BRPI0200269B1 - processo de purificação de proteínas solúveis das cerdas da l. obliqua com atividade ativadora de protrombina e uso da fração proteica - Google Patents

Abstract

"processo de purificação de proteínas solúveis das cerdas da l. obliqua com atividade ativadora de protrombina; processo para determinação parcial da seqüência de aminoácidos do ativador de protrombina; processo de determinação da atividade ativadora de protrombina da fração ii, seqüência n-terminal e seqüência de fragmentos internos da fração ativadora de protrombina, ativador de protrombina e uso do ativador de protrombina". a presente invenção refere-se a um processo de purificação de proteínas solúveis das cerdas da l. obliqua com atividade ativadora de protrombina; ao processo para determinação parcial da seqüência de aminiácidos do ativador de protrombina; ao processo de determinação da atividade ativadora de protrombina da fração ii bem como a seqüência n-terminal e seqüência de fragmentos internos da fração ativadora de protrombina ao ativador de protrombina e ao uso do ativador de protrombina partindo-se da homogeneização das cerdas de l. obliqua. a presente invenção vem comprovar que um único componente do veneno da lonomia obliqua, lopap, causa a síndrome hemorrágica diretamente pela ativação de protrombina e, portanto, deveria encaminhar uma terapia no caso de acidentes com lonomia obliqua. de acordo com a presente invenção o lopap é um novo ativador de protrombina, o que é um importante fator responsável pela coagulopatia de consumo, encontrado em pacientes envenenados por l. oblíqua. em doses baixas a proteína purificada, pela sua capacidade de ativar protrombina gerando trombina, retira da circulação de forma controlada o fibrinogênio, transformando-o em microcoágulos de fibrina. esta diminuição da concentração plasmática de fibrinogênio permite que o tempo de coagulação do sangue se prolongue e, portanto, impede a trombose vascular aguda. pelo fato de não possuir atividade proteolítica a proteína manteria a capacidade coagulante do fibrinogênio não consumido no processo. desta forma a concentração plasmática de fibrinogênio seria diminuída, porém, não haveria predisposição para um estado hemorrágico. além disso, poderia ser utilizada na confecção de kits diagnósticos para detecção de protrombina plasmática.

Description

PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS SOLÚVEIS DAS CERDAS DA

L. OBLIQUA COM ATIVIDADE ATIVADORA DE FROTROMBINA E USO DA FRAÇÃO PROTEICA

Campo da Invenção [0001] A presente invenção refere-se a um processo de purificação de proteínas solúveis das cerdas da L. oblíqua com atividade ativadora de protrombina; ao processo para determinação parcial da sequência de aminoãcidos do ativador de protrombina; ao processo de determinação da atividade ativadora de protrombina da fração II, bem com, ao ativador de protrombina e ao uso do ativador de protrombina.

Antecedentes da Invenção: [0002] A protrombina é uma proteína plasmática, dependente da vitamina K, que é envolvida na coagulação do sangue. A ativação da protrombina é catalisada através do complexo protrombinase que é composto pelo Fatos Xa, Fator Va, fosfolipídeos e íons cálcio e ocorre através da divagem (em sequência) de duas ligações peptídicas da molécula da protrombina (Mann K G. Prothrombin and Thrombin. In: Colman RN, Marder VJ, Salzman EW, Hirsh J eds. Haemostasis and Thrombosis. Basic Principies and Clinicai Practice. Philadelphia: J. B. Lippincott; 1994. P 184-99). A primeira divagem ocorre entre as ligações Arg.320 e Ile321, e esta hidrólise leva à formação de um ativador intermediário, a meizotrombina. A Segunda divagem ocorre entre as ligações Arg271 e Thr272, e libera os fragmentos 1, 2 e a serino protease α-trombina (Mann K G. Prothrombin and Thrombin. In: Colman RN, Marder VJ, Salzman EN, Hirsh J eds. Haemostasis and Thrombosis. Basic Principies and Clinicai Practice. Philadelphia: J. B. Lippincott; 1994. P .184-99).

Na ausência de fosfolipideos, a protrombina pode ser ativada por concentrações fisiológicas do fator Xa, no entanto, a velocidade de ativação é 5 ordens de grandeza menor que a ativação pelo complexo protrombinase (Mann KG. Membrane-bound enzyme complexes in blood coagulation. Prog. Hemost Thromb. 1984;7:1-23.), sendo que o mecanismo de ativação ocorre através da formação de pretrombina (Mann KG. Membrane-bound enzyme complexes in blood coagulation. Prog. Hemost Thromb. 1984;7:1-23.) ao invés da meizotrombina (Heldebrandt CM, Butkowski RJ, Bajaj SP, Mann KG. The activation of prothrombin. H.

Partial reactions, physical and Chemical characterization of the intermediates of activation. J Biol. Chem. 1973; 248: 7149-63). A α-trombina é a serino protease responsável pela conversão do fibrinogênio em fibrina, ativação dos fatores V, VIII, e XIII, e agregação plaquetária (Mann KG, Downing MR. Thrombin generation. In: Lundblad RL, Fenton JW, Mann KG, Eds. Chemistry and Biology of Thrombin. Ann Arbor Science; 1977. Pp. 11-21; Lundblad RL, Kingdon HS, Mann KG. Thrombin. Methods Enzymol. 1976; 45:156-76).

Muitas serpentes venenosas contêm proteínas pró-coagulantes que são capazes de ativar zimogênios, os quais participam da coagulação do sangue.

Tendo em vista que os mecanismos pelos quais as enzimas de venenos ativam os fatores da coagulação de forma diferente das enzimas encontradas em mamíferos, os ativadores de venenos podem fornecer informações adicionais sobre os mecanismos de ativação dos fatores da coagulação. Os ativadores de protrombina do veneno são classificados como Tipo 1 (p.e. ecarina), Tipo 2 (p.e. ativador de Notechis scutatus), 3 (p.e.

Oxyuranus scutellatus) , e 4 (p.e. ativador de Agkistrodon acutus) dependendo da sua interação com os componentes do complexo protrombinase (Rosíng J, Tans G. Inventory of exogenous prothrombin activators. Thromb. Haemost. 1991; 65 (5): 627-30).

Ativadores do tipo 1 não dependem dos componentes do complexo protrombinase, Tipo 2 dependem de fosfolipídeos , Ca2+ e Fator Va, Tipo 3 dependem de fosfolipídeos e Ca2+ . Ativadores do Tipo 4 podem necessitar ou não dos componentes do complexo protrombinase e podem clivar ligações peptídicas na protrombina sem convertê-la em seus produtos com atividade catalítica (e.g. trombina ou meizotrombina).

Os ativadores do Tipo 4 e a trombina hidrolisam a protrombina nas mesmas posições (Arg 155-Ser 156 e Arg 284-Thr 285), gerando fragmentos similares ou idênticos para pretrombina 1 e pretrombina 2 (Rosing J, Tans G. Structural and functional properties of snake venom prothrombin activators. Toxicon. 1992; 30: 1515 -27.) Na hemolinfa bruta da Lonomia achelous dois tipos de atividade de ativadores de protrombina foram descritos. Um deles é capaz de ativar diretamente a protrombina, independentemente do complexo protrombinase, e o outro é estimulado por fator v, íons cálcio, e fosfolipídeos (Guerrero BAG, Arocha-Pinãngo. Activation of human prothrombin by the venom of Lonomia achelous (Cramer) caterpillars. Thrombos. Res. 1992;66:169-77).

