PT756638E - Metodo e meios para a deteccao e tratamento de alteracoes da cascata de coagulacao do sangue - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO ' MÉTODO E MEIOS PARA A DETECÇÃO E TRATAMENTO DE ALTERAÇÕES DA CASCATA DE COAGULAÇÃO DO SANGUE" O presente invento está relacionado com o campo do tratamento de alterações (genéticas) que conduzem a defeitos na cascata de coagulação do sangue, as quais podem conduzir a perturbações hemorrágicas. A manutenção da hemostasia normal requere um equilíbrio delicado dos mecanismos procoagulante e anticoagulante que estão envolvidos na coagulação do sangue. Uma alteração de uma das proteínas pode resultar em tendências hemorrágicas ou casos trombóticos. Um defeito molecular numa das proteínas procoagulantes está normalmente associado com tendências hemorrágicas, as quais podem ser ultrapassadas por terapia de substituição. Isto é melhor ilustrado pela alteração hemorrágica hemofília A, a qual está associada à ausência funcional de Factor VIII, um cofactor essencial na conversão do Factor X em Factor Xa, pelo Factor IX activado (Kane e Davie, 1988. Blood, col. 71, 539-555). O diagnóstico das tendências hemorrágicas é realizado por testes laboratoriais simples que são do conhecimento geral. Ainda, foram desenvolvidos ensaios mais específicos empregando substratos cromogénicos juntamente com Factores de coagulação purificados que são usados para controlar os níveis precisos de várias proteínas procoagulantes. Normalmente, existem técnicas de diagnóstico adequadas para controlar a maioria das deficiências observadas em doentes com tendências hemorrágicas. A via anticoagulante, que resulta no final na inactivação dos cofactores procoagulantes V e VIII, pela APC, foi descrita com detalhe considerável (Esmon, C.T., 1993, Thromb. Vol. 70, 29-35). A proteína S tem sido implicada como cofactor na inactivação dos Factores V e VIII, se bem que o efeito du proteína S na eficiência catalítica da clivagem dos Factores V e VIII seja relativamentc pequeno (Jkoedam et al., 1988, J. Clin. Invest. Vol. 82, 1236-1243; Kalafatis c Mann. 1993. J. Biol. Chem., vol. 268, 27246-27257). A ausência funcional de uma das proteínas envolvidas na via anticoagulante está normalmente associada a trombose. Os defeitos moleculares em várias proteínas envolvidas na via anticoagulante encontrou-se estarem associados a casos trombóticos. A deficiência homozigótica na proteína C está claramente associada a casos trombóticos graves que podem ser corrigidos por terapia de substituição (Dreyfus et al., 1991, N. Eng. J. Med. Vo. 325, 1565-1568). A deficiência heterozi gótica na proteína C foi também estabelecida como um aumento do risco de trombose (Bertina et al., 1982, Thromb. Haemost. Vol. 48, 1-5), se bem que factores adicionais pareçam estar envolvidos pelo menos nalguns casos (Miletich et al., 1987,N. Eng. J. Med. Vol. 317, 991-996). De forma semelhante à proteína C, a deficiência na proteína S está associada a um aumento de risco de trombose (Comp et al., 1980, J. Clin. Invest. Vol. 2082-2088). Defeitos genéticos relativamente raros em antitrombina III, fibrinogénio e plasminogénio, têm sido implicados em trombose. Como um todo, várias deficiências de proteínas envolvidas na via anticoagulante têm sido associadas a um aumento do risco de trombose. No entanto, as deficiências descritas atrás oferecem uma explicação em não mais de 10 a 30% dos doentes que sofrem de doença trombo-embólica, enquanto os restantes casos permanecem por explicar (Heijboer et al., 1990, N. Eng. J. Med. 22, 1512-1516). Avanços recentes diminuíram a percentagem de tromboses inexplicadas para 40 a 60%. Dahlbãck e colaboradores observaram resistência a APC num doente que sofria de casos trombóticos múltiplos (Dahlbãck et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 90, 1004-1008). Um ensaio baseado no prolongamento do tempo de coagulação por APC, medido no -3- tempo de tromboplastma activada parcial (APTT) foi usado para analisar o defeito. Não se observou prolongamento de APTT quando da adição de APC, indicando um defeito na via anticoagulante. Outros grupos confirmaram a ocorrência de resistência a APC em doentes que sofrem de trombose das veias profundas e estudos mais extensos realizados indicaram que 20 a 40% dos doentes que sofrem de episódios trombóticos apresentam resistência a APC (griffin et al., 1993, Blood, vol. 82, 1989-1993; Koster et al., 1993, Lancet col. 342, 1503-1506). O fenótipo da resistência a APC não está limitado a doentes que sofram de trombose venosa. Vários estudos documentaram que a prevalência de resistência a APC é cerca de 2-5% na população normal. A base molecular da resistência a APC permaneceu desconhecida durante algum tempo. Um estudo recente revelou que o fenótipo de resistência a APC poderá ser ultrapassado pela adição do Factor V purificado ao plasma dos indivíduos afectados (Dahlbáck e Hildebrand, 1994. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. Vol. 91. 1396-1400). Se bem que esta observação tenha sugerido ligação da resistência a APC ao Factor V, não foi dada qualquer explicação satisfatória para a ocorrência de resistência a APC ao nível molecular.

Se a causa ou causas da referida resistência puderem ser identificadas, isto levará a uma melhor compreensão das alterações trombolíticas, assim como a melhores métodos de detecção para tais alterações e possivelmente a novas e melhores maneiras de tratamento ou profilaxia das referidas alterações e de outras alterações na cascata de coagulação do sangue. O presente invento identifica uma causa provável para a referida resistência. -4- O presente invento proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um Factor V de coagulação do sangue que é resistente à proteína C activada.

Até agora não foi dirigida qualquer atenção para a ocorrência de mutações em locais de clivagem para APC nos Factores VIII e V que interfiram com a inactivação destas proteínas procoagulantes. Estudos que usaram proteínas purificadas demonstraram que a inactivação do Factor VIII ocorre através da clivagem na ligação peptídica Arg562-Gli563, assim como na ligação peptídica Arg336-Met337, A inactivação do Factor VIII por APC está relacionada com a clivagem na posição Arg562 (Fay et al., 1991, J. Biol. Chem. Vol. 266, 20139-20145). A inactivação do Factor V por APC foi descrita detalhadamente para o Factor V bovino (Kalafatis e Mann, 1933, J. Biol. Chem. Vol. 268, 27246-27257). A inactivação proteolítica do Factor V bovino por APC ocorre nas ligações peptídicas Arg306-Gln307, Arg505-Gli506e Arg662-Gln663 da cadeia pesada. A cadeia leve do Factor V bovino é clivada na ligação peptídica Arg1752-Arg1753 .1754 ou Arg1753-Glnl/;H, se bem que seja pouco claro se a clivagem neste local está associada à perda de actividade (Kalafatis e Mann, 1993, J. Biol. Chem. Vol. 268, 27246-27257). A comparação das sequências do Factor V humano e bovino revela uma homologia considerável entre as duas proteínas (Guinto et al., 1992, J. Biol. Chem. Vol. 267. 2971-2978). Com base nesta homologia os locais de clivagem por APC foram definidos para o Factor V humano (Figura 2; ver Tabela I). De uma forma semelhante ao Factor VIII, uma mutação num local de clivagem por APC do Factor V resulta numa actividade procoagulante prolongada.

