KR100497951B1 - 혈액응고제ⅹⅱ인자활성화법 - Google Patents

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Abstract

생체내에 있어서의 실제의 FⅩⅡ활성화 반응을 보다 충실히 재현하기 위해, 생체내의 FⅩⅡ활성화 물질을 동정(同定)함으로써, 종래의 음성전하를 가지는 이종표면을 이용하는 방법과는 다른 신규한 FⅩⅡ활성화법을 제공한다.
본 발명은, 보체(補體)성분 C1q의 구면형상부위에 대한 수용체(gC1qR)를 이용한 FⅩⅡ활성화법 및 상기한 물질로 이루어진 FⅩⅡ활성화제이다. 본 발명에서 사용되는 gC1qR은, 각종 동물의 내피세포 등의 세포에서 분리·정제해서 얻은 것이나, 유전공학적으로 제조한 리콤비넌트(gC1qR)를 이용할 수 있다.
gC1qR을 이용한 본 발명 FⅩⅡ활성화법은, 생체내에 있어서의 실제의 FⅩⅡ활성화 반응을 보다 충실히 재현·반영하는 것이고, 종래의 음성전하를 가지는 이종표면을 이용하는 방법과는 다른 신규한 FⅩⅡ활성화법이다. 따라서, FⅩⅡ활성화 반응에 관한 여러 가지의 연구 및 FⅩⅡ활성화나 이것을 개시단계로 하는 혈장칼리크레인키닌계 등의 생체내반응계에 관여하는 약제의 활성측정법·스크리닝법 등에 있어서, 본 발명 FⅩⅡ활성화법은 보다 생체내에 가까운 반응계를 실시가능하게 하는 방법으로서 매우 유용성이 높다.

Description

혈액응고 제ⅩⅡ인자활성화법
본 발명은 보체성분 C1q의 구면형상부위에 대한 수용체를 이용한 신규한 혈액응고 제ⅩⅡ인자 활성화법에 관한 것이다.
혈장칼리크레인키닌계는, 여러 가지의 생리활성을 가지는 키닌류를 생성시키는 일련의 생체내 반응계이다. 이 혈장칼리크레인키닌계는, 생체내에 있어서 다른 여러 가지의 효소반응계, 예를 들면 레닌안지오텐신계, 혈액응고계, 선용계, 보체계 및 프로스타글란딘, 로이코트리엔, 트롬복산을 중심으로 하는 아라키돈산 캐스케이드나 카테콜아민 등과 밀접한 관련성을 가지고 생체의 기능조절에 깊게 관련되어 있는 것이다.
칼리크레인키닌계의 생성산물인 브래디키닌 등의 키닌류는, 말초혈관확장에 따르는 강압, 혈관투과성의 항진, 평활근육의 수축 혹은 이완, 발통(發痛), 백혈구의 유주(遊走), 부신피질로부터의 카테콜아민의 유리(遊離)작용 등 여러 가지의 생리활성을 나타내는 것외에, 알레르기반응을 포함한 염증반응의 메디에이터로서도 알려져 있고, 생체내에 있어서의 존재의의는 크다. 따라서, 키닌류의 작용을 억제 혹은 그 생성을 저해하는 물질은, 항염증제, 진통제, 항알레르기제 등의 의약품으로서 유용하다고 생각되어진다.
혈장칼리크레인키닌계의 일련의 반응계의 개시단계는, 혈액응고 제ⅩⅡ인자(FⅩⅡ)의 활성화이다. 생체내에 있어서 조직에 대한 상해나 침해자극 등에 의해 FⅩⅡ가 활성화됨으로써, 혈장칼리크레인키닌계의 일련의 효소반응계가 진행한다. 즉, 활성화된 FⅩⅡ(활성형 혈액응고 제ⅩⅡ인자:FⅩⅡa)는 동일하게 혈장속에 존재하는 혈장프리칼리크레인에 작용해서, 이것을 활성형 효소의 혈장칼리크레인으로 변환하고, 이어서 이 혈장칼리크레인이 혈장속의 고분자 키니노겐에 작용해서, 전술한 바와 같이 여러 가지의 생리활성을 가지는 브래디키닌을 유리(遊離)생산시킨다.
