JP3213832B2 - 被検物質の活性測定法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は再構成した血漿カリクレ
イン・キニン系において生成される生理活性物質の生成
に対する被検物質の活性を測定する方法、更に詳しく
は、血漿カリクレイン・キニン系の各成分からなる再構
成系を利用して、この反応系において生成される生理活
性物質、例えば活性型血液凝固第ＸII因子、血漿カリク
レイン又はブラジキニンを測定する方法に関するもので
ある。
イン・キニン系において生成される生理活性物質の生成
に対する被検物質の活性を測定する方法、更に詳しく
は、血漿カリクレイン・キニン系の各成分からなる再構
成系を利用して、この反応系において生成される生理活
性物質、例えば活性型血液凝固第ＸII因子、血漿カリク
レイン又はブラジキニンを測定する方法に関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】カリクレインはヒトを含む種々の動物の
血漿及び組織中に広汎に存在するタンパク質分解酵素で
あり、カリクレイン・キニン系なる酵素系が知られてい
る。カリクレイン・キニン系は生体内において、他の色
々な酵素反応系、例えばレニアン・アンジオテンシン
系、血液凝固系、線溶系、補体系やプロスタグランジ
ン、ロイコトリエン、トロンボキサンを中心とするアラ
キドン酸カスケード及びカテコールアミン等と密接な関
連性を持って作用している。それ故、カリクレイン・キ
ニン系は血圧調節作用、血液凝固−線溶−補体系を通じ
ての作用、又はアラキドン酸カスケードにより生成する
種々の生理活性物質による生体調節作用や末梢循環改善
作用等に深く関わり、生体内の機能調節に重要な役割を
果たしている。
血漿及び組織中に広汎に存在するタンパク質分解酵素で
あり、カリクレイン・キニン系なる酵素系が知られてい
る。カリクレイン・キニン系は生体内において、他の色
々な酵素反応系、例えばレニアン・アンジオテンシン
系、血液凝固系、線溶系、補体系やプロスタグランジ
ン、ロイコトリエン、トロンボキサンを中心とするアラ
キドン酸カスケード及びカテコールアミン等と密接な関
連性を持って作用している。それ故、カリクレイン・キ
ニン系は血圧調節作用、血液凝固−線溶−補体系を通じ
ての作用、又はアラキドン酸カスケードにより生成する
種々の生理活性物質による生体調節作用や末梢循環改善
作用等に深く関わり、生体内の機能調節に重要な役割を
果たしている。
【０００３】カリクレイン・キニン系の生成産物である
キニン類例えばブラジキニンは、末梢血管拡張に伴う降
圧、血管透過性の亢進、平滑筋の収縮又は弛緩、発痛、
起炎、白血球の遊走、副腎皮質からのカテコールアミン
の遊離作用など種々の生理活性を有するほか、アレルギ
ー反応を含めた急性炎症のメディエーターとしても知ら
れており、生体内における存在意義は大きい。
キニン類例えばブラジキニンは、末梢血管拡張に伴う降
圧、血管透過性の亢進、平滑筋の収縮又は弛緩、発痛、
起炎、白血球の遊走、副腎皮質からのカテコールアミン
の遊離作用など種々の生理活性を有するほか、アレルギ
ー反応を含めた急性炎症のメディエーターとしても知ら
れており、生体内における存在意義は大きい。
【０００４】この血漿カリクレイン・キニン系に関して
は、生体内においては、組織に対する傷害や侵害刺激に
より血液凝固第ＸII因子（ハーゲマン因子、以下ＦＸII
と略称する）が活性化されることによって一連の酵素反
応系が引き起こされると考えられている。即ち図３に示
すように、活性化された活性型血液凝固第ＸII因子（以
下ＦＸIIａと略称する）は、同じく血漿中に存在する血
漿プレカリクレインに作用して、これを活性型酵素の血
漿カリクレインに変換し、次いでこの血漿カリクレイン
が血漿中の高分子キニノーゲン（以下ＨＫと略称する）
に作用して、ブラジキニンを遊離させる。
は、生体内においては、組織に対する傷害や侵害刺激に
より血液凝固第ＸII因子（ハーゲマン因子、以下ＦＸII
と略称する）が活性化されることによって一連の酵素反
応系が引き起こされると考えられている。即ち図３に示
すように、活性化された活性型血液凝固第ＸII因子（以
下ＦＸIIａと略称する）は、同じく血漿中に存在する血
漿プレカリクレインに作用して、これを活性型酵素の血
漿カリクレインに変換し、次いでこの血漿カリクレイン
が血漿中の高分子キニノーゲン（以下ＨＫと略称する）
に作用して、ブラジキニンを遊離させる。
【０００５】カリクレイン・キニン系の酵素反応によっ
て遊離されたキニン類、例えばブラジキニンは前述のよ
うな種々の生理活性を有するので、ブラジキニンの作用
を抑制する物質又は血漿カリクレイン・キニン系におけ
る反応を阻害してブラジキニンの生成を抑制する物質は
抗炎症剤、鎮痛剤、抗アレルギー剤として使用し得る可
能性がある。又ＦＸIIａは内因性の血液凝固系及び線溶
系の開始段階においても重要な因子であり、ＦＸIIａの
生成に影響を及ぼす物質は血液凝固系・線溶分野での薬
剤として期待できる。従って、血漿カリクレイン・キニ
ン系における反応を抑制又は促進する物質の前記作用を
簡便迅速且つ正確に測定する方法を確立することは、上
記のような生体機能の調整に役立つ作用を知るうえで、
又はかかる薬剤を開発するうえで非常に有効な手段とな
る。
て遊離されたキニン類、例えばブラジキニンは前述のよ
うな種々の生理活性を有するので、ブラジキニンの作用
を抑制する物質又は血漿カリクレイン・キニン系におけ
る反応を阻害してブラジキニンの生成を抑制する物質は
抗炎症剤、鎮痛剤、抗アレルギー剤として使用し得る可
能性がある。又ＦＸIIａは内因性の血液凝固系及び線溶
系の開始段階においても重要な因子であり、ＦＸIIａの