Foi descrita uma série de locais de clivagem por APC presentes no Factor V e no Factor VIII e podem ser encontrados na literatura, mas o presente invento também inclui novos locais de clivagem por APC na proteína cofactor Factor V. A análise genética dos locais de clivagem para APC na proteína -5- cofactor envolve a amplificação selectiva das sequêncas de DNA do Factor V possuidoras de um local de clivagem para a proteína C activada e o despiste do fragmento amplificado relativamente à ocorrência de mutações. A mutação num local de clivagem por APC é definida como uma deleção ou substituição de um ou mais pares de bases num dos codões que constituem ou rodeiam os locais de clivagem por APC do Factor V. As sequências do Factor V podem ser amplificadas selectivamente por técnicas de amplificação de RNA. O material de partida para a amplificação de sequências do Factor V portadoras de um local de clivagem para a proteína C compreende RNA, cDNA derivado do RNA por intermédio da actividade de transcriptase reversa ou DNA genómico. O DNA genómico e RNA derivam de tecido ou células do sangue de doentes e são isolados de acordo com métodos que são são do conhecimento geral. A detecção de uma mutação nos locais de clivagem para APC no Factor V pode ser realizada por vários métodos que incluem mas não estão limitados a: 1. Hibridação selectiva: projecta-se uma sequência iniciadora oligonucleotídica que selecciona entre RNA, cDNA ou DNA genómico que contenha uma mutação num local de clivagem para APC e RNA, cDNA ou DNA genómico que não contenha uma mutação num local de clivagem para APC. A referida sequência iniciadora oligonucleotídica poderá conter um ou mais desemparelhamentos relativamente às sequências selvagens dos Factores V e VIII. As sequências selvagens dos Factores V e VIII são definidas tal como se encontram na literatura incluindo polimorfismos. A detecção dos híbridos formados pode ser realizada de acordo com qualquer um dos muitos métodos disponíveis aos familiarizados com a matéria, incluindo mas não estando limitados à utilização de sondas de hibridação marcadas, marcas essas que podem ser directas ou indirectas, sendo marcas directas por exemplo soluções de ouro, radioisótopos, substâncias fluorescentes e similares; marcas indirectas incluem enzimas ou interaeções ligando-antiligando tais como avidina ou estreptavidina i com biotina, ou através da utilização de anticorpos que reconhecem duplas cadeias, etc. 2. PCR de desemparelhamentos: Qualquer sequência iniciadora oligonucleotídica que conjuntamente com uma outra sequência iniciadora oligonucleotídica amplifique selectivamente um fragmento de RNA, cDNA ou DNA genómico que contenha uma mutação e não amplifique um fragmento de RNA, cDNA ou DNA genómico não portador de uma mutação nos referidos locais de clivagem. Estão igualmente incluídas, sequências iniciadoras oligonucleotídicas projectadas por pessoas experimentadas nesta área, que selectivamente amplifiquem um fragmento de RNA, cDNA ou DNA genómico não portador de uma mutação nos referidos locais de clivagem e que não amplifiquem um fragmento de RNA, cDNA ou DNA genómico portador de uma mutação. As referidas sequências iniciadoras oligonucleotídicas podem conter um ou mais desemparelhamentos relativamente às sequências selvagens dos Factores V e VIII. 3. Amplificação por PCR seguida de análise de restrição: Este método inclui a amplificação de um fragmento portador de parte da sequência de DNA do Factor V e VIII contendo os referidos locais de clivagem seguido de digestão com enzimas de restrição que reconhecem sequências de DNA presentes nas sequências de DNA derivadas de doentes portadores de uma mutação nos referidos locais de clivagem ou que estão presentes nas sequências nativas dos Factores V e VIII. Na Tabela II estão definidas sequências iniciadoras oligonucleotídicas que podem ser usadas para controlar mutações nos locais de clivagem para APC na posição de aminoácido Arg506 do Factor V e na posição de aminoácido Arg e Arg do Factor VIII. Podem ser planeadas estratégias semelhantes para a ocorrência de mutações na posição de aminoácidos Arg306, Arg679 e Arg1765 do Factor V e outros locais de clivagem para APC. -Ί Α. Análise de sequências: Este método inclui análise directa da sequência de DNA que rodeia e que constitui os referidos locais de clivagem. Este método envolve qualquer protocolo que esteja normalmente disponível ou seja disponibilizado para os familiarizados com a matéria, para a determinação directa da sequência de DNA ou RNA que codifique os referidos locais de clivagem.

Outros métodos que discriminam entre RNA, cDNA ou DNA genómico contendo uma mutação nos referidos locais de clivagem para APC e RNA, cDNA ou DNA genómico que não possua uma mutação num local de clivagem para APC, podem ser identificados por alguém familiarizado com a matéria. O Exemplo 1 proporciona detalhes sobre a detecção de mutações na posição de aminoácido Arg506 do Factor V e ilustra o uso geral dos métodos para a detecção de mutações nos locais de clivagem para APC. O conhecimento da existência de Factores mutantes pode ser explorado terapeuticamente. Agora que as mutações, ou melhor os locais de mutação, conducentes à resistência a APC, foram identificados, tomou-se possível usar os referidos mutantes como agentes terapêuticos no campo das alterações hemorrágicas. O tratamento das alterações hemorrágicas é geralmente realizado por terapia de substituição com preparações que consistem em Factores de coagulação (parcialmente) purificados. A alteração hemorrágica mais comum é a Hemofilia A que é um resultado da ausência funcional do Factor VIII. O tratamento de doentes que sofrem de Hemofilia A tem evoluido muito durante os últimos anos. Tnicialmente, crioprecipitado contendo Factor VIII foi usado no tratamento de doentes com Hemofilia A. Os concentrados de pureza intermédia obtidos por purificação parcial do Factor VIII a partir de crioprecipitado constituem uma melhoria da terapia. Um outro melhoramento foi proporcionado pela utilização de anticorpos monoclonais dirigidos contra o Factor VIII e contra o Factor de Willebrand para se obter preparações de Factor VIII que consistem quase exclusivamente no Factor VIII (Hoyer, L. W., 1994, N. Eng. J. Med. Vol. 330, 38-47). Recentemente, o Factor VIII recombinante obtido a partir de células animais, em que foi introduzido o cDNA de Factor VIII, está disponível para usar em tratamento. A tecnologia de DNA recombinante proporciona a oportunidade para produzir quantidades ilimitadas de Factor VIII. Ainda, a tecnologia de DNA recombinante permite-nos optimizar as propriedades funcionais do Factor VIII melhorando assim o tratamento de doentes que sofram de Hemofilia A. Podemos agora proporcionar proteínas derivadas do Factor V, as quais são mais resistentes a APC do que o Factor V selvagem.

Apesar do facto de terem sido feitos progressos consideráveis ao longo dos últimos 20 anos no tratamento de doentes com Hemofilia A, um dos principais problemas associados com a terapia de substituição do Factor VIII permanece por resolver. Em cerca de 5 a 20% dos doentes com Hemofilia A tratados com o Factor VIII, desenvolvem-se anticorpos que inibem a actividade do Factor VIII (Ehrenforth et al., 1992, Lancet, vol. 339, 594-598). Os chamados inibidores do Factor VIII surgem 5 a 20 dias após exposição ao Factor VIII e podem originar complicações clínicas graves (Aledort, L. 1994. Am. J. Of Haemat. Vol. 47, 208-217). O estudo da incidência de inibidores do Factor VIII em doentes tratados com diferentes preparações farmacêuticas de Factor VIII, não revela diferenças significativas. Estas observações sugerem que o desenvolvimento de inibidores do Factor VIII não está geralmente relacionado com as preparações de Factor VIII administradas. Foram estabelecidos vários protocolos para o tratamento de inibidores em doentes com Hemofilia A. Níveis baixos ou moderados de inibidores são geralmente tratados por administração de doses elevadas de Factor Vlll (Hoyer, L.W. 1994. N. Eng. J. Med. Vol. 330. 38-47). Ainda, alguns doentes com Hemofilia A que desenvolveram um inibidor foram tratados com êxito com Factor VIII isolado a partir de plasma de suíno (Hay ct al., 1990. Blood. Vol. 76, 882-886). Este último tratamento está associado a um risco desenvolvimento de inibidores contra Factor VIII de suíno e, dc facto, isto foi descrito para vários doentes com Hemofilia A que foram tratados com preparações contendo Factor VIII de suíno. A adsorção extracorporal dc anticorpos inibidores do Factor VIII a proteína A-Sepharose foi empregue cm doentes com Hemofilia A com níveis elevados de inibidores de Factor VIII (Nilsson ct al., 1988, N. Eng. J. Med. Vol. 318, 947-950). Este tratamento requere equipamento especializado e foi descrito como tendo êxito em 9 de 11 doentes com um nível elevado de inibidores do Factor VIII. Os diferentes tratamentos descritos tiveram sucesso variável e é claro que outros métodos de tratamento podem ser úteis para o tratamento de doentes com Hemofilia A com inibidores.

