JPH1084995A - 血液凝固第ｘｉｉ因子活性化法 - Google Patents
血液凝固第ｘｉｉ因子活性化法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】生体内における実際のＦＸII活性化反応をより
忠実に再現するために、生体内のＦＸII活性化物質を同
定することによって、従来の陰性電荷を持つ異種表面を
用いる方法とは異なる新規なＦＸII活性化法を提供す
る。 【解決手段】本発明は、補体成分Ｃ１ｑの球状部位に対
する受容体（ｇＣ１ｑＲ）を用いたＦＸII活性化法並び
に該物質よりなるＦＸII活性化剤である。本発明におい
て用いられるｇＣ１ｑＲは、各種動物の内皮細胞等の細
胞から分離・精製して得たものや、遺伝子工学的に製造
したリコンビナントｇＣ１ｑＲを利用できる。 【効果】ＦＸII活性化反応に関する種々の研究並びにＦ
ＸII活性化やこれを開始段階とする血漿カリクレイン−
キニン系等の生体内反応系に関与する薬剤の活性測定法
・スクリーニング法などにおいて、本発明ＦＸII活性化
法はより生体内に近い反応系を実施可能にする方法とし
て非常に有用性が高い。
忠実に再現するために、生体内のＦＸII活性化物質を同
定することによって、従来の陰性電荷を持つ異種表面を
用いる方法とは異なる新規なＦＸII活性化法を提供す
る。 【解決手段】本発明は、補体成分Ｃ１ｑの球状部位に対
する受容体（ｇＣ１ｑＲ）を用いたＦＸII活性化法並び
に該物質よりなるＦＸII活性化剤である。本発明におい
て用いられるｇＣ１ｑＲは、各種動物の内皮細胞等の細
胞から分離・精製して得たものや、遺伝子工学的に製造
したリコンビナントｇＣ１ｑＲを利用できる。 【効果】ＦＸII活性化反応に関する種々の研究並びにＦ
ＸII活性化やこれを開始段階とする血漿カリクレイン−
キニン系等の生体内反応系に関与する薬剤の活性測定法
・スクリーニング法などにおいて、本発明ＦＸII活性化
法はより生体内に近い反応系を実施可能にする方法とし
て非常に有用性が高い。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は補体成分Ｃ１ｑの球
状部位に対する受容体を用いた新規な血液凝固第ＸII因
子活性化法に関する。
状部位に対する受容体を用いた新規な血液凝固第ＸII因
子活性化法に関する。
【０００２】
【従来の技術】血漿カリクレイン−キニン系は、種々の
生理活性を有するキニン類を生成させる一連の生体内反
応系である。この血漿カリクレイン−キニン系は、生体
内において他の様々な酵素反応系、例えばレニン−アン
ジオテンシン系、血液凝固系、線溶系、補体系並びにプ
ロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサンを
中心とするアラキドン酸カスケードやカテコールアミン
等と密接な関連性をもって生体の機能調節に深く関わっ
ているものである。
生理活性を有するキニン類を生成させる一連の生体内反
応系である。この血漿カリクレイン−キニン系は、生体
内において他の様々な酵素反応系、例えばレニン−アン
ジオテンシン系、血液凝固系、線溶系、補体系並びにプ
ロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサンを
中心とするアラキドン酸カスケードやカテコールアミン
等と密接な関連性をもって生体の機能調節に深く関わっ
ているものである。
【０００３】カリクレイン−キニン系の生成産物である
ブラジキニン等のキニン類は、末梢血管拡張に伴う降
圧、血管透過性の亢進、平滑筋の収縮或いは弛緩、発
痛、白血球の遊走、副腎皮質からのカテコールアミンの
遊離作用など種々の生理活性を示すほか、アレルギー反
応を含めた炎症反応のメディエーターとしても知られて
おり、生体内における存在意義は大きい。従って、キニ
ン類の作用を抑制或いはその生成を阻害する物質は、抗
炎症剤、鎮痛剤、抗アレルギー剤等の医薬品として有用
であると考えられている。
ブラジキニン等のキニン類は、末梢血管拡張に伴う降
圧、血管透過性の亢進、平滑筋の収縮或いは弛緩、発
痛、白血球の遊走、副腎皮質からのカテコールアミンの
遊離作用など種々の生理活性を示すほか、アレルギー反
応を含めた炎症反応のメディエーターとしても知られて
おり、生体内における存在意義は大きい。従って、キニ
ン類の作用を抑制或いはその生成を阻害する物質は、抗
炎症剤、鎮痛剤、抗アレルギー剤等の医薬品として有用
であると考えられている。
【０００４】血漿カリクレイン−キニン系の一連の反応
系の開始段階は、血液凝固第ＸII因子（ＦＸII）の活性
化である。生体内において組織に対する傷害や侵害刺激
等によりＦＸIIが活性化されることによって、血漿カリ
クレイン−キニン系の一連の酵素反応系が進行する。即
ち、活性化されたＦＸII（活性型血液凝固第ＸII因子：
ＦＸIIａ）は同じく血漿中に存在する血漿プレカリクレ
インに作用して、これを活性型酵素の血漿カリクレイン
に変換し、次いでこの血漿カリクレインが血漿中の高分
子キニノーゲンに作用して、前述の如き種々の生理活性
を有するブラジキニンを遊離産生させる。
系の開始段階は、血液凝固第ＸII因子（ＦＸII）の活性
化である。生体内において組織に対する傷害や侵害刺激
等によりＦＸIIが活性化されることによって、血漿カリ
クレイン−キニン系の一連の酵素反応系が進行する。即
ち、活性化されたＦＸII（活性型血液凝固第ＸII因子：
ＦＸIIａ）は同じく血漿中に存在する血漿プレカリクレ
インに作用して、これを活性型酵素の血漿カリクレイン
に変換し、次いでこの血漿カリクレインが血漿中の高分
子キニノーゲンに作用して、前述の如き種々の生理活性
を有するブラジキニンを遊離産生させる。
【０００５】ＦＸIIの活性化反応は、血漿カリクレイン
