RU2669796C1 - Способ определения функционального фибриногена - Google Patents
Способ определения функционального фибриногена Download PDFInfo
- Publication number
- RU2669796C1 RU2669796C1 RU2017137693A RU2017137693A RU2669796C1 RU 2669796 C1 RU2669796 C1 RU 2669796C1 RU 2017137693 A RU2017137693 A RU 2017137693A RU 2017137693 A RU2017137693 A RU 2017137693A RU 2669796 C1 RU2669796 C1 RU 2669796C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fibrinogen
- concentration
- functional fibrinogen
- thromboelastography
- functional
- Prior art date
Links
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 title claims abstract description 100
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 title claims abstract description 100
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 title claims abstract description 100
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 50
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 50
- 108010027612 Batroxobin Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 229960002210 batroxobin Drugs 0.000 claims abstract description 35
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 abstract description 6
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 abstract description 6
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 abstract description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 25
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 22
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 12
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 7
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 7
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 208000005485 Thrombocytosis Diseases 0.000 description 6
- 229960000446 abciximab Drugs 0.000 description 5
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 5
- 238000013169 thromboelastometry Methods 0.000 description 5
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 206010051125 Hypofibrinogenaemia Diseases 0.000 description 4
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 4
- 101000772006 Bombus ignitus Venom serine protease Bi-VSP Proteins 0.000 description 3
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 3
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 3
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- JWICNZAGYSIBAR-LEEGLKINSA-N (4s)-4-[[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-aminopropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]acetyl]amino]-5-[[2-[[(2s)-3-carboxy-1-[[(2s)-1-[[1-[[(2s)-1-[[(2s)-4-carboxy-1-[[2-[[2-[[2-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-4-(diaminomethylideneamino Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CC=CC=C1 JWICNZAGYSIBAR-LEEGLKINSA-N 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 241000271511 Bothrops atrox Species 0.000 description 2
- 101800000974 Fibrinopeptide A Proteins 0.000 description 2
- 102400000525 Fibrinopeptide A Human genes 0.000 description 2
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015795 Platelet Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010010336 Platelet Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 230000036592 analgesia Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- 230000002345 thrombinlike Effects 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036762 Acute promyelocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 241001535291 Analges Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000271532 Crotalus Species 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010058861 Fibrin Fibrinogen Degradation Products Proteins 0.000 description 1
- 101800003778 Fibrinopeptide B Proteins 0.000 description 1
- 102400001063 Fibrinopeptide B Human genes 0.000 description 1
- 206010018852 Haematoma Diseases 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 108010022901 Heparin Lyase Proteins 0.000 description 1
- 229940098704 Heparin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101000962469 Homo sapiens Transcription factor MafF Proteins 0.000 description 1
- 206010051124 Hyperfibrinogenaemia Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 208000033826 Promyelocytic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 206010065304 Spontaneous haematoma Diseases 0.000 description 1
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 description 1
- 102100039187 Transcription factor MafF Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 229940097597 bothrops atrox venom Drugs 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000007675 cardiac surgery Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000000179 crotalid venom Substances 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000000208 fibrin degradation product Substances 0.000 description 1
- MYRIFIVQGRMHRF-OECXYHNASA-N fibrinopeptide b Chemical compound N([C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 MYRIFIVQGRMHRF-OECXYHNASA-N 0.000 description 1
- 229940125672 glycoprotein IIb/IIIa inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002607 heparin antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010911 splenectomy Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229960003425 tirofiban Drugs 0.000 description 1
- COKMIXFXJJXBQG-NRFANRHFSA-N tirofiban Chemical compound C1=CC(C[C@H](NS(=O)(=O)CCCC)C(O)=O)=CC=C1OCCCCC1CCNCC1 COKMIXFXJJXBQG-NRFANRHFSA-N 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине и касается способа определения функционального фибриногена, включающего исследование цельной пробы крови путем тромбоэластографии. Гепаринизированную кровь и батроксобин вносят в кювету для тромбоэластографии, после чего выполняют тромбоэластографию, определяя параметр максимальной амплитуды (МАБатрокс) на тромбоэластограмме, а концентрацию функционального фибриногена (ФФБатрокс) рассчитывают по формуле: ФФБатрокс = 0.1153 × МАбатрокс + 0.5903, где ФФБатрокс - концентрация функционального фибриногена (г/л), МАБатрокс - максимальная амплитуда на тромбоэластограмме с гепаринизированной кровью и батроксобином (мм), 0.1153 и 0.5903 - коэффициенты пересчета. Изобретение обеспечивает повышение точности определения концентрации функционального фибриногена по максимальной амплитуде тромбоэластограммы гепаринизированной крови, в котором образование фибринового сгустка индуцируется добавлением батроксобина. 4 пр., 10 ил.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к инструментальным способам оценки функционального состояния системы гемостаза, интенсивной терапии.
