ES2291661T3 - Prueba de diagnostico para la determinacion de la concentracion de actividad proteolitica transitoria en medios biologicos compuestos. - Google Patents
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Abstract
Método para la determinación en tiempo real del desarrollo de la actividad proteolítica, cuya actividad proteolítica es sustancialmente actividad de trombina, en una primera muestra biológica que aparece y desaparece de la muestra, que comprende las siguientes etapas: a) añadir un activador de proteasa a dicha primera muestra para generar actividad proteolítica; b) añadir un sustrato de señal a la etapa a), provocando dicho sustrato de señal una señal detectable relativa a la cantidad de producto de conversión formado en la reacción por la actividad proteolítica generada; c) añadir un medio con una actividad proteolítica estable conocida y constante sobre el sustrato de señal, tal como se ha definido en la etapa b), pero que por lo demás es inerte, a una segunda muestra en paralelo, en la que no se ha iniciado actividad proteolítica, de manera que los medios con una actividad proteolítica estable y constante conocida se seleccionan en el grupo que consiste en complejo de (2-macroglobulina-trombina, complejo estafitocoagulasa-protrombina, y gamma trombina, d) añadir el mismo sustrato de señal que se ha definido en la etapa b) a la etapa c), provocando dicho sustrato de señal una señal detectable en la reacción por el medio con actividad proteolítica estable conocida, e) determinar el desarrollo del tiempo de la señal en dicha primera muestra y dicha segunda muestra paralela para proporcionar una curva de cada una de ellas, f) comparar dichas curvas para reducir el desarrollo de la actividad proteolítica a lo largo del tiempo en la primera muestra.
Description
Prueba de diagnóstico para la determinación de
la concentración de actividad proteolítica transitoria en medios
biológicos compuestos.
La presente invención se encuentra en el sector
de los diagnósticos y se refiere de manera más específica a un
método para determinar en tiempo real el curso de la concentración
de enzimas biológicamente activas que se encuentran
transitoriamente presentes en la sangre u otros fluidos corporales y
hace referencia también a un equipo de pruebas para llevar a cabo
este método.
La generación y degradación de enzimas
proteolíticas en los fluidos corporales es un elemento clave en
procesos diversos tales como digestión, inflamación, coagulación de
la sangre y trombosis. Un ejemplo: la trombina es una enzima
presente transitoriamente en la coagulación de la sangre y que es la
enzima clave de la hemostasis y trombosis. Los desórdenes del
sistema hemostático trombótico (HTS) son básicos en casi la mitad de
las enfermedades invalidantes y letales. Las cuantitativamente
menos importantes, hemofilia y embolismo pulmonar, se recuerdan con
facilidad. No se ha reconocido de manera muy general que la
trombosis arterial provoca infarto coronario o que una de cada diez
personas mayores tiene riesgo de pérdida de funciones cerebrales por
obstrucción de las arterias cerebrales por coágulos (embolización
en base a fibrilación del atrio y embolia de carótida) o que
pacientes seriamente enfermos pueden sangrar hasta morir a causa de
desórdenes del sistema de coagulación (víctimas de accidentes y
pacientes que sufren de sepsis con coagulación intravascular
mortal). Es insuficientemente reconocido que mueren más personas de
trombosis arterial que de cáncer y más personas mueren de trombosis
venosa que de accidentes. En vista de esta importancia médica es
sorprendente observar que no hay prueba funcional valida del HTS
disponible para el médico clínico en la actualidad.
En fluidos corporales existen varios sistemas
bioquímicos fisiológicamente importantes que actúan a través de la
activación y subsiguiente inactivación de enzimas proteolíticas
tales como, en la sangre, el sistema de coagulación, el sistema
fibrinolítico y el sistema complementario, y en jugos
gastrointestinales las enzimas digestivas. Para la evaluación de la
función biológica de estos sistemas es importante tener la capacidad
de seguir el curso de esta actividad proteolítica al desarrollarse
ésta después de su inicio en una muestra del fluido corporal ex
vivo en el tiempo. Esta evaluación de función es de importancia
básica en el diagnóstico porque las alteraciones de estos sistemas
pueden conducir a enfermedades mortales tales como infarto
coronario, ataque cardiaco o hemorragia mortal (coagulación de la
sangre y fibrinolisis), infecciones generalizadas y enfermedades
autoimmunes (sistema de complemento) o absorción alterada de
alimentos (jugos gastrointestinales).
En la hemostasis y en la trombosis los tiempos
de coagulación son las mejores evaluaciones posibles en la
actualidad y éstas son insensibles a alteraciones hemostáticas
suaves (por ejemplo portadores de hemofilia, enfermedad leve del
hígado) o a la coagulabilidad incrementada que conduce a un mayor
riesgo de trombosis. Las pruebas de coagulación necesitan
frecuentemente ser adaptadas a una utilización específica. Por
ejemplo, el tiempo de tromboplastina
(= tiempo de protrombina (PT) = tiempo rápido) puede ser utilizado para diagnóstico de enfermedades graves del hígado o tratamiento con anticoagulantes, pero no es prolongado por tratamiento de hemofilia o heparina. Una buena parte de la técnica y ciencia de un laboratorio de coagulación clínica consiste en conocer la forma de interpretar la información dispersa que puede ser obtenida a partir de los tiempos de coagulación de diferentes tipos, agregación de plaquetas, tiempo de hemorragia etc.
(= tiempo de protrombina (PT) = tiempo rápido) puede ser utilizado para diagnóstico de enfermedades graves del hígado o tratamiento con anticoagulantes, pero no es prolongado por tratamiento de hemofilia o heparina. Una buena parte de la técnica y ciencia de un laboratorio de coagulación clínica consiste en conocer la forma de interpretar la información dispersa que puede ser obtenida a partir de los tiempos de coagulación de diferentes tipos, agregación de plaquetas, tiempo de hemorragia etc.
La insuficiencia de las pruebas globales es
parcialmente compensada por una amplia variedad de pruebas
sofisticadas de componentes únicos del sistema de coagulación, de
manera que muchos indican que se debe hacer una selección razonable
en cada caso especial, lo cual constituye la otra mitad del
conocimiento específico del laboratorio de hemostasis clínica.
El mecanismo de generación de trombina en el
plasma sanguíneo puede ser explicado a título de ejemplo de la
manera siguiente. El factor de tejido (TF) se encuentra presente de
forma abundante, pero no exclusivamente, en la pared de los vasos.
Cuando un vaso sanguíneo se encuentra dañado, la sangre entra en los
tejidos y el factor de proteína del plasma VIIa (VIIa) puede
interaccionar con TF. Esto pone en marcha un conjunto extremadamente
complicado de interacciones entre proteínas del plasma y plaquetas
de la sangre, lo que tiene como resultado una aparición brusca
transitoria de trombina que permanece limitada en el tiempo y en el
espacio, de manera que normalmente una herida deja de sangrar pero
la coagulación no se propaga al resto del cuerpo.
Ese mecanismo se puede mostrar tan intricado,
lleno de reacciones de realimentación positivas y negativas, que su
acción no puede ser objeto de predicción por el conocimiento de sus
partes (complejidad irreducible). Por lo tanto, si se desea evaluar
la función del sistema hemostático, la generación de trombina tiene
que ser investigada en el momento en que tiene lugar en el cuerpo o
en una parte aislada del cuerpo, es decir, una muestra de sangre o
plasma rico en plaquetas. La interacción entre plaquetas de la
sangre y el factor del plasma es de importancia específica, siendo
esencialmente deficiente la información a obtener a partir de
plasma pobre en plaquetas. Ver por ejemplo, Béguin S., R. Kumar, I.
Keularts, U. Seligsohn, B.C Coller y H.C. Hemker,
Fibrin-Dependent Platelet Procoagulant Activity
Requires GPIb Receptors and Von Willebrand Factor ("La actividad
procoagulante de plaquetas dependiente de fibrina re- quiere
receptores GPIb y factor de Von Willebrand"), Blood (1999)
93:564-570; Béguin, S. y R. Kumar, supra
(1997).
