DK165199B

DK165199B - Aktivatorpraeparat, fremgangsmaade til kvantitativ bestemmelse af protein c under anvendelse af praeparatet, antithrombotisk laegemiddel indeholdende praeparatet og fremgangsmaade til udvinding af aktiveret protein c under anvendelse af praeparatet

Info

Publication number: DK165199B
Application number: DK224886A
Authority: DK
Inventors: Kurt F Stocker; G Svendsen Lars
Original assignee: Pentapharm Ag
Priority date: 1985-05-29
Filing date: 1986-05-14
Publication date: 1992-10-19
Also published as: ES555428A0; DE3678489D1; US4849403A; ES8801037A1; JPS61280298A; NO166303B; ES557670A0; NO166303C; NO862118L; ES8802471A1; IL78829A0; EP0203509A2; DK224886A; DK165199C; AU5736986A; AU605462B2; EP0203509A3; EP0203509B1; DK224886D0; CA1286223C

Description

DK 165199B

Den foreliggende opfindelse angår et aktivatorpræparat, en fremgangsmåde til kvantitativ bestemmelse af protein C under anvendelse af præparatet, et antithrombotisk lægemiddel indeholdende præparatet og en fremgangsmåde til ud-5 vinding af aktiveret protein C under anvendelse af præparatet.

Protein C er et i menneske- og pattedyrsblodplasma indeholdt zymogen fra hæmostasesystemet, som ved begrænset proteolyse aktiveres til serinproteinasen protein Ca via et 10 complex af thrombin og det uopløselige karvægsprotein thrombomodulin. Protein Ca bevirker på den ene side hydro-lytisk spaltning af koaguleringsfaktorerne V (accelerin) og VIII (antihæmofil faktor A) og på den anden side aktivering af fibrinolysen. Virkningen af protein C potentieres af.

15 protein S, phospholipid og calcium og hæmmes af en specifik inhibitor, der er indeholdt i plasma.

Takket være disse egenskaber og virkninger indtager protein C en central stilling i reguleringen af hæmostasen; det forhindrer koagulation i intakte blodkar uden at forringe 20 blodkoagulationen på stedet for en karlæsion.

Protein C er et glycoprotein med en molekylvægt på ca.

60.000, som syntetiseres i leveren i afhængighed af vitamin K. Det har i sit molekyle flere 7-carboxyglutaminsyre-rester, som er nødvendige for bindingen af calcium og -25 dannelsen af enzym-phospholipidcomplexet. Antikoagulations-terapi med vitamin K-antagonister fører til syntese af acarboxy-protein C, som dog ligeledes har enzymaktivitet, men imidlertid ikke kan potentieres af phospholipid og calcium.

30 Nedarvet eller erhvervet mangel eller molekylær misdannelse af protein C fører i mennesker til forhøjet thrombose-tilbøjelighed.

DK 165199B

2

Udførlige beskrivelser af protein C findes hos W. Kisiel og E.W. Davie, "Protein C", Methods in Enzvmoloqv 80. 1981, s. 320-332 og I. Witt, "Protein C - Ein neuer Faktor der Haemostase", fra L. Roka og E. Spanuth (red.), Neue Asoekte 5 in der Gerinnunosdiagnostik. 1984, s. 1-16, Stuttgart, New York; Schattauer Verlag.

Protein C har antigene egenskaber, som muliggør kvantitativ bestemmelse deraf ved en immunologisk teknik.

Ved den enzymbundne immunadsorptionsteknik (ELISA, jfr. I.

10 Witt, loc. cit.) forløber protein C-bestemmelsen således, at der ved immunisering af kaniner fås specifikke og mod protein C rettede antistoffer, disse bindes på en bærer af kunststof, og prøven bringes i kontakt med den antistofbelagte bærer, hvorved antigenet "protein C" bindes af 15 antistofferne. Herpå tilsættes der i overskud antistoffer, der er blevet koblet med peroxidase, og som nu bindes til de endnu frie antigene determinanter på det adsorberede protein C. Efter udvaskning af de overskydende mærkede antistoffer bestemmes den ved immunadsorption bundne pe-20 roxidaseaktivitet ved hjælp af o-phenylendiamin. Den bundne peroxidaseaktivitet er proportional med protein C-koncen-trationen i prøven. I handelen findes der et test-kit til protein C-bestemmelse ifølge ELISA-teknikken (ELISA-protein C, Boehringer Mannheim, BRD).

25 Ifølge en immunelektroforetisk metode (R.M. Bertina, Thrombosis & Haemostasis 48111, 1982, s. 1-5) optages de mod protein C rettede antistoffer i en agaroseopløsning og hældes ud på en plade, prøven anbringes på antistofpladen, og denne udsættes i flere timer og i et egnet apparat for 30 jævnstrøm. Fra gelpladen vaskes nu ikke-udfældet protein ud, og de dannede raketformede fældningszoner gøres synlige ved farvning med amidosort. Fældningszonernes længde er proportional med prøvens protein C-koncentration. Færdige antistofplader til protein C-bestemmelse er tilgængelige i

DK 165199B

3 handelen, fx "Assera®-Plate Protein C", Diagnostics Stago. Asniéres, Frankrig.

Protein C kan endvidere bestemmes ved et radioimmunologisk princip, idet specifikke anti-protein C-antistoffer mærkes 5 med en radioaktiv isotop såsom ^5j/ Qg deres binding til protein C i prøven måles radiologisk. En radioimmunologisk metode til protein C-bestemmelse er beskrevet af K. Ikeda og J. Stenflo i Thrombosis Research 39. 1985, s. 297-306.

De nævnte immunologiske metoder til protein C-bestemmelse 10 er imidlertid behæftede med flere ulemper. For det første kræves der højoprensede præparater af protein C til fremstilling af de specifikke antistoffer, eftersom en forurening af antigenet med plasmaproteiner ville føre til et antistof med en for bred bindingsevne, hvilket ville resul-15 tere i falske høje protein C-kohcentrationer i prøven. Immunologiske metoder kræver endvidere et så stort ressourceforbrug i arbejde, apparater og tid, at praktisk anvendelse deraf kun kommer på tale, hvis patientens tilstand på den ene side retfærdiggør dette ressourceforbrug 20 og på den anden side tillader den lange ventetid. Endelig er immunologiske protein C-bestemmelsers diagnostiske værdi begrænset ved, at disse metoder ud over aktiver bart enzymatisk funktionsdygtigt protein C også måler disses patologiske former såvel som forbrugt og til inhibitor 25 bundet inaktiveret enzym.

Den kostbare oprensning af protein C samt fremstillingen af antistofpræparater bortfalder, og bestemmelsen bliver specifik for funktionsdygtigt protein C, hvis der ikke måles på dets antigene egenskaber, men i stedet på dets 30 enzymfunktion.

Protein C kan bestemmes funktionelt ved, at zymogenet aktiveres, og den opståede enzymaktivitet måles på et naturligt eller syntetisk substrat.

DK 165199B

4

Ifølge metoden beskrevet af Kisiel og Davie (W. Kisiel og E.W. Davie, "Protein C", Methods in Enzymology 80. 1981, s. 320-332) bestemmes protein C i chromatografifraktioner under anvendelse af kaolin-cephalin-koaguleringstiden af 5 humant citratplasma som indikatorreaktion. I et første trin aktiveres den protein C-holdige prøve ved 30-60 minutters inkubation med thrombin, hvorefter thrombinoverskuddet neutraliseres ved tilsætning af antithrombin III og heparin. I et andet trin sættes der nu normalplasma til en 10 portion af aktiveringsblandingen, koaguleringssystemet aktiveres ved tilsætning af calciumchlorid, cephalin og kaolin, og tiden indtil koagulationen måles. Den på grund af aktiveret protein C bevirkede nedbrydning af faktor V og VIII forårsager en forlængelse af koagulationstiden sammen-15 lignet med en kontroltest uden protein C; denne forlængelse er proportional med prøvens protein C-indhold.

