KR960009766B1 - 생리 활성물질 측정법 - Google Patents

Abstract

요약없음

Description

생리 활성물질 측정법

제1도는 혈장칼리크레인-키닌계를 나타내는 그래프이다.

제2도는 칼리크레인생성과 반응시간과의 관계를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 생리 활성물질의 측정법에 관한 것이다. 더욱 상세히 말하면 혈장칼리크레인의 생성과정에 작용을 미치는 생리 활성물질의 측정법에 관한 것이다.

칼리크레인은 여러가지 동물의 혈장속 및 조직에 광범하게 존재하는 단백분해효소로서, 칼리크레인·키닌계라는 효소계가 알려져 있다.

이 칼리크레인·키닌계는 생체내에 있어서 다른 여러가지 효소반응계, 이를 테면 레닌, 안지오렌신계, 혈액응고계, 선용(線溶)계, 보체계나 프로스타그란진, 로이고토리엔, 트론보키산을 중심으로 하는 아라키돈산 가스케이드 및 카테콜아민 등과 밀접한 관련성을 갖고 작용하고 있으며, 생체내의 기능조절에 중요한 의의를 갖고 있다.

따라서 칼리크레인·키닌계는 다른 효소계와 관련하는 것으로서 혈압조절작용, 혈액응고-선용-보체계를 통한 작용, 혹은 아라키돈산 가스게이드에 의하여 생성하는 여러가지 생리 활성물질에 의한 생체조정작용이나 말초순환 개선작용 등에 깊이 관련하고 있는 것이다.

칼리크레인·키닌계의 생성산물인 키닌류는, 말초혈관확장에 따른 강압, 혈관투과성의 항진, 평활근의 수축 혹은 이완, 발통(發痛), 백혈구의 유주(遊走), 부신피질로부터의 카테콜아민의 유리작용 등 여러가지 생리활성을 갖는 것 외에 알러지 반응을 포함한 급성염증의 조성자로서도 알려져 있어서 생체내에서의 존재의의는 크다.

따라서 칼리크레인의 생성에 작용하는 물질, 즉 칼리크레인의 생성을 억제 또는 촉진하는 물질의 작용을 간편, 그리고 정확히 측정하는 방법을 확립하는 일이라는 것은, 상기한 바와 같은 생체기능의 조정에 소응되는 작용을 아는 것과도 이와 같은 약제를 개발하는 것등 매우 유용한 수단으로 되는 것이다.

더우기 칼리크레인·키닌계 자신은 이하와 같은 일련의 효소반응 위에 성립하는 것이다.

즉, 이 효소계에는 혈액응고 제XII인자(하게만인자, 이하 F XII라고 함)가 가 중요한 역활을 담당하고 있고 혈장중의 FXII는 유리, 카올린, 에라진산 등의 음으로 하전한 물질, 또는 콜라겐, 호머스티신, 혈소판막, 황산화당지질 등의 생체내에 존재하는 물질과 접촉하는 것으로서, 혹은 조직에 대한 침해자극 등에 의하여 활성화된다. 이 활성화된 FXII(FXIIa)는 같은 혈장중에 존재하는 프레칼리크레인에 작용하여 이를 칼리크레인으로 변환하고, 이 칼리크레인이 혈장중의 고분자키니노겐에 작용하여 노나펩티드인 브래드키닌을 유리시킨다고 하는 일련의 반응을 일으키게 된다.

더욱 계속하여 유리된 케닌류는 전술한 바와 같은 작용에 의하여 직접적으로 염증, 통증이나 아리키돈산 가스케이드에 대한 작용을 일으키게 하는 등 여러가지 영향을 미치게 된다.

본 발명자 등은 이와 같은 칼리크레인, 키닌계에 관련하는 일련의 효소반응계를 근거로 하여 이들의 반응을 시험관내에서 재구성하므로서, 본 발명의 반응계가 작용물질의 측정법으로서 극히 유용하고 그리고 신뢰성이 높고, 또 조작도 간편함을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 칼리크레인의 생성에 작용하는 생리 활설물질의 측정법 및 이 측정법을 위한 유용한 반응계를 제공하는 것에 있다.

본 발명은 혈장중의 FXII를 활성화하는 것으로 인하여 혈장중의 프레칼리크레인을 칼리크레인으로 변환하여 생긴 칼리크레인을 측정하는 것을 특징으로 하는 생리 활성물질의 측정법이다.