На сегодняшний день известны различные методы определения функционального фибриногена.
Так известно определение концентрации фибриногена по Клауссу, основанное на исследовании времени образования сгустка при добавлении высокой концентрации тромбина к разбавленной в 10-20 раз плазме. Тест выполняется на коагулометрах, при этом логарифм времени образования сгустка обратно пропорционален логарифму концентрации функционального фибриногена. Калибровочная кривая показывает укорочение времени свертывания при увеличении концентрации фибриногена. (Долгов В.В., Свирин П.В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза. - М. - Тверь: ООО «Издательство «Триада» 2005. - 227 с,). Основными ограничениями метода определения фибриногена по Клауссу является чувствительность результатов к гипо-, дис- и гиперфибриногенемии, а также к продуктам деградации фибрина, которые влияют на процесс полимеризации фибрин-мономеров и могут быть причиной ложно низких результатов. Метод выполняется только в лабораторных условиях на специальном оборудовании (центрифуга, коагулометр).
Известно также определение функционального фибриногена (Functional Fibrinogen Level - FLEV)c помощью тромбоэластографии. Метод тромбоэластографии не требует центрифугирования крови, является прикроватным, широко используется в интенсивной терапии. Определение уровня функционального фибриногена с помощью тромбоэластографии заключается в регистрации максимальной амплитуды тромбоэластограммы после добавления к цитратной крови ингибитора тромбоцитарного гликопротеина IIb/IIIa (абциксимаба) и активатора вешнего пути свертывания (лиофилизированного тканевого фактора). Максимальная амплитуда (MAFF), регистрируемая при этом на тромбоэластограмме, отражает уровень функционального фибриногена (FLEV) (Rossaint R, Bouillon В, Cerny V, Coats TJ, Duranteau J, 
E, et al. The European guideline on management of major bleeding and coagulopathy following trauma: fourth edition. Critical Care. Critical Care; 2016;20:100). Определенный таким образом функциональный фибриноген коррелирует с концентрацией фибриногена, определенной по Клауссу. В то же время известно, что функциональный фибриноген, определенный с помощью тромбоэластографии, может переоценивать концентрацию фибриногена (Agren A, Wikman AT, Ostlund A, Edgren G. TEG® functional fibrinogen analysis may overestimate fibrinogen levels. Anesthesia and analgesia. 2014;118:933-5). Возможной причиной переоценки фибриногена является то, что при этом методе не всегда удается полностью ингибировать тромбоциты, что было показано при сравнении его с методом тромбоэластометрии, использующим другой ингибитор тромбоцитов. Существенным недостатком является также дороговизна метода, ограничивающая его широкое использование, а возможное присутствие в пробе гепарина, который может получать обследуемый, требует выполнения теста с гепариназой.
Известен также способ определения функционального фибриногена в тесте FIBTEM ротационной тромбоэластометрии. В этом тесте к цитратной крови добавляются ингибитор тромбоцитов цитохалазин D, рекомбинантный тканевой фактор и ингибитор гепарина, после чего определяется максимальная плотность сгустка (показатель MCF - maximum clot firmness) по данным тромбоэластометрии. Функциональный фибриноген, определенный с помощью теста FIBTEM, коррелирует с концентрацией фибриногена по Клауссу (R2 = 0.671, р<0.001) (
F, 
A, Preininger A, Raggam RB, Grinschgl Y, Krumnikl J, et al. Comparison of functional fibrinogen (FF/CFF) and FIBTEM in surgical patients - a retrospective study. Clinical chemistry and laboratory medicine. 2016;54:453-8). По уровню фибриногена, определенного с помощью теста FIBTEM, рекомендуется принимать решение о коррекции гипофибриногенемии у больных с травмой. Однако и этот метод не позволяет полностью ингибировать функцию тромбоцитов и, следовательно, может завышать уровень функционального фибриногена. Причем это завышение тем выше, чем больше тромбоцитов в крови. Поэтому была предложена модификация теста FIBTEM, которая называется FIBTEM Plus (Solomon С, Baryshnikova Е, Schlimp CJ, 
H, Asmis LM, Ranucci M. FIBTEM PLUS Provides an Improved Thromboelastometry Test for Measurement of Fibrin-Based Clot Quality in Cardiac Surgery Patients. Anesthesia & Analgesia. 2013;117:1054-62). В данном тесте FIBTEM Plus для лучшего подавления функции тромбоцитов наряду с цитохалазином D добавляется ингибитор тромбоцитарного гликопротеина IIb/IIIa - препарат тирофибан. Существенными недостатками является дороговизна метода, ограничивающая его широкое использование, неполное ингибирование функции тромбоцитов, что может привести к переоценке концентрации функционального фибриногена.