Uma opção geral estabelecida para o tratamento de doentes com Hemofilia A com um inibidor é proporcionada através da administração dos chamados "agentes de desvio do Factor VIU". Inicialmente os concentrados de complexos de protrombina (PCC) e os concentrados dos complexos de protrombina activada (APCC) foram usados nos doentes com Hemofilia A com um inibidor (Lusher et al., 1980, N. Eng. J. Med. vol. 303, 421-425; Sjamsoedin et al., 1981, N. Eng. J. Med. vol. 305, 717-721). O tratamento com PCC foi considerado apenas parcialmente eficaz e foi associado a enfarte do miocárdio e coagulação intravascular disseminada nalguns doentes tratados. APCC é considerado mais eficaz comparado com PCC, se bem que a administração dos Factores de coagulação activados presentes em PCC possa dar origem a tromhogenicidade, conforme evidenciado pelo aumento dos níveis de fibrinopeptídeo A observados em doentes tratados com APCC. O Factor VII -10- activado tem sido usado para o tratamento de doentes com Hemofilia A com inibidores (Hedner, U e W. Kisiel, 1983. J. Clin. Invest. 71, 1836-1841; Hedner et al., 1988, Lancet, 309, 1193). Ainda, têm sido usados Factor de Tecido e uma mistura de Factor Xa e fosfolípidos foram usados com êxito em modelos caninos da deficiência em Factor VIII (0'Brien et al., 1988, J. Clin. Invest. Vol. 82, 206-211; Giles et al., 1988. Brit. J. Haematol. vol. 69, 491-497). Actualmente não é clara a eficácia do Factor Vila, Factor de Tecido e uma combinação do Factor Xa e fosfolípidos como "agente de desvio do Factor VIII". Ainda, tanto PCC como APCC não proporcionam um tratamento adequado em cerca de 30 a 50% dos casos. Claramente, existe a necessidade de preparações farmacêuticas adicionais que possam ser usadas como agente de desvio do Factor VIII. O presente invento proporciona agentes de desvio do Factor VIII, os quais são baseados nas proteínas que tenham sido implicadas como factor de risco em trombose de acordo com o presente invento. Estas proteínas incluem mas não estão limitadas a proteínas do Factor V modificadas num local de clivagem para APC de forma a induzir resistência a APC nas referidas proteínas, ou fragmentos ou derivados de tais proteínas tendo actividade biológica comparável (no tipo, não especialmente na quantidade).

Ensaios, como os descritos anteriormente neste pedido de patente, podem ser usados para identificar material que contenha moléculas de cofactores do Factor V, as quais foram modificadas nos locais de clivagem para APC. Após identificação de tal plasma derivado de doentes tendo estas proteínas mutagenizadas, podem ser produzidas preparações que contenham quantidades fixas das proteínas cofactores hipercoagulantes. Como alternativa, as proteínas modificadas nos seus locais de clivagem por APC podem ser obtidas através de tecnologia de DNA recombinante envolvendo a expressão das proteínas modificadas em células eucarióticas ou procarióticas e/ou animais transgénicos.

Também está incluída a utilização terapêutica de uma proteína Factor V modificada no local de clivagem de Arg506, ou quaisquer outros locais de clivagem por APC, por métodos que envolvam protocolos de terapia génica, que incluem mas não estão limitados à utilização de um vector retroviral. A purificação das referidas proteínas pode ocorrer por tecnologia de anticorpos monoclonais, métodos de ffaccionamento de plasma ou qualquer outro método disponível para as pessoas familiarizadas com a matéria. Ainda, as referidas proteínas farmaceuticamente úteis consistindo em proteínas de Factor V modificadas no local de clivagem por APC podem ser modificadas a partir de uma mistura de proteínas contendo também Factor V não modificado. A purificação pode envolver anticorpos monoclonais que reconhecem especificamente o Factor V que foi modificado num ou mais dos locais de clivagem para APC ou purificação por outros métodos que são conhecidos dos familiarizados com a matéria.

Proteínas de Factor V modificadas na posição de aminoácido Arg306 e/ou Arg506 e/ou Arg679. O resíduo arginina que precede o local de clivagem por APC pode ser alterado para uma Gin, Ile ou qualquer outro aminoácido. A utilização terapêutica do Factor V contendo a substituição de aminoácido Arg506-Gln ou outras modificações de locais de clivagem para APC serão úteis no tratamento de doentes com Hemofilia A com inibidores. Baseado na capacidade do Factor V contendo a substituição de aminoácido Arg506-Gln para promover a formação de trombos conforme observado em doentes com trombose venosa, esta proteína será útil como "agente desvio do Factor VIU". Face à eficácia limitada e custos elevados do tratamento corrente dos doentes com Hemofilia A com inibidores, preparações farmacêuticas que contêm o referido Factor V provarão ser mais eficazes. A preparação terapêutica pode consistir em Factor V purificado contendo a substituição de aminoácido Arg506-Gln. Como alternativa, o referido Factor V modificado pode ser um componente -12- de uma preparação terapêutica. A referida preparação pode ser qualquer uma preparação terapêutica derivada de plasma, como seja concentrado de complexos de protrombina (PCC) ou concentrados de complexos de protrombina activada (APCC).

Resumindo, o invento proporciona agentes terapêuticos para o tratamento de alterações hemorrágicas, em que o Factor V mutagenizado possuindo resistência a APC pode ser usado pela sua actividade de hiper-procoagulação. Será óbvio que o invento se estende a derivados e/ou fragmentos de tais agentes terapêuticos, independentemente da forma como tenham sido obtidos. Os familiarizados com a matéria sabem como determinar a dose de agente terapêutico dependente de factores numéricos tais como grau da alteração, peso do doente a ser tratado, actividade específica do agente terapêutico escolhido, etc. Caso não seja directamente claro para os familiarizados com a matéria, a dose pode ser determinada por métodos bem conhecidos, em particular através dos chamados estudos de determinação de doses, os quais envolvem a administração a animais, tais como roedores, e mais tarde a voluntários (saudáveis) doses crescentes do agente terapêutico escolhido. Em geral a dose a ser administrada a um indivíduo residirá entre 1 e 500, mais preferencialmente 5-50 unidades por Kg de peso de corpo por dia.

As formulações farmacêuticas em que os agentes de acordo com o invento podem ser administrados são bem conhecidas na área. Os agentes são materiais do tipo proteína, assim as formulações que se conhece serem adequadas para proteínas serão adequadas para os agentes do invento. Podem ser administrados sozinhos ou juntamente com outros agentes terapêuticos. Podem mesmo ser administrados juntamente com o Factor V normal de forma a equilibrar delicadamente a quantidade de actividade antieoagulante administrada. O invento será ilustrado mais detalhadamente nos exemplos que se seguem. - 13 - EXEMPLO 1

Identificação de mutações no local de clivagem para a proteína C activada na posição de aminoácido Arg506 do Factor V em doentes que sofram de tromboembolismo.

Vinte e sete doentes com episódios idiopáticos (recorrentes) de tromboembolismo, confirmados por venografia de contraste e/ou angiografia pulmonar, foram estudados relativamente à ocorrência de mutações na posição de aminoácido Arg506 do Factor V. Nenhum dos doentes analisados tinha uma deficiência adquirida ou herdada de antitrombina III, proteína C, proteína S ou de plasminogénio. O despiste de rotina da coagulação do sangue e fibrinólise não revelou anormalidades. Os linfócitos do sangue periférico foram isolados a partir de sangue por gradiente de densidade de Ficoll-Paque. O RNA foi isolado a partir de linfócitos de sangue periférico usando o método de RNAzol B (WAK Chemie, Bad Homburg v.d.H., Germany) e preparou-se cDNA essencialmente como descrito anteriormente (Cuypers, et al., 1992, J. Clin. Microbiol. Vol. 30, 3220-3224). Os doentes foram analisados relativamente à presença de mutações na posição de aminoácido Arg506 do Factor V, usando as seguintes sequências iniciadoras oligonucleotídicas: 5TGTAAGAGCAGATCCCTGGACTÇG3' (sequência iniciadora 506-1; cadeia codificadora; nucleótidos 1576-1600 do Factor V humano, o nucleótido 1 corresponde ao primeiro nucleótido do codão de iniciação do Factor V); 5' CATCACGTTTCACCTCATCAGG3' (sequência iniciadora 506-2; complementar da cadeia codificadora; nucleótidos 1708-1730 do Factor V humano). A sequência iniciadora oligonucleotídica 506-1 contem dois desemparelhamentos relativamente à sequência nativa do Facto V, os quais estão sublinhados. Os dois desemparelhamentos em conjunto com o codão CGA adjacente, codificador da Arg506 introduzem um sítio de restrição para a enzima -14- de restrição NruI quando da amplificação com as sequências iniciadoras oligonucleotídicas 506-1 e 506-2 (ver Tabela II). A amplificação por PCR empregando a sequência iniciadora oligonucleotídica 506-1 e 506-2, de cDNA isolado a partir de vários doentes sofrendo de tromboembolismo venoso deu um fragmento de 154 pares de bases (pb), que codifica a parte do Factor V contendo o local de clivagem para APC na posição de aminoácido Arg506. A ocorrência de mutações na posição de aminoácido Arg506 foi controlada por digestão dos fragmentos amplificados com a enzima de restrição NruI.