더욱 상세히 말하면 동물혈장, 혈액응고제 XII인자 활성화제, 전해질, 피검약으로 구성되는 용액을 혼합반응시키고 이어서 칼리크레인 활성에 실질적으로 영향이 없고 활성형 혈액응고제 XII인자 활성만을 특이적으로 저해하는 저해제를 가하여 생성한 칼리크레인의 활성을 정량(定量)하는 것을 특징으로 하는 것이다.

바람직한 상태로서는 동물혈장, 혈액응고 제XII인자 활성화제, 전해질, 피검약으로 구성되는 혼합용액을 반응시킨 후(이하 제1차 반응이라 함) 칼리크레인 활성에 실질적으로 영향이 없고, 활성형 혈액응고 제XII인자 활성만을 특이적으로 저해하는 저해제를 가하고 계속해서 이 제1차 반응액을 칼리크레인에 대한 기질, 완충액으로 이루어지는 제2차 반응액과 혼합반응시켜(이하 제2차 반응이라 함) 생성한 칼리크레인에 의한 분해산물을 정량하는 방법을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 반응계는 전기한 바와 같이 2단계의 반응에 의하여 구성되는 것이고, 제1차 반응은 혈장에 카올린 등의 FXII 활성화제를 첨가하여 활성형 FXII로 하는 것으로서 그 혈장중의 프레칼리클레인으로부터 칼리크레인을 생성시키는 반응계이다.

계속하여 실시되는 제2차 반응은 제1차 반응에서 생성한 칼리크레인을 정량하는 반응계이고, 이를테면 칼리크레인의 활성(생성량)을 칼리크레인에 대한 특이적 기질을 사용하여 측정하는 방법으로 행할 수가 있다.

즉, 본 발명의 측정법은 칼리크레인의 생성에 영향을 미치는 생리 활성물질을 상기한 제1차 반응계에 공존시켜, 생성한 칼리크레인량을 제2차 반응계에 있어서 정량하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 사용한 동물혈장은 혈액응고계 및 칼리크레인, 키닌계를 갖는 것이면 어떠한 동물도 사용할 수가 있고, 이를테면 사람, 원숭이, 소, 양, 돼지, 말, 산양, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스 등을 들 수 있고, 사람 랫트가 바람직하다.

이들의 혈장은 통상의 방법에 의하여 조제한 것을 사용할 수가 있고, 이를테면 구연산 존재하에서 체혈한 후, 원심분리하여 얻은 구연산+혈장 등을 사용할 수가 있다. 또, 본 발명의 반응계에서는 보통방법에 의하여 제조된 동결건조혈장을 사용하여도 좇다.

조제된 혈장은 그대로 혹은 필요에 따라서 적당히 희석하여 사용하는데, 제1차 반응에 있어서 혈장의 희석율과 칼리크레인 활성과의 사이에 직선적인 관계가 성립하는 농도를 선택하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, FXII의 활성화제로서는 여러가지 물질, 이를테면 카올린, 콜라아겐, 황산택스트란, 엘라딘산, 셀라이트 등을 사용할 수가 있다.

FXII 활성화제는 FXII를 활성화하기 위하여 그의 최적농도를 조정하는 것이 바람직하며, 이를테면 사람혈장을 사용하여 카올린 현탁액에 의하여 활성화하는 경우, 최종농도 1 내지 3mg/ml 바람직하게는 1.25 내지 2mg/ml로 조정하여 사용할 수가 있다.

전항의 FXII 활성화제의 작용을 보다 완전한 것으로 하기 위하여 더해지는 전해질는 이를테면 나트륨 이온 등의 1가의 양전하 이온을 포함하는 것이 사용되고, 염화나트륨, 초산나트륨 등이 바람직하다. 이를테면 사람의 혈장을 사용하였을 경우에는 제1차 반응에 있어서 염화나트륨의 최종농도는 50 내지 200mM, 바람직하게는 75 내지 150mM로 조정하는 것이 바람직하다.