Omend denne metode specifikt måler det funktionsdygtige protein C, kan den imidlertid kun anvendes til inhibitorfrie protein Crpræparater, eftersom den i plasma indeholdte 20 protein C-inhibitor inaktiverer enzymet hurtigere, end det dannes ved thrombinaktivering.

Ifølge metoden beskrevet af Francis og Patch (R.B. Francis og M.J. Patch, "A functional assay for protein C in human plasma", Thromb. Res. 32. 1983, s. 605-613) 'fjernes for-25 styrreisen på grund af protein C-inhibitor ved, at prøven eller det patientplasma, der skal undersøges, behandles med bariumcitrat for at adsorbere protein C, medens inhibitoren forbliver i opløsning. Ud fra det bortcentrifugerede ad-sorbat elueres protein C ved behandling med natrium-30 morpholinoethylsulfat, vaskes og aktiveres delvis ved inkubation i 60 minutter med a-thrombin. Thrombinet in-aktiveres derefter med antithrombin III og heparin, hvorefter heparinet neutraliseres med protaminsulfat. Protein C-aktiviteten i den på denne måde forberedte prøve bestem-35 mes herefter på humant normalplasma ved måling af forlængelsen af kaolin-cephalin-koagulationstiden.

5

Ud fra en fortyndingsrække af normalplasma og de dermed opnåede koagulationstider fremstilles der en kalibreringskurve, ud fra hvilken protein C-indholdet i patientplasma kan aflæses i procent af det normale.

5 De særlige ulemper ved metoden ifølge Francis og Patch ligger i dens omstændelighed og i den lange inkubationstid med thrombin, hvilket på trods heraf ikke fører til fuldstændig aktivering af den foreliggende mængde protein C, idet dette ville nødvendiggøre en inkubation på 4 timer 10 ved 37°C med den anvendte forsøgsanordning.

Bertina et al. (R.M. Bertina, A.W. Broekmans, C. Krommen-hoek-van Es og A. van Wyjn-Gaarden: "The use of a functional and immunological assay for plasma protein C in the study of the heterogeneity of congenital protein C defi-15 ciency." Thrombosis and Haemostasis 51. 1984, s. 1-5) beskriver en fremgangsmåde til bestemmelse af protein C i patientplasma, hvilken metode i stedet for den complexe hæmning af kaolin-cephalin-koagulationstiden benytter sig af den direkte spaltning af et chromogent substrat som 20 indikatorreaktion. Ved denne forskrift skilles protein C fra patientplasmaet ved adsorption på aluminiumhydroxid og eluering med ethylendiamintetraeddikesyre og aktiveres i 45 minutter ved 376c med thrombin, thrombinet hæmmes med antithrombin III og heparin, hvorefter det aktiverede 25 protein C til sidst bestemmes ved måling af p-nitroanilin-fraspaltningen fra det syntetiske chromogene substrat pyroglutamyl-L-prolyl-L-arginin-p-nitroanilid.

Den i alle de beskrevne fremgangsmåder til funktionel protein C-bestemmelse i plasma anvendte adsorptionsfase og 30 aktivering med thrombin virker skadelig på målenøjagtig-heden og på målehastigheden.

Adsorption og eluering er ikke-kvantitativt forløbende, temperatur- og tidsafhængige processer, hvis udførelse må

DK 165199B

6 standardiseres og kræver tilsvarende kvalificeret personale. Endvidere forandrer de ved elueringen anvendte stoffer testmediets elektrolytsammensætning og påvirker derigennem substratets omsætning.

5 Thrombin aktiverer protein C langsomt og ufuldstændigt, og det må ved tilendebragt aktivering hæmmes ved hjælp af antithrombin III og heparin eller ved hjælp af hirudin, for at det ikke selv skal reagere med substratet og ved anvendelse af et naturligt substrat give falsk lave eller, 10 ved anvendelse af et syntetisk substrat, falsk høje protein C-værdier. For at tilsat antithrombin og heparin imidlertid ikke selv skal forlænge kaolin-cephalin-koagulationstiden. og forårsage falsk høje resultater, må heparin neutraliseres med protaminsulfat, når protein C skal bestemmes ved 15 en koagulationsmetode. Anvendelsen af thrombin som aktivator til fotometrisk bestemmelse af protein C forudsætter endvidere, at det ved måling af protein C-aktiviteten anvendte chromogene substrat ikke eller kun i lille udstrækning selv spaltes af thrombin.

20 Hidtil har der ikke været kendt nogen praktisk anvendelige bedre alternativer til aktivering af protein C med thrombin. Ganske vist forstærkes aktiveringen med thrombin kraftigt af thrombomodulin; men dette i vand uopløselige protein har hidtil ikke været til rådighed Γ anvendelig 25 form.

En ligeledes accelererende tilsætning af calcium kan ikke foretages i plasma, fordi koaguleringssystemet og dermed andre proteinaser end protein C ville blive aktiveret, som så ville reagere med det naturlige eller syntetiske sub-3 0 strat.

Faktor X-aktivatoren, der isoleres fra giften fra Russell-hugorm, udøver ifølge Kisiel og Davie godt nok ligeledes en aktiverende virkning på protein C på grund af sin protei-naseaktivitet; denne aktivering forløber dog imidlertid

DK 165199 B

7 meget langsommere end aktiveringen ved thrombin og kan derfor ikke anvendes til bestemmelse af protein c. Trypsin, som ligeledes bevirker en proteolytisk aktivering af protein C, kan ikke anvendes, fordi det som uspecifik pro-5 teinase såvel aktiverer som inaktiverer talrige andre plasma-zymogener og endvidere også reagerer med de anvendte substrater.

Proteinaser med thrombinlignende substratspecificitet såsom det fibrinopeptid A-fraspaltende batroxobin fra Bothrops 10 atrox-qift eller anerod fra Agkistrodon rhodostoma-qift, det fibrinopeptid B-fraspaltende enzym fra Agkistrodon contortrix-qift. det thrombocytaktiverende enzym throm-bocytin fra |L_ atrox-qift aktiverer ikke protein C, og det via staphylokoagulase ud fra prothrombin dannede thrombin-15 koagulase eller det via ecarin ud fra prothrombin dannede meizothrombin udviser egenskaber i lighed med thrombin og byder i sammenligning dermed derfor ikke på nogle fordele.

Det har nu overraskende vist sig, at et protein fra giften fra kobberhovedslangen Agkistrodon contortrix. som ikke 20 udøver nogen thrombinlignende virkning på fibrinogen og thrombocytter, som ikke, i modsætning til thrombin, bevirker fraspaltning af fibrinopeptid A eller B fra fibrinogen, som ikke bevirker udløsning af aggregations- eller frigørelsesreaktioner på thrombocytter, bevirker en meget 25 stærk og hurtig aktivering af oprenset protein C, hvorved fibrinolysen og dermed spaltningen af fibrin aktiveres. Det har endvidere vist sig, at dette slangegiftprotein formår at aktivere protein C i så stærk fortyndet plasma, at den eksisterende protein C-inhibitor praktisk talt ikke kan 30 virke, eller at der opstår et aktiveringsprodukt, som ikke kan hæmmes af plasma-protein C-inhibitoren, således at nødvendigheden af en omstændelig adskillelse af protein C og inhibitor ved adsorption bortfalder. Det har endvidere vist sig, at det protein C-aktiverende slangegiftprotein 35 ikke udøver nogen påviselig proteinaseaktivitet og derfor hverken angriber et naturligt eller et syntetisk substrat.