Una fracción importante (\approx30%) de toda
la trombina formada en la coagulación del plasma está unida al
coagulo de fibrina. La trombina unida al coágulo retiene sus
características trombóticas, puede coagular fibrinógeno, activar
los factores V, VIII y XI y también plaquetas [Béguin, S. y R.
Kumar, Thromb. Haemost. (1997) 78:590-594; Kumar,
R., S. Béguin, y H.C. Hemker, Thromb. Haemost. (1994)
72:713-721, y (1995) 74:962-968].
Es inhibido solo de forma parcial por antitrombina. Por lo tanto es
esencial que la fibrina se encuentre presente cuando se investiga
la función del sistema de coagulación.
A efectos de evaluar la función de ese sistema
con el objetivo de diagnóstico y para la utilización segura de
medicamentos antitrombóticos, se han desarrollado una serie de
pruebas de componentes únicos del sistema de coagulación que se
detallarán adicionalmente más adelante.
Tal como se ha indicado anteriormente, la
actividad de trombina que se genera en el lugar de una lesión es un
determinante importante de la extensión de la reacción
hemostática-trombotica que se deriva de ello. La
mayor parte de la trombina (>95%) se genera después del momento
de la coagulación, por lo tanto el tiempo de coagulación no es
automáticamente un buen indicador de la actividad de trombina. La
actividad de trombina en la coagulación de la sangre es un fenómeno
transitorio y por lo tanto debería ser medido durante el proceso de
coagulación.
Un desarrollo típico de la formación de trombina
en la coagulación de sangre y plasma, que se ha designado también
como curva de generación de trombina, se ha mostrado en la figura 1.
Después de un periodo en el que no se forma trombina observable, la
concentración aumenta bruscamente, sube hasta un máximo y luego
disminuye nuevamente. Los parámetros son el tiempo de retardo, el
área por debajo de la curva (AUC), indicada también como
potencial
de trombina endógeno (ETP, ver más adelante), la altura del máximo y el tiempo que requiere alcanzar el máximo.
de trombina endógeno (ETP, ver más adelante), la altura del máximo y el tiempo que requiere alcanzar el máximo.
Una curva de generación de trombina tal como se
ha mostrado en la figura 1 se obtiene de manera clásica por
determinación del contenido de trombina en pequeñas submuestras
tomadas a cortos intervalos de sangre o plasma en coagulación. Ver
por ejemplo: R. Biggs y R. G. Mac-farlane, Human
Blood Coagulation and its Disorders ("Coagulación de sangre
humana y sus alteraciones"), Blackwell Scientific Publications,
Oxford 1953; W. Seegers, Prothombin, Harvard University Press,
Cambrige Mass. 1962. Este método requiere de manera general análisis
separado de las submuestras y permite la determinación solamente de
3-5 curvas simultáneamente mediante la ocupación
continuada de un experto de laboratorio. Requiere tanto trabajo que
impide su aplicación en la rutina clínica o farmacéutica.
El documento
EP-A-0 420 332 (equivalente a US
5.192.689) da a conocer un método para determinar la cantidad de
trombina que se ha encontrado presente en una muestra de sangre o
plasma en coagulación midiendo la cantidad de producto que se ha
generado a partir de un substrato artificial durante la coagulación.
Esta cantidad es proporcional al área situada por debajo de la
curva de generación de trombina, designada como potencial de
trombina endógeno, ETP. El método comprende la adición de un
activador de formación de trombina a una muestra de sangre o plasma
en coagulación junto con un substrato de trombina, de manera que la
cantidad y también las propiedades cinéticas de los substratos de
trombina se escogen de manera tal que la cantidad de trombina
generada en la muestra no puede consumir de forma completa dicho
substrato de trombina, produciendo por lo tanto un producto de
conversión, midiendo la cantidad de dicho producto de conversión
generado de esta manera y a partir de ello determinar el potencial
de trombina endógeno en la muestra. Este método ETP puede ser
mostrado por las reacciones siguientes:
Todas las reacciones son irreversibles y por lo
tanto la trombina se encuentra presente solamente de forma temporal
en la mezcla de reacción. Mientras la trombina se encuentra
presente, participa en la reacción 4, con el resultado de que el
grado de conversión del substrato indica el tiempo durante el cual,
y el tiempo en que, la trombina ha catalizado esta reacción.
Es esencial que la cantidad de substrato no se
deba agotar antes de que desaparezca la trombina. Para que la
cantidad de substrato convertido sea una representación exacta de la
cantidad total de actividad de trombina que se ha desarrollado, la
reacción debe ser proporcional a la concentración de trombina en
cualquier momento de tiempo. La esencia de este método ETP es que
el potencial de trombina es determinado como método de punto final
sin la determinación de la curva de trombina/tiempo como tal. En
caso de que el substrato se midiera en corto, el punto final sería
simplemente la cantidad máxima de producto formado y esta cifra no
tiene ningún significado.
Además, el método ETP es llevado a cabo en la
práctica real con una sustancia cromogénica, es decir, substratos
con un grupo cromofórico cedente que es detectado a través de la
medición de densidad óptica. El fibrinógeno y como consecuencia las
plaquetas de la sangre tienen que ser eliminados del plasma porque
la turbidez que se genera de la conversión
fibrinógeno-fibrina por la trombina hacen imposible
otras mediciones. No obstante el fibrinógeno y las plaquetas son
componentes esenciales del sistema de coagulación que influyen en el
desarrollo de la formación de trombina. Esto pone un serio límite
en la aplicabilidad de la densidad óptica como método de detección.
Por lo tanto la evaluación del ETP en el plasma conteniendo
plaquetas y/o fibrinógeno no sería posible.
El control continuado de la concentración de
trombina se ha intentado por adición de un substrato de trombina
adecuado a la muestra en coagulación y controlando el transcurso de
tiempo de aparición del producto fraccionado amidolítico. Por
ejemplo, se utiliza un substrato cromogénico y se mide la densidad
óptica a efectos de controlar el desarrollo de
p-nitroanilina (Hemker HC, S. Wielders, H. Kessels,
S. Béguin: Thromb Haemost. (1993)
70(4):617-24; Hemker HC, and S. Béguin:
Thromb Haemost. (1995) 74(1):134-8). Si la
velocidad de reacción en esta prueba es dependiente de la
concentración de trombina solamente y si la señal fuera proporcional
a la cantidad de producto, entonces la pendiente de la curva del
producto sería proporcional a la cantidad de trombina presente, de
manera que la curva de generación de trombina se puede obtener a
partir del primer derivado de la curva de producto si se conoce la
constante de proporcionalidad (Kc).
No obstante, en la practica la velocidad de
reacción "not" depende de la concentración de trombinas
solamente, la señal "not" no es necesariamente proporcional a
la cantidad de producto y Kc es desconocido. Las razones son las
siguientes:
- A:
- Consumo del substrato: La señal depende no solamente de la actividad de trombina en la muestra, sino también de la cantidad de substrato que, a través de la propia actividad de la enzima, disminuye en el tiempo. El efecto puede ser atenuado añadiendo un exceso de substrato pero solamente hasta un cierto límite. El substrato se une de forma reversible al centro activo de trombina y por lo tanto protege la trombina contra la inactivación por antitrombinas naturales. Abolir el efecto de consumo de substrato hasta un grado aceptable tiene como resultado la prolongación del experimento para que dure unas dos horas. (Cuanto más substrato se añade más moléculas de enzima quedan ocupadas y no son disponibles para los procesos de inactivación natural. Esto prolonga la duración del experimento. A 1 x Km el experimento se termina en 30 minutos, a 5 Km se obtiene la independencia práctica del consumo de substrato pero el experimento dura 90 minutos). Asimismo, para estas concentraciones de substrato la inhibición de la trombina interfiere con reacciones de realimentación y no queda garantizado que se mida el proceso natural. Esta es también la razón por la que, en un método destinado a evaluar el área situada por debajo de la curva de la cantidad total de substrato convertido, se tiene que añadir un exceso de substrato de manera tal que la antitrombina adicional necesita ser añadida a efectos de hacer el experimento prácticamente posible (ver EP-A-0 420 332, que se explica más adelante).