FⅩⅡ의 활성화 반응은, 혈장칼리크레인키닌계의 개시반응일 뿐만 아니라, 그 밖의 생체내에 있어서의 여러 가지의 기능조절계, 예를 들면 혈액응고계, 선용계, 레닌안디오텐신계, 보체계, 아라키돈산 캐스케이드 등에 있어서의 개시단계를 제어하는 반응으로서 매우 중요한 역할을 하고 있다. FⅩⅡ는 음성전하를 가지는 이종표면상에서 활성화되는 것이 알려져 있고, 그러한 이종표면으로서는 카올린, 유리, 세라이트, 덱스트란황산, 콜라겐, 산성 무코다당 등을 들 수 있지만, 실제의 생체내에 있어서의 FⅩⅡ의 활성화 물질은 아직 동정되어 있지 않다.
본 발명의 목적은, 생체내에 있어서의 실제의 FⅩⅡ활성화 반응을 보다 충실히 재현하기 위해, 생체내의 FⅩⅡ활성화 물질을 동정함으로써, 종래의 음성전하를 가지는 이종표면을 이용하는 방법과는 다른 신규한 FⅩⅡ활성화법을 제공하는 데에 있다.
본 발명자들은, 생체내에 존재하는 FⅩⅡ활성화 물질에 대해서 예의(銳意)연구를 거듭한 결과, 세포막 위에 존재하는 보체성분 C1q의 구면형상부위에 대한 수용체 단백질이 FⅩⅡ의 활성화 물질인 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다.
본 발명은, 보체성분 C1q의 구면형상부위에 대한 수용체(이하, gC1qR로 약기한다)를 이용한 FⅩⅡ활성화법 및 상기한 물질로 이루어진 FⅩⅡ활성화제이다. 보체란 약 20종류의 혈청단백의 총칭이고, 여러 가지의 면역반응, 알레르기반응의 매개물질로서 중요한 역할을 하고 있고, 본래 혈액속에 있어서는 불활성형으로 존재하지만, 항원항체복합물, 세균이나 동물세포의 막성분 등에 의해 활성화되면 용혈·용균반응, 탐식작용촉진, 염증촉진 등의 여러 가지의 생물활성을 나타낸다. 보체계의 활성화는, 상기한 활성화 물질과 접촉해서 보체성분 C1이 활성화됨으로써 개시된다. C1q는 C1의 3종류의 아(亞)성분의 하나이고, 림프구, 단구(單球), 마크로파지, 호중구(好中球), 호산구(好酸球), 피브로블래스트, 혈소판, 내피세포, 활막세포 등 여러 가지의 세포에 결합활성을 가지므로, 이들 세포막상의 수용체의 존재가 시사되고, 단리(單離)·동정되고 있다.
본 발명은, 상기한 보체성분 C1q의 구면형상부위에 대한 수용체 단백질(gC1qR)을 이용한 FⅩⅡ활성화법이고, 본 발명방법은 생체내에 있어서의 실제의 FⅩⅡ활성화 반응을 보다 충실히 재현·반영시키기 때문에 유용한 방법이다. 본 발명에 있어서 사용되는 C1qR은 인간을 포함하는 각종 동물의 내피세포, 림프구, 단구, 마크로파디, 호중구, 호산구, 피브로블래스트, 혈소판, 활막세포 등의 세포에서 분리·정제할 수 있다. 이들 세포는 생체성분에서 얻어지는 정상세포는 물론, 배양해서 증식시킨 세포나 암화시킨 배양세포도 이용할 수 있다. gC1qR의 분리·정제는, 통상의 막단백질의 정제에 있어서 사용되고 있는 방법을 이용해서 행할 수 있고, 예를 들면 계면활성제에 의해 세포막을 가용화한 후, 각종 크로마토그래피 등으로 정제하는 방법 등이 일반적이다. 특히 gC1q나 고분자 키니노겐 등을 불용화한 담체를 이용한 아피니티·크로마토그래피는, gC1qR과의 생화학적인 친화력을 이용하고 있으므로 분리능력이 높고, 다른 막단백질과의 특이적인 분리가 가능하고 유효한 방법이다.