DK 165199 B

8 I modsætning hertil udøver thrombin en spaltende virkning på syntetiske substrater såvel som en koagulerende virkning på naturlige substrater, hvilket har til følge, at throm-binets uønskede virkning må ophæves ved tilsætning af en 5 nøjagtig udmålt mængde af en specifik inhibitor. Det har sluttelig vist sig, at man med denne aktivator kan aktivere protein C så hurtigt, at en funktionel bestemmelse af protein C med tilgængelige automatiske apparater bliver mulig.

10 Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde til kvantitativ bestemmelse af protein c i et medium, der indeholder dette, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at a) aktivatorpræparat ifølge et hvilket som helst af 15 kravene 1-4 lades indvirke på mediet i så lang tid, at zymogenet protein C i maksimal grad aktiveres til en proteinase med protein Ca-aktivitet, og mængden af det således dannede aktiverede protein C bestemmes ved 1) måling af mængden af det farvede eller fluore-20 scerende spaltningsprodukt, der opstår ved den katalytiske hydrolytiske virkning af det aktiverede protein C på et syntetisk chromogent substrat, hvilken mængde er proportional med mængden af protein C i testblandingen, eller ved 25 2) måling af forlængelsen af koagulationstiden for et naturligt substrat, hvilken forlængelse er proportional med mængden af protein C i testblandingen, eller b) at der til mediet sættes et syntetisk chromogent 30 substrat samt aktivatorpræparatet, den hydrolytiske frigørelse af det farvede eller fluorescerende spaltningsprodukt fra det nævnte substrat følges fotometrisk, og indholdet af protein C i mediet beregnes ud fra den observerede maksimale substrathydrolysehastig-35 hed.

DK 165199B

9

Specificiteten af protein c-aktiveringen i humant citratplasma er blevet verificeret ved hjælp af specifikke pro-teinasesubstrater og -inhibitorer såvel som ved måling på faktormangelplasmaer. Ved inkubation af plasma med aktiva-5 torpræparatet ifølge opfindelsen blev der ikke aktiveret nogen enzymer, som spalter plasmakallikreinsubstratet Bz-L-Pro-L-Phe-L-Arg-pNA, faktor Xa-substratet CH3S02-D-Leu** Gly-L-Arg-pNA eller plasminsubstratet Tos-Gly-L-Pro-L-Lys-pNA. Målt på de chromogene substrater H-D-CHG-L-Pro-L-Arg-10 pNA og H-D-Pro-L-Pro-L-Arg-pNA blev der efter aktivering med aktivatorpræparatet ifølge opfindelsen i normalplasma og i plasma med en mangel på faktorerne VII, XI eller X fundet amidolytiske aktiviteter af samme størrelsesorden, medens der ved hjælp af aktivatorpræparatet ifølge opfin-15 delsen i protein C-frit humant plasma ikke kunne erkendes nogen aktivitet, der spaltede protein C-substraterne 2AcOH-H-D-Pro-L-Pro-L-Arg-pNA og 2AcOH-H-D-Lys (Cbo) -L-Pro-L-Arg-pNA. Målt på det chromogene substrat H-D-Pro-L-Pro-L-Arg-pNA hæmmes den protein C-aktivitet, der genereres ud fra 20 plasma ved hjælp af aktivatoren ifølge opfindelsen, ikke ved tilsætning af den specifikke thrombininhibitor hirudin eller ved tilsætning af den polyvalente menneskeurin-tryp-sin-inhibitor. Tilsætning af den polyvalente proteinase-inhibitor aprotinin til plasma inden inkubering med protein 25 C-aktivatoren ifølge opfindelsen forhindrer fuldkommen spaltningen af chromogene protein C-substratér. Tilsætning af aprotinin efter tilendebragt aktivering og under igangværende substratspaltning hæmmer reaktionen med det samme og fuldstændigt. Tilsvarende hæmmes også oprenset humant 30 protein C, som er aktiveret ved hjælp af insolubiliseret thrombin, også fuldstændigt af aprotinin. Disse resultater viser, at aktivatoren ifølge opfindelsen aktiverer protein C specifikt og derved hverken fører til dannelse af thrombin, plasmin, faktor Xa, plasmakallikrein eller til dannel-35 se af en anden enzymaktivitet, der spalter de chromogene protein Ca-substrater. Protein C-bestemmelsens nøjagtighed i plasma ved hjælp af aktivatoren ifølge opfindelsen og et chromogent substrat kunne endvidere påvises ved øgning af

DK 165199 B

10 det fysiologiske plasma-protein C-niveau med tilsat protein c. Det i tilsat plasma fundne protein C-indhold svarede til summen af den fysiologiske og tilsatte protein C-mængde. Endvidere kunne funktionsdygtigheden af protein C-bestem-5 melsesfremgangsmåden ifølge opfindelsen påvises ved aktivitetsmålinger i blandinger af protein c-frit og normalt humant plasma såvel som ved aktivitetsmålinger på normalt humant plasma med stigende tilsætninger af anti-protein C-antistoffer.

10 Opfindelsen angår endvidere et ud fra slangegifte fremstilleligt aktivatorpræparat, som har den egenskab at kunne omdanne protein C fra mennesker og hvirveldyr, fx får, ged, okse, hest, svin, kaniner og høns, til aktiveret protein C.

Som udgangsmateriale til fremstilling af protein C-akti-15 vatorpræparaterne ifølge opfindelsen egner sig gifte fra solenoglyphe slanger (dvs. slanger med bevægelige rørformede gifttænder), som tilhører hugormefamilien Viperidae. især gruppen Crotalinae og indenfor denne slægten Agkistro-don. Specielt egner sig giften fra arten Aa_ contortrix.

20 dennes underarter såsom A*_ contortrix contortrix. A. contortrix laticinctus. A. contortrix mokeson. A. contortrix phaeogaster. A. contortrix pictigaster. såvel som gift fra arter, som indgår i en immunologisk krydsreaktion med gift fra Ai contortrix, fx A piscivorus og dennes underarter 25 såsom Ai. piscivorus piscivorus. A. piscivorus conanti, A. piscivorus leucostoma og gift fra arten A^. bilineatus og dennes underarter såsom Aa_ bilineatus bilineatus. A. bilineatus tavlori og Aa. bilineatus russeolus.

En oversigt over den zoologiske klassificering af slange-30 faunaen findes i G. Underwood, "Classification and distribution of venomous snakes in the world". I: C.Y. Lee (red.) Snake venoms, 1979, s. 15-40, Berlin, Heidelberg,

New York: Springer-Verlag; oplysninger om immunologisk krydsreaktion mellem gifte fra forskellige slangearter og 35 antistoffer fra serum fra immuniserede pattedyr findes hos

DK 165199B

u S.A. Minton, "Common antigens in snake venoms", loc. cit. , s. 847-862.

Isolering og oprensning af protein C-aktivatoren fra slangegift kan udføres ved kendte metoder til proteinadskillel-5 se såsom fraktionerede ethanol- eller ammoniumsulfatfæld-ninger, høj- eller lavtrykschromatografi på molekylsi-eller ionbytningssystemer, affinitetschromatografi, præparativ elektroforese eller ved en kombination af flere af de nævnte teknikker. En aktuel oversigt over proteinsepara-10 tionsmetoder findes hos R. Scopes, Protein purification.

1982, New York, Heidelberg, Berlin: Springer-Verlag.