Наиболее близким техническим решением к заявленному, является способ определения фибриногена, в котором предлагается оценивать уровень фибриногена по величине максимальной амплитуды тромбоэластограммы, выполненной с обедненной тромбоцитами плазмой (RU 2517116 от 27.05.2014). Недостатками данного метода является то, что для получения обедненной тромбоцитами плазмы необходимо центрифугировать кровь в определенных режимах. Кроме того, полученная после центрифугирования обедненная тромбоцитами плазма никогда не является полностью свободной от тромбоцитов, а их количество в ней может варьировать. Следовательно, и максимальная амплитуда тромбоэластограммы обедненной тромбоцитами плазмы будет варьировать и зависеть от количества оставшихся в ней тромбоцитов и не всегда точно отражать уровень функционального фибриногена.
Технический результат заявленного изобретения заключается в повышении точности определения функционального фибриногена по максимальной амплитуде тромбоэластограммы гепаринизированной крови, в котором образование фибринового сгустка индуцируется добавлением фермента, выделенного из яда гремучей змеи Bothrops atrox, батроксобина с активностью 5 МЕ/мл.
Технический результат достигается тем, что определение функционального фибриногена, проводят посредством исследования цельной пробы крови путем тромбоэластографии, при этом гепаринизированную кровь и батроксобин с активностью 5 МЕ/мл вносят в кювету для тромбоэластографии в соотношении 34:1 соответственно, после чего выполняют тромбоэластографию, оценивают параметр максимальной амплитуды (МАБатрокс) на тромбоэластограмме, а концентрацию функционального фибриногена (ФФБатрокс) рассчитывают по формуле: ФФбатрокс = 0.1153 МАбатрокс + 0.5903, где ФФбатрокс - расчетная концентрация функционального фибриногена (г/л) в тесте с батроксобином, МАБатрокс - максимальная амплитуда на тромбоэластограмме с гепаринизированной кровью и батроксобином (мм), 0.1153 и 0.5903 - коэффициенты пересчета.
Сущность изобретения
Задачей настоящего изобретения является определение функционального фибриногена, по образованию фибринового сгустка, индуцируемого добавлением батроксобина. Особенностью метода является использование батроксобина - фермента из яда гремучей змеи Bothrops atrox, обитающей в Южной и Центральной Америке. Батроксобин - тромбиноподобная протеаза, способная вызывать переход фибриногена в фибрин. Батроксобин отщепляет от фибриногена только фибринопептид А, что отличает ее от действия тромбина, который, кроме фибринопептида А, отщепляет от фибриногена еще и фибринопептид В. Батроксобин не подавляется антитромбином и гепарином, поэтому может использоваться для оценки полимеризации мономеров фибрина в присутствии гепарина. Поскольку на определение концентрации функционального фибриногена в цельной крови оказывает влияние возможная активация тромбоцитов, одной из задач исследования было получить тромбиноподобный фермент из яда Bothrops atrox venom, который одновременно не активировал бы тромбоциты. С этой целью были подобраны условия хроматографии, которые заключались в следующем: 50 мг яда растворяли в буферном растворе состава 50 мМ трис-HCl, рН 7.4 и наносили на колонну с анионообменным сорбентом DEAE-Sepharose Fast Flow. Сорбент промывали стартовым буфером и затем связанный с сорбентом белок элюировали градиентом ионной силы натрий хлорида. В выходящих фракциях (по 5 мл) автоматически записывалась концентрация белка, а также определяли время свертывания с раствором фибриногена. Чем короче было время свертывания, тем выше активность тромбиноподобного фермента в выходящих с колонны фракциях. Тромбиноподобная активность распределялась по двум фракциям, первая элюировалась с колонны при низкой концентрации соли, а вторая - при более высокой концентрации. Обе фракции фермента собирали отдельно, стабилизировали, добавляя бычий сывороточный альбумин до концентрации 5 мг/мл, разливали по флаконам и лиофилизировали. Исследовали влияние обеих фракций батрокобсина на тромбоциты, в тесте тромбоэластографии. Для этого из пробы цельной гепаринизированной крови получали обедненную тромбоцитами и обогащенную тромбоцитами плазму, согласно общепринятым методам (Perez AG, Lana JF, Rodrigues AA, Luzo AC, Belangero WD, Santana MH. Relevant Aspects of Centrifugation Step in the Preparation of Platelet-Rich Plasma. ISRN Hematology. 