- B:
- Tienen lugar cambios en la densidad óptica por coagulación de la muestra de plasma. La utilización de substratos cromogénicos implican la eliminación de fibrinógeno y como consecuencia plaquetas de la sangre que provocan incrementos extraños de OD por la dispersión de luz en el momento de la coagulación. No obstante el fibrinógeno y las plaquetas son componentes esenciales del sistema de coagulación que influye en el desarrollo de la formación de trombina (ver lo anterior). Esto pone un serio límite a la aplicabilidad de densidad óptica como método de detección. Este problema puede ser obviado utilizando un substrato que da lugar a un producto fluorescente [H.C. Hemker y otros. The thrombogram: monitoring thrombin generation in platelet rich plasma. ("Trombograma: control de la generación de trombina en un plasma rico en plaquetas") Thromb Haemost.83:589-91 (2000)]. Esto, no obstante, introduce el problema siguiente:
- C:
- En mediciones de fluorescencia la señal no se relaciona de forma lineal con la cantidad de producto. De forma notable, la señal fluorescente no depende de forma lineal de la concentración de producto fluorescente porque las moléculas fluorescentes absorben la luz de otras moléculas de producto, es decir, el llamado "efecto de filtro interno". Con productos fluorescentes, el incremento de las concentraciones en substrato a varias veces Km, tal como se requiere para limitar el efecto de consumo de substrato, incrementa también de forma automática el efecto de filtro interno.
\newpage
El problema A es común en todos los métodos
continuos. El problema B puede ser obviado utilizando un substrato
fluorogénico pero introduce el problema C.
- D:
- Incluso en el caso en que no existiera los problemas A, B y C, subsiste la cuestión de relacionar la velocidad de reacción a la concentración de trombina, es decir, determinar la constante de calibrado Kc. Esta relación varía de una a otra implementación experimental (por ejemplo es diferente en fluorómetros distintos) y de una muestra a otra (por ejemplo debido a variaciones en color del plasma). La adición de una cantidad estándar conocida de trombina a la muestra resulta imposible porque la enzima añadida alterará las reacciones fisiológicas. Asimismo resulta imposible añadir trombina a una muestra paralela no coagulante porque será inactivada en el plasma.
La presente invención está destinada a obviar
estos inconvenientes al dar a conocer un método que se refiere a la
determinación de la trombina en una muestra de plasma o sangre que
es esencialmente distinto del método ETP que se ha indicado
anteriormente, por el hecho de que no se hace determinación de punto
final de la cantidad de producto, sino del desarrollo de la curva
de concentración de trombina en tiempo real que es determinada y
que se considera como señal continua, proporcionando de esta manera
una información más valiosa y exacta con respecto a los parámetros
de retardo de tiempo y altura del máximo. Este último es más
importante para la medición de diferencias sutiles en la actividad
del mecanismo de coagulación tal como se indicará esquemáticamente
a continuación. En otras palabras, el nuevo método no proporciona un
valor único de la cantidad de trombina que se ha encontrado
presente en una muestra, tal como en el método ETP, sino que en vez
de ello proporciona el desarrollo de la concentración de trombina
en tiempo real que se encuentra transitoriamente presente en la
muestra.
Se ha descubierto de manera sorprendente que los
inconvenientes anteriormente indicados pueden ser convenientemente
obviados midiendo la concentración de trombina en plasma en
coagulación, con o sin plaquetas, controlando la división de un
sustrato de señal adecuado y comparándolo con una actividad de
trombina constante conocida en una muestra paralela.
Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la
presente invención, se da a conocer un método para determinar en
tiempo real el desarrollo de la actividad proteolítica, siendo dicha
actividad proteolítica sustancialmente la trombina, en una primera
muestra biológica que aparece y desaparece de la muestra,
comprendiendo las siguientes etapas:
- a)
- añadir un activador de proteasa a dicha primera muestra para generar actividad proteolítica;
- b)
- añadir un sustrato de señal a la etapa a), provocando dicho sustrato de señal una señal detectable relacionada con la cantidad de producto de conversión formado en la reacción por la actividad de proteolítica generada;
- c)
- añadir un medio con una actividad proteolítica estable constante, conocida, sobre el sustrato de señal tal como se define en la etapa b) pero que por lo demás es inerte, a una segunda muestra en paralelo en la que no se ha generado actividad proteolítica, de manera que los medios con una actividad proteolítica estable conocida y constante son seleccionados entre el grupo que consiste en el complejo \alpha_{2}-macroglobulina-trombina, complejo estafilocoagulasa-protrombina y trombina gamma;
- d)
- añadir el mismo sustrato de señal que se ha definido en la etapa b) a la etapa c), provocando dicho sustrato de señal una señal detectable cuando tiene lugar la reacción por medio de la actividad proteolítica estable conocida;
- e)
- determinar la variación en el tiempo del desarrollo de señal en dicha primera muestra y dicha segunda muestra en paralelo para conseguir la curva de cada una de ellas;
- f)
- comparar dichas curvas para derivar el desarrollo de la actividad proteolítica en el tiempo en la primera muestra.
En una realización preferente de la presente
invención se da a conocer un método para determinar en tiempo real
el desarrollo de la actividad proteolítica, cuya actividad
proteolítica es sustancialmente la actividad de trombina en una
primera muestra de sangre o plasma tal como aparece y desaparece de
la muestra, que comprende las siguientes etapas:
- a)
- añadir un activador de formación de trombina a dicha primera muestra para formar trombina;
- b)
- añadir un sustrato de señal a la etapa a), cuyo sustrato de señal provoca una señal detectable relacionada con la cantidad de producto de conversión formado en la reacción por la trombina formada,
- c)
- añadir un medio con una actividad de trombina estable, conocida y constante, al sustrato de señal tal como se ha definido en la etapa b) pero que por lo demás es inerte, a una segunda muestra en paralelo en la que no se ha generado actividad de trombina;
- d)
- añadir el mismo sustrato de señal que se ha definido en la etapa b) a la etapa c), provocando dicho sustrato de señal una señal detectable cuando tiene lugar la reacción por medio de una actividad de trombina estable y conocida,
- e)
- determinar el desarrollo temporal de la señal en dicha primera muestra y dicha segunda muestra en paralelo para proporcionar una curva de cada una de ellas;
- f)
- comparar dichas curvas para derivar el curso de la actividad de trombina en el tiempo en la primera muestra.
La primera muestra biológica es seleccionada
habitualmente entre sangre, plasma que comprende plasma rico en
plaquetas, pobre en plaquetas o libre de plaquetas, saliva, suero,
orina, fluido cerebroespinal, esperma y heces.
Cuando se lleva a cabo el método de la invención
en muestras de sangre, la sangre es recogida habitualmente en tubos
que contienen citrato sódico o EDTA o similares, de manera que los
iones calcio libres en la sangre son unidos y se impide la
formación de trombina y la coagulación. Por lo tanto, a efectos de
iniciar la generación de trombina se debe añadir calcio poco antes
del inicio de la medición. No obstante, en el caso en que la sangre
no es recogida en citrato sódico o similares, esta adición de calcio
puede no ser necesaria. Por ejemplo, cuando el método es utilizado
de forma que hace posible poner en marcha el experimento dentro de
unos minutos después de la toma de
sangre.
sangre.
La actividad proteolítica a determinar se
selecciona usualmente entre el grupo de actividad aumentada del
factor de coagulación, incluyendo trombina, actividad de factor
fibrinolítico aumentada y componente activado de la actividad de
sistema de complemento. La determinación del desarrollo de la
actividad de trombina en tiempo real a partir de una muestra de
sangre o de plasma de acuerdo con el método de la presente
invención, es una realización preferente.
El sustrato de señal utilizado en el presente
método es seleccionado preferentemente entre el grupo de compuestos
que comprenden un grupo cedente, proporcionando dicho grupo cedente
un producto de conversión detectable en la reacción por la enzima
proteolítica formada. Este producto de conversión es determinado
habitualmente por espectroscopia, en particular fluorescencia
(preferente), densidad óptica y NMR. De acuerdo con ello dicho
grupo cedente es normalmente un grupo fluorescente, un grupo
cromofórico, un grupo de iones generadores de hidrógeno o
similares. Un sustrato de señal adecuado y preferente para llevar a
cabo el método de la presente invención es
Z-Gly-Arg-AMC.