Aktivatorpræparatet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det omdanner zymogenet protein C til proteinase med protein Ca-aktivitet, og at det hverken har fibrinogen-15 koagulerende eller fibrin-spaltende aktivitet, hvilket præparat kan fås ud fra gift fra slangen Aakistrodon con-tortrix eller gift fra en slangeart, der indgår i en immunologisk krydsreaktion med giften fra Aakistrodon contor-trix, ved 20 a) chromatografi af en opløsning af giften på en anionbytter med en til binding af proteiner egnet porøsitet, fx tværbundet diethylaminoethyldextran (fx DEAE-Sephadex® A-50) eller diethylaminoethylcellulo-se,

25 b) eluering med natriumphosphatpuffer ved neutral pH

og tiltagende ionstyrke, c) afsaltning af de aktive fraktioner ved ultrafiltrering og d) efterfølgende lyofilisering.

30 Det på denne måde fremstillede aktivatorpræparat, afprøvet i en koncentration på 2 /zg pr. ml på humant fibrinogen, bevirkede inden for 10 minutter ingen koagulering og i løbet af 15 timer ingen fibrinolyse, afprøvet på en ikke-opvarmet humanfibrinplade.

DK 165199B

12 Målt på det syntetiske chromogene substrat H-D-Pro-L-Pro-L-Arg-pNA aktiveres oprenset humant protein C ved pH 8, ionstyrke 0,15 og 37° C ved hjælp af aktivatorpræparatet, i en koncentration på 2 μ g protein pr. 1 ml testblanding i 5 løbet af højst 10 minutter.

Aktivatorpræparatets protein C-aktiverende virkning formindskes ikke ved 15 timers inkubation af præparatet med 2,5 μΐηο 1 diisopropylfluorphosphat pr. 1 ml ved pH 8 eller ved 15 timers inkubation med 1 mg iodacetamid pr. 1 ml ved 10 pH 7 eller ved tilsætning af 0,05 μ mol ethylendiamintetra-eddikesyre-dinatriumsalt pr. 1 ml. Aktivatorpræparatets protein C-aktiverende virkning hæmmes endvidere hverken af thrombininhibitorerne antithrombin III, heparin og hirudin eller af den polyvalente proteinaseinhibitor aprotinin.

15 Aktivatorpræparatet ifølge opfindelsen i høj oprenset form kan også fås ved a) opløsning af slangegiften i et vandigt medium, b) fjernelse af uønskede giftbestanddele fra opløsningen enten ved fraktioneret alkoholfældning, fraktio-

20 neret saltfældning eller varmebehandling ved sur pH

med henblik på fremstilling af en foroprenset giftfraktion, c) videreoprensning af den vundne foroprensede giftfraktion ved chromatografi på en anionbytter med en 25 til binding af proteiner egnet porøsitet, fx tvær bundet diethylaminoethyldextran eller diethylaminoet-hylcellulose, d) eluering med natriumphosphatpuffer ved neutral pH og ved stigende ionstyrke, 30 e) yderligere chromatografi på en kationbytter, fx tværbundet carboxymethyldextran eller carboxymethy!-cellulose, f) eluering med en natriumacetatpuffer ved sur pH, g) koncentrering af det protein C-aktiverende eluat 35 ved ultrafiltrering,

DK 165199B

13 h) afsaltning og slutoprensning af koncentratet ved chromatografi på en molekylsigel, fx en tværbundet dextrangel, under anvendelse af fortyndet vandig eddikesyre som elueringsmiddel, og 5 i) efterfølgende lyofilisering.

Det på denne måde fremstillede aktivatorpræparat udmærker sig ved, at det i en koncentration på 0,1-0,5 pg pr. ml vandig reaktionsblanding ved pH 6-8 og ved en temperatur på 20-40°C i maksimal grad aktiverer det i 0,05 ml normalt 10 humant citratplasma indeholdte protein C i løbet af højst 10 minutter, at det i en koncentration på 5 μg pr. ml testblanding hverken bevirker en koagulation af humant fibrinogen i løbet af 10 minutter eller bevirker en lyse af humant fibrin i løbet af 15 timer, at det ikke aktiverer 15 prothrombin og koaguleringsfaktor X, at det ikke genererer nogen amidolytisk aktivitet fra protein C-frit plasma, at dets protein C-aktiverende virkning ikke formindskes ved 15 timers inkubation med 2,5 μΐηοΐ diisopropylfluorphosphat pr.

1 ml ved pH 8 eller ved inkubation med 1 mg iodacetamid pr.

20 1 ml ved pH 7 eller ved tilsætning af 0,05 /umol ethylendia-mintetraeddikesyre-dinatriumsalt pr. 1 ml, at den protein C-aktiverende virkning hverken hæmmes af thrombininhibi-torer såsom antithrombin III, heparin og hirudin eller af den polyvalente proteinaseinhibitor aprotinin, at dets 25 protein C-aktiverende virkning ikke tabes ved 10 minutters opvarmning ved 70°C ved pH 3-8 eller ved 24 timers opbevaring ved 20-25°C ved pH 2-8, at det efter 1 time ved pH 9 udviser et signifikant aktivitetsfald, at det efter tilsætning af 4% natriumdodecylsulfat eller af 5 /zmol man-30 gan(II)lactat pr. 1 ml mister sin protein C-aktiverende virkning, at det ved 24 timers behandling med dithio-threitol ved pH 7 kun mister lidt af sin aktivitet, at det neutraliseres af polyvalent antiserum, der er rettet mod amerikanske Crotalinae-slanger. at det efter reduktion med 35 dithiothreitol og påfølgende alkylering med iodacetamid ved polyacrylamidgelelektroforese i nærværelse af natriumdodecylsulfat og farvning med coomassieblåt udviser en enkelt

DK 165199B

14 zone med en relativ elektroforetisk mobilitet, der svarer til en molekylvægt på 39.000 ± 3.000, at det ved analytisk ultracentrifugering udviser en sedimentationskonstant (S20w) på 2,65 ± 3%, hvilket svarer til en molekylvægt på 5 36.800 ± 5%, at det fra en kalibreret søjle af tværbundet dextrangel (Sephadex® G-100) elueres med et specifikt volumen (Kav), som svarer til en molekylvægt på 37.000, at det udviser et ved isoelektrisk fokusering bestemt isoelektrisk punkt på 3,0 ± 0,2, at dets specifikke absorption i 1%'s 10 vandig opløsning ved 280 nm og 1 cm lysvej (A282cm 1%) udgør 13,5 + 0,5, at det udviser et indhold af kulhydrater på 20 ± 3%, at det i en koncentration på 1 /xg/ml testprøve ved inkubation med et chromogent substrat jfr. patentkrav 9 eller 10 ved pH 7-8,5 og 37°C ikke forårsager nogen for-15 øgelse større end 0,01 pr. minut af den ved 405 nm og 1 cm lysvej målte absorption, at det ved intravenøs indgift i en dosis på 80 U pr. kg legemsvægt til kaniner forlænger den aktiverede partialthromboplastintid i plasma med mindst det dobbelte af udgangsværdien, at det efter en intravenøs 20 dosis på 80 u pr. kg legemsvægt til kaniner ikke udløser nogen akutte toxiske symptomer og ingen adfærdsforstyrrelser, at gentagen subcutan indgift til kaniner deraf forårsager dannelse af antistoffer, og at de antistoffer, der er indeholdt i serum fra kaniner, som er immuniseret mod 25 aktivatorpræparatet, sammen med antigenet danner et udfældende complex, der kan påvises ved immunodiffusion.

Aktivatorpræparatet kan også fås ved dyrkning af genetisk ensartede (klonede) mikroorganismer såsom Escherichia coli eller Saccharomvces cerevisiae. som ved genmanipulation er 30 blevet gjort i stand til at biosyntetisere protein C-akti-vatoren.