No extrato bruto das cerdas de L. obliqua uma atividade procoagulante foi descrita a qual é devida a ativadores de protrombina e Fator X (Kelen EMA. Duarte A.C, Tomy SC, Sano-Martins ISr Castro SCB, Guerrero B, Arocha-Pinango CL. Acquired haemorrhagic syndrome from contact with a Caterpillar (Lonomia oblíqua Walker 1855,· Saturniidae). Toxicon 1996: 34:146., Donato JL, Moreno RA, Hyslop S. Duarte AC, antunes E, Le Bonniec BF, Rendu F, Nuccí G. Lonomia obliqua Caterpillar spicules trigger human blood coagulation via activation of factor X and prothrombin. Thromb. Haemost. 1998; 79: 539-42). 0 veneno de Lonomia obliqua causa uma severa coagulopatia de consumo, a qual pode levar à síndrome hemorrágica. 0 extrato bruto das cerdas apresenta uma atividade procoagulante devido à ativação do fator X e da protrombina.

Desde 1989, uma síndrome hemorrágica causada pelo contato com a taturana Lonomia obliqua tornou-se uma epidemia no Brasil e casos fatais devido a complicações renais e hemorragias cerebrais têm sido descritos. Os acidentes afetam o mecanismo da coagulação, resultando numa drástica diminuição do fibrinogênio, e dos fatores V e XIII. Além disso, ocorre a diminuição dos níveis de plasminogênio de α-2-antiplasmina e da atividade da proteína C, um inibidor natural da coagulação. Estes ciados indicam uma coagulopatia de consumo com fibrinólise.

Os sintomas decorrentes dos acidentes provocados pela lagarta Lonomia obliqua são: dermatite urticante, equimoses e hematomas (espontâneos ou provocados por traumas), hemorragias das cavidades mucosas (gengivas, hemorragia nasal), hematúria, sangramento de feridas recentes, e hemorragias abdominais, pulmonares, glandulares e cerebrais. Casos fatais relatados foram atribuídos a complicações renais e hemorragias cerebrais.

Estudos anteriores sobre acidentes pelo contato com L. achelous na Venezuela sugeriam que nestes casos a síndrome hemorrágica podería ser explicada por uma grave síndrome fibrinolítica associada a uma coagulação intravascular disseminada. Embora os sintomas clínicos do envenenamento pela Lonomia obliqua e Lonomia obliqua serem muito similares, os resultados dos trabalhos executados, nos laboratórios, pelos pesquisadores da presente invenção demonstram e sugeriram uma interpretação diferente para esta última, atribuindo o principal mecanismo molecular da síndrome hemorrágica à formação de trombina.

Mais especificamente, nos últimos dez anos tem sido relatado na região Sul do Brasil um crescimento de ocorrências de síndrome hemorrágica humana causada pelo contato com a lagarta Lonomia obliqua. 0 veneno causa uma grave coagulopatia de consumo, que pode resultar numa síndrome hemorrágica. A presente invenção parte do princípio de que um extrato bruto preparado com cerdas da Lonomía obliqua ativou tanto a protrombina quanto o Fator X. Em envenenamentos acidentais, ocorre a apresentação de alterações na coagulação e em fatores fibrinolíticos.

Lopap (Lononia obliqua protrombin activator protease) é um serino protease de 69 kDa isolada do extrato das cerdas da lagarta Lonomia obliqua, a qual tem sua atividade aumentada por Ca2+, é capaz de converter diretamente protrombina em trombina de forma dose-dependente. O seu mecanismo de ação é similar ao do Fator Xa, formando fragmentos de pretrombina na via independente do complexo protrombinase. Lopap hidrolisa um substrato fluorogênico baseado na seqüência da protrombina na mesma ligação peptídica pela trombina. A presente invenção também parte da verificação da caracterização biológica da serino protease ativadora da protrombina isolada do extrato bruto das cerdas da Lonomia obliqua, a qual, reproduziu os efeitos do veneno total na coagulação do sangue e formação de trombos nos ratos.

De acordo com a presente invenção o Lopap purificado foi obtido de extrato bruto das cerdas de Lonomia obliqua onde as ditas cerdas foram extraídas em PBS, e o ativador de protrombina foi purificado por gel de filtração, e por duas etapas cromatográficas em fase reversa. A atividade ativadora de protrombina foi monitorada empregando o substrato cromogênico, S-2238 baseado na següência de protrombina, e clivado pela trombina. A presente invenção vem comprovar que um único componente do veneno da Lonomia obliqua, Lopap, causa a síndrome hemorrágica diretamente pela ativação de protrombina e portanto deveria encaminhar uma terapia no caso de acidentes com Lonomia obliqua. A avaliação dos efeitos da injeção de Lopap em ratos, analisando os parâmetros de coagulação, o comportamento dos vasos da microcirculação e os distúrbios em órgãos distintos, quando doses de 100 μg/kg foram injetadas, e o efeito monitorado por 1 hora, demonstrou que o sangue tornou-se incoagulável, a contagem de plaquetas decresceu aproximadamente 40% e a indução da agregação plaquetária induzida por colágeno no sangue total foi completamente abolida. Os números de eritrócitos e de leucócitos no sangue total não foram alterados, apesar da alta concentração de toxina. Por outro lado, intensa parada venular e áreas hemorrágicas foram observadas. A geração da trombina intravascular pode explicar a diminuição da contagem das plaquetas e a hipoagregação de plaquetas após a injeção de Lopap nos ratos, sendo a trombina o principal e mais ativo agonista plaquetário.

Observando a rede microcirculatória visualizou-se coágulos de fibrina em vasos poscapilares 5 min após a injeção de Lopap. As alterações foram proeminentes 1 h após esta administração, quando parada de alguns vasos e intensas áreas hemorrágicas se tornaram aparentes. Este fenômeno pode estar implicado aos hematomas observados na maioria dos pacientes humanos envenenados. Análises histológicas de diversos órgãos em animais experimentais foram realizadas 1 hora após a injeção de Lopap. Foram encontradas alterações somente nos tecidos dos pulmões e rins, sendo este de maior importância, já que áreas hemorrágicas e necróticas foram encontradas. Pacientes que desenvolvem médio ou grave envenenamento geralmente apresentam hematúria e às vezes deficiência renal, que consequentemente podem levar à morte. As lesões nos rins encontrados nos ratos experimentais podem ser causadas pela hemorragia e/ou pelo depósito de fibrina no glomérulo. Talvez durante um tempo maior de envenenamento, os microtrombos e os sinais de congestão em outros órgãos, incluindo o sistema nervoso central, poderíam se tornar aparentes.

Baseado nestas verificações a presente invenção sugere que Lopap é um novo ativador da protrombina, que parece ser um fator muito importante responsável pelos principais sintomas encontrados em pacientes humanos envenenados por Lonomia oblíqua Para avaliar se um ou mais ativadores de protrombina da toxina da taturana poderíam estar envolvidos, as proteínas solúveis das cerdas da Lonomia oblíqua foram purificadas por cromatografias de gel-filtração e fase reversa (HPLC). A ativação da protrombina foi monitorada usando-se a protrombina e o substrato cromogênico específico para trombina S2238, da Chromogenix. Os produtos da hidrólise da protrombina foram também identificados por SDS-PAGE. Uma proteína de 69 kDa apresentou-se como uma serino protease ativada por íons cálcio, a qual converte diretamente protrombina em trombina e pode ser incluída no grupo 1 dos ativadores de protrombina "Lonomia obliqua Phrothrombin Activator Protease" (Lopap), foi purificada até a homogeneidade e a sua sequência de aminoácidos não apresenta homologia com outros ativadores de protrombina nem com nenhuma outra serino protease.

Os experimentos realizados " in vivo" mostraram que injetando-se em ratos a proteína purificada são obtidos os mesmos efeitos causados pelo extrato bruto das cerdas, ocorrendo dessa forma uma incoagulabilidade do sangue que apresenta-se de forma dose-dependente. Esta observação foi corroborada pela observação da rede microcirculatória do músculo cremaster após a injeção da proteína usando-se a técnica da microscopia intravital. Os dados obtidos demonstraram que a infusão de Lopap produz uma coagulação intravascular e trombose em vasos pós-capilares, o qual freqüentemente contribui para o dano orgânico. Seguramente o Lopap é o principal fator que causa a coagulopatia de consumo em acidentes por L. obliqua.