生成に影響を及ぼす物質は血液凝固系・線溶分野での薬
剤として期待できる。従って、血漿カリクレイン・キニ
ン系における反応を抑制又は促進する物質の前記作用を
簡便迅速且つ正確に測定する方法を確立することは、上
記のような生体機能の調整に役立つ作用を知るうえで、
又はかかる薬剤を開発するうえで非常に有効な手段とな
る。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】前述のように、血漿カ
リクレイン・キニン系を用いて薬剤のスクリーニングな
どを試験管内で行う際には、生体内反応の如き傷害や組
織に対する侵害刺激等によるＦＸIIの活性化は実施でき
ないので、ＦＸIIを活性化する物質を分離した血漿に加
えて血漿カリクレイン・キニン系反応を引き起こす反応
を試験管内にて行う方法が採用されていた。
リクレイン・キニン系を用いて薬剤のスクリーニングな
どを試験管内で行う際には、生体内反応の如き傷害や組
織に対する侵害刺激等によるＦＸIIの活性化は実施でき
ないので、ＦＸIIを活性化する物質を分離した血漿に加
えて血漿カリクレイン・キニン系反応を引き起こす反応
を試験管内にて行う方法が採用されていた。
【０００７】しかしながら、動物血漿中には前記成分以
外にも種々の成分が含まれており、血漿カリクレイン・
キニン反応系に阻害や促進等の影響を与える成分や、そ
の他未知の因子も含まれている。それ故、血漿カリクレ
イン・キニン系を用いて、例えば薬剤のスクリーニング
などを目的として本反応系を利用して生理活性物質生成
に対する被検物質の活性を測定しようとする場合には、
従来は動物血漿そのものを使用していたため、反応系は
複雑であり、血漿カリクレイン・キニン反応系に影響を
及ぼす可能性のある未知の成分を含む種々の因子の影響
を常に考慮しなければならなかった。従って、反応系を
制御するため非常に高度な技術が必要とされ、簡単に実
施することは難しかった。
外にも種々の成分が含まれており、血漿カリクレイン・
キニン反応系に阻害や促進等の影響を与える成分や、そ
の他未知の因子も含まれている。それ故、血漿カリクレ
イン・キニン系を用いて、例えば薬剤のスクリーニング
などを目的として本反応系を利用して生理活性物質生成
に対する被検物質の活性を測定しようとする場合には、
従来は動物血漿そのものを使用していたため、反応系は
複雑であり、血漿カリクレイン・キニン反応系に影響を
及ぼす可能性のある未知の成分を含む種々の因子の影響
を常に考慮しなければならなかった。従って、反応系を
制御するため非常に高度な技術が必要とされ、簡単に実
施することは難しかった。
【０００８】本発明は前記従来技術の問題点を解決する
ものであり、その目的とするところは、血漿カリクレイ
ン・キニン系における成分を取り出して再構成した血漿
カリクレイン・キニン系を利用し、この反応を試験管内
で行うことにより、被検物質の生理活性を簡便迅速且つ
正確に測定する方法を提供することにある。
ものであり、その目的とするところは、血漿カリクレイ
ン・キニン系における成分を取り出して再構成した血漿
カリクレイン・キニン系を利用し、この反応を試験管内
で行うことにより、被検物質の生理活性を簡便迅速且つ
正確に測定する方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】即ち本発明の測定法は、
血液凝固第ＸII因子、血漿プレカリクレイン、高分子キ
ニノーゲンにて再構成した血漿カリクレイン・キニン系
において被検物質の存在下、血液凝固第ＸII因子の活性
化を初発反応とする一連の酵素反応を開始させた後、こ
の反応を停止させ、前記反応において生成された生理活
性物質を定量することを特徴とする。
血液凝固第ＸII因子、血漿プレカリクレイン、高分子キ
ニノーゲンにて再構成した血漿カリクレイン・キニン系
において被検物質の存在下、血液凝固第ＸII因子の活性
化を初発反応とする一連の酵素反応を開始させた後、こ
の反応を停止させ、前記反応において生成された生理活
性物質を定量することを特徴とする。
【００１０】本発明の測定法における再構成血漿カリク
レイン・キニン系の構成成分としては、定量する生理活
性物質がＦＸIIａ、血漿カリクレイン又はブラジキニン
のいずれの場合も、ＦＸII、血漿プレカリクレイン及び
ＨＫを用いて再構成した系を利用する。これら各構成成
分は実質的に精製されたものを使用でき、血漿から分離
精製したものや遺伝子工学的手法を用いて製造したもの
などを利用することができる。
レイン・キニン系の構成成分としては、定量する生理活
性物質がＦＸIIａ、血漿カリクレイン又はブラジキニン
のいずれの場合も、ＦＸII、血漿プレカリクレイン及び
ＨＫを用いて再構成した系を利用する。これら各構成成
分は実質的に精製されたものを使用でき、血漿から分離
精製したものや遺伝子工学的手法を用いて製造したもの
などを利用することができる。
【００１１】本発明の測定法において血漿カリクレイン
・キニン系活性化反応を引き起こすためのＦＸII活性化
剤としては、ＦＸIIの活性化作用を有する物質であれば
如何なるものでも使用でき、例えばガラス、カオリン、
セライト、コラーゲン、ホモシスチン、尿酸ナトリウ
ム、血小板や他の細胞の膜等の細胞成分、フィブロネク
チン、エラジン酸、クエルセチン、ルチン、硫酸化糖脂
質、プロテオグリカン、ムコ多糖類、ステアリン酸ナト
リウム、硫酸デキストラン、硫酸アミローズ、カラゲニ
ン並びにＦＸIIを限定分解して活性化するプロテアーゼ
等を単独で又は組み合わせて用いることが可能であり、
これらＦＸII活性化剤の使用濃度は適宜調整することが
できる。
・キニン系活性化反応を引き起こすためのＦＸII活性化