제1차 반응은 전술한 바와 같이 혈장에 FXII 활성화제를 첨가하여 FXII를 활성형 FXII로 하는 것으로서, 프레칼리크레인에서 칼리크레인을 생성시키는 반응계인데 이 반응은 온도가 높을 때에는 급격히 진행함과 동시에 내인성(內因性)의 억제제가 작용하여 칼리크레인 활성의 측정에 매우 영향을 미치므로, 내인성의 억제제가 작용하지 않고, 반응이 천천히 진행하도록 제1차 반응은 저온하, 이를테면 0 내지 4℃에서 행하는 것이 바람직하다.

제1차 반응액의 pH는 제1차 반응의 최종산물인 칼리크레인의 생성에 대하여 최적 pH임이 바람직하고, 이를테면 사람 또는 랫트혈장을 사용하였을 경우에는 7.0 내지 9.0, 바람직하기로는 pH 7.5 내지 8.5범위에서 반응을 행할 수가 있다.

제1차 반응의 반응시간은 제1차 반응액중에 가한 혈장의 량, FXII 활성화제, 피김약의 농도 또는 반응액의 pH 등에 의하여 변화하지만, 반응시간과 생성한 칼리크레인양(칼리크레인활성)과의 사이에 직선적인 관계가 성립하는 시간내에 설정하는 것이 필요하다. 왜냐하면 본 발명 측정법은 칼리크레인 생성에 영향을 주는 생리 활성물질의 작용을, 생성칼리크레인 활성으로 정량하는 방법이 바람직하므로 활성이 포화하여 끝나는 시간전의 직선부분에서 행하지 않으면 안되기 때문이다. 그러나, 실제의 측정조작상의 관점에서 15 내지 30분 사이에 반응시간을 설정하는 것이 실제적으로는 바람직하다.

제1차 반응의 정지는 활성형 FXII만을 특이적으로 저해하고 더욱 여분의 칼리크레인이 생성되지 않도록 하고, 또 제2차 반응에 있어서는 측정하는 칼리크레인활성에는 실질적으로 영향없는 저해제를 제1차 반응계에 첨가하는 것으로 행할 수가 있다.

이와 같은 저해제로서 LBTI(Lima Bean Trypsin Inhibitor : 리마콩 유래의 트립신 인히비터) 혹은 CHFI(Corn Hageman Fragment Inhibitor : 옥수수 유래의 하게만 후라그멘트 인히비터) 등을 들 수 있다.

이들의 저해제는 제1차 반응에 있어서 잔존하는 활성형 FXII를 완전히 저해하고, 더욱 제2차 반응에 있어서 측정하는 칼리크레인 활성에 실질적으로 영향이 없는 농도범위가 되도록 제1차 반응정지시에 더하는 것이 좋다.

이를테면 사람의 혈장을 사용하였을 때 LBTI는 그의 최종농도가 4 내지 15mg/ml로 되도록 더할 수가 있다.

제2차 반응은 전술한 바와 같이 제1차 반응에서 생성한 칼리크레인을 정량하는 반응계인데, 생성칼리크레인 활성(생성량)을 칼리크레인에 대한 특이적 기질을 사용하여 측정하는 방법이 바람직하다.

칼리크레인에 대한 특이적 기질로서는 여러가지 물질을 사용할 수가 있지만, 이를테면 혈장중에 존재하는 고분자 키니노겐, 또는 합성기질 이를테면 Bonzoyl-Arg-OEt(N-벤조일-N-아르기닌에틸에스테르), Tog-Arg-OMe(N-토실-L-아르기닌메틸에스테르), D-Pro-Phe-Arg-pNA(D-프로릴페닐아라닐아르기닐-p-니트로아닐리드), Bonzoyl-Pro-Phe-Arg-pNA(벤조일-프로릴페닐 아라닐 아르기닐-p-니트로아닐리드), Z-Phe-Arg-MCA(벤질옥시카르보닐-페닐아라닐아르기닐-4-메틸쿠마린 아미드)등을 사용할 수가 있다.

고분자 키니노겐을 사용하였을 경우에는, 새성하는 브래드키닌은 바이오어세이인 모르모트 회장 또는 랫트자긍근 등의 평활근을 사용한 마그네스법 혹은 라디오 이무노 어세이법(RIA) 등의 통상의 정량방법에 의하여 정량할 수가 있다.