Um principal aspecto da presente invenção está relacionado ao Processo de purificação de proteínas solúveis das cerdas da L. obliqua com atividade ativadora de protrombina partindo-se da homogeneização das cerdas de L. obliqua em Tampão salina fosfato (PBS), num pH entre 7.4 a 8.0 seguido de centrifugação a 2500g numa temperatura de 4o a 10° C durante 30 a 60 minutos a fim de se obter um extrato bruto com atividade ativadora de protrombina. Segue-se, então, a purificação do ativador de protrombina a partir de 50 a 200 mg de proteína total em 2 a 10 ml de extrato bruto por cromatografia de gel filtração em resina Sephadex G-75, eluída em tampão de Tris-HCL 20 a 50 mM contendo NaCL 50 a 100 mM e benzamidina 2 a 5 mM num pH 7.4 a 8.0 com fluxo 1,0 ml/h. Coleta-se, então, frações de 1 a 3 ml e procede-se o monitoramento do perfil protéico da cromatografia por absorbância UV em 280 nm. A protrombina é ativada com o material obtido nos picos protéicos usando-se o substrato colorimétrico S-2238 específico para trombina a fim de se obter o pico PII que deve conter a ação atívadora de protrombina. Submete-se o obtido ativo à cromatografia de fase reversa através da coluna C4 no sistema analítico de HPLC empregando como solventes: A: 0,1¾ TFA em água (equilíbrio) e B: 10% solvente A e acetonitrila na proporção 1:9 (eluição) ou seja, solvente B: lOOml de solvente A adicionados de 900 ml de acetonitrila. Utiliza-se gradiente de 35-50% de solvente B por 30 minutos e procede-se à detecção protéica a 214 ou 280 nm em monitor de UV. Segue-se a coleta de frações de 0.5 - 1.0 ml e liofiliza-se imediatamente para eliminar a acetonitrila. A seguir, ressuspende-se as amostras liofilizadas em tampão Tris-HCL 20 a 50 mM contendo NaCL 50 a 100 mM pH 7,4 a 8.0 e testa-se, então, a atividade ativadora de protrombina das frações com o material obtido nos picos protéicos usando o substrato colorimétrico S-2238 específico para trombina. 0 pico ativo está nas frações eluídas entre 42 a 44% de solvente B.

Recromatografa-se a fração ativa em cromatografia de fase reversa através da coluna C4 no sistema analítico de HPLC empregando-se como solventes: A: 0,1% TFA em água (equilíbrio) e B: 10% solvente A e acetonitrila na proporção 1:9 (eluição) ou seja, solvente B: lOOml de solvente A adicionados de 900 ml de acetonitrila utilizando gradiente entre 20 - 80% de solvente B, durante 20 minutos. Procede-se à detecção protéica a 214 ou 280 nm em monitor de UV. Coletam-se frações de 0.5 1.0 ml e liofiliza-se imediatamente para eliminar a acetonitrila. Ressuspende-se as amostras liofilizadas em tampão Tris-HCL 20 a 50 mM contendo NaCL 50 a 100 mM pH 7.4 a 8.0. Testa-se a atividade ativadora de protrombina das frações com o material obtido nos picos protéicos usando o substrato colorimétrico S—2238 específico para trombina e observa-se que o pico ativo está nas frações eluídas entre 42 a 44% de solvente B. 0 material purificado pode se submetido a uma eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS para avaliação da pureza. O gel pode ser corado por coomassie brilhante blue. A dosagem de proteína final pode ser avaliada por dosagem de proteína por métodos colorimétricos ou por Absorbância em 280 nm. 0 sistema analítico de HPLC empregado é da Merck-Hitachi (modelo D-2500 0 e o monitor é da Shimadzu UV ( modelo SPD-6AV).

No processo da presente invenção são empregados os seguintes solventes para eluição: - solvente A: 0,1% TFA em água e - solvente B: 10% solvente A e acetonitrila na proporção 1:9 ou melhor, lOOml de solvente A adicionados de 900 ml de acetonitrila .

Para realizar a purificação no HPLC utiliza-se um gradiente de 35-50% de solvente B.

Uma outra modalidade da invenção está relacionada ao Processo para determinação parcial da sequência de aminoácidos do ativador de protrombina onde de 500 - 1000 pM do purificado é submetido à degradação por 10 pmol de tripsina em lOOmM Tris-HCl, pH 8.0 contendo 0.02.% de CaCl2 durante 18 horas a 37°C finalizando a reação com 15 % (v /v) de ácido fórmico. Neste processo, os fragmentos obtidos são separados em HPLC utilizando-se uma coluna C4, solventes de eluição a base de 0,1% de TFA em água (solvente A) e acetonitrila: solvente A (9:1) como solvente B. Para a separação no HPLC utilizou-se um gradiente de 0-100% de solvente B com fluxo de 1.0 ml/min durante 30min.

De acordo com o processo da presente invenção determinou-se a seqüência de quatro peptídeos internos e do N-terminal. A porção N- terminal contém 46 resíduos (DWIDGACPDMKAVSKFDMNAYQGTWYEIKKFPVANEANGDCGSVE) de aminoácidos e os fragmentos de peptídeos internos são: - Fragmentos I (KSHVYTVPFGA); - Fragmento II (KSNQHRVNIWILSRTK); - Fragmento III (VRAGHVE) - Fragmento IV (FDQSKFVETDFSEKACFF). A seqüência obtida corresponde a cerca de 15% da proteína completa e massa molecular de 69KDa.

Uma outra modalidade da invenção relaciona-se ao processo de determinação da atividade ativadora de protrombina da fração II compreendendo a pré-incubar 15 a 300nM da fração purificada durante 10 minutos a 37° C com 90 pM de protrombina na presença de 5mM de CaCl2 para volume final de 500μΕ na presença de 50mM de Tris-HC1, lOOmM de NaCl, pH 8 e 3 e 150 mM de imidazol, a adição de 40 μΜ do substrato cromogênico S-2238 (H-D-phenylalanyl-L-pipicolyl-L-arginine-p-nitroanilide dihydrochloride), à mistura de incubação e acompanhar espectrofotometricamente a 405 nm durante 10 min. a hidrólise do substrato cromogênico. A invenção também se relaciona a seqüência N-terminal e seqüência de fragmentos internos da fração ativadora de protrombina caracterizada por conter a porção N-terminal com 46 resíduos (DWIDGACPDMKAVSKFDMNAY QGTWYEIKKFPVANEANGDCGSVE) de aminoácidos e os fragmentos de peptídeos internos são: Fragmentos I (KSHVYTVPFGA);

Fragmento II (KSNQHRVNIWILSRTK);Fragmento III (VRAGHVE) e Fragmento IV (FDQSKFVETDFSEKACFF) sendo que a sequência obtida | corresponde a cerca de 151 da proteína completa e massa molecular de 69 Kda.

Uma outra modalidade da invenção está relacionada ao ativador de protrombina contendo a seguinte estrutura: A proteína purificada é caracterizada como uma serino protease que hidrolisa a protrombina gerando Fragmentos 1, 2 e trombina. E por fim, a invenção está voltada ao uso do ativador de protrombina como um desfibrilante em estados pró trombóticos.

Em doses baixas a proteína purificada, pela sua capacidade de ativar protrombina gerando trombina, retira da circulação de forma controlada o fibrinogênio, transformando-o em microcoágulos de fibrina. Esta diminuição da concentração plasmática de fibrinogênio permite que o tempo de coagulação do sangue se prolongue e, portanto, impede a trombose vascular aguda.

Pelo fato de não possuir atividade proteolítica a proteína manteria a capacidade coagulante do fibrinogênio não consumido no processo. Desta forma a concentração plasmática de fibrinogênio seria diminuída, porém não havería predisposição para um estado hemorrágico. Além disso, podería ser utilizada na confecção de KITS diagnósticos para detecção de protrombina plasmática.