Además, los productos de conversión detectables apropiados incluyen
p-nitroanilida y
7-amino-4-metil-coumarina.
Se incluyen entre los medios adecuados para una
actividad proteolítica estable conocida constante para llevar a
cabo el método de la presente invención, tal como se ha definido
anteriormente, el complejo
\alpha_{2}-macroglobulintrombina (preferente),
complejo estafilocoagulasa-protrombina y gamma
trombina. Además, se puede utilizar cualquier enzima proteolítica
que es modificada en sus lugares de reconocimiento secundarios por
el hecho de que su centro activo permanece intacto pero su
interacción funcional con las proteínas de la mezcla de reacción
queda suprimida.
Se incluyen entre los activadotes útiles de
proteasa para llevar a cabo el presente método los iones calcio,
fosfolípidos, factor de tejido, factor de tejido soluble,
tromboplastina, caolín y ácido elágico.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, dicha primera muestra biológica comprende además un
agente farmacéutico a comprobar en cuanto a su influencia sobre el
sistema proteolítico en estudio, tal como el sistema
hemostático-trombótico. Son agentes farmacéuticos
adecuados que pueden ser comprobados en el presente método los
agentes antitrombóticos, tales como agentes antiplaquetas y agentes
anticoagulantes, por ejemplo heparina, sulfato de dermatán, un
inhibidor directo de trombina, por ejemplo hirudina, argatroban o
melagatrán, y un inhibidor de factor Xa, por ejemplo una proteína
anticoagulante densa.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención se da a conocer un equipo para llevar a cabo el método de
determinación en tiempo real del transcurso de la actividad
proteolítica, en particular actividad de trombina, tal como se ha
definido anteriormente. Este equipo comprende convenientemente uno o
varios de los componentes siguientes en contenedores adecuados u
otros medios de envasado convencional:
- -
- un complejo de concentración conocida de a_{2}M-trombina,
- -
- un reactivo PRP para plasma rico en plaquetas para iniciar la reacción de coagulación.
- -
- Un reactivo PPP para un plasma libre de plaquetas o pobre en plaquetas para iniciar la reacción de coagulación.
- -
- Un aditivo que facilita el diagnóstico del desarrollo de la actividad de trombina, en particular cuando ocurren anormalidades específicas del sistema hemostático-trombótico o se esperan éstas. Son aditivos adecuados, por ejemplo, trombomodulina o proteína C activada, que son útiles entre otros para el diagnóstico del factor V de Leiden o medicamentos específicos antitrombóticos o antiplaquetas.
- -
- Un reactivo que contiene un sustrato de señal.
- -
- Un programa de software que se puede cargar directamente en la memoria de un ordenador para el cálculo de la curva de la actividad de trombina determinada por un método definido anteriormente cuando dicho programa es activado en un ordenador.
- -
- Un manual de instrucciones.
El equipo puede comprender de manera adecuada
reactivos liofilizados.
Estos y otros objetivos de la presente invención
serán explicados a continuación de manera más detallada.
La figura 1 es una curva de generación de
trombina que muestra un desarrollo típico de la formación de
trombina en sangre o plasma en coagulación, determinada por
submuestreo.
La figura 2 muestra la generación de señal
fluorescente cuando tiene lugar la adición de trombina (línea de
símbolo inferior) y
\alpha_{2}-macroglobulina-trombina
(línea continua) en plasma caliente o en un tampón (línea de
símbolo superior) que contiene un sustrato fluorogénico.
La figura 3 muestra las señales de fluorescencia
originales en dos muestras idénticas de plasma a las que se ha
añadido la misma concentración de sustancia fluorogénica. En una
muestra se añadió un activador de generación de trombina resultando
en generación de trombina. En otra muestra se añadió un complejo de
concentración conocida de
\alpha_{2}-macroglobulina-trombina
que resultó en una actividad amidolítica estable.
Línea gruesa: señal de la muestra en la que se
activó la generación de trombina.
Línea delgada: señal de la muestra en la que se
añadió el complejo de
\alpha2-macroglobulina-trombina.
La figura 4 muestra los primeros derivados de
las señales de la figura 1.
Línea gruesa: dFU/dt de la muestra en la tuvo
lugar la generación de trombina.
Línea delgada: dFU/dt de la muestra en la que se
ha añadido la concentración conocida del complejo
a_{2}-macroglobulina-trombina.
Figura 5 muestra dos curvas de generación de
trombina en plasma. Línea gruesa: concentración de trombina a lo
largo del tiempo que no ha sido corregida por el consumo de sustrato
o del efecto de filtro interno, y línea de símbolo: concentración
de trombina en el tiempo después de corrección por el consumo de
sustrato y efecto de filtro interno. En ambos casos, la
concentración de trombina se determinó a partir de la velocidad
inicial de conversión del sustrato fluorogénico por una actividad
conocida del complejo
\alpha_{2}-macroglobulina-trombina
en el plasma.
La figura 6 muestra los límites medio y de
confianza de las señales de 24 determinaciones simultáneas de
generación de trombina. La curva A muestra el plasma normal y la
curva B muestra plasma normal del que se ha eliminado el
fibrinógeno.
La figura 7 muestra las curvas de trombina de
tres individuos medidas simultáneamente por cuádruplo cada una de
ellas.
La figura 8 muestra las curvas a partir del PRP
de un individuo, medidas en cuádruplo en seis días distintos.
La figura 9 muestra las curvas de generación de
trombina en plasma rico en plaquetas de un donante sano y en el
mismo plasma tratado con un inhibidor de activación de plaquetas,
respectivamente.
El término "transitoriamente activo" que se
utiliza en relación con las enzimas proteolíticas que tienen lugar
en una muestra de sangre o plasma se refiere al hecho de que la
actividad enzimática, una vez que el proceso fisiológico se ha
empezado por medio de las técnicas conocidas, se produce en primer
lugar y a continuación disminuye nuevamente a actividad (casi) cero
al final.
El término "medio biológico compuesto" que
se utiliza en esta descripción se refiere al plasma, plasma con
células de sangre o sangre completa o cualquier otro fluido de
origen corporal u otro, en el que tiene lugar el proceso biológico
de activación e inactivación de enzimas.
El término "tiempo real" utilizado en esta
descripción está destinado a indicar que el desarrollo de la
concentración de enzima en el medio es mostrado simultáneamente con
la activación e inactivación biológica de la muestra que tiene
lugar en el recipiente de reacción.
El término "tiempo de retardo" utilizado en
esta descripción está destinado a indicar el tiempo necesario antes
de que se inicie realmente la formación de trombina.
Tal como se utiliza en esta descripción, el
término "altura del máximo" significa la actividad máxima de
trombina que se ha alcanzado.
El término "pendiente de la parte
ascendente" utilizado en esta descripción tiene como significado
la velocidad de incremento de la concentración de trombina antes de
alcanzar el pico o máximo.
El término "tiempo hasta el máximo"
utilizado en esta descripción significa el tiempo entre el inicio de
la reacción y el momento en el que se alcanza el pico o máxima.
El término "ETP" utilizado en esta
descripción significa la integral de tiempo de la curva hasta el
momento en que se obtiene la actividad de trombina (casi) cero.
Tal como se utiliza en esta descripción el
término "sustrato de señal" significa un sustrato que es
fraccionado por la enzima o enzimas proteolíticas presentes en el
medio, del que se segrega un grupo cedente que es detectable por
métodos ópticos, la NMR u otros. Grupos cedentes óptimamente
detectables son, por ejemplo, p-nitroanilida y
7-amido-4-metil-coumarina.
La p-nitroanilida absorbe una radiación de 405 nm y
la
7-amido-4-metil-coumarina
es fluorescente (excitación a 390 nm y emisión a 460 nm). Son
ejemplos de grupos cedentes activos en NMR los que contienen
^{31}P, ^{13}C, o cualquier otro átomo que puede ser detectado
mediante NMR o técnica similar. También se pueden utilizar iones
H^{+} como grupo cedente, que se puede detectar por medición de
cambios en el pH.