또한 유전자공학적으로 제조한 리콤비넌트(gClqR)도 본 발명 FⅩⅡ활성화법에 있어서 이용할 수 있다. 이 유전자공학적 수법에 의하면 균일하고 보다 혼합단백질이 적은 것을 얻는 것이 용이하고, 예를 들면 B.Ghebrehiwet 등의 방법〔(J. Exp. Med. 179권, 1809-1821페이지(1994년)〕등에 따라서, 리콤비넌트(gClqR)를 제조할 수 있다.
본 발명의 FⅩⅡ활성화법에 있어서의 반응계는, 목적에 따라서 적당히 설정하면 되고, FⅩⅡ만을 실질적으로 함유하는 반응계외에 FⅩⅡ를 함유하는 통상의 동물혈장을 이용한 반응계나 혈장칼리크레인키닌계의 구성성분인 FⅩⅡ, 혈장프리칼리크레인 및 고분자 키니노겐 등을 조합한 재구성계 등을 기본적인 반응계로서 들 수 있다. 본 발명의 gClqR을 이용한 FⅩⅡ활성화법은, 아연의존성인 것이 확인되고 있고, 상기한 어느 쪽의 반응계의 경우에도 아연이온의 공존하에서 행하는 것이 바람직하다. 지적한 반응조건을 설정하기 위해서, 염화나트륨 등의 염류나 완충화제외에 해당 분야에서 관용의 알부민이나 당류 등의 첨가제를 반응계에 적당히 가하더라도 좋다. 본 발명에 있어서의 FⅩⅡ활성화법의 반응조건, 예를 들면 gClqR, FⅩⅡ, 기타 정제단백질, 첨가제 등의 농도 및 pH, 반응온도, 반응시간 등은 실시자의 목적을 달성하기 위해서 각각 검토하여 설정할 수가 있다.
본 발명의 FⅩⅡ활성화법에 의해서 FⅩⅡ가 어느 정도 활성화되었는가를 측정하기 위해서는, 당연히 생성된 FⅩⅡa를 정량하면 확인할 수 있고, 이것은 해당 분야에서의 관용의 방법에 따라서 할 수 있다. 이들 FⅩⅡa 정량법은 문헌에도 다수 보고되어 있고, 실시자에게 있어서 가장 바람직한 방법을 채용하면 좋고, 예를 들면 자주 사용되고 있는 FⅩⅡa 정량법으로서 FⅩⅡa의 효소활성을 이용하여 측정하는 방법을 들 수 있다. 이것은 FⅩⅡa에 대한 기질을 이용하여 측정하는 방법이고, 혈장프레칼리크레인, 혈액응고 제ⅩⅠ인자 또는 플라스민 등의 천연기질외에, D-Pro-Phe-Arg-pNA, D-Leu-Gly-Arg-pNA, N-Benzoyl-I1e-Glu-Gly-Arg-pNA·염산염 및 메틸에스테르 등의 발색이나 Boc-Glu(OBz)-Gly-Arg-MCA, Boc-Gln- Gly-Arg-MCA 등의 형광합성 기질 등을 이용하는 방법이 간편하고 통상 자주 사용되고 있다. 상술한 본 발명에 관한 반응계의 구성성분, 반응조건, FⅩⅡa 생성량의 측정법 등의 기재는, 본 발명을 실시하기 위한 한 예에 지나지 않고, 특히 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 gClqR를 이용한 FⅩⅡ활성화법은 여러가지의 시험계에서 실시가능하다. 상술한 바와 같이 FⅩⅡ의 활성화 반응은, 혈장칼리크레인키닌계, 혈액응고계, 선용계 등의 다양한 생체기능조절계의 개시단계를 제어하는 반응으로서 대단히 중요한 역할을 해내고 있기 때문에, 종래부터 이들 생체내의 조절기구의 해명을 위한 FⅩⅡ활성화에 관한 연구는 수많이 행하여지고 있다. 예를 들면, ①FⅩⅡ활성화 반응의 병리적·생리적 의의의 해명, ②FⅩⅡ활성화 반응을 제어하는 생체내에 존재하는 내인성 물질의 연구, ③ 키닌유리, 내인계 혈액응고, 플라스미노겐활성화, 보체계 등 여러가지의 생체반응에 대한 FⅩⅡ활성화의 관여 등에 관한 여러가지 연구가 행하여지고 있고, 이들의 시험·실험계에서, 실제의 생체내에서의 FⅩⅡ활성화 반응을 보다 충실히 재현·반영시키는 것을 가능하게 한 본 발명방법은 대단히 유용한 것이다.