Na Figura 3, pista 2, está apresentado um fragmento amplificado que pode ser digerido por Nml, dando um fragmento de 130 pb. Uma vez que NruI é capaz de digerir o fragmento amplificado por PCR, nenhuma mutação no aminoácido Arg506 está presente neste indivíduo (indivíduo A). Na Figura 3, pista 4, está apresentado um fragmento amplificado que é parcialmente digerido por NruI, indicando a presença de uma mutação na posição de aminoácido Arg506 num dos alelos do Factor V deste indivíduo (indivíduo B). Para confirmar a presença de uma mutação na posição de aminoácido Arg506 no indivíduo B, empregou-se a estratégia que se segue. Projectaram-se sequências iniciadoras oligonucleotídicas de forma a amplificar um fragmento maior de cDNA do Factor V; 5' ATCAGAGCAGTTCAACCAGGG3' (sequência iniciadora 506-5; cadeia codificadora, nucleótidos 1414-1435 do Factor V humano) e 5' CATCACGTTTCACCTCATCAGG3' (sequência iniciadora 506-2 complementar da cadeia codificadora; nucleótidos 1708-1730 do Factor V humano). A amplificação por PCR com as sequências iniciadoras 506-2 e 506-5 deu um fragmento de 316 pares de bases (pb), que codifica a parte do Factor V contendo o local de clivagem para APC na posição de aminoácido Arg506. A ocorrência de mutações na posição de aminoácido Arg506 foi controlada por sequenciação directa do fragmento amplificado (Figura 4). Claramente, no indivíduo B está presente uma mutação dentro do codão Arg506; uma vez que no segundo par de bases deste codão foram observados tanto um "G" como um "A”, resultando numa substituição de Arg506 (GCA) por uma Gin (CAA) num dos alelos do gene para o Factor V no indivíduo B. A sequenciação directa foi também empregue para um indivíduo A, o qual não revelou um padrão de restrição anormal quando da digestão do fragmento de 154 pb resultante da amplificação com as sequências iniciadoras oligonucleotídicas 506-1 e 506-2 (ver Figura 3; pista 2). A sequenciação directa do indivíduo A não revelou mutações na posição de aminoácido Arg506 do Factor V (Figura 4; painel esquerdo). Estes resultados mostram claramente que os diferentes ensaios aqui empregues são capazes de detectar mutações na posição de aminoácido Arg506 do Factor V humano.

Em seguida, analisámos os 27 doentes com tromboembolismo idiopático (recorrente) relativamente à ocorrência de mutações pontuais dentro das regiões sensíveis à proteína C activada (APC) do Factor V de coagulação do sangue. Empregando amplificação com as sequências iniciadoras oligonucleotídicas 506-1 e 506-2, seguido de digestão com NruI, assim como sequenciação directa dos fragmentos amplificados, 10 destes doentes revelaram um única transição de G para A e surgiram como heterozigóticos para a mutação Arg506 para Gin506. Os métodos descritos são capazes de definir o defeito molecular em aproximadamente 35% dos doentes que sofrem de doença tromboembólica.

Conforme descrito no parágrafo 10 anterior encontraram-se 10 indivíduos que são heterozigóticos para a mutação Arg506 para Gin. A análise por sequenciação revelou que em todos os casos examinados estava presente uma única substituição de nucleótidos de "G" para ”A".

Desenvolveu-se um ensaio para controlar a presença desta substituição de um único par de bases, baseado nas sequências oligonucleotídicas descritas na Tabela III. O DNA genómico de todos os doentes estudados foi -16- isolado empregando processos convencionais. A amplificação por PCR com as sequências iniciadoras oligonucleotídicas 506-5 e 506-6 dá um fragmento de 206 pb nos doentes estudados. A amplificação por PCR com as sequências iniciadoras oligonucleotídicas 506-5 e 506-7 dá um fragmento de 206 pb em todos os doentes estudados. Finalmente a amplificação por PCR com as sequências iniciadoras oligonucleotídicas 506-5 e 506-8, específicas para a substituição Arg506para Gin, apenas dá um fragmento de 206 pb nos 10 doentes que são heterozigóticos para a substituição Arg' ’ para Gin. Não se observou produto após amplificação por PCR com estas sequências iniciadoras oligonucleotídicas nos doentes que não são portadores da mutação Arg506 para Gin.

Concluindo, foram descritos vários métodos capazes de diagnosticar mutações na posição de aminoácido Arg506 do Factor V. A aplicabilidade destes métodos a doentes que sofrem de doença tromboembólica claramente indica a utilidade destes ensaios no diagnóstico de doença tromboembólica. EXEMPLO 2: Geração de trombina no plasma contendo Factor V com ou sem mutação num local de clivagem para a proteína C activada. A utilidade dos métodos descritos no Exemplo 1 não está limitada ao diagnóstico de doentes que sofram de doença tromboembólica, mas também inclui a avaliação do potencial procoagulante do plasma de dadores de sangue saudáveis. Para avaliar o equilíbrio entre as vias procoagulante e anticoagulante, desenvolveu-se um método de teste simples. Este baseou-se na geração da trombina procoagulante na presença de um excesso de proteína C activada anticoagulante. Este ensaio foi realizado como se segue. Primeiro, 50 μΐ de plasma citratado pobre em plaquetas foram adicionados a um tubo de ensaio de plástico contendo 350 μΐ de um tampão de diluição de tris 50 mM (pH 7,3) e 0,1% (p/v) de albumina sérica bovina (Sigma Chemical Co., St. Louis, U.S.A.). -17-

Em seguida adicionou-se 400 μΐ de reagente APTT (Clu-omogenix AB, Mõlndal, Suécia) como fonte de fosfolípidos e sílica coloidal para activar o sistema de coagulação. Após incubação deste mistura durante 5 min a 37°C, adicionou-se 400 μΐ de uma mistura pré-aquecida do tampão de diluição Tris/albumina contendo CaCl2 25 mM e 1 pg/ml de proteína C humana activada purificada (Kisiel, 1979, J. Clin. Invest. Vol. 64, 761-769). Com intervalos regulares, retiraram-se 45 μΐ. Estes foram imediatamente misturados com 5 μΐ de EDTA 0,25 M para parar a formação de trombina. Subsequentemente, as amostras foram diluídas 5 a 20 vezes em tampão Tris/albumina, e misturadas com uma solução aquosa (concentração final de 1,0 mM) do substrato cromogénico S2238 (Chromogenix AB, Mõlndal, Suécia). Controlou-se espectrofotometricamente a absorvância a 405 nm. O ensaio foi calibrado com trombina humana purificada (Mertens et al., 1985, Throm. Haemostasis vol. 54, 654-660) de fonna a converter aumentos de taxas de absorvância em concentrações molares de trombina. A figura 5 mostra a geração de trombina neste ensaio usando amostras de plasma de três dadores de sangue distintos, para os quais o genótipo do Factor V foi estabelecido como Arg506 /Arg506, Arg506 /Gin506 e Gin506 /Gin506 usando a técnica de PCR descrita no Exemplo 1. Como é evidente a partir da figura 5, a formação de trombina neste sistema de ensaio foi completamente dependente da presença da mutação Arg para Gin na posição de aminoácido 506 do Factor V. Ainda, o grau de formação de trombina claramente distinguiu entre plasma de dadores que são homozigóticos e heterozigóticos para esta mutação. Estes dados demonstram que o Factor V portador de uma mutação no local de clivagem para a proteína C activada é um procoagulante invulgarmente forte que contribui grandemente para o potencial procoagulante global do plasma humano. EXEMPLO 3: Preparação de uma fracção contendo o Factor V a partir de plasma de sangue humano.

Nos esquemas convencionais de fraccionamento de plasma não -18- foram implementados passos específicos para preparar fracções deliberadamente enriquecidas em Factor V. Os métodos para a purificação do Factor V a partir de plasma foram bem estabelecidos, tanto por precipitação convencional como por tccnicas cromatográficas (Suzuki et al., 1982, J. Biol. Chem. 257, 6556-6564) e por cromatografia de imuno-afmidade (Katzmann et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. vol. 78, 162-166). No entanto na escala industrial a utilidade destes métodos é limitada devido a produzirem Factor V à custa de produtos extremamente neessários tais como Factor VIII e imunoglobulinas.