Materiais e Métodos empregados: Reagentes: Ξ-64(trans-epoxysuccinil-L-leucilamido-(4-guanidino-butano)-protrombina, EDTA (ácido etileno-díaminotetraacético), PMSF (fenilmetilsulfonil fluoreto), NPGB (p-Nitrofenil-p"-guanidinobenzoato) e tripsina foram obtidos da Sigma; S-2238 (H-D- fenilalanil-L-pipicolil-L-arginina-p-nitroanilida dihidrocloreto) e S-2765 (N-a- benzil-oxicarbonil-D-arginil-L-glícilLarginína-p-nítroanílida) foram obtidos da Chromogenix.

Todos os outros reagentes utilizados foram da melhor procedência possível disponível no mercado. A resina Sephadex G-75 foi adquirida da Pharmacia, a coluna C4 (5 μπι, 4., 6x250mm) da J.T. Baker, e a coluna C i8 ^Bondapack 10 μτη; 22,5 mmx250mm) foi adquirida da Millipore Corp. 0 substrato peptídico fluorescente Abz- YQTFFNPRTFGSQ-EDDnp. (Abz= ortho - aminobenzoic acid; EDDnp^ N-[2,4-dinitrophenyl] ethylenediamine), cuja seqüência é baseada na seqüência da protrombina foi sintetizado no Departamento de Biofísica da Universidade Federal de São Paulo, Brasil, de acordo com procedimentos descritos previamente .

Os exemplos ilustrativos apresentados a seguir servirão para melhor descrever a presente invenção.

Entretanto, os dados e procedimentos ilustrativos referem-se meramente a algumas modalidades de concretização da presente invenção e não devem ser tomados como limitativos do escopo da mesma.

Exemplos Ilustrativos Exemplo 1: PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS SOLÚVEIS DAS CERDAS DA L. OBLIQUA COM ATIVIDADE ATIVADORA DE PROTROMBINA: Cerdas de L. obliqua foram homogeneizadas em Tampão salina fosfato (PBS), pH 7.4-8.0, centrifugadas a 2500g 4o a 10° C durante 30 a 60 minutos obtendo-se um extrato bruto com atividade ativadora de protrombina. O ativador de protrombina foi purificado a partir de 50 a 200 mg de proteína total em 2 a 10 ml de extrato bruto por cromatografia de gel filtração em resina Sephadex G-75, eluída em tampão de Tris-HCl 20 a 50 mM contendo NaCl 50 a 100 mM e benzamídina 2 a 5 mM, pH 7.4 a 8.0 com fluxo 1,0 ml/h. Frações de 1 a 3 ml foram coletadas e monitorado o perfil protéico da cromatografia por absorbância UV em 280 nm, A protrombina foi ativada com o material obtido nos picos protéicos usando o substrato colorimétrico S-2238, especifico para trombina.

Foi obtido o pico PII que deve conter a ação ativadora de protrombina e submetido à cromatografia de fase reversa através da coluna C4 no sistema analítico de HPLC empregando como solventes: A: 0,1% TFA em água (equilíbrio) e B: 10% solvente A e acetonitrila na proporção 1:9 (eluição). Proceder à detecção protéica a 214 ou 280 nm em monitor de UV, coletar frações de 0.5 - 1.0 ml e liofilizar imediatamente para eliminar a acetonitrila, ressuspender as amostras liofilizadas em tampão Tris-HCl 20 a 50 mM contendo NaCl 50 a 100 mM pH 7.4 a 8.0, testar atividade ativadora de protrombina das frações eluídas entre 42 a 441 de solvente B, recromatografar a fração ativa c utilizando gradiente entre 20 - 80% de solvente B, durante 20 minutos. 0 material purificado pode se submetido a uma eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS para avaliação da pureza. O gel pode ser corado por coomassie brilhante blue. A dosagem de proteína final pode ser avaliada por dosagem de proteína por métodos colorimétricos ou por Absorbância em 280 nm.

Exemplo 2: PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS SOLÚVEIS DAS CERDAS DA L, OBLIQUA COM ATIVIDADE ATIVADORA DE PROTROMBINA.

As taturanas L. obliqua foram anestesiadas em atmosfera de CO2 e suas cerdas foram removidas e mantidas no gelo. 0 extrato bruto foi obtido a partir de 9.9g de cerdas que foram homogeneizadas em PBS, pH 7,4 e centrifugadas a 2500 g a 4o C durante 10 minutos. O ativador de protrombina foi purificado a partir do extrato bruto (103,5 mg em 12,0 ml) através de cromatografia de gel filtração (coluna: 100x1,8 cm Sephadex G-75), que foi eluida em tampão tris-HCl 50 mM, NaCl lOOmM, benzamidina 5 mM, pH 8,0, com fluxo de 15 ml/h. Foram coletadas frações de 2,0 ml e 0 perfil protéico da cromatografia foi monitorado por absorbância UV em 280 nm, e a ativação de protrombina foi verificada usando-se 0 substrato colorimétrico especifico para trombina. 0 pico PII (conteúdo protéico: 5,68mg), foi submetido a uma cromatografia de fase reversa empregando-se a coluna C4 no sistema analítico de HPLC da Merck-Hitachi 9 modelo D-2500), e um monitor de UV da Shimadzu UV (modelo SPD-6AV) foram utilizados para detecção protéica a 214 nm. Os solventes para eluição foram TFA 0,1% em H20 (solvente A), e acetonitrila: solvente A (9:1) como solvente B. A purificação no HPLC foi realizada usando-se um gradiente de 35-50% de solvente B com fluxo de 1,0 ml/min durante 30 min. Os picos coletados foram imediatamente liofilizados. 0 pico protéico que apresentou atividade ativadora da protrombina foi ressuspendido em tampão tris-HCl 50 mM, NaCl lOOmM, pH 8,0, e submetido a uma nova cromatografia usando um gradiente de 20 - 80% de solvente B, fluxo de 1,0 ml/min durante 20 min, usando-se na mesma coluna e condições descritas acima. 0 único pico obtido após a Segunda cromatografia no HPLC (PII-4R2) foi coletado e submetido a um SDS-PAGE. Uma alíquota do Lopap purificado foi dialisado contra EDTA 10 mM para ser utilizado nos experimentos descritos na figura 4. A homogeneidade da proteína foi analisada por SDS-PAGE usando gel de poliacrilamida 10% (p/v) corado com Coomassie Brilliant Blue R-250. As concentrações protéicas foram determinadas de acordo com método descrito previamente e por absorbância em 280 nm. A capacidade ativadora do Lopap (300 nM) foi testada na presença de diferentes concentrações de acetonitrila e após a liofilização.

Exemplo 3: DETERMINAÇÃO PARCIAL DA SEQÜÊNCIA DE AMINQÁCIDOS DO ATIVAPOR DE PROTROMBINA : Submeter 500 - 1000 pM do purificado à degradação por 10 pmol de tripsina em lOOmM Tris-HCl, pH 8.0 contendo 0.02.% de CaCl2 durante 18 horas a 37oC finalizando a reação com 15 % ( v /v) de ácido fórmico.

Separar os fragmentos obtidos em HPLC utilizando-se uma coluna C4, solventes de eluição a base de 0,1¾ de TFA em água (solvente A) e acetonitrila: solvente A (9:1) com solvente B.

Para a separação no HPLC utilizou-se um gradiente de 0-100¾ de solvente B com fluxo de 1.0 ml/min durante 30min.

Exemplo 4: DETERMINAÇÃO PARCIAL DA SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DO Lopap: O Lopap purificado (500pM) foi submetido a degradação por tripsina (10 pmol) em tampão Tris-HC1 100 mM, pH 8,0 contendo CaCl2 0,021 durante 18 h a 37°C. A reação foi interrompida usando-se ácido fórmico 15% (v/v). Os fragmentos obtidos foram separados em HPLC usando uma coluna C4, e os solventes de eluição foram TFA 0,1% em H20 (solvente A), e acetonitrila: solvente A (9:1) com solvente B.