2014, article ID 176060). С полученными образцами обедненной тромбоцитами плазмы и обогащенной тромбоцитами плазмы выполняли тромбоэластографию, для чего к 340 мкл каждого образца плазмы добавляли по 10 мкл раствора батроксобина с активностью 5 МЕ/мл, из первой фракции, затем так же выполняли тромбоэластографию с батроксобином из второй фракции. Оценивали максимальную амплитуду на каждой из 4 тромбоэластограмм. Установлено, что первая фракция батроксобина не активировала тромбоциты, что проявилось в одинаковой максимальной амплитуде на тромбоэластограммах с обедненной и обогащенной тромбоцитами плазме (фиг. 1А и 1В). Вторая фракция, напротив, активировала тромбоциты, что проявилось большей максимальной амплитудой на тромбоэластограмме с обогащенной тромбоцитами плазмой, чем с обедненной тромбоцитами плазмой (фиг. 1Б и 1Г), т.е. в ней содержались ферменты, способные кроме расщепления фибриногена еще и активировать тромбоциты. Для определения функционального фибриногена использовали только первую фракцию батроксобина, не активирующую тромбоциты. Выход тромбиноподобного фермента, не активирующего тромбоциты (первая фракция), составил 20 МЕ/мг яда Bathrops atrox venom.
Определение функционального фибриногена осуществляют следующим образом: набирают кровь в пробирку, содержащую гепарин. Затем в кювету для тромбоэластографии вносят цельную гепаринизированную кровь и батроксобин с активностью 5 МЕ/мл в соотношении 34:1 соответственно. После чего выполняют тромбоэластографию, оценивают параметр максимальной амплитуды (МАбатрокс) на тромбоэластограмме, а концентрацию функционального фибриногена рассчитывают по формуле линейной регрессии:
ФФбатрокс = 0.1153 МАбатрокс + 0.5903,
где ФФбатрокс - это расчетная концентрация функционального фибриногена (г/л) в тесте с батроксобином с активностью 5 МЕ/мл, МАбатрокс - максимальная амплитуда на тромбоэластограмме с гепаринизированной кровью и батроксобином (мм), 0.1153 и 0.5903 - коэффициенты уравнения регрессии (коэффициенты пересчета).
Примеры осуществления способа.
Пример 1. Определение зависимости между концентрацией функционального фибриногена, определенной по методу Клаусса, и максимальной амплитудой на тромбоэластограмме с батроксобином активностью 5 МЕ/мл.
Исследовано 30 образцов крови, полученных у 17 онкогематологических больных. Кровь получали путем венепункции одной из периферических вен и помещали в пробирки S-Monovette с 3.2% раствором цитрата натрия в соотношении 1:9 (1 часть раствора цитрата, 9 частей крови) и пробирки S-Monovette с литий гепарином (концентрация гепарина 10-30 ед/мл крови).
Концентрацию функционального фибриногена в плазме цитратной крови определяли по методу Клаусса на коагулометре Sysmex СА-620 с помощью реактивов компании Siemens (Германия).
Тромбоэластографию цельной гепаринизированной крови выполняли на тромбоэластографе TEG 5000 ("Haemoscope Corporation", США). Для этого 340 мкл гепаринизированной крови вносили в кювету, в которую было добавлены 10 мкл раствора батроксобина, полученному по описанному выше способу, с активностью 5 МЕ/мл. Определяли максимальную амплитуду (МАБатрокс) на тромбоэластограмме.
Концентрация фибриногена в плазме цитратной крови, определенная по методу Клаусса, колебалась в пределах от 0,5 г/л до 8,7 г/л. Величина МАБатрокс на тромбоэластограмме в пробе с батроксобином активностью 5 МЕ/мл и гепаринизированной кровью колебалась в пределах от 2,3 мм до 62,5 мм. Корреляция между концентрацией фибриногена в плазме, определенной по методу Клаусса, и МАБатрокс показана на фиг. 2. Эта зависимость представляет собой прямую линию, с коэффициентом корреляции 0,83 (р<0.001), что позволяет связать концентрацию функционального фибриногена с максимальной амплитудой уравнением:
ФФБатрокс = 0.1153 × МАБатрокс + 0.5903, где
где ФФБатрокс - расчетная концентрация функционального фибриногена (г/л) в тесте с батроксобином активностью 5 МЕ/мл, МАБатрокс - максимальная амплитуда на тромбоэластограмме с гепаринизированной кровью и батроксобином (мм), 0.1153 и 0.5903 - коэффициенты уравнения регрессии (коэффициенты пересчета).