A continuación se facilitará una descripción
típica del sistema hemostático y trombótico (HTS) para la práctica
de la presente invención con énfasis en su enzima más importante, la
trombina. Se debe observar, no obstante, que la presente invención
se refiere también a otras enzimas y a otros sistemas fisiológicos
tales como otras enzimas proteolíticas activadas (factores) del
sistema de coagulación en sangre y plasma, componentes de plasmina
y otros componentes activados del sistema fibrinolítico en sangre y
plasma, factores de complemento activado en sangre y plasma,
pepsina en el jugo gástrico, tripsina y quimiotripsina en el jugo
del duodeno y similares.
Tal como se ha indicado anteriormente, en
general las actividades enzimáticas transitorias pueden ser medidas
añadiendo un sustrato que, después de la conversión, produce una
señal. Utilizando un sustrato fluorogénico en el presente sector
este método comprendería de manera típica la adición de un sustrato
fluorogénico a la sangre (u otra muestra biológica) en el que se ha
iniciado la generación de trombina (utilizando un método conocido
en esta técnica). Después del fraccionamiento del sustrato se
formaría un producto fluorescente que se puede medir para las
longitudes de onda apropiadas de excitación y de emisión.
Usualmente, en casos similares esto se puede
conseguir añadiendo, en una segunda muestra completamente
comparable, una cantidad fija de la misma enzima de sustrato de
actividad conocida, designada también en este caso como
"calibrador", y comparando la actividad conocida en tiempo real
con la actividad de la muestra investigada. No obstante, en el
presente caso, a causa de su inestabilidad en el plasma y
subsiguiente desaparición en el mismo, no es posible utilizar la
trombina como calibrador. Asimismo, inmediatamente después de la
adición de trombina, tiene lugar la formación de coágulos lo cual
impide una mezcla apropiada de reactivos e induce resultados
erráticos.
erráticos.
Aparte de los problemas anteriormente
mencionados, las unidades en el eje Y seguirían siendo arbitrarias,
no obstante, y variando con el avance del experimento dado que el
incremento de la concentración de producto de conversión, a través
del llamado efecto de filtro interno, junto con la disminución
simultánea del sustrato disponible modificaría la relación entre la
concentración de trombina y la velocidad de producción de señal.
Además, los experimentos se tienen que llevar a cabo en sangre o
plasma que, de forma dependiente del donante, influirían en la
señal por la absorción de luz y la desaparición de la
fluorescencia.
Por lo tanto, cada una de las muestras de cada
uno de los donantes debería ser medida de manera tal que las
unidades arbitrarias pudieran ser atribuidas en el eje Y, en tiempo
real, a una cantidad válida de actividad de trombina, expresada
como concentración de trombina en unidades molares.
La presente invención se basa en el
descubrimiento sorprendente de que ciertas sustancias muestran una
actividad similar a trombina constante que puede ser utilizada de
manera adecuada para asignar valores absolutos (nM) a las primeras
derivadas de las señales obtenidas a partir de moléculas que son
escindidas por trombina al desarrollarse y desaparecen del plasma
en coagulación. Una sustancia adecuada y especialmente preferente
es el complejo irreversible de
\alpha_{2}-macroglobulina (indicado asimismo en
este caso como \alpha_{2}-M o a_{2}M) y
trombina o, alternativamente, el complejo de estafilocoagulasa y
protrombina.
Si la actividad de la trombina es controlada en
una muestra, por ejemplo con intermedio de su acción amidolítica
que produce una molécula fluorescente, la señal obtenida no puede
ser relacionada directamente con la actividad de trombina presente
por varias razones. La relación entre la cantidad de producto
fluorescente formado por unidad de tiempo y el incremento de la
señal fluorescente depende del instrumento, de las características
de absorción de la luz de la muestra y de la cantidad de producto ya
presente en la muestra (el llamado efecto de filtro interno). La
relación entre la cantidad de trombina y la cantidad de producto
fluorescente depende de la cantidad de sustrato ya consumido.
Aunque existe una relación directa entre la formación de producto a
lo largo del tiempo (dP/dt) y la actividad de trombina, depende del
instrumento y de la muestra y cambiará durante el experimento.
Es la propia característica del sistema de
coagulación el que la trombina aparece y desaparece después de
poner en marcha el sistema. Cambios patológicos en las tasas de
aparición y de desaparición provocan enfermedades graves. Por lo
tanto, la tasa de desaparición de la trombina en una muestra es una
variable biológica importante que se debe dejar intacta en la
muestra a investigar. Esta misma característica hace imposible
obtener un preparado de trombina con actividad constante en el
plasma que se puede utilizar como calibrador para asignar un valor
absoluto a la actividad de trombina.
Es un elemento esencial de la presente invención
que el instrumento, muestra y dependencia del tiempo se eviten por
la comparación de la señal procedente del plasma en coagulación con
respecto a un medio con actividad similar a trombina constante. Se
observó que el complejo de
\alpha_{2}-macroglobulina-trombina
tiene las características deseadas para ser un medio excelente
proporcionando una actividad similar a trombina constante que se
puede determinar fácilmente por un técnico en la materia. La unión
de la trombina a la \alpha_{2}-macroglobulina
hace la trombina inmune a los inactivadores naturales presentes en
el plasma, pero deja intacta su capacidad de dividir pequeños
sustratos que después de la escisión liberan una molécula con
características de absorción de luz, de fluorescencia, u otras
características portadoras de señal. Dado que la
\alpha_{2}-macroglobulina es capaz de unión con
una gran variedad de enzimas proteolíticas, también se puede
utilizar para preparar calibradores para otras enzimas
proteolíticas (por ejemplo, factor X de coagulación activado,
plasmina, tripsis, pepsina, factor 3 de complemento). Tal como se
ha mencionado, el complejo de estafilocoagulasa y protrombina se
observó que poseía características similares por el hecho de que
puede proporcionar también una actividad constante similar a la
trombina que no es sensible a inhibidores plasmáticos, y por lo
tanto se puede aplicar como sistema calibrador alternativo para las
otras enzimas
proteolíticas.
proteolíticas.
El método según la presente invención comprende
la división de una muestra de sangre o plasma en dos partes, o la
utilización simplemente de dos muestras sustancialmente idénticas,
añadiendo a ambas partes un sustrato que, por unidad de tiempo,
produce una señal detectable en una cantidad que guarda relación con
la actividad de trombina presente. En una muestra la generación de
trombina (es decir, la coagulación) es iniciada por un método
conocido en la técnica. A la otra muestra se añade un preparado con
actividad de trombina determinada de manera independiente e
invariable, preferentemente el complejo
\alpha_{2}-macroglobulina-trombina,
que se ha mencionado anteriormente. La formación de producto se
mide en las dos muestras preferentemente al mismo tiempo. La
cantidad molar exacta de trombina presente en cualquier momento en
la muestra de coagulación se obtiene por comparación de la señal
procedente de la muestra con la señal medida simultáneamente desde
la muestra a la que se ha añadido el preparado con actividad de
trombina conocida e invariable, pero en la que no se ha iniciado la
formación de trombina.
Además del complejo
\alpha_{2}-macroglobulina-trombina,
una enzima alternativa con la actividad amidolítica pero no la
actividad fisiológica de la trombina es la estafilocoagulasa
producida por la bacteria Staphylococcus aureus. Esta enzima
es capaz de unirse a la protrombina presente en el plasma. El
complejo estafilocoagulasa-protrombina es capaz de
convertir pequeños sustratos de trombina sin ser inhibida por AT.
Por ejemplo, la estafilocoagulasa,
estafilocoagulasa-protrombina o complejos de
\alpha_{2}-M trombina son añadidos a una muestra
de pruebas en una cantidad usualmente comprendida entre 5 y 1000
nanomoles por litro, preferentemente unos 100 nanomoles por
litro.