Den genetiske omprogrammering af de relevante mikroorganismer kan opnås ved i og for sig kendte metoder, ved rekombination af disses arveinformation-bærende desoxyribonuclein-35 syre (DNA) med en DNA-kæde (gen), der bærer informationen til biosyntese af protein C-aktivator.

DK 165199 B

15

Til udvinding af gener, som bærer informationen til biosyntese af protein C-aktivatoren, kan der enten syntetiseres en DNA-kæde efter forbillede fra protein C-aktiva-torens primære struktur på en sådan måde, at kædens base~ 5 sekvens ved biosyntesen dikterer aktivatorens aminosyre-sekvens, og endvidere kan DNA-kæder ved kemiske indgreb modificeres således, at den nødvendige basesekvens opstår, eller der kan isoleres naturlige gener fra celler fra slangearter, som indeholder informationen til biosyntese af 10 protein C-aktivatoren.

Genteknologiens grundprincipper er beskrevet af E.L. Win-nacker, "Gene und Klone", 1985, Weinheim, VCA-Verlag.

Aktivatorpræparatet ifølge opfindelsen er også i stand til at aktivere protein C i hvirveldyrs levende organisme. Hvis 15 kaniner injiceres intravenøst med aktivatorpræparatet, og hvis den aktiverede partialthromboplastintid i plasmaprøver fra forsøgsdyrene måles før og efter injektionen, kan der fastslås en tydelig forlængelse af koagulationstiden. Denne forlængelse af den aktiverede partialthromboplastintid kan 20 føres tilbage til en ødelæggelse af faktorerne Va og VIIIa under koagulationsforløbet.

Ingen af dyrene udviste tegn på toxisk virkning fra aktivatorpræparatet. Disse resultater viser, at aktivatorpræparatet ifølge opfindelsen ud over til bestemmelse af 25 protein C også kan anvendes til farmakologisk arbejde vedrørende protein C-virkninger på forsøgsdyr. Dette aktivatorpræparat er endvidere anvendeligt som et antithrom-botisk virksomt medikament inden for human- og veterinærmedicinen.

30 Som naturlige substrater til måling af virkningen af aktiveret protein C i forhold til inaktivering af faktorerne V og VIII i en koagulationstest kan der anvendes frisk, frosset eller lyofiliseret blodplasma fra mennesker eller

DK 165199 B

16 pattedyr med de sædvanlige calciumionbindende tilsætninger såsom citrat eller oxalat, eller plasmapræparater, som ved opvarmning, pH-justering eller behandling med enzymer, adsorptions- eller proteinfældningsmidler er blevet befriet 5 for inhibitorer eller for en for protein C-bestemmelse ikke relevant komponent. Der kan også anvendes koagulationsfaktorkoncentrater, der er fremstillet ud fra blodplasma, eller biprodukter derfra, som kan finde anvendelse til terapeutiske formål, og endvidere faktormangelplasmaer.

10 Som syntetiske substrater til direkte fotometrisk måling af aktiviteten af aktiveret protein C egner sig oligopeptider, især di- eller tripeptidyl-L-argininderivater, hvis C-terminale arginin via en amidbinding, som kan spaltes enzymatisk af aktiveret protein C, er forbundet med en 15 chromogen gruppe, og salte deraf med mineralsyrer eller organiske syrer.

Der kan især anvendes forbindelser med den almene formel 0 ? '1· ni

Fl - D - NH - CH - C - L - Pro - L - Arg - R

(CH.)

I 2 n 3 NH - R

hvor n er 3 eller 4, R2 er hydrogen eller 20 a) en ligekædet eller forgrenet alkanoylgruppe med -2-6 carbonatomer, b) en ω-carboxyl-, ω-methoxycarbonyl- eller ω-et- hoxycarbonylalkanoylgruppe med 2-4 carbonatomer i alkanoyIdelen, 25 c) en ligekædet eller forgrenet alkoxycarbonylgruppe med 1-4 carbonatomer i alkoxydelen,

DK 165199B

17 d) en alkylsulfonylgruppe med 1-2 carbonatomer i alkyldelen, e) en usubstitueret eller substitueret benzoylgruppe eller 5 f) en i kernen usubstitueret eller substitueret benzyloxycarbonylgruppe, R3 er hydrogen eller en gruppe som defineret for R2 ifølge a)-f) og endvidere, når n = 3, en amidino-eller tosylamidinogruppe, og 10 R1 er en p-nitrophenylamino-, 1- eller 2-naphthylamino-, 4 -methoxy-2-naphthylamino-, 4-methylcumaryl- (7) -amino- , 1,3-di(methoxycarbonyl) phenyl-(5)-amino, quino-lylamino- eller nitroquinolylaminogruppe, eller et' salt deraf med en mineralsyre eller en organisk syre.

15 Som eksempler på sådanne syntetiske substrater kan der nævnes H-D-Pro-L-Pro-L-Arg-pNA, D-Pyroglu-L-Pro-L-Arg-pNA, H-D-Lys (€ -Cbo) -L-Pro-L-Arg-pNA, H-D-Lys-L-Pro-L-Arg-pNA og salte deraf, især hydrochloriderne og acetaterne.

Eftersom det protein c-aktiverende aktivatorpræparat (slan-20 gegiftprotein) ifølge opfindelsen i modsætning til thrombin ikke udviser nogen som helst påviselig proteinaseaktivitet og derfor ikke formår at spalte noget syntetisk protein C-substrat, kan der til bestemmelse af aktiveret protein C ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen også anvendes sådanne 25 substrater, som er ubrugelige ved de hidtidige fotometriske metoder til bestemmelse af protein C i plasma, eftersom' de ikke kun spaltes af aktiveret protein C, men også af det til aktivering anvendte thrombin.

Inden for denne kategori af syntetiske substrater falder 30 eksempelvis følgende forbindelser: 2AcOH·H-D-CHG-L-Pro-L-Arg-pNA, 2AcOH·H-D-CHG-L-Ala-L-Arg-pNA, Tos-Gly-L-Pro-L-Arg-pNA*AcOH og phenylsulfonyl-Gly-L-Pro-L-Arg-pNA·AcOH.

De i de ovenstående formler benyttede forkortelser har følgende betydning: Ala = alanin, Arg = Arginin, Cbo, =

DK 165199B

18 carbobenzoxy, CHG = cyclohexy lglycin, Lys = lys in, pNA = p-nitroanilid, Pro = prolin, Pyroglu = pyroglutaminsyre.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen tillader endvidere at bestemme aktiviteten af protein C-inhibitorer kvantitativt 5 ved, at en kendt mængde protein C blandes i den inhibitor-holdige prøve, det tilstedeværende protein C herpå omdannes til aktiveret protein C ved hjælp af aktivatorpræparatet, den ikke-hæmmede protein Ca-aktivitet bestemmes ved hjælp af et syntetisk eller naturligt substrat efter en udmålt 10 reaktionstid, og inhibitorindholdet beregnes ud fra forskellen mellem foreliggende og tilbageværende protein Ca-aktivitet.

Opfindelsen angår også anvendelsen af aktivatorpræparatet som antithrombotisk virksom komponent i lægemidler samt 15 antithrombotiske lægemidler, der som virksom komponent indeholder aktivatorpræparatet. Endelig angår opfindelsen en fremgangsmåde til udvinding af aktiveret protein C ud fra protein C-holdige vandige medier, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at aktivatorpræparatet med henblik på 20 insolubilisering bindes på en i vand uopløselig bærer, fx CNBr-Sepharose, putrescinagarose eller e-aminocaproyl-agarose, det insolubiliserede aktivatorpræparat lades indvirke på det protein C-holdige vandige medium til aktivering af protein C, det insolubiliserede aktivatorpræ-25 parat fjernes fra det vandige medium, når omdannelsen af protein C til aktiveret protein C er fuldført og det aktiverede protein C isoleres fra det vandige medium på i og for sig kendt måde.