Концентрация функционального фибриногена в пробах с батроксобином активностью 5 МЕ/мл, рассчитанная согласно уравнению, колебалась от 0,8 г/л до 7,8 г/л, т.е. значения были близки к концентрации фибриногена по Клауссу.
Пример 2. Сравнение методов определения функционального фибриногена по тромбоэластографии с использованием абциксимаба и батроксобина активностью 5 МЕ/мл.
Исследовано 29 образцов крови, полученных у 17 онкогематологических больных. Кровь для исследования у больных получали путем венепункции одной из периферических вен и собирали в пробирки S-Monovette с 3.2% раствором цитрата натрия в соотношении 1:9 (1 часть раствора цитрата, 9 частей крови) и пробирки S-Monovette с литий гепарином (концентрация гепарина 10-30 ед/мл крови).
Тромбоэластографию выполняли на тромбоэластографе TEG 5000 ("Haemoscope Corporation", США). Использовали два канала тромбоэластографа.
На одном канале 340 мкл гепаринизированной крови вносили в кювету, в которую было добавлено 10 мкл раствора батроксобина, полученного по описанному выше методу, с активностью 5 МЕ/мл. Выполняли тромбоэластографию. Определяли максимальную амплитуду (МАБатрокс) на тромбоэластограмме. На втором канале выполняли тест функционального фибриногена, как предписано инструкцией к тромбоэластографу TEG 5000 ("Haemoscope Corporation", США). Для этого в кювету для тромбоэластографии вносили 20 мкл 0,2М раствора кальция хлорида. Затем 500 мкл цитратной крови добавляли во флакон с реагентом на функциональный фибриноген (Functional Fibrinogen Reagent для TEG 5000). Этот реагент содержит ингибитор абциксимаб и лиофилизированный тканевой фактор. После перемешивания из этого флакона отбирали 340 мкл крови и вносили в кювету, в которой уже находился раствор кальция хлорида. Выполняли тромбоэластографию. По окончанию теста определяли максимальную амплитуду стандартного метода определения функционального фибриногена (MAFF).
Величина максимальной амплитуды (МАБатрокс) колебалась от 2,3 мм до 62,5 мм. Величина максимальной амплитуды (MAFF) колебалась от 7,6 мм до 54,5 мм. На фиг. 3 показана корреляция между MAFF и МАБатрокс
Коэффициент корреляции между MFF и МАБатрокс составил 0,88 (р<0.001).
По методу Бленд-Альтмана оба показателя также соответствовали друг другу (фиг. 4). На фиг. 4 показано сравнение MAFF и МАБатрокс методом Бленд-Альтмана. Видно, что данные, полученные обоими методами, согласуются между собой. Пунктирными линиями представлены средняя разница MAFF и МАБатрокс, а также среднее разницы ± 1,96 стандартного отклонения.
Пример 3. Исследование функционального фибриногена двумя методами с помощью тромбоэластографии у больной с гипофибриногенемией до и после коррекции содержания фибриногена в плазме с помощью криопреципитата.
Больная З., 29 лет, госпитализирована в связи с впервые выявленным острым промиелоцитарным лейкозом. У больной имелся выраженный геморрагический синдром в виде гематом после инъекций, спонтанных гематом на коже груди, нижних конечностей. При поступлении плазменная концентрация фибриногена, определенная по методу Клаусса, составила 1,1 г/л.
Выполнена тромбоэластография на тромбоэластографе TEG 5000 реактивом Haemonetics® для исследования функционального фибриногена. В кювету для тромбоэластографии вносили 20 мкл 0,2М раствора кальция хлорида. Затем 500 мкл цитратной крови добавляли во флакон с реагентом на функциональный фибриноген (Functional Fibrinogen Reagent для TEG 5000). После перемешивания из этого флакона отбирали 340 мкл крови и вносили в кювету, в которой уже находился раствор кальция хлорида. Выполняли тромбоэластографию. По окончанию теста определяли максимальную амплитуду (MAFF), которая составила 13,5 мм, что соответствовало уровню функционального фибриногена (FLEV) 2,5 г/л (фиг. 5). Одновременно выполняли тест с батроксобином, полученным по описанному выше методу с активностью 5 МЕ/мл: 340 мкл гепаринизированной крови вносили в кювету, в которую было добавлены 10 мкл раствора батроксобина с активностью 5 МЕ/мл. Выполняли тромбоэластографию. Определяли максимальную амплитуду (МАБатрокс) на тромбоэластограмме, которая составила 3,6 мм (фиг. 6), что, согласно полученной нами формуле, соответствовало концентрации функционального фибриногена (ФФБатрокс) 1,0 г/л.
