ES2354086T3 - Determinación de la actividad de trombina en sangre completa. - Google Patents
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Abstract
Un método para determinar in vitro la actividad de la trombina en una muestra biológica que es una muestra de sangre entera o una muestra de plasma y en el que la generación de trombina se mide por las etapas de: - poner en contacto una capa de dicha muestra con un substrato fluorógeno de trombina y con una concentración conocida de fluoróforo en el que dicho fluoróforo está en el intervalo de 1-10% de la cantidad de molécula fluorescente unida al substrato fluorógeno de trombina, y en el que dicha capa tiene un grosor dentro de un intervalo de 0,05 a 5 mm y una superficie dentro de un intervalo de 10 a 500 mm 2 , y en el que dicha muestra se introduce en un recipiente que contiene medios que ayudan a la dispersión de la muestra; - permitir que se genere trombina en dicha muestra; - medir la fluorescencia emitida desde la superficie de la capa, por el grupo fluorescente desprendido del substrato fluorógeno como resultado de la acción enzimática de la trombina generada sobre dicho substrato fluorógeno.
Description
Determinación de la actividad de trombina en
sangre completa.
La invención se refiere a un método para
determinar, especialmente medir la secuencia temporal de la
actividad de la trombina in vitro, es decir, medir la
trombina activa en una muestra, especialmente cuando se desarrolla
en una muestra coagulada que consiste en sangre entera. El resultado
de la medida de la actividad de la trombina se puede representar
por la denominada "curva de generación de trombina" ilustrada
en la figura 1.
La invención se refiere también a medios que
permiten la medida de la trombina activa después de su generación
en una muestra in vitro. También se refiere al uso de dicho
método de medida para la detección o la monitorización del estado
de un paciente, incluyendo la detección o monitorización del estado
patológico relacionado con la deficiencia de la coagulación de la
sangre.
La invención trata también del uso del método de
medida para el examen de substancias, incluyendo el examen de
fármacos que podrían interaccionar con el procedimiento de
coagulación, especialmente con la actividad de la trombina.
Las enfermedades trombóticas, tales como el
infarto coronario, apoplejía, embolismo pulmonar y varias otras son
responsables de alrededor de la mitad de todas las muertes e
invalidez en la sociedad occidental. En los países en desarrollo se
incrementan con el grado de desarrollo. Las enfermedades
hemorrágicas, aunque numéricamente menos importantes, son también
una significativa causa de muerte. De este modo el sobre- o
sub-funcionamiento del sistema hemostático es un
mecanismo patógeno extremadamente importante. Es por lo tanto aún
más sorprendente que no esté disponible un buen análisis de
funcionamiento clínico.
En la hemostasia y trombosis la trombina
desempeña un papel fundamental. En la enfermedad trombótica venosa
esto ha sido reconocido (1) desde hace mucho tiempo y está
convincentemente demostrado por el hecho de que la prevención y el
tratamiento de la trombosis venosa se proporciona mejor disminuyendo
la actividad de la trombina, por inhibición directa (hirudina,
melagastran) o por síntesis disminuida (antagonistas de vitamina K)
o por descomposición incrementada (heparinas). En el último decenio
se empezó a ver cada vez más claro que la trombina es tan
importante en la enfermedad arterial como lo es en la enfermedad
venosa. Los ensayos clínicos han mostrado que los antagonistas (2)
de la vitamina K así como la heparina (3) disminuyen la tasa de
reaparición del infarto de miocardio. Un papel de la trombina en la
hemorragia es sugerido por el prolongado tiempo de hemorragia que
se observa cuando la generación de trombina está tan profundamente
afectada como en la sobredosis severa de anticoagulantes (4) orales
o heparina (5). Además, las hemofilias son enfermedades del sistema
(6) de formación de trombina.
La investigación moderna ha conducido al
reconocimiento de que la trombina se forma por la cooperación de
los elementos formados de la sangre y plasma. Los glóbulos rojos
(RBCs) son los menos activos en este aspecto aunque en un pequeño
porcentaje de ellos la membrana externa exhibe actividad (7)
precoagulante. Mucho más importante es que los glóbulos blancos
llevan la actividad del factor tisular. Esta actividad normalmente
está encriptada pero en lesiones se pone de manifiesto por medio de
interacciones con las plaquetas (8, 9). Los principales jugadores
son indudablemente las plaquetas y el sistema de coagulación
plasmática. En los libros de texto se encuentra aún que las
plaquetas son responsables de la hemostasia primaria y de la
trombosis arterial mientras que la coagulación del plasma sirve
para la consolidación del tapón hemostático y es el mecanismo
detrás de la trombosis venosa. Esta visión es debida al hecho de que
el plasma y las plaquetas se estudiaron por separado. En realidad
la cooperación entre las plaquetas y el plasma y las otras células
de la sangre es esencial tanto en la hemostasia primaria y
secundaria como en la trombosis arterial y venosa. La formación del
tapón de plaquetas desempeña un papel en la generación de trombina
porque los intersticios en un agregado de plaquetas forman un nicho
sin agitar en el que se puede formar la trombina sin ser barrida
por la sangre circulante. Es por eso por lo que medir la generación
de trombina en sangre entera coagulada es tan cercano a la realidad
fisiológica.