EKSEMPEL 1 30 Fremstilling af et protein C-aktivatorpræparat ud fra A. contortrix- gift 200 mg Agkistrodon contortrix-gift blev opløst i 1 ml 0,015M natriumphosphatpuffer, pH 6,8, og centrifugeret, og

DK 165199B

19 supernatanten blev anbragt på en med den samme puffer ækvilibreret søjle med DEAE-Sephadex® A-50 (tværbundet diethylaminoethyldextran) med dimensionerne 2,6 x 90 cm.

Herpå blev der elueret med en lineær gradient blandet ud 5 fra 0,015M natriumphosphatpuffer, pH 6,8, og 0,4M natri-umchlorid i 0,015M natriumphosphatpuf fer, pH 6,8, og der blev opsamlet fraktioner på hver 20 ml. Den protein C-aktiverende virkning af de enkelte fraktioner blev bestemt ved, at kommercielt tilgængeligt bariumcitrat-eluat fra 10 humanplasma, 1 mU pr. ml (Plasma Barium Citrate Eluate,

Sigma-Chemie GmbH, Miinchen, BRD) blev inkuberet med prøven i 15 minutter ved 37eC, 0,1 ml derfra blev pipetteret til 0,1 ml humant normalplasma, denne blanding blev tilsat 0,1 ml kephalin-ellagsyrereagens (Actin®, Dade, Aguada, Puerto 15 Rico, USA) og 0,1 ml 0,025M calciumchlorid, et stopur øjeblikkeligt blev sat i gang, og tiden indtil koagulation blev bestemt. De protein C-aktivatorholdige prøver bevirkede en forlængelse af koagulationstiden fra 34 sekunder (kontrol uden eluat) til 60-90 sekunder, alt efter akti-20 vatorindhold.

Den protein C-aktiverende aktivitet var indeholdt i fraktionerne 40-45 (jfr. fig. 1 der viser isolering af protein C-aktivator ud fra A. Contortrix-gift ved hjælp af Chroma-tografi på DEAE-Sephadex® A-50). De forenede aktive eluater 25 fra 8 chromatografibatch'er blev koncentreret ved ultrafiltrering, vasket saltfrie, taget op i 0,1M glycin, pH 7,4, og lyofiliseret. Der blev vundet 830 mg lyofilisat med et proteinindhold på 16,5%.

5 μς af det fremstillede aktivatorpræparat (0,825 //g pro-30 tein) bevirkede ved 37®C og pH 8,0 maksimal aktivering i løbet af 7,5 minutter af 40 mU oprenset humant protein C, målt på det syntetiske, chromogene substrat 2AcOH·H-D-Pro-L-Pro-L-Arg-pNA.

EKSEMPEL 2 20

DK 165199B

Fotometrisk bestemmelse af oprenset protein C

Fra en stamopløsning af humant protein C, der var isoleret og oprenset ved bariumcitråtadsorption og påfølgende elu-5 ering, chromatografi på tværbundet diethylaminoethylagaro-se, chromatografi på dextransulfat-agarose og præparativ polyacrylamidgel-elektroforese, og med et proteinindhold på 1,1 mg pr. ml, blev der fremstillet en fortyndingsrække med 0,1M Tris-HCl-puffer, pH 8,0.

10 Protein C-indholdet i disse fortyndinger blev bestemt ved, at der til 0,200 ml af en opløsning af 0,025 mg/ml af den ifølge eksempel 1 fremstillede protein C-aktivator i en. fotometerkuvette blev sat 0,010 ml protein C-fortynding, at der blev inkuberet i 7,5 minutter ved 37°C, at der blev 15 tilsat 1,390 Tris-imidazolpuffer, pH 8,4, ionstyrke 0,3, og 0,400 ml af det chromogene substrat 2AcOH·H-D-Pro-L-Pro-L-Arg-pNA, 4 μίαοί pr. ml, og at den på grund af frigjort p-nitroanilin bevirkede absorptionsforøgelse (ΔΑ) ved 405 nm blev registreret kontinuerligt.

20 Ud fra absorptionsforøgelsen pr. tidsenhed blev prøvens protein C-indhold beregnet ud fra følgende ligning:

ΔΑ/min. · V

_ = U/ml prøve v · e.

25 V =. Testvolumen v = Prøvevolumen e Millimolær ekstinktionskoefficient for p-nitroa-nilin U = International enzymenhed, den enzymmængde, som 30 under standardbetingelser omsætter 1 /imol sub strat pr. minut

DK 165199B

21

Den målte og af aktiveret protein C bevirkede substratspaltning er proportional med prøvens protein C-indhold (se tabel 1).

TABEL 1

5 Fotometrisk indholdsbestemmelse af oprenset protein C

μ 1 protein C- Δ A/minut U protein C pr.

stamopløsning ml stamopløsning 10 0,080 16,1 10 12 0,098 16,4 15 0,126 16,9 18 0,152 16,9 20 0,166 16,6 15 EKSEMPEL 3

Fotometrisk bestemmelse af protein C i plasma

Protein C-indholdet i humant citratplasma blev bestemt ved, at 0,200 ml protein c-aktivator (fremstillet ifølge eksempel 1, 0,025 mg/ml) i en f otometer kuve tte fik tilsat 20 0,050 ml plasma, blev inkuberet i 7,5 minutter ved 37°C, fik tilsat 1,550 ml Tris-imidazolpuffer, pH 8,4, ionstyrke 0,3, og 0,200 ml af det chromogene substrat 2ÅcOH*H-D-CHG-L-Pro-L-Arg-pNA, 4 μΐηοΐ/ml, og den på grund af frigjort p-nitroanilin bevirkede absorptionsforøgelse ved 405 nm blev 25 registreret kontinuerligt.

Ved hjælp af den i eksempel 2 viste ligning blev der beregnet et protein C-indhold på 0,90 U pr. ml plasma.

DK 165199 B

EKSEMPEL 4 22

Bestemmelse af protein C i plasma ved en koagulationsmetode 0,1 ml reagens til bestemmelse af den aktiverede partial-thromboplastintid (Actin®, DADE, Aguada, Puerto Rico, USA), 5 0,1 ml plasma og 0,1 ml af den ifølge eksempel 1 fremstil lede aktivator (200 μg/ml) blev inkuberet i 60 sekunder ved 37°C, fik tilsat 0,1 ml 0,025M calciumchloridopløsning, og ved hjælp af et stopur blev tiden indtil koagulationens · indtrædelse bestemt.

10 Som model for protein C-deficient plasma blev der til normalplasma sat forskellige doser af et kommercielt tilgængeligt anti-protein c-antistofpræparat (Merz og Dade, Diidingen, CH).

Koagulationen af normalplasma forlænges flere gange på 15 grund af aktiveringen af protein C; tilsætning af anti-protein C fører til en dosisafhængig koagulationstidsforkortelse (tabel 2).

TABEL 2

Plasma Protein C-akti- Anti-protein C Koagulerings- 20 (ml) vator (ml) (μΐ) tid (sek.) 0,1 - - 35,5· 0,1 0,1 - 140,5 0,1 0,1 2,5 108,0 25 0,1 0,1 5,0 79,5 0,1 0,1 10,0 51,5 EKSEMPEL 5 23

DK 165199B

100 mg af den ifølge eksempel 1 vundne aktivator blev opløst i 100 ml fysiologisk natriumchloridopløsning, pH-værdien blev justeret til 7,4 ved hjælp af IN NaOH, og 5 opløsningen blev filtreret steril gennem et membranfilter med en porestørrelse på 0,22 μία.