Больной была выполнена коррекция гипофибриногенемии трансфузиями 40 доз криопреципитата. При повторном исследовании крови плазменная концентрация фибриногена, определенная по методу Клаусса, составила 3,7 г/л.
При выполнении пробы на функциональный фибриноген реактивом Haemonetics®, как описано выше, максимальная амплитуда (MAFF) составила 28,8 мм, что соответствовала концентрации функционального фибриногена (FLEV) 5,53 г/л (фиг. 7).
На фиг. 7 показана тромбоэластограмма с реактивом на функциональный фибриноген (Functional Fibrinogen Reagent для TEG 5000) больной 3. после переливания 40 доз криопреципитата. MAFF 28,8 мм, расчетный уровень функционального фибриногена (FLEV) 5,5 3 г/л
При выполнении тромбоэластографии с гепаринизированной кровью и раствором батроксибина активностью 5 МЕ/мл, как описано выше, максимальная амплитуда составила 22,1 мм (фиг. 8), что, согласно разработанной нами формуле, соответствовала концентрации функционального фибриногена 3,1 г/л. На фиг. 8 показана тромбоэластограмма с гепаринизированной кровью и батроксобином активностью 5 МЕ/мл больной 3. после переливания 40 доз криопреципитата. МАБатрокс 22,1 мм, расчетная концентрация функционального фибриногена (ФФБатрокс) 3,1 г/л.
Пример 4. Сравнение определения концентрации функционального фибриногена по методу Клаусса и функционального фибриногена двумя методами с помощью тромбоэластографии у больной с тромбоцитозом.
Больная А. 21 года страдает талассемией. В 2013 г. была выполнена спленэктомия. С 2013 г. в клиническом анализе крови у больной выявляется тромбоцитоз. На момент исследования функционального фибриногена концентрация тромбоцитов в периферической крови составила 1333×109/л (норма 180-320×109/л), плазменная концентрация фибриногена, определенная по методу Клаусса, составила 1,1 г/л.
Была выполнена тромбоэластография на тромбоэластографе TEG 5000 с реактивом Haemonetics® для исследования функционального фибриногена. В кювету для тромбоэластографии вносили 20 мкл 0,2М раствора кальция хлорида. Затем 500 мкл цитратной крови добавляли во флакон с реагентом на функциональный фибриноген (Functional Fibrinogen Reagent для TEG 5000). После перемешивания из этого флакона отбирали 340 мкл крови и вносили в кювету, в которой уже находился раствор кальция хлорида. Выполняли тромбоэластографию. По окончанию теста определяли максимальную амплитуду стандартным методом определения функционального фибриногена (MAFF), которая составила 34 мм, что соответствовало концентрации функционального фибриногена (FLEV) 6,3 г/л (фиг. 9). На фиг. 9 показана тромбоэластограмма с реактивом на функциональный фибриноген (Functional Fibrinogen Reagent для TEG 5000) больной А с тромбоцитозом 1333×109/л. MAFF 34,4 мм, что соответствовало уровню функционального фибриногена (FLEV) 6,3 г/л. Одновременно выполняли тест с батроксобином активностью 5 МЕ/мл, полученным по описанному выше методу: 340 мкл гепаринизированной крови вносили в кювету, в которую было добавлены 10 мкл раствора батроксобина с активностью 5 МЕ/мл. Выполняли тромбоэластографию. Определяли максимальную амплитуду (МАБатрокс) на тромбоэластограмме, которая составила 6,3 мм (фиг. 10), что, согласно полученной нами формуле, соответствовало концентрации функционального фибриногена (ФФБатрокс) 1,3 г/л, это оказалось значительно ближе к концентрации фибриногена, определенного по методу Клаусса, чем с реактивом Haemonetics®. На фиг 10 показана тромбоэластограмма с гепаринизированной кровью и батроксобином с активностью 5 МЕ/мл больной А. с тромбоцитозом 1333×109/л. МАБатрокс 6,2 мм, расчетная концентрация функционального фибриногена (ФФБатрокс) 1,3 г/л. Большую величину MAFF, чем МАБатрокс, а, следовательно, и большую концентрацию функционального фибриногена можно объяснить различиями в методологических подходах. В тесте Haemonetics® максимальная амплитуда, которая должна бы соответствовать уровню фибриногена, достигается добавлением абциксимаба, ингибирующего тромбоциты, однако при тромбоцитозе, при котором количество тромбоцитов крови значительно превышает их нормальное значение, стандартная доза абциксимаба может не полностью ингибировать тромбоциты (Schlimp CJ., Solomon С, Ranucci М, Hochleitner G, Redl H, Ню The Effectiveness of Different Functional Fibrinogen Polymerization Assays in Eliminating Platelet Contribution to Clot Strength in Thromboelastometry. Anesth Analg 2014; 118: 269-76) и, следовательно, сохраняется их вклад в максимальную амплитуду тромбоэластограммы, поэтому ее величина будет завышенной. При определении функционального фибриногена в гепаринизированной крови в тесте с батроксобином активностью 5 МЕ/мл тромбоциты вообще не участвуют в формирования сгустка и максимальной амплитуды, следовательно, их количество в крови не влияет на определяемую концентрацию функционального фибриногена.