또한, FⅩⅡ활성화가 관여하는 혈장칼리크레인키닌계, 혈액응고계, 선용계, 레닌안지오텐신계, 보체계, 아라키돈산 캐스케이드 등에 대해서 저해 또는 촉진작용을 갖는 약제의 개발도 진행되고 있다. 예를 들면, 혈장칼리크레인키닌계를 저해하는 물질은, 그 최종생성산물인 브래디키닌의 생성을 저해하는 작용을 갖기 때문에, 브래디키닌에 의해서 유발되는 통증, 염증, 알레르기 등을 억제하는 약제, 즉 진통제, 항염증제, 항알레르기제 등의 의약품으로서 유용하다. 이러한 약제의 활성측정법·스크리닝법에 있어서, 보다 생체내에 가까운 반응계를 이용하는 쪽이 적절한 작용기전을 갖는 바람직한 약제를 발견할 수 있는 가능성이 높기 때문에, 그와 같은 특징을 갖는 본 발명방법은 상기한 약제의 활성측정법 등에도 이용할 수 있고 대단히 유용성이 높다. 특히 gClqR에 작용해서 FⅩⅡ활성화를 제어하는 약제의 활성을 측정할 경우, 본 발명방법은 필수인 것이다.
예를 들면, 구체적인 상기한 약제의 활성측정법으로서는, ①동물혈장을 이용한 피검물질의 칼리크레인 생성저해능측정법(일본국 특공평 4-14000호공보), ②동물혈장을 이용한 FⅩⅡa 생성에 대한 피검물질의 저해·촉진활성측정법(일본국 특개평 7-51097호 공보), ③재구성한 혈장칼리크레인키닌계에 의한 FⅩⅡa, 칼리크레인 또는 브래디키닌의 생성에 대한 피검물질의 저해·촉진활성측정법(일본국 특개평 7-51098호 공보) 등을 들 수 있다.
이하의 실시예에 있어서, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 한편, 이하의 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 한 예이고, 한정적인 의미를 갖는 것은 아니다.
실시예1. (gClqR의 조제)
이하의 FⅩⅡ활성화시험에 있어서는, 인간탯줄 정맥유래 내피세포(HUVEC)로부터 분리정제한 gClqR 또는 리콤비넌트 gClqR을 이용하였다. 리콤비넌트 gC1qR로서는, 상기한 B.Ghebrehiwet 등의 방법〔J.Exp. Med. 179권,1809-1821페이지(1994년)〕에 의해서 얻은 것을 사용하였다. 또한 HUVEC에서는 아래와 같이 gClqR를 정제하여 FⅩⅡ활성화시험에 제공했다.