Para a separação no HPLC foi utilizado um gradiente de 0-100% de solvente B, com fluxo de 1,0 ml/min, durante 30 min. A seqüência de três peptideos internos e do N-terminal foi determinada usando-se 0 equipamento da Applied BioSystem que realiza as reações da degradação de Edman (17). A busca para verificar homologia da estrutura primária do Lopap com outras proteínas foi realizada usando-se o banco de dados Swiss Proteín Data Base.

Exemplo 5: ATIVIDADE ATIVADQRA DE PROTROMBINA: A capacidade do Lopap ativar a protrombina foi indiretamente determinada através do ensaio de formação de trombina a partir da protrombina usando o substrato cromogênico S—2238. A atividade ativadora da protrombina do extrato das cerdas, das frações parcialmente purificadas e do Lopap purificado (15 a 300nM) foi avaliada após pré-incubação durante 10 min a 37°C com protrombina (90 pM), na presença de 5 mM de CaCl2 para volume final de 500μ1. Esta reação ocorreu em Tris-HCl 50mM, NaCl lOOmM, pH 8,3, contendo imidazol 150mM. A hidrólise de S-2238 40μΜ pela trombina formada a partir do Lopap usando 90nM do fator II e 90nM de trombina purificada foi acompanhada espectrofotometricamente a 405 nm durante 10 min a 37°C.

Exemplo 6: ATIVIDADE ATIVADORA DO FATOR X: Fator X (30nM) foi pré-incubado com Lopap 75nM durante 20 min a 37°C em 120μ1 de tampão Tris-Hcl 25mM pH 8,3 contendo NaCl 200mM e CaCl2 10 mM. A seguir 150 μΐ de tampão Tris-HCl 50mM pH 8,3 contendo imidazol 150 mM, NaCl lOOmM e 165μ1 de tampão Tris-HCl 10 mM pH 8,0 contendo Hepes lOmM, NaCl 500 mM e PEG 6000 0,1% foram adicionados até o volume final de 500μ1. A formação do fator Xa foi acompanhada através da absorbância em 405 nm durante 10 min a 37 °C após a adição de 150 μΜ do substrato S-2765. A hidrólise de 150 μΜ do substrato S-2765 por 30 nM do Fator Xa purificado foi acompanhado usando as condições experimentais descritas.

Exemplo 7: ATIVIDADE DO LOPAP SOBRE O FIBRINOGÊNIO PURIFICADO

Lopap (2μΜ) foi incubado na presença e na ausência de fator II (90nM) em tampão Tris-HCl 50mM, contendo CaCl2 5mM e NaCl lOOmM, num volume final de 300μ1 durante 10 min a 37 °C . Em seguida, fibrinogênio humano purificado (7,5 μΜ 0 (Chromogenix) foi adicionado e a transformação da protrombina em trombina foi avaliada através do tempo de coagulação.

Exemplo 8: ENSAIO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA COM SUBSTRATO FLUOROGENICO E DETERMINAÇÃO DOS SÍTIOS DE CL I VAGEM: 0 ensaio foi realizado usando-se o substrato de fluorescência apagada Abz- YQTFFNPRTFGSQ-EDDnp no espectrofluorímetro da marca Hitachi F-2000 nos comprimentos de onda de 320nm (excitação) e 420 nm (emissão) . Antes da adição DE 10μ1 da solução estoque do substrato (preparado em DMF:H20, 1:1 v/v), a enzima (73,3pM) foi incubada em uma cubeta termoestável com l,5ml de tampão Tris-HCl 50mM, pH 8,0 a 37°C. A partir dos dados da velocidade que foram registradas continuamente por 10 min foram determinadas as constantes cinéticas Km e Kcat. As constantes cinéticas e seus respectivos erros foram obtidos através da equação de Michaelis-Menten usando-se o método descrito por Wilkinson. Para a determinação do sítio de divagem, os fragmentos peptídicos foram separados através de cromatografia de fase reversa em HPLC usando-se uma coluna Ci8. Os solventes de eluição são TFA 0,1% em H20 (solvente A ), e acetonitrila-solvente A (9:1) como solvente B. 0 gradiente usado para a separação foi de 10-100% do solvente B, com fluxo de lml/min. Os sítios de divagem foram determinados usando fragmentos internos de peptídeos sintéticos usados como padrão.

Exemplo 9: INIBIÇÃO DE LOPAP 0 ensaio para a verificação da enzimática do Lopap foi realizada através de substratos cromogênicos , neste experimento foram utilizados os inibidores PMSF (lOMm) ou E-64 (3.2mM) com Lopap (75nM) num volume final de 500μ1. Os inibidores foram pré-incubados com Lopap durante 15 min a 37°C antes da adição do substrato S-2238 (40μΜ).

Exemplo 10: INFLUÊNCIA DE ÍQNS BIVALENTES NA ATIVIDADE DO LOPAP: 0 Lopap foi exaustivamente dialisado contra EDTA lOOmM durante 48 h a 4 °C Lopap (75 nM) dialisado ou não tratado foi incubado na presença na ausência de CaCl2 (5 mM), MgCl2 (5mM), ou ZnCl2(5 mM), a 37 °C durante 10 min com Fator II (90mM), na presença de 40 μΜ do substrato S-2238, com tampão Tris-HCl 50mM, contendo NaCl lOOmM, pH 8,3, num volume final de 500μ1. A hidrólise do substrato foi monitorado espectrofotometricamente a 405 nm durante 20 min em um equipamento Beckman DU-7.

Exemplo 11: TITULAÇÃO DA ATIVIDADE DA SERINO PRQTEASE LOPAP POR NPGB: 0 ensaio cromogênico para a titulação do sítio ativo Lopap foi realizada com o reagente NPGB, seguindo protocolo descrito previamente. A concentração do Lopap ativo foi determinada através da titulação com p-nitrofenil-p'-guanidinobenzoato 0,47μΜ (NPGB) em tampão barbital sódico Ο,ΙΜ, pH 8,3 a 37 °C, num volume final de 1,0 ml. O p-nitrofenol liberado foi quantificado em absorbância a 410nm em um espectrofotômetro Hitachi U-2000.

Exemplo 12: DETERMINAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE PRQTROMBINA POR LOPAP: Lopap (30nM) foi incubado com protrombina (500nM) durante 0, 1, 3, 6, 8 e 24 h a 37 °C em 500μ1 de tampão Tris-HCl 50 mM, contendo CaCl2 (5mM) e NaCl lOOmM, pH 8,0. Os resultados da hidrólise foram analisados por SDS-PAGE (gel 10%) sob condições redutoras e não redutoras e corado pelo método de coomassie Brilliant Blue R-250.

Exemplo 13: PURIFICAÇÃO DQ ATIVAPOR DE PROTROMBINA (LOPAP): O processo de purificação do Lopap incluiu uma cromatografia de gel filtragem e duas cromatografias de fase reversa. O perfil protéico obtido na cromatografia de gel filtração está representado na figura 1 A. Somente a filtração denominada PII apresentou a capacidade de ativar a protrombina, o qual foi submetido a cromatografia de fase reversa, que resultou em vários picos que estão representados na figura 1B. A capacidade de ativação da protrombina foi detectada no pico eluido com 43% de acetonitrila (fig. 1B) . Esta fração que continha a atividade foi submetida a uma segunda cromatografia de fase reversa resultando em dois picos, sendo que apenas um deles apresentou a capacidade de ativar a protrombina (Fig. 1C) . A fração de interesse foi novamente submetida a uma cromatografia de fase reversa usando as mesmas condições, com , objetivo de confirmar a presença de um único pico (Fig. 1D). Esta purificação resultou em uma proteína com cerca de 50% da atividade, como está mostrado na tabela 1. A homogeneidade da preparação da proteína está representada na Fig. 1D. O material purificado apresentou uma banda única de aproximadamente 69 KDa no SDS-PAGE.