Таким образом, максимальная амплитуда тромбоэластограммы, выполненной с гепаринизированной кровью с добавлением батроксобином с активностью 5 МЕ/мл, хорошо коррелирует с плазменной концентрацией фибриногена, измеренной по методу Клауссса, с максимальной амплитудой тромбоэластограммы, выполненной с реактивом Haemonetics® для исследования функционального фибриногена (Functional Fibrinogen Reagent для TEG 5000), отражает концентрацию функционального фибриногена у больных с гипофибриногенемией, нормальным содержанием фибриногена, при тромбоцитозе.
Claims (1)
- Способ определения функционального фибриногена, включающий исследование цельной пробы крови путем тромбоэластографии, отличающийся тем, что гепаринизированную кровь и батроксобин с активностью 5 МЕ/мл вносят в кювету для тромбоэластографии в соотношении 34:1 соответственно, после чего выполняют тромбоэластографию, определяя параметр максимальной амплитуды (МАБатрокс) на тромбоэластограмме, а концентрацию функционального фибриногена (ФФБатрокс) рассчитывают по формуле: ФФБатрокс = 0.1153 × МАбатрокс + 0.5903, где ФФБатрокс - концентрация функционального фибриногена (г/л), МАБатрокс - максимальная амплитуда на тромбоэластограмме с гепаринизированной кровью и батроксобином (мм), 0.1153 и 0.5903 - коэффициенты пересчета.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017137693A RU2669796C1 (ru) | 2017-10-30 | 2017-10-30 | Способ определения функционального фибриногена |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017137693A RU2669796C1 (ru) | 2017-10-30 | 2017-10-30 | Способ определения функционального фибриногена |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2669796C1 true RU2669796C1 (ru) | 2018-10-16 |
Family
ID=63862490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017137693A RU2669796C1 (ru) | 2017-10-30 | 2017-10-30 | Способ определения функционального фибриногена |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2669796C1 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2703541C1 (ru) * | 2019-03-15 | 2019-10-21 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ПМ" Минздрава России) | Способ определения фибриногена при рекальцификации цитратной плазмы и оценка его функциональности |
| WO2021028448A1 (en) * | 2019-08-12 | 2021-02-18 | Dublin City University | Method for the determination of plasma fibrinogen concentration in whole blood samples |
| RU2786591C2 (ru) * | 2020-10-05 | 2022-12-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ивановский государственный химико-технологический университет" | Способ определения показателей коагуляции плазмы крови - активности тромбина, времени рекальцификации плазмы и толерантности плазмы к гепарину |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009080303A1 (en) * | 2007-12-21 | 2009-07-02 | Csl Behring Gmbh | Diagnostic in vitro method for assessing von willebrand disease and increased bleeding risk associated with von willebrand disease and acquired or congenital disorders of platelet function |
| RU2517116C2 (ru) * | 2012-07-03 | 2014-05-27 | Государственное бюджетное учреждение Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт скорой помощи им. И.И. Джанелидзе | Способ оценки состояния свертывающей системы крови у пациентов, находящихся в критическом состоянии |
-
2017
- 2017-10-30 RU RU2017137693A patent/RU2669796C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009080303A1 (en) * | 2007-12-21 | 2009-07-02 | Csl Behring Gmbh | Diagnostic in vitro method for assessing von willebrand disease and increased bleeding risk associated with von willebrand disease and acquired or congenital disorders of platelet function |
| RU2517116C2 (ru) * | 2012-07-03 | 2014-05-27 | Государственное бюджетное учреждение Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт скорой помощи им. И.И. Джанелидзе | Способ оценки состояния свертывающей системы крови у пациентов, находящихся в критическом состоянии |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| PRULLER F. et al., Comparison of functional fibrinogen (FF/CFF) and FIBTEM in surgical patients - a retrospective study.Clin Chem Lab Med. 2016 Mar;54(3):453-8. doi: 10.1515/cclm-2015-0345. * |