가용화한 HUVEC 막단백질 분획을, 159mM 염화나트륨, 2mM 페닐메틸술포닐플루오라이드, 1μM 아프로티닌, 1μM 펩스타틴, 0.1% 트리톤X-100 및 50μM 염화아연을 포함하는 10mM 헤페스완충액에 투석하고, 고분자 키니노겐·어피니티 컬럼에 첨가하였다. 컬럼을 충분히 씻은 후, 0.lM 글리신-염산(pH2.5)으로 용출하고, 0.5㎖씩 분취(分取)했다. 각 용출액을 1M 트리스염산완충액(pH9.0)으로 pH 7.0으로 조정한 후, 용출액의 단백검출모니터 및 비오틴화 고분자 키니노겐에 의한 도트플롯분석을 행하여 정제 gClqR을 얻었다.
실시예2. (FⅩⅡ의 활성화시험1)
20㎍/㎖의 FⅩⅡ, 32㎍/㎖의 리콤비넌트 gClqR 및 0.6mM의 S-2222(FⅩⅡa에 대한 합성기질: N-벤조일-L-이소로이실-L-글루타밀-글루실-L-알기닐-p-니트로아닐리드·염산염 및 메틸에스테르)를, 헤페스완충액(10mM 헤페스, 137mM 염화나트륨, 11mMD-글루코오스, 4mM 염화칼륨, 1mg/㎖ 소혈청알부민, 1mM 염화칼슘, 50μM 염화아연, pH 7.4)속에서 25℃로 반응을 행하였다. 헤페스완충액은 (4-아미디노페닐)메탄술포닐플루오라이드 [APMSF]로 사용전에 처리하고, 알부민에 혼입하고 있는 프로테아제류를 확실하게 불활성화시켰다. FⅩⅡ활성화에 의해서 생성된 FⅩⅡa의 효소작용에 의해서, 합성기질S-2222에서 p-니트로아닐린이 유리되기 때문에, 이 p-니트로아닐린의 유리량을 측정함으로써 FⅩⅡa의 생성량을 정량할 수가 있다. p-니트로아닐린은 황색으로 발색하고, 이것은 405㎚에서의 흡광도로 측정할 수가 있기 때문에, 이 흡광도를 분광광도계로 경시적으로 모니터함으로써 FⅩⅡa의 생성량을 측정하였다. 결과의 한 예를 도 1에 나타낸다.
실시예3. (FⅩⅡ의 활성화시험2)
여러가지 농도의 리콤비넌트 gClqR, 1㎍/㎖의 FⅩⅡ, 1㎍/㎖의 고분자 키니노겐, 1㎍/㎖의 혈장프리칼리크레인 및 0.6mM의 S-2302(혈장칼리크레인에 대한 합성기질: H-D-플로릴-L-페닐알라닐-L-알기닐-p-니트로아닐리드·이염산염)을, 상기와 같은 APMSF처리 헤페스완충액속에서 25℃로 반응을 행하였다. 이 시험계에서는 FⅩⅡ의 활성화를 칼리크레인생성량을 지표로서 측정했다. 즉, FⅩⅡ가 활성화되어 FⅩⅡa로 변환되면, FⅩⅡa는 혈장프리칼리크레인에 작용하여 효소활성을 갖는 혈장칼리크레인으로 변환시키기 때문에, 이 칼리크레인의 생성량을 측정함으로써 FⅩⅡ가 어느 정도 활성화되었는가를 알 수 있다. 칼리크레인의 생성량은, 칼리크레인의 가수분해작용에 의해서 합성기질S-2302로부터 유리되는 p-니트로아닐린의 황색의 발색을, 상기와 같이 분광광도계를 이용하여 경시적으로 모니터해서 구했다. 결과의 한 예를 도 2에 나타낸다.