剤としては、ＦＸIIの活性化作用を有する物質であれば
如何なるものでも使用でき、例えばガラス、カオリン、
セライト、コラーゲン、ホモシスチン、尿酸ナトリウ
ム、血小板や他の細胞の膜等の細胞成分、フィブロネク
チン、エラジン酸、クエルセチン、ルチン、硫酸化糖脂
質、プロテオグリカン、ムコ多糖類、ステアリン酸ナト
リウム、硫酸デキストラン、硫酸アミローズ、カラゲニ
ン並びにＦＸIIを限定分解して活性化するプロテアーゼ
等を単独で又は組み合わせて用いることが可能であり、
これらＦＸII活性化剤の使用濃度は適宜調整することが
できる。
【００１２】実質的に精製されたＦＸII、血漿プレカリ
クレイン及びＨＫからなる溶液にＦＸII活性化剤を添加
して被検物質の存在下にて行う混合反応は、反応を制御
し易いように反応温度を適宜設定して行うことができ
る。混合反応は血漿カリクレイン・キニン系反応が良好
に進行するｐＨ、例えば７．０乃至９．０付近で行うの
が好ましい。又、至適な反応条件を設定するために、塩
化ナトリウム等の塩類や亜鉛イオン等の金属イオンの
他、当該技術分野で慣用の添加剤、補助剤等を反応系に
適宜加えてもよい。
クレイン及びＨＫからなる溶液にＦＸII活性化剤を添加
して被検物質の存在下にて行う混合反応は、反応を制御
し易いように反応温度を適宜設定して行うことができ
る。混合反応は血漿カリクレイン・キニン系反応が良好
に進行するｐＨ、例えば７．０乃至９．０付近で行うの
が好ましい。又、至適な反応条件を設定するために、塩
化ナトリウム等の塩類や亜鉛イオン等の金属イオンの
他、当該技術分野で慣用の添加剤、補助剤等を反応系に
適宜加えてもよい。
【００１３】混合反応の時間は、前記ＦＸII、ＦＸII活
性化剤、血漿プレカリクレイン、ＨＫ及び被検物質の濃
度又は反応液のｐＨ等によって適宜設定できるが、定量
すべき生理活性物質の生成量が飽和に達すると被検物質
の作用の正確な評価ができないので、定量すべき生理活
性物質の生成量が飽和に達する前、即ち反応時間と生成
した生理活性物質との間に明確な正の対応関係、例えば
評価上好ましくは直線的な比例関係などが成立する時間
内に設定するのが好ましい。
性化剤、血漿プレカリクレイン、ＨＫ及び被検物質の濃
度又は反応液のｐＨ等によって適宜設定できるが、定量
すべき生理活性物質の生成量が飽和に達すると被検物質
の作用の正確な評価ができないので、定量すべき生理活
性物質の生成量が飽和に達する前、即ち反応時間と生成
した生理活性物質との間に明確な正の対応関係、例えば
評価上好ましくは直線的な比例関係などが成立する時間
内に設定するのが好ましい。
【００１４】前記混合反応において生理活性物質の生成
を停止させるための方法は、定量すべき生理活性物質の
種類に応じて適宜選択する。即ち、例えばＦＸIIａを定
量する場合には、ＦＸIIａの生成を停止させるための物
質、例えばポリブレンなどのＦＸII活性化阻害剤及び血
漿カリクレインを特異的に阻害する阻害剤、好ましくは
ＦＸIIａには実質的に無影響な血漿カリクレイン阻害
剤、例えばＳＢＴＩ（Soy Bean Trypsin Inhibitor：大
豆由来のトリプシンインヒビター）などを用いると、Ｆ
ＸIIａに対する基質を用いＦＸIIａの酵素活性を指標と
して生成したＦＸIIａを定量することができ好ましい。
を停止させるための方法は、定量すべき生理活性物質の
種類に応じて適宜選択する。即ち、例えばＦＸIIａを定
量する場合には、ＦＸIIａの生成を停止させるための物
質、例えばポリブレンなどのＦＸII活性化阻害剤及び血
漿カリクレインを特異的に阻害する阻害剤、好ましくは
ＦＸIIａには実質的に無影響な血漿カリクレイン阻害
剤、例えばＳＢＴＩ（Soy Bean Trypsin Inhibitor：大
豆由来のトリプシンインヒビター）などを用いると、Ｆ
ＸIIａに対する基質を用いＦＸIIａの酵素活性を指標と
して生成したＦＸIIａを定量することができ好ましい。
【００１５】又、血漿カリクレインを定量する場合に
は、血漿カリクレインの生成を停止させるための物質、
例えばＦＸIIａに対する特異的阻害剤、好ましくは血漿
カリクレインには実質的に無影響な阻害剤、例えばＬＢ
ＴＩ（Lima Bean Trypsin Inhibitor ：リマ豆由来のト
イプシンインヒビター）、ＣＨＦＩ（Corn Hageman Fra
gment Inhibitor ：トウモロコシ由来のハーゲマンフラ
グメントインヒビター）などを用いると、血漿カリクレ
インに対する基質を用い血漿カリクレインの酵素活性を
指標として生成した血漿カリクレインを定量することが
でき好ましい。
は、血漿カリクレインの生成を停止させるための物質、
例えばＦＸIIａに対する特異的阻害剤、好ましくは血漿
カリクレインには実質的に無影響な阻害剤、例えばＬＢ
ＴＩ（Lima Bean Trypsin Inhibitor ：リマ豆由来のト
イプシンインヒビター）、ＣＨＦＩ（Corn Hageman Fra
gment Inhibitor ：トウモロコシ由来のハーゲマンフラ
グメントインヒビター）などを用いると、血漿カリクレ
インに対する基質を用い血漿カリクレインの酵素活性を
指標として生成した血漿カリクレインを定量することが
でき好ましい。
【００１６】更に、生成する生理活性物質としてブラジ
キニンを定量する場合には、ブラジキニンの生成を停止
させるための物質、例えばＨＫを限定分解してブラジキ
ニンを遊離させる作用を有する血漿カリクレインやＦＸ
IIａに対する前記阻害剤、或いはアセトン、エタノール
などの有機溶媒又は塩酸、過塩素酸などの酸を用いるこ
とができる。
キニンを定量する場合には、ブラジキニンの生成を停止
させるための物質、例えばＨＫを限定分解してブラジキ
