマーの部分を太く示す。オリゴヌクレオチド−プライマー506-8は、オリゴヌクレオチドプライマー506-7に関して“Ｃ”から“Ｔ”への置換を含み、これは明細書に記載したArg⁵⁰⁶からGln置換に相当する（下線）。

（センス；第Ｖ因子cDNAのヌクレオチド１４１４−１４３５）

（アンチ−センス；第Ｖ因子遺伝子のヌクレオチド１６０２−１６１２および第Ｖ因子遺伝子のイントロン１０のヌクレオチド１−８）

（アンチ−センス；第Ｖ因子遺伝子のｃＤＮＡヌクレオチド１６０１−１６１２および第Ｖ因子遺伝子のイントロン１０のヌクレオチド１−８）

（アンチ−センス；第Ｖ因子遺伝子のヌクレオチド１０６２−１６１２および第Ｖ因子遺伝子のイントロン１０のヌクレオチド１−８）

Claims

活性化プロテインＣに対して耐性である血液凝固第Ｖ因子を有効成分とする血液凝固カスケードにおける疾患を治療するための医薬製剤であって、該血液凝固第Ｖ因子が活性化プロテインＣの開裂部位３０６位および５０６位の少なくとも１つに突然変異を有することを特徴とする医薬製剤。
突然変異が３０６位および／または５０６位におけるアルギニン残基の置換突然変異である請求項１記載の医薬製剤。
突然変異が３０６位に存在する請求項１または２記載の医薬製剤。
突然変異が５０６位に存在する請求項１または２記載の医薬製剤。
突然変異が３０６位および５０６位に存在する請求項１または２記載の医薬製剤。
血液凝固第Ｖ因子が活性化プロテインＣに対して耐性である
第Ｖ因子を発現する遺伝子操作された細胞または生物体から得られる請求項１〜５のいずれかに記載の医薬製剤。
血液凝固第Ｖ因子が活性化プロテインＣに対して耐性を示す個体の血液もしくは血漿から得られる請求項１〜５のいずれかに記載の医薬製剤。
少なくとも１種の追加の凝固因子をさらに含む請求項１〜７のいずれかに記載の医薬製剤。
少なくとも１種の追加の凝固因子が第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子および第Ｘ因子からなる群より選ばれる請求項８記載の医薬製剤。
製薬学的に許容されうる担体、希釈剤、または助剤をさらに含む請求項１〜９のいずれかに記載の医薬製剤。
血液凝固カスケードにおける疾患が第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子および第Ｘ因子からなる群より選ばれる少なくとも１種の凝固因子の欠失に起因する請求項１記載の医薬製剤。
疾患が凝固因子に対するインヒビターまたは抗体の存在により悪化する請求項１１記載の医薬製剤。