−キニン系の開始反応であるだけでなく、その他の生体
内における種々の機能調節系、例えば血液凝固系、線溶
系、レニン−アンジオテンシン系、補体系、アラキドン
酸カスケード等における開始段階を制御する反応として
非常に重要な役割を果たしている。ＦＸIIは陰性電荷を
持つ異種表面上で活性化されることが知られており、そ
のような異種表面としてはカオリン、ガラス、セライ
ト、デキストラン硫酸、コラーゲン、酸性ムコ多糖など
が挙げられているが、実際の生体内におけるＦＸIIの活
性化物質は未だ同定されていない。
−キニン系の開始反応であるだけでなく、その他の生体
内における種々の機能調節系、例えば血液凝固系、線溶
系、レニン−アンジオテンシン系、補体系、アラキドン
酸カスケード等における開始段階を制御する反応として
非常に重要な役割を果たしている。ＦＸIIは陰性電荷を
持つ異種表面上で活性化されることが知られており、そ
のような異種表面としてはカオリン、ガラス、セライ
ト、デキストラン硫酸、コラーゲン、酸性ムコ多糖など
が挙げられているが、実際の生体内におけるＦＸIIの活
性化物質は未だ同定されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、生体
内における実際のＦＸII活性化反応をより忠実に再現す
るために、生体内のＦＸII活性化物質を同定することに
よって、従来の陰性電荷を持つ異種表面を用いる方法と
は異なる新規なＦＸII活性化法を提供することにある。
内における実際のＦＸII活性化反応をより忠実に再現す
るために、生体内のＦＸII活性化物質を同定することに
よって、従来の陰性電荷を持つ異種表面を用いる方法と
は異なる新規なＦＸII活性化法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、生体内に
存在するＦＸII活性化物質について鋭意研究を重ねた結
果、細胞膜上に存在する補体成分Ｃ１ｑの球状部位に対
する受容体蛋白質がＦＸIIの活性化物質であることを見
い出し、本発明を完成させた。
存在するＦＸII活性化物質について鋭意研究を重ねた結
果、細胞膜上に存在する補体成分Ｃ１ｑの球状部位に対
する受容体蛋白質がＦＸIIの活性化物質であることを見
い出し、本発明を完成させた。
【０００８】本発明は、補体成分Ｃ１ｑの球状部位に対
する受容体（以下、ｇＣ１ｑＲと略記する）を用いたＦ
ＸII活性化法並びに該物質よりなるＦＸII活性化剤であ
る。補体とは約２０種類の血清タンパクの総称であり、
種々の免疫反応、アレルギー反応の媒介物質として重要
な役割を果たしており、本来血中においては不活性型で
存在するが、抗原抗体複合物、細菌や動物細胞の膜成分
などによって活性化されると溶血・溶菌反応、貪食作用
促進、炎症促進等の種々の生物活性を示す。補体系の活
性化は、前記活性化物質と接触して補体成分Ｃ１が活性
化されることによって開始される。Ｃ１ｑはＣ１の３種
類の亜成分の一つであり、リンパ球、単球、マクロファ
ージ、好中球、好酸球、フィブロブラスト、血小板、内
皮細胞、滑膜細胞など種々の細胞に結合活性を有するた
め、それら細胞膜上の受容体の存在が示唆され、単離・
同定されている。
する受容体（以下、ｇＣ１ｑＲと略記する）を用いたＦ
ＸII活性化法並びに該物質よりなるＦＸII活性化剤であ
る。補体とは約２０種類の血清タンパクの総称であり、
種々の免疫反応、アレルギー反応の媒介物質として重要
な役割を果たしており、本来血中においては不活性型で
存在するが、抗原抗体複合物、細菌や動物細胞の膜成分
などによって活性化されると溶血・溶菌反応、貪食作用
促進、炎症促進等の種々の生物活性を示す。補体系の活
性化は、前記活性化物質と接触して補体成分Ｃ１が活性
化されることによって開始される。Ｃ１ｑはＣ１の３種
類の亜成分の一つであり、リンパ球、単球、マクロファ
ージ、好中球、好酸球、フィブロブラスト、血小板、内
皮細胞、滑膜細胞など種々の細胞に結合活性を有するた
め、それら細胞膜上の受容体の存在が示唆され、単離・
同定されている。
【０００９】本発明は、上記補体成分Ｃ１ｑの球状部位
に対する受容体蛋白質（ｇＣ１ｑＲ）を用いたＦＸII活
性化法であり、本発明方法は生体内における実際のＦＸ
II活性化反応をより忠実に再現・反映させるために有用
な方法である。本発明において用いられるｇＣ１ｑＲは
ヒトを含む各種動物の内皮細胞、リンパ球、単球、マク
ロファージ、好中球、好酸球、フィブロブラスト、血小
板、滑膜細胞等の細胞から分離・精製して得ることがで
きる。これら細胞は生体成分より得られる正常細胞は勿
論のこと、培養して増殖させた細胞や癌化させた培養細
胞も利用することができる。ｇＣ１ｑＲの分離・精製
は、通常の膜蛋白質の精製において用いられている方法
を利用して行うことができ、例えば界面活性剤によって
細胞膜を可溶化した後、各種クロマトグラフィー等で精
製する方法などが一般的である。特にｇＣ１ｑや高分子
キニノーゲン等を不溶化した担体を用いたアフィニティ
・クロマトグラフィは、ｇＣ１ｑＲとの生化学的な親和
力を利用しているため分離能が高く、他の膜蛋白質との
特異的な分離が可能であり有効な方法である。
に対する受容体蛋白質（ｇＣ１ｑＲ）を用いたＦＸII活
性化法であり、本発明方法は生体内における実際のＦＸ
II活性化反応をより忠実に再現・反映させるために有用
な方法である。本発明において用いられるｇＣ１ｑＲは
ヒトを含む各種動物の内皮細胞、リンパ球、単球、マク
ロファージ、好中球、好酸球、フィブロブラスト、血小
板、滑膜細胞等の細胞から分離・精製して得ることがで
きる。これら細胞は生体成分より得られる正常細胞は勿
論のこと、培養して増殖させた細胞や癌化させた培養細
胞も利用することができる。ｇＣ１ｑＲの分離・精製
は、通常の膜蛋白質の精製において用いられている方法