Uma vez que o isolamento do Factor V preferencialmente deverá ser compatível com esquemas regulares de fraccionamento de plasma, várias fracções regulares de plasma foram avaliadas como fontes potenciais do Factor V. As fracções foram analisadas relativamente à actividade de Factor V usando o ensaio clássico de coagulação numa fase (Biggs, 1976, Human blood coagulation, haemostasis and thrombosis, 2a edição, Blackwell, Oxford, pp. 310-364), usando plasma comercial deficiente em Factor V (Baxter, Dudingen, Suissa) e trombo-plastina humana de tecido (Thromborel R-S, Behring, Marburg, Alemanha). O processo de fraccionamento avaliado compreendeu crioprecipitação e passos de permuta aniónica antes de um fraccionamento vulgar com etanol da albumina e imunoglobulina (Brummelhius, em: Methods of plasma protein fractionation (J.M. Curling, Ed.), 1980, Academic Press, London, pp. 117-128). A análise de seis corridas diferentes de fraccionamento demonstrou que no primeiro passo, cerca de 80% da actividade inicial de Factor V foi recuperada no plasma do crio-sobrenadante. No segundo passo, uma quantidade substancial (pelo menos 50%) da actividade de Factor V demonstrou ser adsorvida pela resina de permuta aniónica DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia, Uppsala, Suécia) usada para a preparação do Concentrado de Complexos de Protrombina (PCC). Após lavagem e eluição como descrito (Brummelhius, vide supra), o PCC resultante contem concentrações variáveis (entre 5 e 20%) da actividade inicial de Factor V. -19-

Expcricncias em pequena escala, empregando quantidades de 10 ml de plasma do crio-sobrenadante, demonstrou que os rendimentos de Factor V podem ser aumentados através de (1) aumento da quantidade de DEAE-Sephadex para pelo menos 1,5 g por Kg de plasma do crio-sobrenadante, (2) diminuição da força iónica durante a fase de adsorção através da diluição do plasma do crio-sobrenadante, (3) diminuição da força iónica das condições de lavagem antes da eluição ou (4) através de uma combinação destas alterações.

Ao usar-se um processo melhorado para a preparação de PCC, pareceu possível obter até 30% do Factor V inicial nesta fracção de plasma. A avaliação da pureza desta fracção testando a actividade de Factor V e o teor proteico (Bradford, 1976, Anal. Biochem. Vol. 72, 248-254) revelou uma actividade específica de 0,4 unidades/mg, o que corresponde a uma purificação de 25 vezes. Assim, um processo melhorado da preparação de PCC proporciona acesso a uma fracção de plasma enriquecida em Factor V sem interferir com a preparação dos produtos Factor VII, albumina ou imunoglobulina. Este Factor V parcialmente purificado pode então servir como material de partida para posterior purificação através dos métodos convencionais atrás referidos ou por métodos de imuno-afmidade até ao grau de pureza pretendido. EXEMPLO 4: Produção de trombina em fracções contendo Factor V preparadas a partir de plasma seleccionado para Arg ou Gin na posição 506 do Factor V.

Para a preparação de Factor V parcialmente purificado, colheu-se sangue com anticoagulantes convencionais contendo citrato. As células foram colhidas por centrifugação (15 min a 5 000 g) e o plasma do sobrenadante foi congelado e guardado abaixo de -30°C até ser usado. Amostras individuais de plasma foram despistadas pelo método descrito no Exemplo 2 e divididas em três categorias, de acordo com o fenótipo dos perfis de geração de trombina (cf. Figura 5). Em todos os casos, linfócitos do sangue periférico dos mesmos dadores foram isolados para confirmar o genótipo por análise por PCR como descrito no Exemplo 1. O plasma foi então descongelado a 4°C e o crioprecipitado foi colhido por centrifugação (5 min a 2 OOOg). Os plasmas do crio-sobrenadante do mesmo fenótipo foram reunidos e adicionou-se DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia, Uppsal, Suécia) numa quantidade de 1,5 g de peso seco por Kg de plasma. A mistura foi agitada durante 30 min à temperatura ambiente e transferida para uma coluna para colher a resina de permuta aniónica. A coluna foi lavada usando um tampão de citrato tri-sódico 10 mM (pH 7,0) contendo NaCl 154mM e a ffaeção de PCC enriquecida em Factor V foi eluida com o mesmo tampão contendo NaCl 0,7M. Este processo deu três fraeções PCC distintas, contendo os tipos de Factor V Arg506 , Gin506 ou, derivado de dadores heterozigóticos, uma mistura dos dois.

Para avaliar o potencial de geração de trombina das três fraeções de PCC, PCC foi diluído para uma actividade de Factor V entre 0,2 e 0,3 unidades/ml num tampão contendo Tris 50 mM (pH 7,3) e 0,1% (p/v) de albumina sérica bovina. Em seguida foi avaliada a geração de trombina pelo mesmo método descrito detalhadamente no Exemplo 2, usando 400 μΐ de reagente APTT e 400 μΐ de tampão Tris/albumina contendo CaCl2 25 mM, 1 pg/ml de proteína C humana activada purificada e reagente de tromboplastina diluído a 1/2000 (Tromborel®, Behring, Marburg, Alemanha) para activar ainda o sistema de coagulação. Em intervalos regulares, retiraram-se amostras para a quantificação de trombina, empregando o método descrito no Exemplo 2, e construiram-se perfis de geração de trombina (ver figura 6). Conforme evidenciado pela figura 6, a formação de trombina esteve grandemente dependente da presença da mutação Arg para Gin na posição de aminoácido 506 do Factor V. Ainda, o grau de formação de trombina claramente distinguiu entre PCC de dadores que são homozigóticos e heterozigóticos para a mutação. -21 -

Estes dados demonstram que o forte efeito procoagulante do Factor V portador de uma mutação num local de clivagem para a proteína C activada não está restringido ao plasma total, mas está igualmente presente nas fracções de plasma enriquecidas em Factor V tais como PCC. O despiste da fonte de plasma para as referidas mutações como primeiro passo na preparação de fracções de plasma contendo Factor V conduz assim a preparações farmacêuticas que diferem muito relativamente à geração de trombina na presença de proteína C activada. Como é evidente a partir da figura 6, este resultado é vantajoso para a redução do potencial procoagulante de PCC, o qual diminui o potencial trombogénico normalmente conhecido de PCC, ou para o aumento do seu potencial procoagulante, como é desjável para melhorar a eficácia de PCC no tratamento de doentes com anticorpos inibidores contra o Factor VIII ou outros Factores de coagulação.

EXEMPLO 5: Factor V com uma mutação num local de clivagem para proteína C activada apresenta actividade de desvio do inibidor do Factor VIII

Colheu-se plasma de um doente com hemofilia A grave e um inibidor contra o Factor VIII. O seu título anti-Factor VIII foi determinado empregando o chamado "ensaio Bethesda" (Kasper et al., 1975, Thromb. Diath. Haemorrh. Vol. 34, 869-872) e encontrou-se ser 40 unidades Bethesda. Como tal, este título elevado é proibitivo para a terapia de substituição normal com Factor VIII. 100 μΐ do plasma do doente foram fornecidos com Factor V parcialmente purificado para uma concentração final de 0,5 unidades/ml. Este Factor V foi purificado a partir de plasma que foi seleccionado relativamente à presença da mutação Arg para Gin na posição de aminoácido 506, como descrito detalhadamente no Exemplo 4. A mistura foi então diluída para 400 μΐ usando um tampão contendo Tris 50 mM (pH 7,3) e 0,1% (p/v) de albumina sérica -22- buvina. Em seguida a geração de Uombina foi avaliada pelo mesmo método descrito detalhadamente no Exemplo 2, usando 400 μΐ do reagente APTT e 400 μΐ de tampão Tris/albumina contendo reagente de tromboplastina 25 mM e diluído a 1/8000 (ver Exemplo 4). Em intervalos regulares, as amostras foram retiradas para a quantificação de trombina empregando o método descrito no Exemplo 2 e os perfis de geração de trombina foram construídos (ver figura 7). Conforme evidenciado pela figura 7, apenas se detectou uma formação mínima de trombina na ausência da adição de Factor V ou após a adição do Factor V com Arg na posição de aminoácido 506. No entanto, na presença de Factor V com a mutação Arg para Gin na posição de aminoácido 506 a formação de trombina pareceu ser semelhante à de plasma normal de não hemofílico. Isto demonstra que uma preparação farmacêutica compreendendo o Factor V variante Arg506 -»Gln apresenta actividade de desvio do Factor VIII e como tal tem utilidade na correcção de um defeito de coagulação. EXEMPLO 6: Construção de uma molécula de Factor VIII com uma mutação num local de clivagem para a proteína C activada.