Exemplo 14: DETERMINAÇÃO DA SEQUÊNCIA n-TERMINAL E DE FRAGMENTOS INTERNOS DO LQPAP: A porção N-termínal com 46 resíduos de aminoácidos (DWIDGAC PDMKAVSKFDMNAY QGTWYEIKKFPVANEANGDCGSVE) foi obtida a partir do Lopap purificado, assim como a seqüência de alguns fragmentos de peptídeos internos denominados Fragmento I: KSHVYTVPFGA.

Fragmento II: KSNQHRVNIWILSRTR. Fragmento III: VRAGHVE e Fragmento IV: FDQSKFVETDFSEKACFF. A seqüência obtida correspondeu a cerca de 15% da proteína completa assumindo-se a massa molecular de 69 kDa.

Exemplo 15: CAPACIDADE DE ATIVAÇÃO DE PROTROMBINA: A trombína gerada a partir do Lopap ocorreu de forma dose dependente (Fig. 2) . Protrombina (90nM) foi incubada com 75 nM de Lopap gerando a mesma quantidade de trombina, que foi capaz de hidrolisar o substrato S-2238 (40mM), assim como a hidrólise induzida por 90 nM de trombina purificada. A atividade da trombina foi detectada a partir de 1 min de pré-incubação.

Exemplo 16: ATIVIDADE ATIVADORA DE FATOR X: O Lopap não apresentou capacidade de ativar o fator X e, além disso, não foi capaz de hidrolisar o substrato cromogênico S-2765. A hidrólise obtida com 75 nM de Lopap incubado durante 10 min a 37 °C do substrato S-2765 150 μΜ foi de 0,34 μΜ. A concentração de p-nitroanilida formada durante a reação foi calculada usando-se o valor 8900 M _1 cm _1 para o coeficiente de extinção molar a 405 nm. Quando Fator X (30nM) foi adicionado ao ensaio, a hidrólise do substrato obtida foi de 2,6μΜ. Na ausência de Lopap a absorbância do Fator Xa (30nM) purificado foi 34 μΜ.

Exemplo 17: COAGÜLAÇÃO DO FIBRINOGÊNIQ POR LQPAP: O Lopap não apresentou atividade do tipo trombina sobre o fibrinogênio purificado, assim como podería ser deduzido a partir do prolongamento do tempo de coagulação (tabela 2) . No entanto, na presença de protrombina, a formação de um coágulo sólido foi observada após 240s, e a adição de Ca2+ reduziu o tempo de coagulação para 60s.

Exemplo 18: ATIVIDADE HIDROLÍTICA DO LOPAP SOBRE Q PEPTÍDEO FLUOROGÊNICO: Os parâmetros cinéticos determinados para o Lopap usando o substrato de fluoresc6encia apagada Abz-QTFFNPRTFGSQ-EDDnp, baseado na seqüência da protrombina foram K Μρρ 4,5 μΜ; K cat 5,32 sec _1 ; K cat/K mapp 1,2χ106 M _1 sec _1 , indicando uma boa afinidade e uma alta eficiência catalítica para a enzima estudada, sendo que estes parâmetros foram obtidos de acordo com Chagas et al . A seqüência de aminoácidos originada a partir dos fragmentos internos do Lopap mostrou atividade sobre o substrato Abz-YQTFFNPRTFGSQ-EDDnp o qual foi hidrolisado em dois sítios Phe-Phe (10%) e Arg-Thr (90%) (Fig. 3) Exemplo 19: INIBIÇÃO E INTERFER6ENCIA ÍONS BIVALENTES NA ATIVIDADE DE LOPAP: A atividade do Lopap foi drasticamente diminuída após a diálise contra EDTA, e pode ser substancialmente recuperada através da adição de Ca2+ (Fig.4). Além disso, a atividade do Lopap foi completamente abolida por PMSF 10 mM, enquanto não afetada por E-64 3,2 mM. A titulação dos resíduos putativos de serina encontrados no Lopap usando-se o NPGB indicou a estequiometria de 1,2 resíduos de serina por molécula de NPGB.

Como pode ser visualizado na Fig.4, Lopap ativa diretamente a protrombina e mostrou um aumento desta atividade após a adição de íons Ca2+. Após ter sido submetido a exaustiva diálise contra EDTA, a atividade do Lopap diminuiu cerca de 75%, e pode ser gradativamente recuperada através da adição de concentrações crescentes de íons Ca2+. Outros íons bivalentes, tais como Mg2+ e Zn2+ não produziram o mesmo efeito.

Exemplo 20: DETERMINAÇÃO DOS FRAGMENTOS DE PROTROMBINA POR LOPAP: Sob condições não redutoras a hidrólise da protrombina (72 kDa) por Lopap resultou em vários fragmentos (massas moleculares de 52 kDa, 36 kDa, 27 kDa e 16 kDa representando o peptídeo F1/F2, pretrombina 2 ou α-trombina, Fragmento-1 (Fl) e Fragmento-2 (F2) respectivamente. Sob condições redutoras, a ativação de protrombina resultou em fragmentos de massas moleculares 52 kDa, 36 kDa, 32 kDa, 27 kDa e 16 kDa, representando F1/F2-activation peptide, pretrombina 2, trombina B-chain, Fragmento-1 (Fl) e Fragmento-2 (F2), respectivamente (fig.5) Exemplo 21: DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ATIVADQRA DE PROTROMBINA DA FRAÇÃO II: Pré-incubar 15 a 300nM da fração purificada durante 10 minutos a 37° C com 90 pM de protrombina na presença de 5mM de CaCl2 para volume final de 500μΙ, na presença de 50mM de Tris-HC1, lOOmM de NaCl, pH 8 e 3 e 150 mM de imidazol, a adição de 40 μΜ do substrato cromogênico S-2238 (H-D-phenylalanyl-L-pipicolyl-L-arginine-p-nitroanilide dihydrochloride), à mistura de incubação e acompanhar espectrofotometricamente a 405 nm durante 10 min. a hidrólise do substrato cromogênico.

Exemplo 22: TESTE DA ATIVIDADE DO LAPAP NQ PLASMA HUMANO NORMAL: A fim de testar a atividade procoagulante do Lopap, extrato bruto de cerdas (10 a 30 pg) ou a enzima purificada (1 a 16 μρ) foram incubadas a 37 °C com ΙΟΟμς de plasma humano normal na presença de 6,25 mM de CaCl2; num volume final de 400μς. A atividade pró-coagulante foi avaliada pela redução do tempo de recalcificação do plasma comparado ao tempo de coagulação do plasma na ausência de Lopap ou extrato bruto (controle).

Exemplo 23: OS EFEITOS DE LOPAP NA REDE MICROCIRCULATÓRIA

Estudos microscópicos intravitais: Os efeitos de Lopap na rede microcirculatória foram determinados in si tu na fáscia espermática interna em ratos anestesiados (250g) com pentobarbital sódico, 50 mg/kg, via intraperitonial. A técnica cirúrgica empregada para este procedimento foi descrita Resumidamente, os animais foram mantidos numa mesa especial termostaticamente controlada a 37°C incluindo uma plataforma transparente na qual o tecido foi colocado para ser transiluminado. A preparação foi mantida úmida e quente pela irrigação do tecido com solução aquecida de Ringer-Locke, 154mM de NaCl, 5,6mM de KC1, 2mM de CaCl2, 6 mM de NaHC03, e 6 mM de glicose, pH 7,2 -7,4, contendol% de gelatina. Através de uma câmera de video colorida incorporada a um microscópio triocular (Axioskope, Carl Zeiss), as imagens da microcirculaçao foram simultaneamente visualizadas nos monitores da TV e do computador. As imagens obtidas no monitor da TV foram gravadas em video e as imagens digitalizadas no computador foram analisadas usando software (KS300, Kontron). As imagens foram obtidas usando uma distância longitudinal de abertura no diafragma/numérica objetiva de xl0/025xl.6 otpovar. Lopap (100pg/kg) foi injetado i.v. (veia caudal) e a dinâmica da microcirculação dos vasos foram observadas nos monitores. Animais controle receberam volumes equivalentes de salina estéril. Uma hora após a injeção e a observação da microcirculação, o sangue foi coletado da aorta abdominal (500pg), e o tempo de coagulação do sangue total foi medido.