を利用して行うことができ、例えば界面活性剤によって
細胞膜を可溶化した後、各種クロマトグラフィー等で精
製する方法などが一般的である。特にｇＣ１ｑや高分子
キニノーゲン等を不溶化した担体を用いたアフィニティ
・クロマトグラフィは、ｇＣ１ｑＲとの生化学的な親和
力を利用しているため分離能が高く、他の膜蛋白質との
特異的な分離が可能であり有効な方法である。
【００１０】また遺伝子工学的に製造したリコンビナン
トｇＣ１ｑＲも本発明ＦＸII活性化法において用いるこ
とができる。この遺伝子工学的手法によれば均一でより
夾雑蛋白質の少ないものを得ることが容易であり、例え
ばＢ．Ｇｈｅｂｒｅｈｉｗｅｔ等の方法〔Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．１７９巻、１８０９−１８２１頁（１９９４
年）〕等に従って、リコンビナントｇＣ１ｑＲは製造す
ることができる。
トｇＣ１ｑＲも本発明ＦＸII活性化法において用いるこ
とができる。この遺伝子工学的手法によれば均一でより
夾雑蛋白質の少ないものを得ることが容易であり、例え
ばＢ．Ｇｈｅｂｒｅｈｉｗｅｔ等の方法〔Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．１７９巻、１８０９−１８２１頁（１９９４
年）〕等に従って、リコンビナントｇＣ１ｑＲは製造す
ることができる。
【００１１】本発明のＦＸII活性化法における反応系
は、目的に応じて適宜設定すればよく、ＦＸIIのみを実
質的に含有する反応系の他に、ＦＸIIを含有する通常の
動物血漿を用いた反応系や血漿カリクレイン−キニン系
の構成成分であるＦＸII、血漿プレカリクレイン及び高
分子キニノーゲン等を組み合わせた再構成系などが基本
的な反応系として挙げることができる。本発明のｇＣ１
ｑＲを用いたＦＸII活性化法は、亜鉛依存性であること
が確認されており、前記いずれの反応系の場合にも亜鉛
イオンの共存下で行うことが好ましい。至適な反応条件
を設定するために、塩化ナトリウム等の塩類や緩衝化剤
の他、当該分野で慣用のアルブミンや糖類などの添加剤
を反応系に適宜加えてもよい。本発明におけるＦＸII活
性化法の反応条件、例えばｇＣ１ｑＲ、ＦＸII、その他
精製蛋白質、添加剤等の濃度並びにｐＨ、反応温度、反
応時間等は実施者の目的を達成するために各々検討し設
定することができる。
は、目的に応じて適宜設定すればよく、ＦＸIIのみを実
質的に含有する反応系の他に、ＦＸIIを含有する通常の
動物血漿を用いた反応系や血漿カリクレイン−キニン系
の構成成分であるＦＸII、血漿プレカリクレイン及び高
分子キニノーゲン等を組み合わせた再構成系などが基本
的な反応系として挙げることができる。本発明のｇＣ１
ｑＲを用いたＦＸII活性化法は、亜鉛依存性であること
が確認されており、前記いずれの反応系の場合にも亜鉛
イオンの共存下で行うことが好ましい。至適な反応条件
を設定するために、塩化ナトリウム等の塩類や緩衝化剤
の他、当該分野で慣用のアルブミンや糖類などの添加剤
を反応系に適宜加えてもよい。本発明におけるＦＸII活
性化法の反応条件、例えばｇＣ１ｑＲ、ＦＸII、その他
精製蛋白質、添加剤等の濃度並びにｐＨ、反応温度、反
応時間等は実施者の目的を達成するために各々検討し設
定することができる。
【００１２】本発明のＦＸII活性化法によってＦＸIIが
どの程度活性化されたかを測定するには、当然ながら生
成してきたＦＸIIａを定量すれば確認することができ、
これは当該分野における慣用の方法に従って行うことが
できる。これらＦＸIIａ定量法は文献にも数多く報告さ
れており、実施者にとって最も好ましい方法を採用すれ
ばよく、例えば繁用されているＦＸIIａ定量法としてＦ
ＸIIａの酵素活性を利用して測定する方法が挙げられ
る。これはＦＸIIａに対する基質を用いて測定する方法
であり、血漿プレカリクレイン、血液凝固第ＸＩ因子又
はプラスミン等の天然基質の他、Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−
Ａｒｇ−ｐＮＡ、Ｄ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮ
Ａ、Ｎ−Ｂｅｎｚｏｙｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ−ｐＮＡ・塩酸塩及びメチルエステル等の発色合成
基質やＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｍ
ＣＡ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ等の蛍
光合成基質などを用いる方法が簡便であり通常よく用い
られている。上述した本発明に係る反応系の構成成分、
反応条件、ＦＸIIａ生成量の測定法等の記載は、本発明
を実施するための一例に過ぎず、特に本発明はこれらに
限定されるものではない。
どの程度活性化されたかを測定するには、当然ながら生
成してきたＦＸIIａを定量すれば確認することができ、
これは当該分野における慣用の方法に従って行うことが
できる。これらＦＸIIａ定量法は文献にも数多く報告さ
れており、実施者にとって最も好ましい方法を採用すれ
ばよく、例えば繁用されているＦＸIIａ定量法としてＦ
ＸIIａの酵素活性を利用して測定する方法が挙げられ
る。これはＦＸIIａに対する基質を用いて測定する方法
であり、血漿プレカリクレイン、血液凝固第ＸＩ因子又
はプラスミン等の天然基質の他、Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−
Ａｒｇ−ｐＮＡ、Ｄ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮ
Ａ、Ｎ−Ｂｅｎｚｏｙｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ−ｐＮＡ・塩酸塩及びメチルエステル等の発色合成
基質やＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｍ
ＣＡ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ等の蛍
光合成基質などを用いる方法が簡便であり通常よく用い
られている。上述した本発明に係る反応系の構成成分、
反応条件、ＦＸIIａ生成量の測定法等の記載は、本発明
を実施するための一例に過ぎず、特に本発明はこれらに
限定されるものではない。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明のｇＣ１ｑＲを用いたＦＸ
II活性化法は種々の試験系において実施可能である。上
述したようにＦＸIIの活性化反応は、血漿カリクレイン
−キニン系、血液凝固系、線溶系等の多様な生体機能調
節系の開始段階を制御する反応として非常に重要な役割
を果たしているため、従来よりこれら生体内の調節機構
の解明のためＦＸII活性化に関する研究は数多く行われ
ている。例えば、ＦＸII活性化反応の病理的・生理的
意義の解明、ＦＸII活性化反応を制御する生体内に存
在する内因性物質の研究、キニン遊離、内因系血液凝
固、プラスミノーゲン活性化、補体系など種々の生体反
応に対するＦＸII活性化の関与等に関する様々な研究が
行われており、これらの試験・実験系において、実際の
生体内におけるＦＸII活性化反応をより忠実に再現・反
映させることを可能にした本発明方法は非常に有用なも
のである。
II活性化法は種々の試験系において実施可能である。上
述したようにＦＸIIの活性化反応は、血漿カリクレイン
−キニン系、血液凝固系、線溶系等の多様な生体機能調
節系の開始段階を制御する反応として非常に重要な役割
を果たしているため、従来よりこれら生体内の調節機構
の解明のためＦＸII活性化に関する研究は数多く行われ
ている。例えば、ＦＸII活性化反応の病理的・生理的
意義の解明、ＦＸII活性化反応を制御する生体内に存
在する内因性物質の研究、キニン遊離、内因系血液凝
固、プラスミノーゲン活性化、補体系など種々の生体反
応に対するＦＸII活性化の関与等に関する様々な研究が
行われており、これらの試験・実験系において、実際の
生体内におけるＦＸII活性化反応をより忠実に再現・反
映させることを可能にした本発明方法は非常に有用なも
のである。
【００１４】また、ＦＸII活性化が関与する血漿カリク
レイン−キニン系、血液凝固系、線溶系、レニン−アン
ジオテンシン系、補体系、アラキドン酸カスケード等に
対して阻害又は促進作用を有する薬剤の開発も進められ
ている。例えば、血漿カリクレイン−キニン系を阻害す
る物質は、その最終生成産物であるブラジキニンの生成
を阻害する作用を有するため、ブラジキニンによって誘
発される痛み、炎症、アレルギー等を抑える薬剤、即ち
鎮痛剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤等の医薬品として有
用である。このような薬剤の活性測定法・スクリーニン
グ法において、より生体内に近い反応系を利用する方が
適切な作用機序を有する好ましい薬剤を見い出すことが
できる可能性は高いため、そのような特徴を有する本発
明方法は上記薬剤の活性測定法等にも利用でき非常に有
用性が高い。特にｇＣ１ｑＲに作用してＦＸII活性化を
制御する薬剤の活性を測定する場合、本発明方法は必須
のものである。
レイン−キニン系、血液凝固系、線溶系、レニン−アン
ジオテンシン系、補体系、アラキドン酸カスケード等に
対して阻害又は促進作用を有する薬剤の開発も進められ
ている。例えば、血漿カリクレイン−キニン系を阻害す
る物質は、その最終生成産物であるブラジキニンの生成
を阻害する作用を有するため、ブラジキニンによって誘
発される痛み、炎症、アレルギー等を抑える薬剤、即ち
鎮痛剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤等の医薬品として有
用である。このような薬剤の活性測定法・スクリーニン
グ法において、より生体内に近い反応系を利用する方が
適切な作用機序を有する好ましい薬剤を見い出すことが
できる可能性は高いため、そのような特徴を有する本発
明方法は上記薬剤の活性測定法等にも利用でき非常に有
用性が高い。特にｇＣ１ｑＲに作用してＦＸII活性化を
制御する薬剤の活性を測定する場合、本発明方法は必須
のものである。
【００１５】例えば、具体的な前記の薬剤の活性測定法
としては、動物血漿を用いた被検物質のカリクレイン
生成阻害能測定法（特公平４−１４０００号公報）、
動物血漿を用いたＦＸIIａ生成に対する被検物質の阻害
・促進活性測定法（特開平７−５１０９７号公報）、
再構成した血漿カリクレイン−キニン系によるＦＸII
ａ、カリクレイン又はブラジキニンの生成に対する被検
物質の阻害・促進活性測定法（特開平７−５１０９８号
公報）等を挙げることができる。
としては、動物血漿を用いた被検物質のカリクレイン
生成阻害能測定法（特公平４−１４０００号公報）、
動物血漿を用いたＦＸIIａ生成に対する被検物質の阻害
・促進活性測定法（特開平７−５１０９７号公報）、
再構成した血漿カリクレイン−キニン系によるＦＸII
ａ、カリクレイン又はブラジキニンの生成に対する被検
物質の阻害・促進活性測定法（特開平７−５１０９８号
公報）等を挙げることができる。
【００１６】
【実施例】以下の実施例において、本発明を更に詳細に
説明する。尚、以下の実施例は本発明を具体的に説明す
るための一例であり、限定的な意味を有するものではな
い。