Las curvas producidas por el método de la
presente invención se caracterizan por parámetros tales como tiempo
de retardo, área por debajo de la curva, altura máxima, inclinación
de la pendiente de ascenso, tiempo hasta el máximo y además todos
los parámetros de una curva que se parece a la función matemática
T=a.t
\circun{1} b.exp-ct (empezando
después del tiempo de retardo). La concentración de trombina
típicamente empieza en cero, se eleva hasta una altura máxima que
es usualmente un valor comprendido entre 50 y 500 nanomolar y que
vuelve otra vez a cero. El tiempo de retardo es usualmente un valor
entre cero y 20 minutos y se termina tan pronto como la
concentración de trombina es aproximadamente superior a 10
nanomolar. En este momento aparece también la formación de un
coágulo, mientras que el máximo tiene lugar unos pocos minutos más
tarde. Los parámetros de la curva de generación de trombina,
denominada también como Thrombogram®, marca registrada de Synapse
B.V., que se describen en esta descripción son parámetros
compuestos que reciben la influencia de un conjunto grande de
concentraciones y constantes de reacción de los factores de
coagulación que interaccionan. Reflejan todas las variaciones de
estas variables que influyen en la función del sistema trombótico
hemostático, tal como tienen lugar en un medio clínico, terapéutico
o de otro tipo. Todos los antitrombóticos y todas las enfermedades
relativas al sistema trombótico hemostático que se han medido hasta
el momento tienen su influencia sobre estos parámetros. Durante el
tratamiento antitrombótico o desórdenes de la coagulación
hemostática de cualquier tipo, los tiempos de retardo y los valores
del tiempo hasta el máximo habitualmente se incrementan, y la altura
del máximo y el área por debajo de la curva habitualmente
disminuyen. Por otra parte, en estados hipercoagulables estos
parámetros se desplazan en dirección opuesta. De este modo, el
Thrombogram refleja realmente la capacidad de coagulación de la
sangre y proporciona una indicación sobre el riesgo trombótico o
hemostático.
La presente invención se refiere además a un
equipo para llevar a cabo el método de la presente invención tal
como se ha descrito, y también a un equipo para llevar a cabo de
forma rutinaria la determinación del método de la invención y para
facilitar una fuente de componentes de prueba en cantidad importante
para facilitar el funcionamiento de aparatos automatizados que
pueden procesar grandes cantidades de muestras de pruebas.
En una realización preferente el equipo de
pruebas comprende de manera adecuada:
- 1.
- Un "calibrador" de trombina que consiste en una concentración conocida del complejo \alpha_{2}-macroglobulina-trombina, opcionalmente en forma liofilizada;
- 2.
- Un reactivo PRP que está destinado para plasma rico en plaquetas y que contiene un iniciador para empezar la reacción de coagulación, habitualmente tromboplastina o factor de tejidos relipidado recombinante o factor de tejido soluble opcionalmente en forma liofilizada. De manera alternativa, puede comprender un iniciador que activa el sistema intrínseco, tal como ácido elágico o caolín.
- 3.
- Un reactivo PPP que se ha destinado a plasma pobre en plaquetas o libre de plaquetas que contiene vesículas de fosfolípido en combinación con tromboplastina o factor de tejidos relipidados recombinante o factor de tejidos soluble, opcionalmente en forma liofilizada. De forma alternativa, puede contener un iniciador que activa el sistema intrínseco tal como ácido elágico o caolín.
- 4.
- Un reactivo que contiene compuestos de reactivos PPP o PRP además de compuestos específicos que hacen el Thrombogram más sensible a anormalidades específicas del sistema de coagulación. Por ejemplo, reactivo PPP sin fosfolípido haría que el Thrombogram fuera sensible a las micropartículas presentes en el plasma. Reactivo PPP o PRP al que se añade trombomodulina o proteína C activada (APC) haría el Thrombogram más sensible a todos los desórdenes del sistema anticoagulante natural conocido como sistema de proteína C. El reactivo PPP o PRP al que se ha añadido proteína C activada (APC) haría el Thrombogram sensible al factor V de Leiden u otras formas congénitas o adquiridas de la llamada resistencia APC del factor V y/o factor VIII. El reactivo PRP o PPP sin factor de tejidos haría el Thrombogram sensible a la presencia de actividad de falta de tejidos endógenos presente en la muestra (ver Giesen y otros, Proc Natl Acad Sci USA 1999 96(5):2311-5.).
- 5.
- Un reactivo que contiene un sustrato de señal, tal como Z-Gly-Gly-Arg-AMC, y usualmente también iones calcio.
- 6.
- Un programa de software para facilitar el cálculo de las correcciones que están incluidas en el presente método para obtener la concentración de trombina a lo largo del tiempo. Un programa de software adecuado que está diseñado especialmente para llevar a cabo el método de la presente invención y diseñado con la Marca Thrombinoscope® se puede conseguir de la sociedad solicitante Synapse B.V. a la que se puede contactar por la página Web www.thrombin.com o por email info@thrombin.com.
- 7.
- Un manual con instrucciones de la forma en la que se tiene que utilizar el equipo puede formar parte también del equipo de pruebas.
La diferencia entre reactivo PPP y PRP consiste
en el contenido de fosfolípidos, que debe ser bajo en el caso de PRP
a efectos de tener capacidad de medir la contribución de plaquetas
en la formación de trombina.
El equipo de pruebas es utilizado de forma
conveniente del modo siguiente: A 80 microlitros de PPP se añaden
20 microlitros de reactivo PPP y a otra muestra de 80 \muL del
mismo plasma se añaden 20 \muL de calibrador de trombina. A
continuación 20 microlitros de una mezcla de sustrato fluorogénico y
de calcio se añaden a ambas muestras y la reacción es seguida en un
fluorómetro.
Se comprenderá por los técnicos en la materia
que el método y equipo de la presente invención no quedan limitados
en la utilización con sustratos fluorogénicos, sino que se pueden
aplicar potencialmente a otros métodos de ensayo cromogénicos, NMR,
quimioluminiscentes y otros métodos de ensayo similares. No
obstante, los sustratos fluorogénicos son habitualmente la elección
preferente, puesto que en contraste con cualesquiera otros métodos
adecuados se pueden realizar evaluaciones de la presencia de
fibrina, y por lo tanto se mide también la trombina de la fibrina.
Además, se puede evitar la defribinación que es frecuentemente
engorrosa, resultando en un método más simple y más fiable que
puede ser llevado a cabo de manera fácil en una clínica. Además, el
presente método utilizando un sustrato fluorogénico permite
evaluaciones de trombina en presencia de plaquetas (tal como es
bien conocido en esta técnica, la fibrina es necesaria para la
activación de las plaquetas), y por lo tanto se pueden someter a
pruebas medicamentos antiplaquetas, y se pueden medir patologías de
plaquetas, posibilitando por lo tanto un tratamiento más
adecuado.
La figura 9 es un ejemplo de un experimento en
el que un plasma rico en plaquetas de un donante sano es medido,
así como el mismo plasma tratado con un inhibidor conocido de
activación de plaquetas (ReoPro®). Las dos curvas tienen forma
diferente, lo cual es evidente de un TTP más largo y una altura
máxima más reducida, pero el área por debajo de la curva en ambas
curvas es idéntica dentro de 3%. Este efecto en la altura del pico o
máximo y TTP en ausencia de un efecto claro en el ETP se aprecia
también en muchas deficiencias de factor de coagulación suaves,
tales como la enfermedad de Willebrand, deficiencias del factor VII
o del factor V y en el factor VIII o IX (hemofilia). En muchos
casos la altura máxima y el TTP se ha demostrado que son parámetros
mucho más sensibles de la curva de generación de trombina que el ETP
solo.
El método, según la presente invención, puede
ser utilizado de manera adecuada para diagnosticar estados hiper- e
hipocoagubles, bien sean congénitos, adquiridos o inducidos por
medicamentos en humanos y animales y, por lo tanto, para controlar
la terapia profiláctica o terapéutica con antitrombóticos y, en
general, todos los medicamentos que influyan en la función del
sistema de coagulación y todos los estados de enfermedad
caracterizados por una función defectuosa de este sistema.
La invención se ilustrará a continuación por los
siguientes ejemplos que no se deben considerar como limitadores del
ámbito de la invención en ningún aspecto.
Se prepara \alpha_{2}-macroglobulina
(\alpha_{2}M) en bruto, de acuerdo con Barrett. A.J., Alfa
2-macroglobulina, Methods Enzymol.
(1981)80(Pt C)p. 737-54. El
material es aislado de plasma bovino citrado. El procedimiento es
seguido hasta la precipitación de \alpha_{2}M en 12%
(peso/volumen) PEG-20.000. La pastilla es disuelta
en 100 mM NaCl, 20 mM HEPES (pH 7,9) y utilizada para preparar
complejo de \alpha_{2}M-trombina
(\alpha_{2}M-T).