Aparte de formar una "esponja" en la que se
puede formar trombina, las plaquetas contribuyen también activamente
a la generación de trombina. Liberan factor V y proporcionan la
superficie de fosfolípido procoagulante requerida para la
conversión de protrombina así como para las diferentes etapas en el
mecanismo de coagulación que conduce a la formación (10) de
protrombinasa. La velocidad de generación de trombina y la cantidad
formada depende de este modo de la actividad de las plaquetas así
como de las proteínas plasmáticas implicadas. Es particularmente
interesante el papel de la fibrina polimerizante. El factor de Von
Willebrand (vWf) interacciona con la fibrina polimerizante y sufre
un cambio conformacional que la hace reactiva al receptor de
plaquetas GPIb y por medio de esta unión coopera para que las
plaquetas se vuelvan procoagulantes (11, 12). Esto muestra que
formar un coágulo de fibrina no es el acto final de la hemostasia y
que la formación de trombina en forma de un tapón (o trombo o
coágulo) es un suceso clave en el procedimiento. Ciertamente, como
veremos a continuación, >95% de toda la trombina formada se
forma después de que ha tenido lugar la coagulación y esta trombina
es esencial en el procedimiento de hemostasia y trombosis
(H&T). Quizás la mejor prueba de las estrechas uniones entre
las plaquetas y el sistema de coagulación plasmática es el hecho de
que todos los "inhibidores de agregación" y otros agentes
antiplaqueta también inhiben la generación de trombina en plasma
rico en plaquetas (o sangre entera). Esto ha sido mostrado para
aspirina (13), abciximab (14), MK383 (15) y clopidogrel (16).
Inversamente, el hecho de que el fármaco antiplaquetas por
excelencia, aspirina, previene la trombosis (17) venosa ilustra
adicionalmente la cercana conexión entre la función de las plaquetas
y la coagulación de la sangre.
Así, en resumen, la cantidad de trombina formada
en un coágulo es una característica esencial en el procedimiento de
hemostasia y trombosis y todos los elementos de la sangre participan
en su formación.
La TG incrementada invariablemente indica riesgo
trombótico, tanto si es debido a la deficiencia de antitrombina o a
un exceso de protrombina. Además, en trastornos en el sistema de la
proteína C (deficiencia de proteínas S y C, factor V_{Leiden}) la
generación de trombina es más alta de lo normal. Esto vale para la
coagulación del plasma como tal, pero se vuelve especialmente obvio
si el sistema de la proteína C es activado por trombomodulina (fig.
1). La tendencia trombótica inducida por los contraconceptivos
orales puede ser atribuida a una resistencia adquirida a la
proteína C activada que provoca un incremento del 10% de la
generación de trombina que se vuelve más obvia cuando se añade TM o
APC (18, 19).
Un caso particularmente interesante es el
anticoagulante lúpico. Este tipo de anticuerpo induce un incremento
del tiempo retraso de la formación de trombina, y por lo tanto un
incremento del tiempo de coagulación, pero también una importante
resistencia a la actividad del sistema (20) de la proteína C. Esto
explica la "paradoja de LE", es decir, un efecto
anticoagulante que está acompañado de una tendencia trombótica.
Se ha encontrado que cantidades en exceso de los
factores II, VIII y VII se correlacionan con la aparición de
infarto de miocardio (21-24). Además, niveles más
altos de lo normal de vWf que incrementan la generación de trombina
(12) son un factor de riesgo para la trombosis arterial (25,
26).