説明する。尚、以下の実施例は本発明を具体的に説明す
るための一例であり、限定的な意味を有するものではな
い。
【００１７】実施例１．（ｇＣ１ｑＲの調製） 以下のＦＸII活性化試験においては、ヒト臍帯静脈由来
内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）から分離精製したｇＣ１ｑＲ又
はリコンビナントｇＣ１ｑＲを用いた。リコンビナント
ｇＣ１ｑＲとしては、上記Ｂ．Ｇｈｅｂｒｅｈｉｗｅｔ
等の方法〔Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９巻、１８０９−
１８２１頁（１９９４年）〕に従って得たものを使用し
た。またＨＵＶＥＣからは以下のようにｇＣ１ｑＲを精
製してＦＸII活性化試験に供した。
内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）から分離精製したｇＣ１ｑＲ又
はリコンビナントｇＣ１ｑＲを用いた。リコンビナント
ｇＣ１ｑＲとしては、上記Ｂ．Ｇｈｅｂｒｅｈｉｗｅｔ
等の方法〔Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９巻、１８０９−
１８２１頁（１９９４年）〕に従って得たものを使用し
た。またＨＵＶＥＣからは以下のようにｇＣ１ｑＲを精
製してＦＸII活性化試験に供した。
【００１８】可溶化したＨＵＶＥＣ膜蛋白質画分を、１
５９ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭフェニルメチルスルホ
ニルフルオライド、１μＭアプロチニン、１μＭペプス
タチン、０．１％トリトンＸ−１００及び５０μＭ塩化
亜鉛を含む１０ｍＭヘペス緩衝液に透析し、高分子キニ
ノーゲン・アフィニティカラムに添加した。カラムを充
分に洗った後、０．１Ｍグリシン−塩酸（ｐＨ２．５）
で溶出し、０．５ｍｌずつ分取した。各溶出液を１Ｍト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）でｐＨ７．０に調整した
後、溶出液の蛋白検出モニター及びビオチン化高分子キ
ニノーゲンによるドット−ブロット分析を行い精製ｇＣ
１ｑＲを得た。
５９ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭフェニルメチルスルホ
ニルフルオライド、１μＭアプロチニン、１μＭペプス
タチン、０．１％トリトンＸ−１００及び５０μＭ塩化
亜鉛を含む１０ｍＭヘペス緩衝液に透析し、高分子キニ
ノーゲン・アフィニティカラムに添加した。カラムを充
分に洗った後、０．１Ｍグリシン−塩酸（ｐＨ２．５）
で溶出し、０．５ｍｌずつ分取した。各溶出液を１Ｍト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）でｐＨ７．０に調整した
後、溶出液の蛋白検出モニター及びビオチン化高分子キ
ニノーゲンによるドット−ブロット分析を行い精製ｇＣ
１ｑＲを得た。
【００１９】実施例２．（ＦＸIIの活性化試験１） ２０μｇ／ｍｌのＦＸII、３２μｇ／ｍｌのリコンビナ
ントｇＣ１ｑＲ及び０．６ｍＭのＳ−２２２２（ＦＸII
ａに対する合成基質：Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−イソロイシ
ル−Ｌ−グルタミル−グリシル−Ｌ−アルギニル−ｐ−
ニトロアニリド・塩酸塩およびメチルエステル）を、ヘ
ペス緩衝液（１０ｍＭヘペス、１３７ｍＭ塩化ナトリウ
ム、１１ｍＭＤ−グルコース、４ｍＭ塩化カリウム、１
ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１ｍＭ塩化カルシウ
ム、５０μＭ塩化亜鉛、ｐＨ７．４）中において２５℃
で反応を行った。ヘペス緩衝液は（４−アミジノフェニ
ル）メタンスルホニルフルオライド〔ＡＰＭＳＦ〕で使
用前に処理し、アルブミンに混入しているプロテアーゼ
類を念の為に不活性化しておいた。ＦＸII活性化によっ
て生じたＦＸIIａの酵素作用によって、合成基質Ｓ−２
２２２よりｐ−ニトロアニリンが遊離されるので、この
ｐ−ニトロアニリンの遊離量を測定することによってＦ
ＸIIａの生成量を定量することができる。ｐ−ニトロア
ニリンは黄色に発色し、これは４０５ｎｍにおける吸光
度で測定することができるので、この吸光度を分光光度
計で経時的にモニターすることによってＦＸIIａの生成
量を測定した。結果の一例を図１に示す。
ントｇＣ１ｑＲ及び０．６ｍＭのＳ−２２２２（ＦＸII
ａに対する合成基質：Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−イソロイシ
ル−Ｌ−グルタミル−グリシル−Ｌ−アルギニル−ｐ−
ニトロアニリド・塩酸塩およびメチルエステル）を、ヘ
ペス緩衝液（１０ｍＭヘペス、１３７ｍＭ塩化ナトリウ
ム、１１ｍＭＤ−グルコース、４ｍＭ塩化カリウム、１
ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１ｍＭ塩化カルシウ
ム、５０μＭ塩化亜鉛、ｐＨ７．４）中において２５℃
で反応を行った。ヘペス緩衝液は（４−アミジノフェニ
ル）メタンスルホニルフルオライド〔ＡＰＭＳＦ〕で使
用前に処理し、アルブミンに混入しているプロテアーゼ
類を念の為に不活性化しておいた。ＦＸII活性化によっ
て生じたＦＸIIａの酵素作用によって、合成基質Ｓ−２
２２２よりｐ−ニトロアニリンが遊離されるので、この
ｐ−ニトロアニリンの遊離量を測定することによってＦ
ＸIIａの生成量を定量することができる。ｐ−ニトロア
ニリンは黄色に発色し、これは４０５ｎｍにおける吸光
度で測定することができるので、この吸光度を分光光度