Exemplo 24: Estudo in vivo: Lopap (100pg/kg), foi injetado através da veia caudal em ratos machos do tipo Wistar pesando 200-250g. Ratos controle receberam 150mM de NaCl sob as mesmas condições. Após uma hora, eles foram anestesiados e o sangue foi coletado pela aorta abdominal em seringas plásticas. Sangue para contagem de células foi anticoagulado com 2,7mM de NS2-EDTA, e para agregação plaquetária do sangue total com 139mM de citrato trisódico (1 parte para 9 partes de sangue total) foi adicionado. Plasma pobre em plaquetas foi obtido pela centrifugação do sangue com citrato a 19OOg por 15 min. a 4o C. A agregação plaquetária do sangue total foi realizada como descrito em Sano-Martins IS, Santoro ML, Castro SCB, Fan HW, Cardoso JLC, theakson RDG. Platelet aggregation in patients bitten by he brazilian snake Bothrops jararaca . Thromb. Res. 1997; 87 (2): 183-95. Colágeno (5 μς /ml de concentração final) (Hormon-Chemie, Alemanha) foi usado como um agonista para induzir a agregação das plaquetas. As contagens das células do sangue foram realizadas num sistema Serono-Baker 9020+AX, e o fibrinogênio foi mantido de acordo com von Clauss (gerinnungsphysiologische schnellmethode zur bestimmung des fibrinogens. Acta Haematol 1957, 17: 237-46 ) com reagentes e controles da Diagnostica Stago.

Exemplo 25: HIST0PAT0L06IA: Os mesmos animais empregados nos estudos in vivo foram usados para análises histopatológicas. Fragmentos de cérebro, pulmões, figado e rins foram coletados e colocados por 48 horas numa solução a 10% de formalina. Eles foram, então embebidos em parafina e processados para análises histológicas de rotina e analisadas após a coloração com eosina.

Exemplo 26: ANÁLISES ESTATÍSTICAS: Com a finalidade de comparar a contagem de plaquetas e agregação plaquetária do sangue total entre ratos injetados com Lopap e ratos controle, estudo do teste-t foi empregado, usando o software de estatística Stata ™5.0.

Resultados: a) Atividade do Lopap sobre o plasma: 0 extrato bruto da cerda foi incubado com plasma humano normal citratado e o tempo de coagulação obtido foi entre 290-80 s (tabela 1), enquanto Lopap (1-16^g) coagulou o plasma humano normal citratado num intervalo de tempo similar (tabela 1) b) Testes biológicos com Lopap: 1. Estudos microscópicos intravirais: A administração intravenosa de proteína provocou proeminentes alterações na rede microcirculatória do músculo cremaster. A formação de trombos foi observada em pequenos vasos (10 - 30μ m de diâmetro), principalmente em vênulas 5 min após a injeção. Este efeito foi mais pronunciado após 40 min, quando o envenenamento sistêmico com total parada venular e trombos nas arteriolas foram claramente visualizadas (fig. 6) . Áreas hemorrágicas foram visualizadas após 30 min. da administração de Lopap. Uma hora após a injeção, o sangue obtido dos animais tratados com Lopap estava incoagulável. Animais controle que receberam solução salina não apresentaram alterações microcirculatórias. 2. Parâmetros coagulantes "in vivo": A contagem de plaquetas decresceu uniformemente nos ratos injetados com Lopap, cerca de 40% em comparação aos ratos controle, bem como a agregação plaquetária induzida por colágeno foi abolida. Nenhuma alteração morfológica ou quantitativa tanto de eritrócitos ou de células da linhagem de leucócitos foram observadas . Nenhum fibrinogênio foi detectado nestes animais. 3. Histopatologia: Uma hora após a inoculação de Lopap, uma pronunciada infiltração de leucócitos foi observada nos pulmões dos animais experimentais (Fig. 7B e C). Neutrófilos e monócitos aderiram as células endoteliais de pequenos vasos sangüineos. Estas células também foram detectadas nos espaços parenquemais do órgão (fig.7C). Uma marcante congestão vascular foi observada nos vasos glomerulares e em vasos entre os túbulos renais proximais e distais (fig, 8b) A hemorragia não foi observada somente nos vasos glomerulares, mas também em outros vasos do órgão. Na região medular, células tubulares apresentaram áreas focais de necrose hialina. Alterações histológicas não foram observadas quando outros órgãos foram analisados.

Acidentes devido ao contato com as cerdas da taturana Lonomia obliqua causam a incoagulabilidade do sangue em seres humanos e alterações nos fatores de coagulação que estão relacionados com a trombina e podendo levar a síndrome hemorrágica. Proteínas procoagulantes tais como fator X e ativadores de protrombina de venenos de animais são responsáveis pela coagulopatia de consumo através da depleção de fibrinogênio. Embora a via de ativação de protrombina mais importante ser através do complexo protrombinase, a protrombina também pode der ativada por fatores exógenos, tais como componentes do veneno de serpentes através de vias distintas.

Após comparar os produtos de hidrólise da protrombina gerada a partir do Lopap (tabela 3) com os fragmentos gerados por outros ativadores de protrombina, um mecanismo de ação pode ser sugerido envolvendo a formação de pretrombina 2 e trombina.

Como aparentemente a meizotrombina não é formada por Lopap e produtos com massa moleculares similares a pretrombina 2 são gerados, Lopap podería ser classificado como um ativador do Tipo 4. No entanto, os ativadores do Tipo 4 não são capazes de converter protrombina em produtos enzimaticamente ativos enquanto Lopap é capaz de gerar trombina ativa. Por outro lado, as massas moleculares dos fragmentos formados são similares àqueles formados por fator Xa na presença do complexo protrombinase. Além disso, os resultados obtidos a partir da hidrólise do substrato de fluorescência apagada, demonstram que a divagem na cadeia principal ocorre na mesma ligação clivada pela trombina (Arg-Thr). A auto-catálise é um dos maiores problemas detectados no ensaio de hidrólise envolvendo a protrombina, e o verdadeiro mecanismo de ação do Lopap sobre a protrombina somente será elucidado e confirmado quando um recombinante de protrombina poderá ser empregado, e a análise da espectrometria da massa e a seqüência de aminoácidos dos fragmentos forem realizadas. A partir do extrato das cerdas da L. obliqua os inventores da presente invenção purificaram uma serino protease ativadora de protrombina de 69 kDa. Os resultados preliminares mostraram que a capacidade ativadora do Lopap é independente do complexo protrombinase, no entanto íons Ca2+ promoveram um aumento desta atividade. 0 processo de purificação do Lopap incluiu o uso de solventes orgânicos, os quais causaram uma visível perda da atividade, atingindo cerca de 50% na presença de 30% de acetonitrila e 80% na presença de 50% acetonitrila (tabela 1), dessa forma é muito difícil calcular a atividade específica da proteína. Métodos menos drásticos de purificação não foram tão eficientes, e no momento a produção de Lopap recombinante está sendo realizada.

Lopap foi caracterizado como sendo uma serino protease ativada por íons Ca2+ , e é estruturalmente distinta de outros ativadores de protrombina descritos até o presente momento. O fragmento N- terminal apresentaram 45,6% de identidade com a porção N-terminal da insecticianina purificada da hemolinfa de Manduca Sexta, enquanto os fragmentos I, II, e III apresentaram respectivamente 36,4%, 37,5%, 42,9% e 55,5% de identidade com a seqüência dos fragmentos internos da mesma proteína (G 86 - Q97; D124 - Ei48; I160-Í177) · A homogeneidade do Lopap purificado foi confirmada através de um único resíduo N-terminal. 0 substrato de fluorescência apagada foi desenhado de forma a conter a ligação Arg 284-Thr 285 da trombina, flanqueada pela seqüência Tyr 277-Ser 28β· Este substrato foi clivado pelo Lopap na ligação peptídica correspondente à ligação da protrombina clivada tanto pelo Lopap como pela trombina.