칼리크레인의 에스테라제작용을 사용하여 그 활성을 측정하는 경우에는 Bonzoyl-Arg-OEt-Tos-Arg-OMe 등의 기질을 사용할 수가 있고, 측정법으로서는 이를테면 가수분해에 따르는 흡광도의 변화물 측정하는 방법, 발색물질로 유도하여 분광학적으로 정량하는 방법, 이를테면 히드록사메니트법, 크로모트로프산을 사용하는 방법, MBTH(3-메틸-2-벤조티아조론히드라진)을 사용하는 방법, 형광물질로 유도하는 방법, 알코올디히드로게나이제를 사용하는 방법 또는 방사선합성기질를 사용하여 방사화학적으로 검출하는 방법등을 들 수 있다.

더욱 발색 또는 형광방법 펩리드기질을 사용하는 경우에는 이를테면 D-·Benzoyl-Pro-Phe-Arg-pNA·Z-Phe-Arg-MCA 등을 사용할 수가 있고 칼리크레인의 가수분해작용에 의하여 생성한 발색물질 혹은 형광물질 이를테면 pNA(p-니트로아니린) 혹은 AMC(7-아미노-4-메틸쿠마린)의 량을 분광학적을 측정하고 칼리크레인 활성을 정량할 수가 있다.

제2차 반응계에 있어서 pH는 칼리크레인 최적할성 pH부근의 pH 7.0 내지 9.0이 바람직하면, 반응온도는 마찬가지로 최적조건으로서의 실온, 즉 20 내지 40℃의 범위로 설정하는 것이 바람직하다. 반응시간은 온도, pH, 기질농도 등에 의하여 변동한다. 따라서 이러한 반응시간을 설정하는 것도 가능하지만, 측정조작상의 관점에서 30분 이내정도가 적당하다.

실시예 1

동물혈장으로서 사람혈장을 사용한 경우에 대하여 실시예를 이하에 상세히 설명한다.

(1) 사람구연산+혈장의 조정

건강한 성인으로부터 보통방법에 따라 사람혈액 : 3.8% 구연산나트륨(9:1)로 되도록 체혈한 후 원심분리하고, 사람구연산+혈장(이하 단지 사람혈장이라 함)을 윗 맑은 액을 얻음.

(2) 제1차 반응

단, 상기한 조성중 사람혈장은 제2차 반응에 있어서 1.6 내지 2.2mU의 칼리크레인 활성을 표시하는 농도에 생리식염액으로 희석한 것을 사용하였다.

더우기 칼리크레인 활성은 제2차 반응에 있어서 1μmole/min/ml의 p-니트로 아니린을 생성하는 양을 1U(1,000mU)로서 표시하였다.

표준 조성중, 카올린 현탁액의 농도는 2.5mg/ml[50mM 도리스 임산완충액(pH 8.0)], 0.4ml 혼액의 임화나트륨 농도는 0.25M로 행하였다.

상기한 반응액을 빙수옥중 20분간 반응시킨 후 0.5ml의 LBTI 용액[45mg/ml, 50mM 도리스 임산완충액(pH 8.0)]을 더하여 반응을 정지하였다.

혹은 0.2ml의 반응액을 채취하여 0.1ml의 LBTI 용액을 더하여도 좋다. (이하 이를 제1차 반응액이라함)

(3) 제2차 반응

단, 상기한 조성중 합성기질은 D-Pro-Phe-Arg-pNA의 4mM 수용액을 완충액은 100mM 트리스 염산완충액(pH 8.0)을 사용하였다.

반응에 즈음하여 상기 반응액을 30℃로 20분간 반응시킨 후, 1% 구연산 0.8ml을 더하여 필요하여 따라 원심분리하여 현탁물을 제기한 후 p-니트로 아닐린의 405nm에 있어서 흡광도를 측정하였다.

(4) 제1차 반응의 최적 pH

각종 pH로 조정한 50mM의 도리스 임산완충액을 사용하여 제1차 반응을 행하고, 생성한 칼리크레인 활성을 제2차 반응에서 측정한 결과 제1차 반응에 반응에 이서서 pH는 7.0 내지 9.0의 범위, 바람직하기로는 pH 7.5 내지 8.5의 범위가 최적임을 보였다.

(5) 제1차 반응에 있어서 최적염화 나트륨 농도

제1차 반응에 있어서 여러가지 농도의 염화나트륨 수용액을 사용하여 제1차 반응을 행하고, 그후 제2차 반응에 의하여 생성한 가리구레인 활성을 측정한 결과, 제1차 반응에 있어서 염화나트륨의 최종농도는 50 내지 200mM 바람직한 것은 75 내지 150mM이 최적임을 보였다.