Al \alpha_{2}M se añade 12 \muM de
protrombina bovina, 6 mM CaCl_{2}, 50 \muM de vesícula de
fosfolípido (20% de fosfatidil serina de cerebro, 80% de fosfatidil
colina de yema de huevo), 5 nM de factor bovino Xa y 0,78 nM de
factor bovino Va. Esta mezcla es agitada durante 30 minutos a
temperatura ambiente y, a continuación, se mantiene durante una
noche a 4ºC. Los coágulos formados son retirados y la preparación es
dividida en cantidades adecuadas para purificación por filtración
de gel (cromatografía de exclusión de tamaño), es decir, en
cantidades de 40 ml en el presente caso. La preparación se puede
congelar a \sim80ºC hasta proceso posterior.
Se aplican 40 ml de
\alpha_{2}M-T a una columna de Sephacryl (20
cm^{2} x 90 cm) que es equilibrada con 100 mM de citrato sódico.
20 mM HEPES (pH 7,4), 0,02% NaN_{3}. La columna se hace funcionar
con tampón de equilibrado con 0,7 ml/min por 700 ml y a
continuación con 3 ml/minuto. Las fracciones con volumen de
retención de 774-846 ml contienen
\alpha_{2}M-T. El material se eluye en forma de
un pico agudo.
La concentración de
\alpha_{2}M-T se mide por su capacidad de
hidrolizar el sustrato cromogénico S2238. La capacidad de
hidrolizar un sustrato cromogénico se llama actividad amidolítica.
La actividad amidolítica de la preparación es ajustada a la misma
actividad de 600 nM de trombina humana y, a continuación, se añaden
100 nM de antitrombina bobina y 2 U/ml de heparina (LEO). El
material se encuentra listo en este momento para su utilización
como calibrador de trombina. En caso deseado el material puede ser
liofilizado en cantidades adecuadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se añade trombina al plasma, su actividad
disminuye inmediatamente debido a los inhibidores naturales de la
trombina presente en el plasma. Por otra parte, la misma actividad
de \alpha_{2}M-trombina resulta en una línea
que se curva debido a agotamiento del sustrato y a efecto de filtro
interno solamente. La figura 1 muestra la señal fluorescente medida
en el pocillo de una placa de 96 pocillos a la que se ha añadido
trombina (100 mM) o un complejo
\alpha_{2}M-trombina, además del sustrato
fluorogénico
Z-Gly-Gly-Arg-AMC
(0,417 \muM que se puede conseguir de BACHEM, catálogo #
1-1140). Se puede apreciar que en contraste con el
complejo \alpha_{2}M-trombina (línea gruesa),
la actividad de la curva de trombina (símbolos) disminuye de manera
rápida. En tampón (20 mM Hepes, 140 mM NaCl, 5 g/l suero albúmina
bovina (BSA) pH 7,35) estos dos preparados tienen idéntica actividad
(línea delgada y símbolos) y se observa también que el rendimiento
fluorescente en el tampón es más elevado que en el plasma. Esto es
debido a que el color del plasma difiere de manera considerable con
respecto al tampón. Incluso las variaciones donante a donante en el
color del plasma pueden proporcionar diferencias considerables en
la cantidad de señal. Esto destaca la necesidad de comparar siempre
la actividad de trombina en el plasma de un donante específico con
la actividad de un calibrador conocido en plasma del mismo
donante.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determina la actividad amidolítica del
calibrador por comparación de su actividad con una cantidad conocida
de trombina humana. La concentración de esta trombina humana es
determinada por titulación activa en el lugar. La trombina se deja
interaccionar con un sustrato que reacciona muy rápidamente la
primera parte de la reacción catalítica, liberando un producto
cromofórico, por ejemplo, la acilación rápida de la enzima para
liberar un producto medible (por ejemplo,
p-nitroanilina), seguido de una reacción mucho más
lenta para completar la reacción de transformación. De este modo,
la generación brusca de producto es proporcional al número de
lugares activos. A partir de esta trombina se conoce de manera
exacta la actividad en número de las moléculas convertidas por
unidad de tiempo por molécula de enzima. La comparación se lleva a
cabo en condiciones que en cuanto la temperatura, pH y
concentración de sustrato son idénticas a las de un experimento real
y en un medio en el que la trombina es estable dentro de límites de
tiempo del experimento (<30 min). Esto puede ser tampón (ver lo
anteriormente indicado y figura 2) o plasma caliente, es decir,
plasma en el que los inhibidores naturales de la trombina han sido
inactivados por calentamiento (10 minutos a 70ºC).
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar, se describe un experimento en
el que se mide la generación de trombina en una muestra de plasma
rico en plaquetas. Soluciones utilizadas: Plasma humano rico en
plaquetas, obtenido tal como en Beguin, S., T. Lindhout, y H.C.
Hernker. El efecto de las cantidades de trazas de factor de tejidos
en la generación de trombina en plasma rico en plaquetas, su
inhibición por heparina. Thromb Haemost, 1989. 61(1): p.
25-9. Tampón A: 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, 5 g/l
suero albúmina bovina (BSA), pH 7,35; Tampón C: 20 mM Hepes. 140 mM
NaCl, con BSA 60 mg/mL, pH 7,35 con 0,02% de azida sódica como
conservante.
Solución FluCa: A 1750 \muL de tampón C se
añaden 200 \muL de 1 M CaCl_{2}. La mezcla es calentada a 37ºC.
A continuación 50 \muL de 100 mmoles/litro de la solución de
sustrato en DMSO son proyectados en la mezcla y el tubo es sometido
inmediatamente a vórtex para obtener una solución perfectamente
transparente que tiene 2,5 mM de sustrato, 100 mM en CaCl_{2},
2,5% en DMSO.
Un fluorómetro de placa de microtitulación
(Fluoroscan Ascent, Thermolab Systems, Helsinki, Finlandia) fue
termostatizado a 37ºC. En una placa de 96 pocillos de fondo redondo
se añadieron 20 \muL de una solución iniciadora precalentada,
consistiendo en una concentración 30 picomolar de factor de tejido
recombinante en tampón A, a un pocillo y 20 \muL de calibrador
precalentado, consistiendo en una concentración 600 nanomolar de
complejo \alpha_{2}M-trombina a otros 80 \muL
de plasma, se añadieron a cada uno de estos pocillos. El
dispensador de fluorómetro fue llenado con solución FluCa y se
inició el experimento. La figura 3 muestra las señales
fluorescentes que se derivaron. Los primeros derivados de la señal
obtenida se muestran en la figura 4.
Los primeros derivados mostrados en la figura 3
no representan realmente la curva trombina-tiempo
por tres razones: a) la relación
producto-fluorescencia no es lineal, porque las
moléculas fluorescentes absorben también luz en la longitud de onda
de medición (efecto de filtro interno), b) el sustrato se consume, y
c) se constituye
\alpha2-macroglobulina-trombina a
partir de la trombina generada en el experimento y la
\alpha2-macroglobulina normalmente presente en
cualquier plasma.
El efecto de \alpha2M-trombina
que se constituye durante el experimento es una característica común
de todas las mediciones de generación de trombina en la que la
trombina es estimada por su actividad amidolítica sobre un sustrato
de señal reducida, submuestreando y métodos continuos de modo
similar. La forma de corregir este efecto ha sido aplicada y bien
conocida para los técnicos en la materia [Hernker, H.C. y S. Beguin.
Thrombin generation in plasma: its assessment via the endogenous
thrombin potential. Thromb Haemost, 1995.74 (1):
p.134-8] ("Generación de trombina en plasma: Su
evaluación mediante el potencial endógeno de trombina").
Los efectos de alteración a y b son corregidos
por comparación continua en línea del primer derivado de la señal a
partir de la trombina generada en la muestra (O= f(t)) y el
primer derivado de la señal producida en la otra muestra por el
calibrador (S=f(t)). Éste último es de manera aceptablemente
aproximada a una línea recta que se adapta a la fórmula S = B - At.