計で経時的にモニターすることによってＦＸIIａの生成
量を測定した。結果の一例を図１に示す。
【００２０】実施例３．（ＦＸIIの活性化試験２） 種々の濃度のリコンビナントｇＣ１ｑＲ、１μｇ／ｍｌ
のＦＸII、１μｇ／ｍｌの高分子キニノーゲン、１μｇ
／ｍｌの血漿プレカリクレイン及び０．６ｍＭのＳ−２
３０２（血漿カリクレインに対する合成基質：Ｈ−Ｄ−
プロリル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニル−ｐ
−ニトロアニリド・二塩酸塩）を、上記と同様のＡＰＭ
ＳＦ処理ヘペス緩衝液中において２５℃で反応を行っ
た。この試験系においてはＦＸIIの活性化をカリクレイ
ン生成量を指標として測定した。即ち、ＦＸIIが活性化
されＦＸIIａに変換されると、ＦＸIIａは血漿プレカリ
クレインに作用して酵素活性を有する血漿カリクレイン
に変換させるため、このカリクレインの生成量を測定す
ることによってＦＸIIがどの程度活性化されたかを知る
ことができる。カリクレインの生成量は、カリクレイン
の加水分解作用によって合成基質Ｓ−２３０２より遊離
されるｐ−ニトロアニリンの黄色の発色を、上記と同様
に分光光度計を用いて経時的にモニターして求めた。結
果の一例を図２に示す。
のＦＸII、１μｇ／ｍｌの高分子キニノーゲン、１μｇ
／ｍｌの血漿プレカリクレイン及び０．６ｍＭのＳ−２
３０２（血漿カリクレインに対する合成基質：Ｈ−Ｄ−
プロリル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニル−ｐ
−ニトロアニリド・二塩酸塩）を、上記と同様のＡＰＭ
ＳＦ処理ヘペス緩衝液中において２５℃で反応を行っ
た。この試験系においてはＦＸIIの活性化をカリクレイ
ン生成量を指標として測定した。即ち、ＦＸIIが活性化
されＦＸIIａに変換されると、ＦＸIIａは血漿プレカリ
クレインに作用して酵素活性を有する血漿カリクレイン
に変換させるため、このカリクレインの生成量を測定す
ることによってＦＸIIがどの程度活性化されたかを知る
ことができる。カリクレインの生成量は、カリクレイン
の加水分解作用によって合成基質Ｓ−２３０２より遊離
されるｐ−ニトロアニリンの黄色の発色を、上記と同様
に分光光度計を用いて経時的にモニターして求めた。結
果の一例を図２に示す。
【００２１】
【発明の効果】実施例２の試験系はｇＣ１ｑＲと精製し
たＦＸIIのみを混合反応してＦＸII活性化を測定した結
果であるが、図１の結果に示したとおりＦＸIIａ生成量
の指標となる合成基質から遊離されるｐ−ニトロアニリ
ンの発色量が経時的に増加していることから明らかなよ
うに、ｇＣ１ｑＲはＦＸIIを活性化する作用を有するこ
とが認められた。このｇＣ１ｑＲによるＦＸII活性化反
応は、亜鉛イオンの非存在下では全く活性化は見られ
ず、また血漿中に存在する内在性インヒビターとして知
られているＣ１インヒビターによってこのＦＸII活性化
は濃度依存的に抑制された。
たＦＸIIのみを混合反応してＦＸII活性化を測定した結
果であるが、図１の結果に示したとおりＦＸIIａ生成量
の指標となる合成基質から遊離されるｐ−ニトロアニリ
ンの発色量が経時的に増加していることから明らかなよ
うに、ｇＣ１ｑＲはＦＸIIを活性化する作用を有するこ
とが認められた。このｇＣ１ｑＲによるＦＸII活性化反
応は、亜鉛イオンの非存在下では全く活性化は見られ
ず、また血漿中に存在する内在性インヒビターとして知
られているＣ１インヒビターによってこのＦＸII活性化
は濃度依存的に抑制された。
【００２２】また実施例３の試験系は、ＦＸII、血漿プ
レカリクレイン及び高分子キニノーゲンより成る血漿カ
リクレイン−キニン系の再構成系であり、ＦＸIIの活性
化をカリクレインの生成量を指標として測定した結果で
ある。図２の結果に示したとおりｇＣ１ｑＲは濃度依存
的にＦＸIIを活性化し、実施例２の反応系と同様に亜鉛
イオンの非存在下では活性化は認められなかった。この
ＦＸII活性化反応系においてｇＣ１ｑＲの使用量を一定
にしＦＸII濃度を変化させた場合、カリクレイン生成量
はＦＸII用量に依存して増加した。またリコンビナント
ｇＣ１ｑＲの代わりにＨＵＶＥＣから精製したｇＣ１ｑ
Ｒを用いた場合にも、同様のＦＸII活性化が認められた
ことから、ｇＣ１ｑＲにおける糖化部位はＦＸIIの活性
化に影響しないことが示唆された。
レカリクレイン及び高分子キニノーゲンより成る血漿カ
リクレイン−キニン系の再構成系であり、ＦＸIIの活性
化をカリクレインの生成量を指標として測定した結果で
ある。図２の結果に示したとおりｇＣ１ｑＲは濃度依存
的にＦＸIIを活性化し、実施例２の反応系と同様に亜鉛
イオンの非存在下では活性化は認められなかった。この
ＦＸII活性化反応系においてｇＣ１ｑＲの使用量を一定
にしＦＸII濃度を変化させた場合、カリクレイン生成量
はＦＸII用量に依存して増加した。またリコンビナント
ｇＣ１ｑＲの代わりにＨＵＶＥＣから精製したｇＣ１ｑ
Ｒを用いた場合にも、同様のＦＸII活性化が認められた
ことから、ｇＣ１ｑＲにおける糖化部位はＦＸIIの活性
化に影響しないことが示唆された。
【００２３】上述のとおり、補体成分Ｃ１ｑの球状部位
に対する受容体（ｇＣ１ｑＲ）はＦＸIIの活性化作用を
有し、生体内における実際のＦＸII活性化物質の一つで
あることが明らかになった。従って、このｇＣ１ｑＲを
用いた本発明ＦＸII活性化法は、生体内における実際の
ＦＸII活性化反応をより忠実に再現・反映するものであ
り、従来の陰性電荷を持つ異種表面を用いる方法とは異
なる新規なＦＸII活性化法である。前記の「発明の実施
の形態」の項で詳述したとおり、ＦＸII活性化反応に関
する種々の研究並びにＦＸII活性化やこれを開始段階と
する血漿カリクレイン−キニン系等の生体内反応系に関