더우기 상기한 염화나트륨의 최종농도는 혈장중의 염화나트륨양을 환산하지 않고, 첨가한 것만으로 산출하였다.

(6) 제1차 반응에 있어서 최적 카올린 농도 50mM 트리스염산완충액(pH 8.0)으로 여러가지 농도로 조정한 카올린 현탁액을 제1차 반응에 사용하였고, 생성한 칼리크레인 활성을 제2차 반응에 의하여 측정하였다.

그 결과 제1차 반응에 있어서 카올린 농도는 최종농도 1 내지 3mg/ml 바람직한 것은 1.25 내지 2mg/ml로 행할 수가 있다.

(7) 제1차 반응의 반응시간

제1차 반응을 여러가지의 시간으로 행하여 생성한 칼리크레인 활성을 제2차 반응에 의하여 측정하였다.

제1차 반응은 0 내지 20분 사이에서 반응시간과 칼리크레인 활성과의 사이에 직선적인 관계가 성립하다.

따라서 본 실시예에 있어서 제1차 반응은 20분 이내로 할 수가 있다.

(8) 제1차 반응에 반응에 있어서 LBTI량

제1차 반응을 0℃에서 20분간 행하고, 여러가지 농도의 LBTI 용액을 더한 후, 그 제1차 반응액의 0.1ml을 사용하여 제2차 반응을 행하고 칼리크레인 활성을 측정하였다.

LBTI는 최종농도 4mg/ml 이상으로 활성형 FXII을 완전히 저해하였다.

또 제2차 반응에 있어서 칼리크레인의 활성으로의 LBTI의 영향을 조사한 즉, LBTI는 제1차 반응 최종농도 15mg/ml에 있어서도 칼리크레인 활성을 저하시킬 만한 뜻있는 영향은 주지 못하였다.

(9) 제1차 반응액에 있어서 사람혈장의 농도

사람혈장을 생리식염수로 적당히 희석하여 제1차 반응을 행하고 생성한 칼리크레인 활성을 제2차 반응에 반응에 의하여 측정하였다.

사람혈장을 1/5 내지 1/10희석의 범위에서 사용하였을 때 희석율과 칼리크레인 활성과의 사이에 직선적인 관계가 성립하였다.

(10) 제2차 반응에 있어서 기질농도

제2차 반응에 있어서 여러가지 농도의 합성기질 D-Pro-Phe-Arg-pNA를 사용하여, 전술한 바와 같이 30℃에서 20분간 반응시킨 결과, 제2차 반응에 있어서 Km값은 0.34mM이였다.

(11) 제2차 반응에 효소량

제2차 반응의 효소량(즉 제1차 반응액의 량)을 여러가지 량으로 사용한 경우의 효소량과 칼리크레인 활성과의 관계를 조사하였다.

제2차 반응으로 쓰이는 제1차 반응액의 량을 0 내지 0.1ml까지의 범위에서 칼리크레인 활성과의 사이에 직선적인 관계가 성립하였다.

(12) 제2차 반응의 반응시간

제2차 반응을 여러가지 시간으로 행하고 반응시간과 칼리크레인 활성과의 관계를 조사하였다.

제2차 반응에 있어서는 0-2분 사이에서 반응시간과 칼리크레인 활성과의 사이에 직선적인 관계가 성립하였다.

따라서 본 실시예에 잇어서 제2차 반응은 20분 이내로 할 수가 있다.

(13) 제2차 반응의 최적 pH

여러가지 pH의 도리스 염산 완충액(100m)을 조정하여, 제2차 반응을 행하고, 반응 pH와 칼리크레인 활성과의 최적조건을 조사하였다.

제2차 반응에 있어서는 pH 7.0 내지 9.0, 바람직하기로는 pH 7.5 내지 8.5의 범위에서 행할 수가 있다.

실시에 2

동물혈장으로서 사람혈장, 활성형 FXII의 특이적 지해제로서, CHFI, 칼리크레인에 대한 특이적 기질로서는 Z-Phe-Arg-MCA을 사용한 실시예를 이하에 표시한다.

(1) 제1차 반응

제1차 반응계는 실시예 1과 같은 것을 사용하였다.