ニンを遊離させる作用を有する血漿カリクレインやＦＸ
IIａに対する前記阻害剤、或いはアセトン、エタノール
などの有機溶媒又は塩酸、過塩素酸などの酸を用いるこ
とができる。
【００１７】これらの生理活性物質の生成を停止させる
ための物質の濃度は、各生理活性物質の定量時に実質的
に影響を及ぼさない濃度範囲になるように適宜設定す
る。
ための物質の濃度は、各生理活性物質の定量時に実質的
に影響を及ぼさない濃度範囲になるように適宜設定す
る。
【００１８】生成された生理活性物質の定量は、慣用の
測定法に従って行うことができる。ＦＸIIａの生成量を
測定する方法としては、例えばＦＸIIａの酵素活性を利
用しＦＸIIａに対する基質を用いて測定する方法を挙げ
ることができ、血漿プレカリクレイン、ＦＸII又はプラ
スミン等の天然基質の他、Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ
−ｐＮＡ、Ｄ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ等の発
色合成基質やＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚ）−Ｇｌｙ−Ａｒ
ｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ
等の蛍光合成基質などを用いる方法が簡便であり通常よ
く用いられている。
測定法に従って行うことができる。ＦＸIIａの生成量を
測定する方法としては、例えばＦＸIIａの酵素活性を利
用しＦＸIIａに対する基質を用いて測定する方法を挙げ
ることができ、血漿プレカリクレイン、ＦＸII又はプラ
スミン等の天然基質の他、Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ
−ｐＮＡ、Ｄ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ等の発
色合成基質やＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚ）−Ｇｌｙ−Ａｒ
ｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ
等の蛍光合成基質などを用いる方法が簡便であり通常よ
く用いられている。
【００１９】生成された血漿カリクレインを定量する場
合も、ＦＸII又はＨＫ等の天然基質、或いはＤ−Ｐｒｏ
−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡ、Ｂｚ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａ
ｒｇ−ｐＮＡ等の発色合成基質やＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−
ＭＣＡ等の蛍光合成基質などを用いる方法を挙げること
ができる。
合も、ＦＸII又はＨＫ等の天然基質、或いはＤ−Ｐｒｏ
−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡ、Ｂｚ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａ
ｒｇ−ｐＮＡ等の発色合成基質やＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−
ＭＣＡ等の蛍光合成基質などを用いる方法を挙げること
ができる。
【００２０】上記の基質を用いる測定法の他にも、ラジ
オイムノアッセイ法（ＲＩＡ）やエンザイムイムノアッ
セイ法（ＥＩＡ）等の免疫学的測定法、クロマトグラフ
ィー等を用いた定量分析法なども利用することができ
る。
オイムノアッセイ法（ＲＩＡ）やエンザイムイムノアッ
セイ法（ＥＩＡ）等の免疫学的測定法、クロマトグラフ
ィー等を用いた定量分析法なども利用することができ
る。
【００２１】又生成されたブラジキニンを定量する方法
としては、バイオアッセイ法、ＲＩＡ、ＥＩＡ等の慣用
の方法を挙げることができ、被検物質の数、測定施設の
設備、要求される測定精度等の諸条件に応じて如何なる
方法を選択してもよい。
としては、バイオアッセイ法、ＲＩＡ、ＥＩＡ等の慣用
の方法を挙げることができ、被検物質の数、測定施設の
設備、要求される測定精度等の諸条件に応じて如何なる
方法を選択してもよい。
【００２２】
【実施例】以下の実施例において、本発明を更に詳細に
説明する。なお、以下の実施例は本発明を説明するため
の一例であり、限定的な意味を有するものではない。
説明する。なお、以下の実施例は本発明を説明するため
の一例であり、限定的な意味を有するものではない。
【００２３】実施例１ ６ｎＭＦＸII、３５ｎＭ血漿プレカリクレイン、１０ｎ
ＭＨＫ及び所定量の被検物質（被検薬）、並びにTriton
X-100 、BSA 及び１００ｍＭＮａＣｌを含む２５ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８）からなる溶液に、デキストラ
ン硫酸を終濃度が５μｇ／ｍｌとなるように加え混合
し、次いで氷水中でインキュベーションした後、ＬＢＴ
Ｉを終濃度が２０ｍｇ／ｍｌとなるように反応液に加え
た。この反応液を、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）中で１
ｍＭＤ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（合成基質）
とともに３０℃で３０分間インキュベーションした後、
クエン酸を加えて反応を停止させ、３０００ｒｐｍで１
０分間遠心分離した後、得られた上澄みの４０５ｎｍに