与する薬剤の活性測定法・スクリーニング法などにおい
て、本発明ＦＸII活性化法はより生体内に近い反応系を
実施可能にする方法として非常に有用性が高い。
に対する受容体（ｇＣ１ｑＲ）はＦＸIIの活性化作用を
有し、生体内における実際のＦＸII活性化物質の一つで
あることが明らかになった。従って、このｇＣ１ｑＲを
用いた本発明ＦＸII活性化法は、生体内における実際の
ＦＸII活性化反応をより忠実に再現・反映するものであ
り、従来の陰性電荷を持つ異種表面を用いる方法とは異
なる新規なＦＸII活性化法である。前記の「発明の実施
の形態」の項で詳述したとおり、ＦＸII活性化反応に関
する種々の研究並びにＦＸII活性化やこれを開始段階と
する血漿カリクレイン−キニン系等の生体内反応系に関
与する薬剤の活性測定法・スクリーニング法などにおい
て、本発明ＦＸII活性化法はより生体内に近い反応系を
実施可能にする方法として非常に有用性が高い。
【図１】ＦＸIIとｇＣ１ｑＲを混合反応させ、ｇＣ１ｑ
ＲによるＦＸII活性化を経時的に調べた結果である。
ＲによるＦＸII活性化を経時的に調べた結果である。
【図２】ＦＸII、血漿プレカリクレイン及び高分子キニ
ノーゲンより再構成した血漿カリクレイン−キニン系に
おけるｇＣ１ｑＲによるＦＸII活性化を調べた結果であ
る。
ノーゲンより再構成した血漿カリクレイン−キニン系に
おけるｇＣ１ｑＲによるＦＸII活性化を調べた結果であ
る。
Claims (3)
- 【請求項１】 補体成分Ｃ１ｑの球状部位に対する受容
体を用いた血液凝固第ＸII因子活性化法。 - 【請求項２】 亜鉛イオンの存在下で行う請求項１記載
の血液凝固第ＸII因子活性化法。 - 【請求項３】 補体成分Ｃ１ｑの球状部位に対する受容
体からなる血液凝固第ＸII因子活性化剤。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8265318A JPH1084995A (ja) | 1996-09-12 | 1996-09-12 | 血液凝固第ｘｉｉ因子活性化法 |
| TW086112901A TW521089B (en) | 1996-09-12 | 1997-09-06 | Activation method of blood coagulation factor XII through the use of a receptor for globular head of Clq |
| US08/925,167 US6117648A (en) | 1996-09-12 | 1997-09-08 | Method for the activation of blood coagulation factor XII |
| DE69719425T DE69719425T2 (de) | 1996-09-12 | 1997-09-10 | Verfahren zur Aktivierung von Blutgerinnungsfaktor XII |
| EP97115720A EP0829725B1 (en) | 1996-09-12 | 1997-09-10 | A method for the activation of blood coagulation factor XII |
| AT97115720T ATE233898T1 (de) | 1996-09-12 | 1997-09-10 | Verfahren zur aktivierung von blutgerinnungsfaktor xii |
| KR1019970046510A KR100497951B1 (ko) | 1996-09-12 | 1997-09-10 | 혈액응고제ⅹⅱ인자활성화법 |
| CNB971184275A CN1138002C (zh) | 1996-09-12 | 1997-09-11 | 第ⅻ凝血因子活化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8265318A JPH1084995A (ja) | 1996-09-12 | 1996-09-12 | 血液凝固第ｘｉｉ因子活性化法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1084995A true JPH1084995A (ja) | 1998-04-07 |
Family
ID=17415534
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8265318A Pending JPH1084995A (ja) | 1996-09-12 | 1996-09-12 | 血液凝固第ｘｉｉ因子活性化法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6117648A (ja) |
| EP (1) | EP0829725B1 (ja) |
| JP (1) | JPH1084995A (ja) |
| KR (1) | KR100497951B1 (ja) |
| CN (1) | CN1138002C (ja) |
| AT (1) | ATE233898T1 (ja) |
| DE (1) | DE69719425T2 (ja) |
| TW (1) | TW521089B (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019502095A (ja) * | 2015-10-19 | 2019-01-24 | ダイアックス コーポレーション | 切断高分子量キニノーゲンを検出するイムノアッセイ |