| PRULLER F. et al., Comparison of functional fibrinogen (FF/CFF) and FIBTEM in surgical patients - a retrospective study.Clin Chem Lab Med. 2016 Mar;54(3):453-8. doi: 10.1515/cclm-2015-0345. SOLOMON C., et al., FIBTEM PLUS provides an improved thromboelastometry test for measurement of fibrin-based clot quality in cardiac surgery patients.Anesth Analg. 2013 Nov;117(5):1054-62. doi: 10.1213/ANE.0b013e3182a1afac. * |
| SOLOMON C., et al., FIBTEM PLUS provides an improved thromboelastometry test for measurement of fibrin-based clot quality in cardiac surgery patients.Anesth Analg. 2013 Nov;117(5):1054-62. doi: 10.1213/ANE.0b013e3182a1afac. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2703541C1 (ru) * | 2019-03-15 | 2019-10-21 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ПМ" Минздрава России) | Способ определения фибриногена при рекальцификации цитратной плазмы и оценка его функциональности |
| WO2021028448A1 (en) * | 2019-08-12 | 2021-02-18 | Dublin City University | Method for the determination of plasma fibrinogen concentration in whole blood samples |
| RU2786591C2 (ru) * | 2020-10-05 | 2022-12-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ивановский государственный химико-технологический университет" | Способ определения показателей коагуляции плазмы крови - активности тромбина, времени рекальцификации плазмы и толерантности плазмы к гепарину |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Paar et al. | Anticoagulant action of low, physiologic, and high albumin levels in whole blood | |
| Roullet et al. | Rotation thromboelastometry detects thrombocytopenia and hypofibrinogenaemia during orthotopic liver transplantation | |
| Smith et al. | Correlation of hematocrit, platelet concentration, and plasma coagulation factors with results of thromboelastometry in canine whole blood samples | |
| Larsen et al. | Diagnostic performance and therapeutic consequence of thromboelastometry activated by kaolin versus a panel of specific reagents | |
| Edwards et al. | Parameters of thromboelastography in healthy newborns | |
| Karon | Why is everyone so excited about thromboelastrography (TEG)? | |
| Herring et al. | Diagnostic approach to small animal bleeding disorders | |
| Stang et al. | Fibrinogen | |
| Peng et al. | A comparative study of viscoelastic hemostatic assays and conventional coagulation tests in trauma patients receiving fibrinogen concentrate | |
| Carroll et al. | Measurement of functional fibrinogen levels using the Thrombelastograph | |
| JP2017520757A (ja) | 線維素溶解及び線溶亢進を検出するための方法及び試薬 | |
| KR101298966B1 (ko) | 혈전탄성초음파영상 기법을 사용하여 인자 ｘⅲ 결핍 상태를 식별하는 방법 | |
| RU2669796C1 (ru) | Способ определения функционального фибриногена | |
| Gant et al. | Abnormal platelet activity in dogs and cats–impact and measurement | |
| Hutton et al. | Haemostatic mechanism in uraemia | |
| Paniccia et al. | Evaluation of a new point-of-care celite-activated clotting time analyzer in different clinical settings: the i-STAT celite-activated clotting time test | |
| RU2703541C1 (ru) | Способ определения фибриногена при рекальцификации цитратной плазмы и оценка его функциональности | |
| DeLoughery | Tests of hemostasis and thrombosis | |
| CA2883260C (en) | Composition for use as an abnormal coagulation control plasma in in vitro assays | |
| Smith et al. | The prolonged bleeding time in hemophilia A: comparison of two measuring technics and clinical associations | |
| Adams et al. | Emerging technologies in hemostasis diagnostics: a report from the Australasian Society of Thrombosis and Haemostasis Emerging Technologies Group | |
| JP2007503589A (ja) | 活性化混合物 | |
| Schlimp et al. | Fibrinogen assays | |
| Turner et al. | Correlation of rotational thromboelastometry (ROTEM) parameters with platelet count and their ability to predict thrombocytopenia in dogs | |
| JP2021513650A (ja) | 活性炭を使用する止血障害の診断方法 |