おける吸光度（血漿カリクレイン生成量に相当）を測定
した。
ＭＨＫ及び所定量の被検物質（被検薬）、並びにTriton
X-100 、BSA 及び１００ｍＭＮａＣｌを含む２５ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８）からなる溶液に、デキストラ
ン硫酸を終濃度が５μｇ／ｍｌとなるように加え混合
し、次いで氷水中でインキュベーションした後、ＬＢＴ
Ｉを終濃度が２０ｍｇ／ｍｌとなるように反応液に加え
た。この反応液を、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）中で１
ｍＭＤ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（合成基質）
とともに３０℃で３０分間インキュベーションした後、
クエン酸を加えて反応を停止させ、３０００ｒｐｍで１
０分間遠心分離した後、得られた上澄みの４０５ｎｍに
おける吸光度（血漿カリクレイン生成量に相当）を測定
した。
【００２４】実施例２ ＦＸIIを０．６ｎＭ使用したこと以外は、実施例１と同
様にして４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
様にして４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００２５】図１に、実施例１（●）及び実施例２
（▲）においてインキュベーション時間を種々に変化さ
せた場合の吸光度の変化を示す。図中、横軸はインキュ
ベーション時間（分）を表わし、縦軸は４０５ｎｍにお
ける吸光度を表わす。実施例１の場合は、インキュベー
ション時間が７分間程度まではカリクレインが経時的に
ほぼ直線的に増加して生成され約７分後に生成が飽和に
達するため、０〜７分の間にインキュベーション時間を
設定するのが好ましい。実施例２の場合には、カリクレ
イン生成量が飽和に達する時間を３０分に延長すること
ができた。又、実施例２においては血漿プレカリクレイ
ンの量は実施例１と同一であるため、最終的に測定可能
な吸光度の強度は０．４と実施例１の場合と同一強度を
得ることができた。
（▲）においてインキュベーション時間を種々に変化さ
せた場合の吸光度の変化を示す。図中、横軸はインキュ
ベーション時間（分）を表わし、縦軸は４０５ｎｍにお
ける吸光度を表わす。実施例１の場合は、インキュベー
ション時間が７分間程度まではカリクレインが経時的に
ほぼ直線的に増加して生成され約７分後に生成が飽和に
達するため、０〜７分の間にインキュベーション時間を
設定するのが好ましい。実施例２の場合には、カリクレ
イン生成量が飽和に達する時間を３０分に延長すること
ができた。又、実施例２においては血漿プレカリクレイ
ンの量は実施例１と同一であるため、最終的に測定可能
な吸光度の強度は０．４と実施例１の場合と同一強度を
得ることができた。
【００２６】なお、従来の血漿カリクレイン・キニン系
において動物血漿を用いた場合は、ＦＸIIの量を１０分
の１に減らすためには動物血漿を１０倍希釈することに
なり、それに応じて血漿プレカリクレインの量も１０分
の１に減ぜられるため、最終的に測定される吸光度の強
度も１０分の１に低くなってしまいほとんど測定が不可
能となる。
において動物血漿を用いた場合は、ＦＸIIの量を１０分
の１に減らすためには動物血漿を１０倍希釈することに
なり、それに応じて血漿プレカリクレインの量も１０分
の１に減ぜられるため、最終的に測定される吸光度の強
度も１０分の１に低くなってしまいほとんど測定が不可
能となる。
【００２７】図２に、本発明の活性測定法を使用して、
鎮痛剤や抗アレルギー剤として用いられている５種の被
検薬（インドメタシン、ケトプロフェン、アミノピリ
ン、ケトチフェン及びＤＳＣＧ）の血漿カリクレイン生
成阻害活性を測定した結果を示す。図中、横軸は被検薬
濃度（ｍＭ）を表わし、縦軸はカリクレイン生成阻害率
（％）を表わす。
鎮痛剤や抗アレルギー剤として用いられている５種の被
検薬（インドメタシン、ケトプロフェン、アミノピリ
ン、ケトチフェン及びＤＳＣＧ）の血漿カリクレイン生
成阻害活性を測定した結果を示す。図中、横軸は被検薬
濃度（ｍＭ）を表わし、縦軸はカリクレイン生成阻害率
（％）を表わす。
【００２８】
【発明の効果】再構成した血漿カリクレイン・キニン系
を利用した本発明活性測定法は、夾雑するその他因子を
実質的に除いた反応系であるため、血漿カリクレイン・
キニン系の酵素反応系に対して影響を及ぼす可能性のあ
る因子や未知の成分の影響などを考慮して反応を制御す
る必要もなく、血漿カリクレイン・キニン系において生
成される生理活性物質の生成に対する被検物質の純粋な
活性（促進能又は阻害能）を簡便迅速且つ正確に測定す
ることができる。
を利用した本発明活性測定法は、夾雑するその他因子を
実質的に除いた反応系であるため、血漿カリクレイン・
キニン系の酵素反応系に対して影響を及ぼす可能性のあ
る因子や未知の成分の影響などを考慮して反応を制御す
る必要もなく、血漿カリクレイン・キニン系において生
成される生理活性物質の生成に対する被検物質の純粋な
活性（促進能又は阻害能）を簡便迅速且つ正確に測定す
ることができる。
【００２９】本発明の活性測定法では、従来の血漿カリ
クレイン・キニン系において使用していた動物血漿に代
えて実質的に精製された各構成成分を使用するため、動
物血漿を使用する場合に比べて以下に例示する如き種々
の長所を有している。 各構成成分の量を自由に調節できるため、反応系にお
ける反応時間、反応温度、吸光強度等を、被検物質の数
や要求精度に応じて適宜設定することができる。 動物血漿中に存在するα2 マクログロブリン、Ｃ１−