반응액을 빙욕중 20분간 반응시킨후 0.5ml의 3mg/ml CHFI용액[50mM 트리스염산 완충액(pH 8.0, 0℃)]을 더한다.

혹은 0.2ml의 반응액을 채취하여 0.1ml의 CHFI 용액에 더하여도 좋다.(이하 이를 제1차 반응액이라 함)

(2) 제2차 반응

단 상기 조성중 합성기질은 형광기질 Z-Phe-Arg-MCA의 10mM 디메칠 술폰옥시드 용액을 사용하고, 완충액 100mM 도리스 염산완충액(pH 8.0)을 사용하였다.

반응에 임하여서는 상기한 반응액을 30℃에서 20분간 반응시킨 후, 0.1M 초산 2ml를 더하고, 필요에 따라 원심분리하여 현탁물을 제거한 후 7-아미노-4-메틸 구마린 아미드의 형광(Ex 380mm, Em 460mm)을 측정하였다.

(3) 실시예 1과 마찬가지로 제1차 반응 및 제2차 반응의 조건을 검토하였다.

그 결과 제1차 반응에 있어서는 반응정지시의 CHFI 농도는 2mg/ml 이상으로 활성형 FXII을 억제하였다.

본 실시예의 제1차 반응은 반응의 정지시에 CHFI을 사용하고 있는 부분만이 실시예 1과 다르고, 기타의 조건은 실시예 1과 마찬가지였다.

제2차 반응에 이서서는 그의 반응 pH는 pH 7.0 내지 9.0 바람직한 것은 pH 7.5 내지 8/5의 범위이고, 합성형광기질 Z-Phe-Arg-MCA에 대한 Km값은 약 1mM이였다.

또, 제2차 반응시간과 칼리크레인 활성에는 0 내지 30분 사이에 직선적인 관계가 보여졌기 때문에 반응 시간은 30분 이내로 행할 수가 있다.

실시예 3

동물혈장으로서 사람 동결건조 혈장을 사용한 실시예를 이하에 표시한다.

(2) 제1차 반응

사람동결건조 혈장은 증류수로 용해한 후, 제2차 반응에 있어서 1.6 내지 2.2mU의 칼리크레인 활성을 나타내는 농도에 생리식염수로 희석한 것을 사용하였다.

카올린현탁액, 염화나트륨용액, 반응온도, 반응시간, 반응정지 조작등은 실시예 1과 마찬가지로 행하였다.

(2) 제2차 반응은 실시예 1과 마찬가지로 행하였다.

(3) 실시예 1과 마찬가지로 제1차 반응 및 제2차 반응의 조건을 검토한 결과, 사람동결 건조혈장을 사용할지라도 신선한 사람혈장의 경우와 마찬가지로 조건으로 할 수 있는 것이 판명되었다.

실시예 4

동물혈장으로서 랫트혈장을 사용한 실시예를 이하에 표시한다.

(1) 랫트구연산 혈장의 조정

에테르 마취하의 랫트복수 대동맥에서, 3.8% 구인산 나트륨 : 혈액(1 : 9)되도록 채결한 후, 원심분리하여 랏드 혈장을 맑은 윗물로서 얻었다.

(2) 제1차 반응

단 상기한 조성중 랏드 혈장은 생리식염액으로 3 내지 5배 희석한 액이고, 카올린 현탁액 및 염화나트륨 수용액은 실시예 1과 마찬가지 것을 사용하였다.

상기한 반응액을 0℃에서 15분간 반응시킨후, 0.5ml의 45mg/ml LBTI 용액[50mM 도리스 염산 완충액(pH 8.0)]을 더하였다.

(3) 제2차 반응

실시예 1과 마찬가지로 행하였는데 반응시간은 30분간 행하였다.

(4) 실시예 1과 마찬가지로 제1차 반응 및 제2차 반응의 조건을 검토하였다.

그 결과, 제1차 반응에 있어서는 pH는 7.0 내지 9.0 바람직하기로는 pH 7.0 내지 8.5의 범위에서, 염화나트륨 수용액은 0 내지 150mM, 바람직하기로는 25 내지 125mM이고, 카올린 현탁액 농도는 1 내지 3.5mg/ml 바람직하기로는 1.5 내지 3mg/ml에서 행할 수가 있다.

또 반응시간과 생성하는 칼리크레인 활성은 0 내지 20분 사이에 직선적인 관계가 발견되었으므로 제1차 반응은 20분 이내로 하는 것이 바람직하다.