| US11156612B2 (en) | 2013-01-20 | 2021-10-26 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Methods of determining levels of cleaved and/or intact kininogen |
| US11372002B2 (en) | 2013-10-21 | 2022-06-28 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Assays for determining plasma kallikrein system biomarkers |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6913900B2 (en) * | 2001-08-29 | 2005-07-05 | Nippon Zoki Pharmaceutical Co., Ltd. | Plasma prekallikrein activation and kallikrein production assay |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63185398A (ja) * | 1986-09-10 | 1988-07-30 | Nippon Zoki Pharmaceut Co Ltd | 生理活性物質測定法 |
| JPH0414000A (ja) * | 1990-05-07 | 1992-01-17 | Fujitsu Ltd | 放射線装置 |
| JP3213832B2 (ja) * | 1993-08-06 | 2001-10-02 | 日本臓器製薬株式会社 | 被検物質の活性測定法 |
| JP3213831B2 (ja) * | 1993-08-06 | 2001-10-02 | 日本臓器製薬株式会社 | 被検物質の活性測定方法 |
| JP2594222B2 (ja) * | 1993-09-28 | 1997-03-26 | 日本臓器製薬株式会社 | 新規生理活性物質−ｋｆ |
-
1996
- 1996-09-12 JP JP8265318A patent/JPH1084995A/ja active Pending
-
1997
- 1997-09-06 TW TW086112901A patent/TW521089B/zh not_active IP Right Cessation
- 1997-09-08 US US08/925,167 patent/US6117648A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-09-10 KR KR1019970046510A patent/KR100497951B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-09-10 DE DE69719425T patent/DE69719425T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-09-10 EP EP97115720A patent/EP0829725B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-10 AT AT97115720T patent/ATE233898T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-09-11 CN CNB971184275A patent/CN1138002C/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11156612B2 (en) | 2013-01-20 | 2021-10-26 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Methods of determining levels of cleaved and/or intact kininogen |
| US11372002B2 (en) | 2013-10-21 | 2022-06-28 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Assays for determining plasma kallikrein system biomarkers |
| JP2019502095A (ja) * | 2015-10-19 | 2019-01-24 | ダイアックス コーポレーション | 切断高分子量キニノーゲンを検出するイムノアッセイ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6117648A (en) | 2000-09-12 |
| ATE233898T1 (de) | 2003-03-15 |
| EP0829725B1 (en) | 2003-03-05 |
| CN1182137A (zh) | 1998-05-20 |
| KR100497951B1 (ko) | 2005-09-30 |
| KR19980024488A (ko) | 1998-07-06 |
| EP0829725A2 (en) | 1998-03-18 |
| CN1138002C (zh) | 2004-02-11 |
| DE69719425D1 (de) | 2003-04-10 |
| EP0829725A3 (en) | 1998-06-10 |
| TW521089B (en) | 2003-02-21 |
| DE69719425T2 (de) | 2003-12-18 |
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