インヒビター等の内因性インヒビターやキニナーゼなど
の影響を実質上無視でき、又、反応に影響を及ぼす可能
性のある動物血漿中の因子やその他未知物質についても
考慮せずに済むため、血漿カリクレイン・キニン系にお
いて生成する生理活性物質の生成に対する被検物質の活
性を純粋且つ正確に測定することができる。具体的に
は、例えばブラジキニン生成に対する被検物質の作用を
測定するときに、キニナーゼ阻害剤を使用する必要がな
いなどの利点がある。 動物血漿成分の不均一性による反応のばらつきを抑え
ることができるので、測定精度が向上する。
クレイン・キニン系において使用していた動物血漿に代
えて実質的に精製された各構成成分を使用するため、動
物血漿を使用する場合に比べて以下に例示する如き種々
の長所を有している。 各構成成分の量を自由に調節できるため、反応系にお
ける反応時間、反応温度、吸光強度等を、被検物質の数
や要求精度に応じて適宜設定することができる。 動物血漿中に存在するα2 マクログロブリン、Ｃ１−
インヒビター等の内因性インヒビターやキニナーゼなど
の影響を実質上無視でき、又、反応に影響を及ぼす可能
性のある動物血漿中の因子やその他未知物質についても
考慮せずに済むため、血漿カリクレイン・キニン系にお
いて生成する生理活性物質の生成に対する被検物質の活
性を純粋且つ正確に測定することができる。具体的に
は、例えばブラジキニン生成に対する被検物質の作用を
測定するときに、キニナーゼ阻害剤を使用する必要がな
いなどの利点がある。 動物血漿成分の不均一性による反応のばらつきを抑え
ることができるので、測定精度が向上する。
【００３０】本発明の活性測定法では、生成した生理活
性物質を定量する際に、所望により種々の方法例えばＦ
ＸIIａ生成阻害能の測定方法、血漿カリクレイン生成阻
害能の測定方法、ブラジキニン生成阻害能の測定方法を
適宜選択し得るため、測定における自由度が大きく、
又、適用範囲が広い。
性物質を定量する際に、所望により種々の方法例えばＦ
ＸIIａ生成阻害能の測定方法、血漿カリクレイン生成阻
害能の測定方法、ブラジキニン生成阻害能の測定方法を
適宜選択し得るため、測定における自由度が大きく、
又、適用範囲が広い。
【００３１】更に本発明の活性測定法は、実質的に精製
された各成分を用い夾雑する他の因子を除いた再構成系
を利用して種々の角度から血漿カリクレイン・キニン系
における各種生理活性物質の生成に対する活性（生成促
進能又は阻害能）を有する薬剤をスクリーニングするこ
とができ、明解で具体的な作用機構に基づく薬剤のスク
リーニングが可能であるため、種々の疾患に対する新薬
の開発に大きな効果を奏する。
された各成分を用い夾雑する他の因子を除いた再構成系
を利用して種々の角度から血漿カリクレイン・キニン系
における各種生理活性物質の生成に対する活性（生成促
進能又は阻害能）を有する薬剤をスクリーニングするこ
とができ、明解で具体的な作用機構に基づく薬剤のスク
リーニングが可能であるため、種々の疾患に対する新薬
の開発に大きな効果を奏する。
【図１】本発明の実施例１及び実施例２において、種々
のインキュベーション時間における吸光度の変化を示す
図である。
のインキュベーション時間における吸光度の変化を示す
図である。
【図２】本発明の活性測定法を使用して種々の被検薬の
血漿カリクレイン生成に対する阻害活性を測定した結果
を示す図である。
血漿カリクレイン生成に対する阻害活性を測定した結果
を示す図である。
【図３】血漿カリクレイン・キニン系の酵素反応機構を
説明した図である。
説明した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−185398（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−86100（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/70
Claims (11)
- 【請求項１】 血液凝固第ＸII因子、血漿プレカリクレ
イン、高分子キニノーゲンにて再構成した血漿カリクレ
イン・キニン系において被検物質の存在下、血液凝固第
ＸII因子の活性化を初発反応とする一連の酵素反応を開
始させた後、この反応を停止させ、前記反応において生
成された生理活性物質を定量することを特徴とする被検
物質の活性測定法。 - 【請求項２】 生理活性物質の生成量が飽和に達する前
に該生理活性物質の生成を停止させる請求項１記載の測
定法。 - 【請求項３】 生理活性物質が活性型血液凝固第ＸII因
子である請求項２記載の測定法。 - 【請求項４】 生理活性物質が血漿カリクレインである
請求項２記載の測定法。 - 【請求項５】 生理活性物質がブラジキニンである請求
項２記載の測定法。 - 【請求項６】 反応の停止が血液凝固第ＸII因子活性化
阻害剤及び血漿カリクレイン阻害剤を加えることにより
行われる請求項３記載の測定法。 - 【請求項７】 血液凝固第ＸII因子活性化阻害剤がポリ
ブレンであり、血漿カリクレイン阻害剤が大豆由来のト
リプシンインヒビターである請求項６記載の測定法。 - 【請求項８】 反応の停止が活性型血液凝固第ＸII因子
に対する特異的阻害剤を加えることにより行われる請求
項４記載の測定法。 - 【請求項９】 活性型血液凝固第ＸII因子に対する特異
的阻害剤がリマ豆由来のトリプシンインヒビターである
請求項８記載の測定法。 - 【請求項１０】 反応の停止が有機溶媒又は酸を加える
ことにより行われる請求項５記載の測定法。 - 【請求項１１】 有機溶媒がアセトン又はエタノールで
あり、酸が塩酸又は過塩素酸である請求項１０記載の測