Tre kaniner fik intravenøst injiceret 1 ml af denne opløsning pr. kg legemsvægt. Før og 30 minutter efter injektionen blev den aktiverede partialthromboplastintid i 10 plasmaprøver fra forsøgsdyrene målt. For hvert dyr blev der observeret en kraftig forlængelse af koagulationstiden; ingen af dyrene viste symptomer på toxiske virkninger.

Resultaterne fra dette forsøg er sammenfattet i tabel 3.

TABEL 3 15 Dyr nr. Aktiveret partialthromboplastintid (sekunder) Før injektion 30 minutter efter injektion 1 12,5 125 2 24 150 20 3 19,5 60 EKSEMPEL 6 24

DK 165199B

Fremstilling af et højoprenset protein C-aktivatorpræparat ud fra Aj. contortrix-crift 1 g As. cgntorhrix-gift blev opløst i 100 ml vand, opløs-5 ningens pH- værdi blev justeret til 3,0 ved hjælp af IN orthophosphorsyre, og den sure giftopløsning blev holdt i 10 minutter i et vandbad ved 70 ± 2° C og blev derefter afkølet til 20°C, pH-værdien blev justeret til 7,2 ved hjælp af IN natriumhydroxidopløsning, den uklare opløsning 10 blev centrifugeret, og supernatanten blev fortyndet til et volumen på 100 ml med destilleret vand for på denne måde at opnå en foroprenset giftfraktion.

Den foroprensede giftfraktion blev anbragt på en søjle af DEAE-Sephadex® A-50 med dimensionerne 2,6 x 90 cm, som var 15 ækvilibreret med 0,015M natriumphosphatpuffer, pH 6,8, og blev elueret med en lineær gradient blandet ud fra 0,015M natriumphosphatpuffer, pH 6,8, og 0,4M natriumchlorid i 0,015M natriumphosphatpuffer, pH 6,8, og fraktioner på hver 20 ml blev opsamlet. Den protein C-aktiverende virkning af 20 de enkelte fraktioner blev bestemt ved, at 0,1 ml humant citratplasma fik tilsat 0,1 ml prøve (1:350 i vand fortyndet fraktion) og 0,1 ml kephalin-ellagsyrereagens (Ac-tin®) og 0,1 ml 0,025M calciumchloridopløsnihg, et stopur med det samme blev sat i gang, og tiden indtil koagulatio-25 nen blev bestemt. De protein C-aktivator-holdige prøver bevirkede en forlængelse af koagulationstiden fra 34 sekunder til op til 200 sekunder, alt efter aktivatorindhold.

De protein C-aktiverende fraktioner blev forenet, koncentreret til 1/10 af eluatvolumenet ved ultrafiltrering,

30 taget op i 0,05M natriumacetatpuffer, pH 5,0, og justeret til 100 ml, sat på en søjle af CM- Sephadex® C-50, der var ækvilibreret med 0,05M natriumacetatpuffer, pH 5,0, og elueret med en lineær gradient blandet ud fra 0,05M na-triumacetatpuffer, pH 5,0, og 0,4M natriumchlorid i 0,05M

DK 165199B

25 natriumacetatpuffer, pH 5,0, og fraktioner på hver 20 ml blev opsamlet og ved den ovenfor beskrevne metode afprøvet med hensyn til protein C-aktiverende virkning.

De protein C-aktiverende fraktioner blev blandet sammen, 5 koncentreret til 1/25 af deres volumen ved ultrafiltrering, justeret til 25 ml ved hjælp af 1% eddikesyre i destilleret vand og sat på en søjle af Sephadex® G-100, der var ækvili-breret med 1% eddikesyre i vand, og blev elueret med 1% eddikesyre, og fraktioner på hver 20 ml blev opsamlet, som 10 igen ved den indledningsvis beskrevne metode blev afprøvet med hensyn til protein C-aktiverende virkning.

De protein c-aktiverende fraktioner blev forenet og lyo.fi-liseret. Der blev vundet et saltfrit aktivatorpræparat, som ved polyacrylamid- gelelektroforese udviste en enkelt zone 15 og udviste en protein C-aktiverende aktivitet på 35 u pr. mg.

Én enhed (U) protein C-aktivator er den mængde, som under standardbetingelser fuldstændig aktiverer den mængde protein C, der er indeholdt i 1 ml normalt humant citratplas-20 ma.

EKSEMPEL 7

Udvinding af aktiveret protein C

25 mg aktivatorpræparat ifølge eksempel 6 blev opløst i. 100 ml 0,1M natriumhydrogencarbonatpuffer, pH 8,3, og 0,5 molær 25 med hensyn til NaCl. Opløsningen fik tilsat 5 g CNBr-Sepha-rose 4B (AB Pharmacia, Uppsala, SE), som på forhånd var blevet vasket i Ο,ΟΟΙΝ saltsyre. Blandingen blev omrørt i 2 timer ved 20-25°C. Efter endt reaktion blev blandingen filtreret på et sugeglasfilter G3, og det frafiltrerede 30 insolubiliserede aktivatorpræparat blev vasket med 5 x 30 ml natriumhydrogencarbonatpuffer med den ovenfor beskrevne sammensætning. Til mætning af eventuelt tilstedeværende

DK 165199B

26 reaktionsdygtige CNBr- grupper blev det insolubiliserede aktivatorpræparat omrørt i 2 timer med 100 ml 0,5%'s ethan-olamin i natriumhydrogencarbonatpuffer med den ovennævnte sammensætning, igen opsamlet på et sugeglasfilter og igen 5 vasket med 3 x 300 ml natriumhydrogencarbonatpuffer.

Én enhed bariumsulfat-eluat af humant plasma (Sigma-Chemie GmbH, Miinchen, BRD) opløst i 100 ml destilleret vand blev filtreret gennem et membranfilter, porestørrelse 0,4 pm.

Denne opløsning, som udviste et ved hjælp af D-Lys(Cbo)-Ι-ΙΟ Pro-L-Arg-pNA bestemt indhold på 0,9 U protein C pr. ml, fik tilsat det insolubiliserede aktivatorpræparat, blev omrørt i 2 timer ved stuetemperatur og blev herpå filtreret gennem et sugeglasfilter. Filtratet udviste et indhold på 0,95 U aktiveret protein C.

Claims

1. Aktivatorpræparat, kendetegnet ved, at det omdanner zymogenet protein C til proteinase med protein ca-aktivitet, og at det 5 hverken har fibrinogen-koagulerende eller fibrin-spaltende aktivitet, hvilket præparat kan fås ud fra gift fra slangen Aakistrodon contortrix eller gift fra en slangeart, der indgår i en immunologisk krydsreaktion med giften fra Aakistrodon contortrix. ved 10 a) chromatografi af en opløsning af giften på en anionbytter med en til binding af proteiner egnet porøsitet, fx tværbundet diethylaminoethyldextran eller diethylaminoethylcellulose, b) eluering med natriumphosphatpuffer ved neutral pH 15 og tiltagende ionstyrke, c) afsaltning af de aktive fraktioner ved ultrafiltrering og d) efterfølgende lyofilisering.