제2차 반응에 있어서는 그의 반응 pH는 pH 7 내지 9의 범위가 최적이고, 합성기질 D-Pro-Phe-Arg-pNA에 대한 Km의 값은 0.29mM이였다.

또 제2차 반응시간과 칼리크레인 활성에는 0 내지 60분 사이에서 직선적인 관계가 보이고 있었다.

따라서 제2차 반응은 60분 이내에서 행할 수가 있고 조작상으로는 30분 정도가 바람직하다.

실시예 5

덱스트란 황산(분자량 약 50만)을 FXII 활성화제로서 사용한 실시예를 이하에 나타낸다.

다른 조건은 실시예 1과 마찬가지로 행하였지만 동물혈장으로는 신선한 사람혈장 및 사람동결 건조혈장을 사용하였다.

(1) 덱스트란 황상농도는 최종농도 1 내지 5㎍/ml 바람직하기로는 1.5 내지 3㎍/ml로 행할 수가 있다.

(2) 제1차 반응에 있어서 염화나트륨 농도를 여러가지로 바꾸어 행한 즉, 최종농도 50 내지 85mM, 바람직하기로는 70 내지 80mM이 최적임을 표시하였다.

(3) 제1차 반응의 반응시간에 관하여는 4 내지 20분 사이에서 반응시간과 칼리크레인 활성과의 사이에 직선관계가 성립하였다.

(4) 제1차 반응의 최적 pH를 검토한 결과, pH 7.8 내지 8.3에서 행하는 것이 바람직한 것이 표시되었다.

이상과 같이 FXII 활성화제로서 카올린 현탁액 대신에 덱스트란 황산을 사용하여도 본 발명법을 실시할 수 있다.

실시예 6

브래드키닌 유리억제작용의 검정

본 발명 반응계에 있어서, 피검약에 의한 발통, 기염물질 브래드키닌의 생간이 억제되어 있는가를 조사하였다.

브래드키닌의 분해를 억제하기 위하여 실시예 1의 제1차 반응게에 키니나아제 활성저해제 0-페난스토린을 공존시켰다.

브래드키닌은 카올린에 흡착하는 성질이 있고, 따라서 제1차 반응종료 후, FXII 활성화제로서 첨가한 카올린에 흡착한 부분의 브래드키닌을 추출하기 위하여 아세톤을 최종농도 50%로 되도록 제1차 반응액에 가하였다.

브래드키닌량은 라디오이므노 앗세이법에 의하여 측정하였다.

즉, 상기한 바와 같이 조정한 추출 브래드키닌의 시료 200㎕와 앗세이용 완충액(0.% 제라틴 07mM 염화칼슘-0.01% Tween 20-0.02% 아지화 나트륨함유 트리스-초산 완충액 pH 8.5)200㎕, 1251-Tyr…브래드키닌(약 5,000cpm/ml)200㎕ 및 1/15,000희석 토끼항 브라지기닌항 혈청 200㎕를 더하고 4℃에서 48시간 반응시켰다.

다음에, 정상 양(羊)혈청 200㎕ 및 덱스트란 황산 피복활성탄용액 500㎕을 더하여 4℃에서 더욱 30분간 반응시켜 원심분리하여 윗 맑은 물을 제거한 후, 감마카운터로서 방사선량을 측정하고 시료대신에 브래드키닌 표준액을 사용하여 마찬가지로 얻어진 검량선에서 시료중의 브래드키닌량을 구한 결과의 일례를 제2도에 표시한다.

실시예 1의 반응계를 인도메다신, 캐도프로펜, 모르히네, 아미노 피린 등의 각종 진통제의 칼리크레인 생성저해활성을 측정하였다.

더욱 이들 피검약은 중성부근의 수용액으로 조재하여 사용하였다.

결과의 일례는 제1도에 표시하다.

제1도에서 명백한 바와 같이 진통작용의 한 원인이 브래드키닌의 유리억제작용인 인도메다신이나 케도프로펜은 본 발명 측정법에 의하여 현저한 칼리크레인 생성저해작용이 관찰되었지만, 중추신경계에 작용하는 전통제인 모르히네나 아미노피린은 칼리크레인 생성저해작용의 기의 보이지 않았다.