定法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21517893A JP3213832B2 (ja) | 1993-08-06 | 1993-08-06 | 被検物質の活性測定法 |
| KR1019940017772A KR100270160B1 (ko) | 1993-08-06 | 1994-07-22 | 피검물질의 활성 측정법 |
| US08/284,972 US5648228A (en) | 1993-08-06 | 1994-08-04 | Measuring activity toward production of activated blood coagulation factor XII, plasma kallikrein or bradykinin using reconstituted kallikrein-kinin system |
| DE69425197T DE69425197T2 (de) | 1993-08-06 | 1994-08-05 | Verfahren zur Prüfung der Wirksamkeit einer Testsubstanz |
| ES94112271T ES2149833T3 (es) | 1993-08-06 | 1994-08-05 | Metodo para la medicion de la actividad de una sustancia de ensayo. |
| AT94112271T ATE194659T1 (de) | 1993-08-06 | 1994-08-05 | Verfahren zur prüfung der wirksamkeit einer testsubstanz |
| EP94112271A EP0637632B1 (en) | 1993-08-06 | 1994-08-05 | Method of measuring activity of test substance |
| CN94115039A CN1080762C (zh) | 1993-08-06 | 1994-08-05 | 被检物质的活性测定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21517893A JP3213832B2 (ja) | 1993-08-06 | 1993-08-06 | 被検物質の活性測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0751098A JPH0751098A (ja) | 1995-02-28 |
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Family
ID=16667967
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21517893A Expired - Fee Related JP3213832B2 (ja) | 1993-08-06 | 1993-08-06 | 被検物質の活性測定法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5648228A (ja) |
| EP (1) | EP0637632B1 (ja) |
| JP (1) | JP3213832B2 (ja) |
| KR (1) | KR100270160B1 (ja) |
| CN (1) | CN1080762C (ja) |
| AT (1) | ATE194659T1 (ja) |
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| NZ521534A (en) * | 2000-02-23 | 2004-10-29 | Besst Test Aps | Method for correlating blood coagulation activity with markers in urine |
| US6632678B2 (en) | 2001-01-03 | 2003-10-14 | Sienco, Inc. | Method for performing activated clotting time test with reduced sensitivity to the presence of aprotinin and for assessing aprotinin sensitivity |
| US6913900B2 (en) * | 2001-08-29 | 2005-07-05 | Nippon Zoki Pharmaceutical Co., Ltd. | Plasma prekallikrein activation and kallikrein production assay |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB697351A (en) * | 1951-01-16 | 1953-09-23 | Masuichi Takino | Improved process for the manufacture of nerve sedatives |
| JPS53101515A (en) * | 1977-02-17 | 1978-09-05 | Nippon Zoki Pharmaceutical Co | Medicine having anodyne * sedative and antiallergic activity and production thereof |