De acordo com a presente invenção foi demonstrado que o Lopap não é capaz de ativar o fator X, tendo o ativador de Fator X purificado (resultados preliminares) do extrato bruto das cerdas de L. obliqua , de forma distinta do Lopap. Há ao menos dois componentes procoagulantes no veneno deste animal (tabela 3).

De acordo com a presente invenção o Lopap é um novo ativador de protrombina, o que é um importante fator responsável pela coagulopatia de consumo, encontrado em pacientes envenenados por L. obliqua.

Em doses baixas a proteína purificada, pela sua capacidade de ativar protrombina gerando trombina, retira da circulação de forma controlada o fibrinogênio, transformando-o em microcoágulos de fibrina. Esta diminuição da concentração plasmática de fibrinogênio permite que o tempo de coagulação do sangue se prolongue e, portanto, impede a trombose vascular aguda.

Pelo fato de não possuir atividade proteolítica a proteína manteria a capacidade coagulante do fibrinogênio não consumido no processo. Desta forma a concentração plasmática de fibrinogênio seria diminuída, porém, não haveria predisposição para um estado hemorrágico. Além disso, poderia ser utilizada na confecção de KITS diagnósticos para detecção de protrombina plasmática.

Tabela 1: Influência da acetonitrila na atividade do Lopap (300nM) testada na presença de diferentes concentrações de acetonitrila. Sua atividade foi determinada indiretamente através do ensaio da formação de trombina a partir da protrombina utilizando o substrato cromogênico S—2238.

Tabela 2: Coagulação do fibrinogênio por Lopap.

Lopap (2μΜ) foi incubada durante 10 min. a 37°C na presença e na ausência de Fator II (90nM), em tampão Tris-HCl 50mM contendo CaCl2 5nM e NaCl lOOmM em um volume final de 300μ1. Fibrinogênio humano purificado (7,5 μΜ) foi adicionado e a transformação de protrombina em trombina foi avaliada através do tempo de coagulação da fibrina FG= fibrinogênio.

Tabela 3: Comparação dos fragmentos de protrobina obtidos após a hidrólise com diferentes ativadores, analisada por SDS-PAGE. A: condições redutoras; B: condições não redutoras.

Figura 1: PURIFICAÇÃO DO ATIVAPOR DE PROTRQMBINA LQPAP ENCONTRADO NO EXTRATO DAS CERDAS DA TATURANA LONOMIA OBLIQUA . A) Cromatografia de gel filtração em Sephadex G—75. A capacidade de ativação da protrombina foi detectada usando-se substrato cromogênico S-2238. B) Cromatografia de fase reversa (sistema de HPLC, coluna C4) da fração PH da etapa da gel filtração, eluido com um gradiente linear de 35-50% do solvente B. C) Segunda cromatografia de fase reversa, como descrita previamente, exceto que neste caso o gradiente utilizado foi de 20-80% do solvente B. D) Cromatografia de fase reversa do pico PII-4R2 como descrita previamente. Detalhe: SDS_PAGE de 20μρ da proteína purificada (Poço 1), e padrão de massa molecular ( Poço 2): fosforipase B, 94kDa; albumina, 67kDa, ovalbumina, 43kDa; anidrase carbônica, 30kDa; inibidor de tripsina, 21 kDa; α-lactoalbumina, 14.4kDa.

Figura 2: Lopap (15-300nM) foi pré-incubada durante 10 min a 37°C com protrombina 90nM e incubada a 37°C com o substrato cromogênico S-2238 (40μΜ) na presença de CaCl2 5mM no volume final de 500 μΐ. O 15nM; ^ 30nM; □ 75nM; 150nM; □ 300nM.

Figura 3: HIDRÓLISE DO SUBSTRATO FLUOROGÊNICO POR LOPAP: A) Abz-YQTFFNPRTFGSQ-EDDnp foi incubado com Lopap em tampão Tris-HCl 50mM, pH 8,0 a 37°C por 3 h. A incubação foi analisada através de cromatografia em HC1 como descrito em Materiais e Método. B) O perfil para a determinação da constante de Michaelis-Menten obtida com o substrato fluorescente substrato (0,8 - 8,0 μΜ) hidrolisado por Lopap (73,3 pM).

Figura 4: INFLUÊNCIA DE ÍONS BIVALENTES NA CAPACIDADE DE LOPAP ATIVAR A PRQTROMBINA.

Lopap dialisado ou não tratado (75nM ) foi incubado a 37°C com 40μΜ de substrato cromogênico S—2238 e protrombina 90nM; · Controle: ausência de protrombina; □ reação com Lopap não tratado na presença de CaCl2 5mN; reação com Lopap não tratado na ausência de Ca2+;^· Lopap dialisado contra EDTA lOOmM; □ reação usando Lopap dialisado na presença de CaCl2 5 Mm; * reação usando Lopap dialisado na presença de MgCl2 5mM mM; O reação usando Lopap dialisado na presença de ZnCl2 5mM.

Figura 5: HIDRQLISE DE PRQTROMBINA POR LOPAP SDS-PAGE: Hidrólise de protrombina por lopap SDS-PAGE (gel de poliacrilamida 101) incubações de protrombina humana (500nM) com Lopap (30nM) durante 0.1.3.6.8 e 24 h em condições redutoras. Controles: FII (protrombina humana) e Fator lia (trombina humana, 12 ü).

REIVINDICAÇÕES

Claims (2)

1. Processo de purificação de proteínas solúveis das cerdas da 1. obliqua com atividade ativadora de protrombina caracterizado pelo fato de compreender: a) Homogeneizar cerdas de L. obliqua em solução tampão fosfato (PBS), pH 7.4-8.0, centrifugar a 2500g a uma temperatura de 4o a 10° C durante 10 a 60 minutos; b) Purificar o extrato a partir de 50 a 200 mg de proteína total em 2 a 12 ml de extrato bruto por cromatografia de gel de filtração em resina Sephadex G-75, eluída em tampão de Tris-HCL 20 a 50 mM contendo NaCL 50 a 100 mM e benzamidina 2 a 5 mM, pH 7.4 a 8.0 com fluxo 15 ml/h; c) Coletar frações de 1 a 3 ml e monitorar o perfil proteico da cromatografia por absorção UV em 280 nm; d) Ativar a protrombina com o material obtido nos picos proteicos usando o substrato colorimétrico S-2238; e) Obter o conteúdo proteico (pico PII) contendo a ação ativadora de protrombina; f) Submeter o ativo a cromatografia de fase reversa com a coluna C4 no sistema analítico de HPLC empregando como solventes: - A: 0,1% TFA em água (equilíbrio); e - B: 10% solvente A e acetonitrila na proporção 1:9 (eluição) em gradiente de 35-50% e em fluxo de lmL/min por 30 min e submeter a detecção proteica a 214 ou 280 nm em monitor de UV; g) Coletar frações de 0.5 - 1.0 ml e liofilizar imediatamente para eliminar a acetonitrila; h) Ressuspender as amostras liofilizadas em tampão Tris-HCL 20 a 50 mM contendo NaCL 50 a 100 mM pH 7.4 a 8.0; i) Testar atividade ativadora de protrombina das frações conforme descrito no item d); j) Recromatografar a fração ativa eluída entre 42 a 44% de solvente B conforme descrito na etapa (f) utilizando para eluição gradiente entre 20 - 80% de solvente B, com fluxo de lml/min durante 20 minutos; l)Repetir etapas de (g) a (i).

2. Uso da fração proteica eluida quando da passagem de 42-44% do solvente B por coluna C4 ao fim da etapa "1" do método da reivindicação 1, caracterizado por ser na fabricação de um kit para diagnóstico de protrombina em plasma de pacientes com problemas hemorrágicos.