더욱 본 발명 측정계에 있어서 최종생성물인 발롱, 기염물질 브래드키닌의 피검약에 의한 유리억제 작용을 조사한 결과의 일례를 제2도에 표시한다.

제2도에서 명백한 바와 같이 제1도에서 현저한 칼리크레인 생성저해 작용을 표시한 약제는, 마찬가지로 우수한 브래드키닌 유리억제 작용을 갖는 것이 표시되었다.

이상과 같이 칼리크레인 생성저해(제1도)와 브라지기닌 유리억제(제2도)와는 좋은 상관관계를 표시하고, 따라서 본 발명 측정법은 칼리크레인-키닌계에 관여하는 생리활성 물질의 측정법으로서 신뢰성이 높은 것이다.

전기한 측정결과로부터 본 발명의 생리 활성물질 측정법은 칼리크레인 생성에 영향을 미치는 물질, 이를테면 브래드키닌 유리억제작용을 갖는 물질 등의 측정법으로서 유용함이 명백하게 표시된다.

본 발명의 반응계는 복잡한 일련의 효소반응을 이용하고, 따라서 여러가지 효소가 필요로 되는 것이지만 효소원으로서 동물혈장 혹은 그의 동결건조 혈장을 사용함으로서, 필요로 하는 일련의 효소의 분리 정제라는 극히 번작하고 시간을 요하는 준비단계를 불필요로 하는 것으로서, 이 점에 있어서 매우 유리한 것이다. 또, 본 발명의 반응계는 일련의 효소반응을 이용하고 있으므로, 피검약으로서 쓰이는 생리 활성물질의 작용점이 다수 존재하고, 따라서 본 발명의 반응계를 이용하는 것으로 다관점에서 본 생리 활성물질의 스크린(Screening)을 동시에 또 간편하게 행할 수가 있다.

전술한 바와 같이 칼리크레인, 키닌계는 여러가지 효소계에 밀접한 관련을 갖고 여러가지 생체제어기능에 관계되므로, 이를 테면 아리키돈산 가스케이드에 의하여 생성하는 프로스타그란진, 로이코포리엔, 토른보키산 등에 의한 생리작용의 조성물질, 레닌, 안지오텐신계와 관련한 혈압조절 작용물질, 혈액응고계, 신용계에 대한 조성물질, 더욱더 생성물인 브래드키닌의 생리작용을 조정하는 물질, 이를 테면 항염즐 작용물질, 전통확성물질 등의 측정법으로서 본 발명의 반응계는 극히 유용한 것이다.

Claims (11)

1. 동물혈장, 혈액응고 제XII인자 활성화제, 전해질, 피검물질로 구성된 용액을 혼합반응시키고, 게속해서 그 반응에 있어서의 칼리크레인의 생성을 정지시키기 위해서, 생성된 칼리크레인 활성에는 실질적으로 영향이 없는 활성형 혈액응고 제XII자 활성만을 특이적으로 저해하는 저해제를 칼리크레인생성과 반응시간 사이에 실질적으로 직선적인 관계가 성립하는 시간내에 가하여 생성된 칼리크레인을 정량하는 것을 특징으로 하는 피검물질의 칼리크레인 생성저해능 측정법.
2. 제1항에 잇어서, 칼리크레인에 대한 합성기질을 사용하여 생성된 칼리크레인을 정량하는 측정법.
3. 제1항에 있어서, 동물혈장이 인체혈장인 측정법.
4. 제3항에 있어서, 인체혈장이 구연산첨가 혈장 또는 동결건조품인 측정법.
5. 제1항에 있어서, 동물혈장이 가축 또는 실험용 동물의 혈장인 측정법.
6. 제5항에 있어서, 동물혈장이 소, 양, 말, 돼지, 염소, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 또는 마우스의 혈장인 측정법.
7. 제1항에 있어서, 동물혈장을 5∼10배 희석하여 사용하는 측정법.
8. 제1항에 있어서, 0∼4℃의 반응온도하에서 칼리크레인 생성반응을 실시하는 측정법.
9. 제1항에 있어서, 혈액응고 제XII인자 활성화제가 칼리크레인인 측정법.
10. 제1항에 있어서, 전해질이 1가의 정전하이온을 포함하는 화합물인 측정법.
11. 제1항에 있어서, 1가의 정전하이온이 나트륨이온인 측정법.

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