Conforme demonstrado nos Exemplos 2 e 4, moléculas de cofactor com uma mutação num local de clivagem para a proteína C activada podem ocorrer no plasma de dadores de sangue normais saudáveis e o cofactor variante pode ser selectivamente obtido através do despiste de plasmas de dadores antes da purificação. A avaliação de tais variantes pode ser restringida de acordo com a sua prevalência na população de dadores normais. Esta limitação pode ser ultrapassada produzindo tais variantes por tecnologa de DNA recombinante. Um exemplo desta estratégia é proporcionado pela descrição que se segue, que relata a construção e expressão de um cDNA do Factor VIII contendo uma substituição no local de clivagem Arg506 para a proteína C activada. Esta descrição é exemplificativa, para alguém familiarizado com a matéria, da criação de -23- substituições semelhantes noutros loeais de clivagem na moléeula eofactor do Factor VIII (ver figura 1) ou do Factor V (ver figura 2).

Anteriormente descrevemos o plasmídeo pCLB-BPVdB695 que codifica cDNA de uma forma de Factor VIII sem o domínio B (Mertens et al., Br. J. Haematol. Vol, 85, 133-142). Empregámos a reacção em cadeia com polimcrase para preparar um cDNA de Factor VIII em que Arg562 foi substituído por Ile. Amplificou-se um fragmento de 1206 pb usando o plasmídeo pCLB-BPVdBodS como molde empregando as seguintes sequências iniciadoras oligonucleotídicas: F8-F547S 5'CTGGTAAAAGACTTGAAT3' (nucleótidos 547-565 do cDNA do Factor VIII); cadeia codificadora e F8-1732AS 5'CTGGTTTCCATTTTGATCTAC3' (nucleótidos 1732-1753 do cDNA do Factor VIII; estão sublinhados os desemparelhamentos na sequência complementar da codificadora). Ainda, amplificou-se um fragmento de 306 pb usando o plasmídeo pCLB-BPVdB695 como molde com as seguintes sequências iniciadoras oligonucleotídicas: F8-1732S 5'GTAGATCAAAATGGAAACCAG3' (nucleótidos 1732-1753 do Factor VIII; estão sublinhados os desemparelhamentos na sequência complementar da codificadora) e F8-2020AS 5'GTGTTTGAAGGTATATCC3' (nucleótidos 2020-2038 do Factor VIII); complementar da sequência codificadora. As condições de reacção foram: 2' 90°C, 20' 50°C, 3' 72°C; 37 vezes 45" 90°C, 90" 50°C, 3' 72°C; 5’ 65°C na presença de dNTPs 1 mM, tampão de reacção polimerase Pfu 10 vezes, 50 pMol da sequência iniciadora Hl e H2 e 2,5 U da polimerase Pfu (Stratagene, Cambridge, UK). O fragmento de 306 pb e o fragmento de 1206 pb foram purificados por electroforese em gel de agarose de baixo ponto de fusão, seguido de extracção com fenol. Os fragmentos purificados serviram de molde à amplificação de um fragmento de 1491 pb empregando as sequências iniciadoras oligonucleotídicas F8-547S e F8-2020AS usando as condições de reacção descritas atrás. O fragmento de 1491 pb resultante foi digerido com Apall -24- (posição 853) e Kpnl (posição 1811) e o fragmento Apal-Kpnl resultante foi usado para substituir o fragmento Apall-Kpnl correspondente do pCLB-BPVdB695. O plasmídeo resultante foi designado pCLB-BPVdB695RI562 e a sequência do fragmento Apall-Kpnl que continha a mutação Arg562-»Ile foi verificada por sequenciação com oligonucleótidos.

As células C127 foram mantidas em meio Iscove suplementado com 10% de soro fetal de vitela, 100 U/ml de penicilina e 100 pg/ml de estreptomicina. As monocamadas subconfluentes de células Cl27 foram transfectadas empregando fosfato de cálcio essencialmente como descrito (Graham e Van der Eb, 1973, Virology vol. 52, 456-467). O plasmídeo pCLB-BPVdB695RI562 (20 pg) foi cotransfectado com pGkhyg (1 pg; Tem Riele et al., 1990, Nature vol. 348, 649-651). Após transfecção e selecção das células transfectadas com 200 pg/ml de higromicina, os clones individuais foram isolados e propagados em meio selectivo. A secreção do Factor VIII foi controlada medindo a capacidade do Factor VIII para funcionar como cofactor da conversão do Factor Xa dependente do Factor Ixa, empregando um substrato cromogénico para o Factor Xa (Coatest Factor VIII, Chromogenix, Mõlndal, Suécia). O antigénio do Factor VIII foi determinado usando anticorpos monoclonais que tinham sido anteriormente caracterizados (Lenting et al., 1994, J. Biol. Chem. Vol 269, 7150-7155). O anticorpo monoclonal CLB-Cagl2, dirigido contra a cadeia leve do Factor VIII foi usado como fase sólida, enquanto o anticorpo monoclonal marcado com peroxidase CLB-Cagll7, também dirigido contra a cadeia leve do Factor VIII foi usado para quantificar a quantidade de Factor VIII ligado. Plasma normal derivado de um lote de 40 dadores saudáveis foi usado como padrão. Os clones derivados de células transfectadas com pCLB-BPVdB695RI562 que produziram quantidades significativas de Factor VIII foram guardados em azoto líquido até serem usados. Um clone derivado de células transfectadas com pCLB-BPVdB695RI562 foi cultivado até à confluência -25- e subsequenlemeiile determinou-se a aclividade de cofactor e de aiiligénio conforme descrito atrás. A proteína do Factor VIII modificada na posição de aminoácido Arg562 apresentou uma actividade de cofactor de 56 mU/ml. O nível de antigénio resultante foi subsequentemente determinado como sendo de 72 mU/ml.

Os nossos resultados mostram que as moléculas de cofactor modificadas nos seus locais de clivagem para proteína C activada podem ser expressas em células eucarióticas. Estas moléculas de cofactor variantes são mais convenientemente purificadas por métodos de cromatografia de imunoafinidade, conforme foi anteriormente estabelecido (Mertens et al., 1993. Br. J. Haematol. Vol. 85, 133-142). Após purificação, as proteínas cofactor modificadas podem ser formuladas numa preparação terapêutica para ultrapassar alterações hemostáticas. EXEMPLO 7: Construção de uma molécula de Factor V com uma mutação num local de clivagem para a proteína C activada.

Como se mostra no Exemplo 1, a molécula cofactor com uma mutação num local de clivagem para a proteína C activada pode ocorrer em plasma de doentes que sofram de doença tromboembólica assim como em dadores de sangue saudáveis normais. No Exemplo 4, está descrito que tal cofactor modificado, obtido a partir de plasma, apresenta um aumento de geração de trombina quando comparado com a molécula modificada. Ainda, no Exemplo 5 mostra-se que uma molécula de Factor V portadora da substituição Arg506—>Gln é capaz de funcionar como "agente de desvio do Factor VIU". O acesso a tais variantes pode ser restringido de acordo com a sua prevalência na população dadora normal. Esta limitação pode ser ultrapassada através da produção de tais variantes por tecnologia de DNA recombinante. Um exemplo desta estratégia é proporcionado pela descrição que se segue, a qual relata a construção de um eDNA do Factor V contendo uma substituição no local de clivagem Arg506 para a proteína C activa-da. Esta descrição é exemplificativa para alguém familiarizado com a área da criação de substituições semelhantes noutros locais de clivagem na molécula co-factor Factor V. 0 cDNA do Factor V foi isolado essencialmente como descrito (Jenny ct al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 84, 4846-4850). O extremo 5' do cDNA do Factor V foi modificado pela utilização de uma adaptador sintético de cadeia dupla (5AATGTCGACAAAGCCACCATG3', codificadora; 5'GTGGCTTTGTCGACATT3', complementar da sequência codificadora) que é inserido no local NspI que se sobrepõe ao codão de iniciação do Factor V. O extremo 3’ do cDNA do Factor V foi modificado como se segue: a sequência iniciadora oligonucleotídica FV-7 (5,AATGCGGCCGCGGGGTTTTTGAATGTTCA3' nucleótidos 5579-6697; complementar da cadeia codificadora) foi usado conjuntamente com a sequência iniciadora oligonucleotídica FV-8 (5'GTGGCTAGATATATTAGGATC3’ nucleótidos 6109-6130; codificadora) para amplificar um fragmento de 588 pb. As condições de reacção são: 2' 90°C, 20' 55°C, 3' 72°C; 37 vezes 45" 90°C, 90" 55°C, 3' 72°C; 5' 65°C na presença de dNTPs 1 mM, tampão de reacção polimerase Pfu 10 vezes, 50 pMol da sequência iniciadora FV-7 e FV-8 e 2,5 U de polimerase Pfu (Stratagene, Cambridge, UK). O fragmento resultante foi digerido com Xhol e Notl (nucleótidos 6137-6697) do Factor V) e o fragmento resultante foi usado numa ligação juntamente com um fragmento Sphl-Xhol (nucleótidos 5134-6137 do Factor V), um fragmento Sall-Sphl (nucleótidos 1-5134) contendo o extremo 5' modificado do cDNA do Factor V e o vector pBPV que foi digerido com Xhol e Notl (Pharmacia-LKB, Upsala, Suécia). A construção resultante foi designada pCLB-PBVFV.