A y B se calculan de manera continua durante el experimento a
partir de la línea recta que mejor se adapta a través de
S=f(t). Los valores corregidos (R) se obtienen mediante la
siguiente fórmula:
R(t) = B
* SQRT(((B
\circun{1} 2 - 4 * A *) * O(t))/(2 *
A)) - (B \circun{1} 2/(2 *
A))
La curva resultante R=f(t) se muestra de
manera continua durante el experimento en la pantalla de un
ordenador que lleva a cabo estos experimentos (figura 5A y B).
\vskip1.000000\baselineskip
El experimento descrito sub 4 requiere dos
pocillos en una placa de 96 pocillos. Puede ser llevado a cabo
simultáneamente en cualquier número de pocillos disponibles para
experimentos duplicados o distintos. La única exigencia es que
siempre un experimento en un plasma determinado sea acompañado por
el registro de la señal desde el calibrador en otra muestra del
mismo plasma. La figura 6 muestra los límites medio y de confianza
de las señales procedentes de 24 experimentos simultáneos. Se
aprecia que la cantidad de trombina generada en presencia de
fibrin(ógeno) es más elevada, lo que indica que el método recoge la
actividad de la trombina unida a coágulos.
La figura 7 muestra las curvas de tres
individuos distintos medidos simultáneamente cada uno de ellos de
forma cuádruple. La figura 8 muestra las curvas de un donante
individual PRP, medido de forma cuádruple en seis días
distintos.
\newpage
La presente invención ofrece un método de
pruebas conveniente para determinar en tiempo real el desarrollo de
la actividad proteolítica en una muestra biológica, en particular la
actividad de trombina en sangre o plasma, que es facilitada como
señal continua proporcionando, por lo tanto, una información más
exacta y valiosa con respecto a dichos parámetros que el tiempo de
retardo y la altura máxima, en comparación con métodos que
pertenecen al estado de la técnica, tal como el método ETP según el
cual solamente se pueden realizar determinaciones de punto final de
la cantidad de producto.
La materia de la presente descripción se
considera en todos los aspectos ilustrativa y no restrictiva, el
ámbito de la invención queda indicado por las reivindicaciones
adjuntas y todos los cambios que queden incluidos dentro del
significado y equivalencia están destinados a quedar abarcados por
las mismas.
Claims (16)
1. Método para la determinación en tiempo real
del desarrollo de la actividad proteolítica, cuya actividad
proteolítica es sustancialmente actividad de trombina, en una
primera muestra biológica que aparece y desaparece de la muestra,
que comprende las siguientes etapas:
- a)
- añadir un activador de proteasa a dicha primera muestra para generar actividad proteolítica;
- b)
- añadir un sustrato de señal a la etapa a), provocando dicho sustrato de señal una señal detectable relativa a la cantidad de producto de conversión formado en la reacción por la actividad proteolítica generada;
- c)
- añadir un medio con una actividad proteolítica estable conocida y constante sobre el sustrato de señal, tal como se ha definido en la etapa b), pero que por lo demás es inerte, a una segunda muestra en paralelo, en la que no se ha iniciado actividad proteolítica, de manera que los medios con una actividad proteolítica estable y constante conocida se seleccionan en el grupo que consiste en complejo de \alpha_{2}-macroglobulina-trombina, complejo estafitocoagulasa-protrombina, y gamma trombina,
- d)
- añadir el mismo sustrato de señal que se ha definido en la etapa b) a la etapa c), provocando dicho sustrato de señal una señal detectable en la reacción por el medio con actividad proteolítica estable conocida,
- e)
- determinar el desarrollo del tiempo de la señal en dicha primera muestra y dicha segunda muestra paralela para proporcionar una curva de cada una de ellas,
- f)
- comparar dichas curvas para reducir el desarrollo de la actividad proteolítica a lo largo del tiempo en la primera muestra.
2. Método, según la reivindicación 1, para
determinar en tiempo real el desarrollo de la actividad
proteolítica, siendo dicha actividad proteolítica sustancialmente
actividad de trombina, en una primera muestra de sangre o plasma que
aparece y desaparece de la muestra, que comprende las siguientes
etapas:
- a)
- añadir un activador de formación de trombina a dicha primera muestra para formar trombina;
- b)
- añadir un sustrato de señal a la etapa a), provocando dicho sustrato de señal una señal detectable relativa a la cantidad de producto de conversión formado en la reacción por la trombina formada,
- c)
- añadir un medio con una actividad de trombina estable conocida y constante sobre el sustrato de señal, tal como se define en la etapa b), pero que por lo demás es inerte a una segunda muestra en paralelo en la que no se ha generado actividad de trombina,
- d)
- añadir el mismo sustrato de señal que se define de la etapa b) a la etapa c), provocando dicho sustrato de señal una señal detectable cuando tiene lugar la reacción con el medio con actividad de trombina estable conocida,
- e)
- determinar el desarrollo en el tiempo de la señal en dicha primera muestra y dicha segunda muestra en paralelo para conseguir una curva para cada una de ellas,
- f)
- comparar dichas curvas para deducir el desarrollo de la actividad de trombina a lo largo del tiempo en la primera muestra.
3. Método, según la reivindicación 1 ó 2, en el
que la primera muestra biológica es seleccionada entre el grupo que
consiste en sangre, plasma, incluyendo plasma rico en plaquetas,
pobre en plaquetas o libre de plaquetas, saliva, suero, orina,
fluido cerebroespinal, esperma y heces.
4. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la actividad proteolítica
seleccionada entre el grupo que consiste en actividad de factor de
coagulación activado, incluyendo trombina, actividad de factor
fibrinolítico activado, y componente activado de la actividad del
sistema de complemento.
5. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la señal de sustrato es
seleccionada del grupo que consiste en compuestos que comprenden un
grupo cedente, cuyo grupo cedente proporciona un producto de
conversión detectable en la reacción por la enzima proteolítica
formada.
6. Método, según la reivindicación 5, en el que
el sustrato de señal es
Z-Gly-Gly-Arg-AMC.
7. Método, según la reivindicación 5 ó 6, en el
que el producto de conversión detectable es determinado por
espectroscopia, en particular fluorescencia, densidad óptica, y
NMR.
\newpage
8. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 7, en el que el grupo cedente es un grupo
fluorescente, un grupo cromofórico o un grupo que libera iones de
hidrógeno.
9. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el producto de conversión
detectable es p-nitroanilida o
7-amino-4-metil-coumarino.
10. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el activador de proteasa es
seleccionado entre el grupo que consiste en iones calcio,
fosfolípidos, Factor de tejidos, Factor de tejidos soluble,
tromboplastina, kaolín, y ácido elágico.
11. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha primera muestra
biológica comprende además un agente farmacéutico a comprobar en
cuanto a su influencia sobre el sistema proteolítico a estudio.
12. Método, según la reivindicación 11, en el
que dicho sistema proteolítico es el sistema
haemostático-trombótico.
13. Método, según la reivindicación 11 ó 12, en
el que el agente farmacéutico es un agente antitrombótico, tal como
un agente anti-plaquetas o un agente
anticoagulante.
14. Método, según la reivindicación 13, en el
que el agente antitrombótico es seleccionado entre el grupo que
consiste en heparina, dermatán sulfato, un inhibidor directo de
trombina, por ejemplo hirudina, argatrobán o melagatrán, y un
factor inhibidor Xa, por ejemplo proteína anticoagulante densa.
15. Equipo para llevar a cabo el método, según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende:
- -
- un complejo de concentración conocida de \alpha_{2}M-trombina;
- -
- un reactivo PRP para plasma rico en plaquetas para iniciar la reacción de coagulación.
- -
- un reactivo PPP para plasma pobre en plaquetas o libre de plaquetas para iniciar la reacción de coagulación.
- -
- un aditivo que facilita el diagnóstico de la evolución de la actividad de trombina
- -
- un reactivo que contiene un sustrato de señal
- -
- un programa de software que se puede cargar directamente en la memoria de un ordenador para calcular la curva de actividad de trombina determinada por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, cuando dicho programa es tratado en un ordenador.
- -
- un manual de instrucciones.
16. Equipo, según la reivindicación 15, que
contiene reactivos liofilizados.
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