| US4335203A (en) * | 1980-07-10 | 1982-06-15 | The Regents Of The University Of California | Method for identifying potential contrast media reactors |
| JPS5777697A (en) * | 1980-11-04 | 1982-05-15 | Nippon Zoki Pharmaceut Co Ltd | Physiologically active substance nsq |
| JPS5835117A (ja) * | 1981-08-25 | 1983-03-01 | Nippon Zoki Pharmaceut Co Ltd | 新規生理活性物質ｎｓｈ |
| ATE17262T1 (de) * | 1981-11-02 | 1986-01-15 | Pentapharm Ag | Verfahren zur quantitativen bestimmung von blutgerinnungsfaktor xii in humanplasma. |
| DE3504405A1 (de) * | 1985-02-08 | 1986-08-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Bestimmung von prokallikrein |
| JPS63185398A (ja) * | 1986-09-10 | 1988-07-30 | Nippon Zoki Pharmaceut Co Ltd | 生理活性物質測定法 |
| US4882272A (en) * | 1986-10-01 | 1989-11-21 | Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education | High molecular weight kininogen assay |
| JP2651674B2 (ja) * | 1987-07-23 | 1997-09-10 | 日本臓器製薬 株式会社 | 新規生理活性物質及びその製造方法 |
| US4985254A (en) * | 1987-11-06 | 1991-01-15 | Nippon Zoki Pharmaceutical Co., Ltd. | Method of treating ischemic diseases |
| EP0341209B1 (en) * | 1988-04-30 | 1993-09-15 | Nippon Zoki Pharmaceutical Co. Ltd. | Physiologically active substances, a process for preparation and pharmaceutical compositions thereof |
| JP2539665B2 (ja) * | 1988-06-20 | 1996-10-02 | 日本臓器製薬株式会社 | 神経疾患治療剤 |
| CA2082643A1 (en) * | 1990-05-10 | 1991-11-11 | Jan H. Nuijens | Inhibitors of factor xii activation and applications thereof |
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1993
- 1993-08-06 JP JP21517893A patent/JP3213832B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-07-22 KR KR1019940017772A patent/KR100270160B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-08-04 US US08/284,972 patent/US5648228A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-08-05 ES ES94112271T patent/ES2149833T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-05 EP EP94112271A patent/EP0637632B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-05 DE DE69425197T patent/DE69425197T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-08-05 AT AT94112271T patent/ATE194659T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-08-05 CN CN94115039A patent/CN1080762C/zh not_active Expired - Fee Related
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| ATE194659T1 (de) | 2000-07-15 |
| JPH0751098A (ja) | 1995-02-28 |
| KR100270160B1 (ko) | 2000-10-16 |
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| EP0637632A3 (en) | 1998-01-07 |
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