Para construir um cDNA de Factor V que continha uma mutação no local de clivagem APC na Arg506 do Factor V, usou-se uma sequência iniciadora oligonucleotídica 506-11 (5'CTGTATTCCTTGCCTGTCCAG3' nucleótidos 1591- -27- 1612; complementar da cadeia codificadora) juntamente com a sequência iniciadora oligonucleotídica FV-2 (5TTGCAAGCTGGGATGCAGGCT3'; nucleótidos 946-967; cadeia codificadora) para amplificar um fragmento de 666 pb. As condições de reacção são: 2' 90°C, 20' 55°C, 3' 72°C; 37 vezes 45" 90°C, 90" 55°C, 3' 72°C; 5' 65°C na presença de dNTPs lmM, tampão de reacção polimerase Pfu 10 vezes, 50 pMol da sequência iniciadora 506-11 e FV-2 e 2,5 U de polimerase Pfu (Stratagene, Cambridge, UK). De forma semelhante, foram usadas a sequência iniciadora oligonucleotídica 506-12 (5'CTGGACAGGCAAGGAATACAG3'; nucleótidos 1591-1612; codificadora) e a sequência iniciadora oligonucleotídica 506-2 (5’CATCACGTTTCACCTCATCAGG3'; nucleótidos 1708-1730; complementar da sequência codificadora) para amplificar um fragmento de 139 pb usando as condições de reacção descritas atrás. Os fragmentos de 139 pb e de 666 pb foram usados para amplificar um fragmento de 784 pb empregando as sequências iniciadoras oligonucleotídicas 505-2 e FV-2. O fragmento resultante foi digerido com Kpnl (posição de nucleótido 1674) e PstI (posição de nucleótido 1068) e o fragmento do Factor V que contem a mutação Arg506-»Gln foi usado para substituir o fragmento correspondente do plasmídeo pCLB-BPV-FV. O plasmídeo resultante foi designado pCLB-BPVFRQ506 e a sequência do fragmento PstI-Kpnl que continha a mutação Arg506—»Gln foi verificada por sequenciação com oligonucleótidos.

Os nossos resultados mostram que as moléculas do Factor V modificadas nos seus locais de clivagem para a proteína C activada podem ser construídas e clonadas num vector de expressão eucariótico. Estas moléculas de cofactor variantes são mais convenientemente expressas em células eucarióticas pelos métodos descritos (Kane et al., 1990. Biochemistiy, vol. 29, 6762-6768). A purificação das proteínas modificadas é preferencialmente realizada por métodos de cromatografia de imuno-afmidade, como foi anteriormente estabelecido para o Factor V (Katzman et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. vol 78, 162-166). -28-

Breve descrição dos desenhos. A figura 1 mostra os locais de activação e inactivação respectivamente para trombina e APC no Factor VIII. No topo da barra estão descritos os locais de clivagem para trombina no Factor VIII. Mostrou-se que as mutações na posição de aminoácido Arg e Arg , que interferem com a função procoagulante desta proteína resultam em hemofilia A. No fundo da barra estão descritos os locais de clivagem para APC na posição Arg e Arg . As mutações neste local provavelmente prolongam a actividade procoagulante do Factor VIII, resultando em trombofilia. A figura 2 mostra os locais de activação e inactivação respectivamente para trombina e APC no Factor V. No topo da barra estão descritos os locais de clivagem para trombina. Não estão ainda descritas mutações nestas posições de aminoácido do Factor V. No fundo da barra estão descritos os locais de clivagem para APC na posição Arg306, Arg506, Arg679e Arg1765. As mutações neste local provavelmente prolongam a actividade procoagulante do Factor VIII, resultando em trombofilia. A figura 3 representa uma análise de um doente que não é portador de uma mutação na posição de aminoácido Arg506 do Factor V (indivíduo A) e um doente portador da mutação (indivíduo B). Pista 1. Fragmento de 154 pb, amplificado com a sequência iniciadora oligonucleotídica 506-1 e 506-2, derivado de cDNA do indivíduo A. Pista 2. O mesmo fragmento do indivíduo A, após digestão com Nrul. Pista 3. Fragmento de 154 pb amplificado com as sequências iniciadoras oligonucleotídicas 506-1 e 506-2, derivado de cDNA do indivíduo B. Pista 4. O mesmo fragmento do indivíduo B após digestão com Nrul. Escada de 100 pb. -29- A figura 4 dá uma análise da sequência do cDNA Factor V dos doentes. 0 cDNA do Factor V derivado do indivíduo B, heterozigótico para a mutação Arg506 para Gin está apresentado no painel da direita. A heterozigotia é contabilizada pela ocorrência de um "G" e de um "A" no segundo par de bases do codão Arg506 (CGA/CAA) do Factor V (conforme indicado pela seta). No painel da esquerda está apresentada a análise da sequência do indivíduo A, o qual não possui a mutação. A seta indica o único "G" observado no segundo par de bases do codão Arg506 (CGA/CGA). A figura 5 mostra a geração de trombina no plasma contendo Factor V com ou sem a mutação no local de clivagem para a proteína C activada na posição de aminoácido 506. O plasma foi obtido a partir de três dadores distintos, com o genótipo do Factor V Arg506/Arg506, Arg506/Gln506 e Gln506/Gln506. A figura 6 mostra a geração de trombina no Factor V parcialmente purificado, preparado como Concentrado do Complexo Protrombina a partir de plasma de dadores seleccionados para os genótipos Arg506/Arg506, Arg506/Gln506 e Gln506/Gln506. A figura 7 mostra a geração de trombina no plasma de um doente com hemofilia A grave e um inibidor contra o Factor VIII com título elevado. A formação de trombina está totalmente normalizada pela presença de Factor V exógeno, desde que este seja portador da mutação Arg506 para Gin no local de clivagem para a proteína C activada. -30-

Tabela I: Locais de clivagem para APC no Factor VIII e no Factor V. Os locais de clivagem no Factor VIIII humano foram identificados por sequenciação de aminoácidos dos produtos de clivagem do Factor VIII digerido com APC. Os locais de clivagem no Factor V são baseados na homologia com o Factor V bovino. A sequenciação de aminoácido dos fragmentos proteolíticos gerados por digestão do Factor V bovino por APC foi usado para determinar os locais de clivagem exactos. O aminoácido 1 do Factor V e VIII corresponde ao primeiro aminoácido após o peptídeo sinal. O nucleótido 1 do Factor V e VIII corresponde ao primeiro nucleó-tido do codão de iniciação.