실시예2의 시험계는 gClqR과 정제한 FⅩⅡ만을 혼합반응해서 FⅩⅡ활성화를 측정한 결과이지만, 도 l의 결과에 나타낸 바와 같이 FⅩⅡa생성량의 지표가 되는 합성기질로부터 유리되는 p-니트로아닐린의 발색량이 경시적으로 증가하고 있는 것에서 명백하듯이, gClqR는 FⅩⅡ를 활성화하는 작용을 갖는 것이 인정되었다. 이 gClqR에 의한 FⅩⅡ활성화 반응은, 아연이온의 비존재하에서는 전혀 활성화는 보이지 않고, 또한 혈장속에 존재하는 내재성 인히비터로서 알려져 있는 C1인히비터에 의해 이 FⅩⅡ활성화는 농도의존적으로 억제되었다.
또한 실시예3의 시험계는, FⅩⅡ, 혈장프리칼리크레인 및 고분자 키니노겐으로 이루어진 혈장칼리크레인키닌계의 재구성계이고, FⅩⅡ의 활성화를 칼리크레인의 생성량을 지표로서 측정한 결과이다. 도 2의 결과에 나타낸 gClqR는 농도의존적으로 FⅩⅡ를 활성화하고, 실시예2의 반응계와 같이 아연이온의 비존재하에서는 활성화는 인정되지 않았다. 이 FⅩⅡ활성화 반응계에서 gClqR의 사용량을 일정하게 하여 FⅩⅡ농도를 변화시킨 경우, 칼리크레인생성량은 FⅩⅡ용량에 의존하여 증가하였다. 또한 리콤비넌트 gClqR을 대신해서 HUVEC로 정제한 gClqR를 이용한 경우에도, 같은 FⅩⅡ활성화가 인정되었기 때문에, gClqR에서의 당화부위는 FⅩⅡ의 활성화에 영향을 주지 않은 것이 시사되었다.
상술한 대로, 보체성분 Clq의 구면형상부위에 대한 수용체(gClqR)는 FⅩⅡ의 활성화 작용을 갖고, 생체내에서의 실제의 FⅩⅡ활성화 물질의 하나인 것이 밝혀지게 되었다. 따라서, 이 gClqR를 이용한 본 발명 FⅩⅡ활성화법은, 생체내에서의 실제의 FⅩⅡ활성화 반응을 보다 충실히 재현·반영하는 것으로 종래의 음성전하를 가지는 이종표면을 이용하는 방법과는 다른 신규한 FⅩⅡ활성화법이다. 상기한 「발명의 실시의 형태」의 항에서 상술한 대로, FⅩⅡ활성화 반응에 관한 여러가지의 연구 및 FⅩⅡ활성화나 이것을 개시단계로 하는 혈장칼리크레인키닌계 등의 생체내반응계에 관여하는 약제의 활성측정법·스크리닝법 등에 있어서, 본 발명 FⅩⅡ활성화법은 보다 생체내에 가까운 반응계를 실시가능하게 하는 방법으로서 대단히 유용성이 높다.
도 1은, FⅩⅡ와 gC1qR을 혼합반응시켜, gC1qR에 의한 FⅩⅡ활성화를 경시적으로 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는, FⅩⅡ, 혈장프리칼리크레인 및 고분자 키니노겐으로 재구성한 혈장칼리크레인키닌계에 있어서의 gC1qR에 의한 FⅩⅡ활성화를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.

Claims (5)

  1. 아연이온의 존재하에 C1q의 구면형상부위에 대한 수용체와 제XII인자를 혼합시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 C1q의 구면형상부위에 대한 수용체를 이용한 혈액응고 제XII인자 활성화법.
  2. 보체성분 C1q의 구면형상부위에 대한 수용체로 이루어진 혈액응고 제XII인자활성화제.
  3. (a) 아연이온의 존재하에 제XII인자, C1q의 구면형상부위에 대한 수용체 및 활성화된 제XII인자에 대한 기질을 혼합시키는 단계,
    (b) 활성화된 제XII인자의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 C1q의 구면형상부위에 대한 수용체에 의해 활성화된 제XII인자를 검출하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, FXIIa에 대한 합성기질을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 프리칼리크레인이 활성화된 제XII인자(FXIIa)에 대한 기질이고, 프리칼리크레인 및 고분자 키니노겐을 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
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