2. Aktivatorpræparat ifølge krav 1 i højoprenset form, 20 kendetegnet ved, at det kan fås ved a) opløsning af slangegiften i et vandigt medium, b) fjernelse af uønskede giftbestanddele fra opløsningen enten ved fraktioneret alkoholfældning, fraktioneret saltfældning eller varmebehandling ved sur pH 25 med henblik på fremstilling af en foroprenset gift fraktion, c) videreoprensning af den yundne foroprensede giftfraktion ved chromatografi på en anionbytter med en til binding af proteiner egnet porøsitet, fx tvær- 30 bundet diethylaminoethyldextran eller diethylaminoet hylcellulose, d) eluering med natriumphosphatpuffer ved neutral pH og ved stigende ionstyrke, e) yderligere chromatografi på en kationbytter, fx 35 tværbundet carboxymethyldextran eller carboxymethyl- cellulose, DK 165199B f) eluering med en natriumacetatpuffer ved sur pH, g) koncentrering af det protein C-aktiverende eluat ved ultrafiltrering, h) afsaXtning og sXutoprensning af koncentratet ved 5 chromatografi på en moXekyXsigeX, fx en tværbundet dextrangeX, under anvendelse af fortyndet vandig eddikesyre som elueringsmiddel, og i) efterfølgende lyofilisering.

3. Aktivatorpræparat ifølge krav 1, 10 kendetegnet ved, at det i en koncentration på 2 μς protein pr. ml testblanding, ved pH 8, ionstyrke 0,15 og 37°C forårsager maksimal aktivering af det i 0,05 ml normalt humant citratplasma indeholdte protein C i løbet af højst 10 minutter, og at det i en koncentration på 2 μ<$ 15 protein pr. ml testblanding hverken bevirker en koagulation af humant fibrinogen i løbet af 10 minutter eller bevirker en lyse af humant fibrin i løbet af 15 timer.

4. Aktivatorpræparat ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det i en koncentration på 20 0,1-0,5 μg pr. ml vandig reaktionsblanding ved pH 6-8 og ved en temperatur på 20-40°C forårsager maksimal aktivering af det i 0,05 ml normalt humant citratplasma indeholdte protein c i løbet af højst 10 minutter, og at det i en koncentration på 5 μg pr. ml testblanding"hverken be-25 virker en koagulation af humant fibrinogen i løbet af 10 minutter eller bevirker en lyse af humant fibrin i løbet af 15 timer.

5. Fremgangsmåde til kvantitativ bestemmelse af protein C i et medium, der indeholder dette, 30 kendetegnet ved, at a) aktivatorpræparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4 lades indvirke på mediet i så lang tid, at zymogenet protein C i maksimal grad aktiveres til en proteinase med protein Ca-aktivitet, og mængden af det 35 således dannede aktiverede protein C bestemmes ved DK 165199B 1. måling af mængden af det farvede eller fluorescerende spaltningsprodukt, der opstår ved den katalytiske hydrolytiske virkning af det aktiverede protein C på et syntetisk chromogent 5 substrat, hvilken mængde er proportional med mængden af protein C i testblandingen, eller ved 2. måling af forlængelsen af koagulationstiden for et naturligt substrat, hvilken forlængelse er proportional med mængden af protein C i test- 10 blandingen, eller b) at der til mediet sættes et syntetisk chromogent substrat samt aktivatorpræparatet, den hydrolytiske frigørelse af det farvede eller fluorescerende spaltningsprodukt fra det nævnte substrat følges fotome-15 trisk, og indholdet af protein C i mediet beregnes ud fra den observerede maksimale substrathydrolysehastig-hed.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at der som protein C-holdigt 20 medium anvendes blodplasma eller fraktioner deraf, opløsninger af oprenset protein C, eluater af protein C-adsor-bater, organekstrakter eller vævskulturfiltrater og -ekstrakter .

7. Fremgangsmåde ifølge krav 5 eller 6, 25 kendetegnet ved, at der som syntetisk chromogent substrat anvendes et oligopeptid, til hvilket en chromogen gruppe, som kan fraspaltes ved hjælp af aktiveret protein C, er bundet via en amidbinding. DK 165199B

8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 5- 7, kendetegnet ved, at der som syntetisk substrat anvendes en forbindelse med den almene formel 0 R2 - D - NH - CH - ft - L - Pro - L - Arg - R1 (ca,) i 2 n NH - R~ 5 hvor n er 3 eller 4, R2 er hydrogen eller a) en ligekædet eller forgrenet alkanoylgruppe med 2-6 carbonatomer, b) en ω-carboxyl-, ω-methoxycarbonyl- eller ω-et- 10 hoxycarbonylalkanoylgruppe med 2-4 carbonatomer i alkanoyIdelen, c) en ligekædet eller forgrenet alkoxycarbonylgruppe med 1-4 carbonatomer i alkoxydelen, d) en alkylsulfonylgruppe med 1-2 carbonatomer i 15 alkyIdelen, e) en usubstitueret eller substitueret benzoylgruppe eller f) en i kernen usubstitueret eller substitueret benzyloxycarbonylgruppe,

20 R3 er hydrogen eller en gruppe som defineret for R2 ifølge a)-f) og endvidere, når n = 3, en amidino-eller tosylamidinogruppe, og R1 er en p-nitrophenylamino-, 1- eller 2-naphthylamino-, 4-methoxy-2-naphthylamino-, 4-methylcumaryl-(7)-ami-25 no-, l,3-di(methoxycarbonyl)phenyl-(5)-amino, quino- lylamino- eller nitroquinolylaminogruppe, eller et salt deraf med en mineralsyre eller en organisk syre. DK 165199B

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 5- 8, kendetegnet ved, at der som syntetisk substrat anvendes et vandopløseligt salt, fx hydrochloridet eller 5 acetatet, af H-D-Pro-L-Pro-L-Arg-pNA, D-Pyroglu-L-Pro-L-Arg-pNA, H-D-Lys(e-Cbo)-L-Pro-L-Arg-pNA eller H-D-Lys-L-Pro-L-Arg-pNA.

10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 5- 8, 10 kendetegnet ved, at der som syntetisk substrat anvendes én af følgende forbindelser: 2AcQH·H-D-CHG-L-Pro-L-Arg-pNA, 2AcOH·H-D-CHG-L-Ala-L-Arg-pNA, Tos-Gly-L-Pro-L-Arg-pNA· AcOH og phenylsulfonyl-Gly-L-Pro-L-Arg-pNA*AcOH.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 5 eller 6, kendetegnet ved, at der som naturligt substrat til måling af virkningen af aktiveret protein c via inaktivering af faktorerne V og VIII i koagulationstesten anvendes frisk, frosset eller lyofiliseret plasma fra menne-20 sker eller hvirveldyr med de sædvanlige calciumionbindende tilsætninger såsom citrat, oxalat eller ethylendiamintetra-acetat, eller et plasmapræparat, som ved opvarmning, pH-ændring eller behandling med enzymer, adsorptions- eller proteinfældningsmidler er blevet befriet for' inhibitorer 25 eller for ved protein C-bestemmelse ikke-relevante komponenter .

12. Anvendelse af aktivatorpræparatet ifølge krav l og/eller 2 som antithrombotisk virksom komponent i lægemidler, især i antithrombotika.

13. Antithrombotisk lægemiddel, kendetegnet ved, at det som antithrombotisk virksom komponent indeholder aktivatorpræparatet ifølge krav 1 og/eller 2. DK 165199 B

14. Fremgangsmåde til udvinding af aktiveret protein C ud fra protein C-holdige vandige medier, kendetegnet ved, at aktivatorpræparatet ifølge krav 1 og/eller 2 med henblik på insolubilisering bindes på 5 en i vand uopløselig bærer, fx CNBr-Sepharose, putrescina-garose eller e-aminocaproylagarose, det insolubiliserede aktivatorpræparat lades indvirke på det protein C-holdige vandige medium til aktivering af protein C, det insolubiliserede aktivatorpræparat fjernes fra det vandige medium, 10 når omdannelsen af protein C til aktiveret protein C er fuldført og det aktiverede protein C isoleres fra det vandige medium på i og for sig kendt måde. ✓