Factor VIII humano (sequência de aminoácidos Ser328-Asp345; nucle-ótidos 1039-1090):

Ser-Cis-Pro-Glu-Glu-Pro-Gln-Leu-Arg 4 Met-Lis-Asn-Asn-Glu-Glu-Ala-Glu

AGC TGT CCA GAG GAA CCC CAA CTA CGA ATG AAA AAT AAT GAA GAA GCG GAA

Factor VIII humano (sequência de aminoácidos Cis554-Arg571; nucle-ótidos 1717-1768):

Cis-Tir-Lis-Glu-Ser-Val-Asp-Gln-Arg 4 Gli-Asn-Gln-Ile-Met-Ser-Asp-Lis

TGC TAC AAA GAA TCT GTA GAT CAA AGA GGA AAC CAG ATA ATG TCA GAC AAG

Factor V (sequência de aminoácidos Ile298-Gln315; nucleótidos 976-1027) :

Ile-Lis-Asn-Cis-Pro-Lis-Lis-Tre-Arg 4· Asn-Leu-Lis-Lis-Ile -Tre-Arg-Glu -31 -

ATT AAA AAC TGC CCA AAG AAA ACC AGG AAT CTT AAG AAA ATA ACT CGT GAG

Factor V humano (sequência de aminoácidos Cis498-Glu51s; nucleóti-dos 1576-1627):

Cis-Lis-Ser-Arg-Ser-Leu-Asp-Arg-Arg l Gli-Ile-Gln-Arg-Ala-Ala-Asp-Ile

TGT AAG AGC AGA TCC CTG GAC AGG CGA GGA ATA CAG AGG GCA GCA GAC ATC

Factor V humano (sequência de aminoácidos Pro€71-GluS88; nucleóti-dos 2095-2146):

Pro-Glu-Ser-Tre-Val-Met-Ala-Tre-Arg Φ Lis-Met-His-Asp-Arg-Leu-Glu-Pro

CCA GAA TCT ACA GTC ATG GCT ACA CGG AAA ATG CAT GAT CGT TTA GAA CCT

Factor V humano (sequência de aminoácidos Glu1757-Ser1774; nucleó-tidos 5353-5404):

Glu-Lis-Lis-Ser-Arg-Ser-Ser-Trp-Arg 4- Leu-Tre-Ser-Ser-Glu-Met-Lis-Lis

GAA AAG AAG TCC CGA AGT TCT TGG AGA CTC ACA TCC TCA GAA ATG

AAA AAA -32-

Tabela TT: Lista de sequências i ni ri adoras oligonucleotídicas usadas para detectar mutações de locais de clivagem por APC na posição de aminoãcido Arg506 do factor V e Arg336 e Arg562 do Factor VIII: os desemparelhamentos nas sequências iniciadoras oligonucleotidicas, relativamente à sequência selvagem dos Factorco V e VIII, estão sublinhadas. Apés amplificação por PCR das sequências iniciadoras projectadas, com uma sequência selvagem dos Factores V e VIII, obtem-se um fragmento portador de um local de restrição. A presença de uma mutação num codão particular, destrói este local de restrição e pode ser assim usada para controlar mutações nos locais de clivagem para APC.

Factor VIII humano (sequência de aminoãcidos Ser328-Asp34S; nucleótidos 1039-1090):

Met-Lis-Asn-Asn-Glu-Glu-ATG AAA AAT AAT GAA GAA

Ser-Cis-Pro-Glu-Glu-Pro-Gln-Leu-Arg i Ala-Glu

AGC TGT CCA GAG GAA CCC CAA CTA CGA GCG GAA

Sequência iniciadora oligonucleotídica 336-1 (codificadora; nucleótidos 1039-1064) :

AGC TGT CCA GAG GAA CCC CAA CTT C Sítio de restrição: Taq I T CGA

Sequência iniciadora oligonucleotídica 336-2 (codificadora; nucleótidos 1039-1063):

AGC TGT CCA GAG GAA CCC CAA GTA Sítio de restrição: Rsa I GTA C

Sequência iniciadora codificadora 336-3 (complementar da sequência codificadora; nucleótidos 1180-1201):

AGT TTT AGG ATG CTT CTT GGC

Factor VIII humano (sequência de aminoácidos Cis554-Arg571; nucleótidos 1717-1768) : - 33 -

Cis-Tir-Lis -Glu-Ser-Val-Asp-Gln-Arg 4 Gli-Asn-Gln-Ile-Met-Ser-

Asp-Lis

TGC TAC AAA GAA TCT GTA GAT CAA AGA GGA AAC CAG ATA ATG TCA GAC AAG

Sequência iniciadora oligonucleotídica 562-5 (codificadora; nucleótidos 1717-1741)

TGC TAC AAA GAA TCT GTA GAT CGA

Sítio de restrição: MboII GA AGA

Sequência iniciadora oligonucleotídica 562-6 (complementar da sequência codificadora; nucleõtidos 2020-2038)

GTG TTT GAA GGT ATA TCC

Factor V humano (sequência de aminoácidos Cis498-Glu515; nucleõtidos 157 6-1627) :

Cis-Lis-Ser-Arg-Ser-Leu-Asp-Arg-Arg 4 Gli-Ile-Gln-Arg-Ala-Ala-Asp-Ile

TGT AAG AGC AGA TCC CTG GAC AGG CGA GGA ATA CAG AGG GCA GCA GAC ATC

Sequência iniciadora oligonucleotídica 606-1 (codificadora; nucleõtidos 1576-1600) :

TGT AAG AGC AGA TCC CTG GAC TCG Sítio de restrição: NruI TCG CGA

Sequência iniciadora oligonucleotídica 506-2 (anti-codificadora; nucleõtidos 1708-1730)

C ATC ACG TTT CAC CTC ATC AGG -34-

Tabela III: Sequências iniciadoras oligonucleotídicas derivadas de sequências de cDNA e de DNA genómico do Factor V para diagnosticar a substituição Argb06 para Gin. A parte da sequência iniciadora derivada dos nucleótidos 1-8 do intrão 10 do gene do Factor V está indicada a cheio. A sequência iniciadora oligonucleotídica 506-8 contem uma substituição de "C" para "T" relativamente à sequência iniciadora oligonucleotídica 506-7, que corresponde à substituição Arg506 para Gin descrita no texto (sublinhado).

Sequência iniciadora 506-5 5' ATCAGAGCAGTTCAACCAGGG3' (codificadora; nucleótidos 1414-1435 do cDNA do Factor V)

Sequência iniciadora 506-6 5' AAAAGTACCTGTATTCCT3' (complementar da sequência codificadora; nucleótidos 1602-1612 do cDNA do Factor V e nucleótidos 1-8 do intrão 10 do gene do Factor V)

Sequência iniciadora 506-7 5' AAAAGTACCTGTATTCCTC 3' (complementar da sequência codificadora; nucleótidos 1601-1612 do cDNA do Factor V e nucleótidos 1-8 do intrão 10 do gene do Factor V)

Sequência iniciadora 506-8 5' AAAAGTACCTGTATTCCTT3' (complementar da sequência codificadora; nucleótidos 1602-1612 do cDNA do Factor V e nucleótidos 1-8 do intrão 10 do gene do Factor V)

Lisboa, 8 de Maio de 2001

ALBERTO CANELAS

Agente Cficiti ts Praprfedade industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição farmacêutica compreendendo um Factor V da coagulação do sangue que é resistente à proteína C activada.
2. 2. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, cm que o referido Factor V é portador de uma mutação em pelo menos um dos locais de clivagem para a proteína C activada.
3. 3. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, em que a mutação no Factor V é uma mutação de substituição de um resíduo arginina em pelo menos uma posição seleccionada do grupo consistindo nos resíduos 306, 506,679 e 1765.
4. 4. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, em que a mutação está na posição 306.
5. 5. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, em que a mutação é na posição 506.
6. 6. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, em que a mutação é na posição 306 e na posição 506.
7. 7. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que o referido Factor V é obtido a partir de células eucarióticas ou procarióticas e/ou de animais transgénicos expressando Factor V, o qual é resistente à proteína C activada. -2-
8. 8. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que o referido Factor V é obtido a partir de plasma de indivíduos que apresentam resistência à proteína C activada.
9. 9. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, que compreende ainda pelo menos um Factor de coagulação adicional.
10. 10. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 9, que compreende uma preparação derivada de plasma, como seja o concentrado de complexos de protrombina ou o concentrado de complexos de protrombina activada.
11. 11. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindica ção 1, para o tratamento de alterações na cascata de coagulação do sangue.
12. 12. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que a referida alteração na cascata de coagulação do sangue é devida a uma deficiência do Factor de coagulação.
13. 13. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12, em que a referida alteração é complicada pela presença de inibidores ou anticorpos contra o referido Factor de coagulação.
14. 14. Utilização de um Factor V de coagulação do sangue que é resistente à actividade da proteína C na produção de uma composição farmacêutica para o tratamento de alterações na cascata de coagulação do sangue.
15. 15. Um Factor V de coagulação do sangue que é resistente à proteína C activada para usar no tratamento de alterações na cascata de coagulação do sangue. Lisboa, 8 de Maio de 2001 Wj ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VÍCTOR CORDON, 14 1200 LISBOA