En una subpoblación de jóvenes pacientes con
apoplejía (alrededor de 30%) se ha mostrado que tanto la generación
de trombina en plasma rico en plaquetas (PRP) como el vWF son
significativamente más altos de lo normal (27). En todas las
deficiencias congénitas del factor de coagulación disminuye la
generación de trombina. Esto ha sido demostrado para las hemofilias
A, B y C (deficiencia de factor VIII, IX o XI;
28-31) así como para todas las deficiencias raras
(protrombina, factores V, VII, X, XII; 32). Se ve una tendencia a la
hemorragia tan pronto como la TG está por debajo del 20% de lo
normal. En la hemofilia A no solo la infusión de factor VIII o la
administración de DDAVP aumenta la capacidad de la sangre para
formar trombina sino también la terapia de bypass del inhibidor con
productos que contienen protrombina y/o factor VII incrementa la
generación de trombina.
La trombopenia severa (<50 000 \mul^{-1})
provoca generación de trombina disminuida así como las trombopatías
de Glanzman y Bernard-Soulier. En la enfermedad de
Willebrand - que se sabe hasta ahora que induce un trastorno de
adhesión de plaquetas a altas tasas de cizalladura - la generación
de trombina en plasma rico en plaquetas está significativamente
deteriorada (véase anteriormente). El defecto en PRP es mucho más
alto que en plasma pobre en plaquetas (PPP), lo que indica que no
se puede explicar por la concomitante - usualmente moderada -
disminución del factor VII.
Se deben tener en cuenta las siguientes
observaciones con respecto al mecanismo de generación de trombina
cuando se trata el problema que se va a resolver según la
invención.
Incluso un esquema simplificado del mecanismo de
formación de trombina (fig. 1) muestra que es extremadamente
complejo y está lleno de reacciones de retroalimentación positiva y
negativa. Ciertamente tan complejo como para convertirse en un
sistema no lineal, es decir, no hay relaciones simples entre la
concentración de los reactantes y el resultado y fenómenos de
umbral pueden provocar que el sistema reaccione en lo esencial
imprevisiblemente. La reacción del total a un activador dado no
puede por lo tanto ser deducida del conocimiento de las
concentraciones individuales de los reactantes relevantes (que
incluso pueden no ser conocidos) y solo un ensayo que mide la
función del sistema completo como el contenido
\hbox{en la
sangre de un paciente revela el estado hemostático/trombótico de
ese paciente.}
El resultado de todo el procedimiento de la
generación de trombina es la aparición y desaparición de una
actividad de la trombina transitoria. La curva de la actividad de
la trombina frente el tiempo, o Trombograma^{TM} (TG) está
caracterizada por una fase de iniciación, o tiempo de retraso,
durante el cual solo se forman cantidades diminutas de trombina; a
continuación viene un estallido de actividad, conocido como la fase
de propagación (fig. 1). La sangre forma un coágulo en el comienzo
del estallido y casi toda la trombina se forma después de que se ha
formado el coágulo. Toda la trombina formada se inactiva
subsecuentemente por las antitrombinas de la sangre. Estas
proteínas se unen estequiométricamente a la trombina en una reacción
lenta. La velocidad de inactivación es proporcional a la
concentración de trombina y de antitrombina. Con tal de que la
velocidad de conversión de protrombina sea más alta que la
velocidad de inactivación de trombina el nivel de trombina aumenta.
En el máximo ambas velocidades son iguales, a partir de entonces
predomina la descomposición. La curva obtenida de la actividad de
la trombina muestra las distintas fases y especialmente muestra el
máximo de generación de trombina, el tiempo para llegar al máximo y
el potencial de trombina endógena (ETP).
La necesidad de medir la función del sistema de
hemostasia y trombosis no ha escapado de la atención de la
profesión médica durante el último siglo. Las soluciones de este
problema no han cambiado esencialmente hasta los 1990s, ofreciendo
medios que eran prácticos pero inadecuados o adecuados pero no
prácticos.
Las soluciones prácticas se refieren a la medida
del tiempo de coagulación y del tiempo de hemorragia. El tiempo de
coagulación mide la duración de la fase de iniciación de la
generación de trombina y por lo tanto refleja solo parte de la
función (33, véase también anteriormente). El único hecho de que
están en uso muchas variedades del ensayo en el laboratorio
clínico, cada una útil solo en una situación específica, muestra ya
que el tiempo de coagulación no refleja el mecanismo de coagulación
en su conjunto. Para el tiempo de hemorragia se puede decir que es
extremadamente impreciso teniendo un coeficiente de variación de
alrededor del 40%, que simplemente limita enormemente su uso
práctico (34).
Desde los 1950s se ha reconocido que medir la
secuencia temporal de la trombina en la coagulación de la sangre es
lo mejor para estimar la función de H&T (35-37).
Hasta 1992 el único modo de medir la TG era tomando muestras de
sangre coagulada o plasma y determinar la trombina contenida en
ellas. Esto lleva un hombre-hora por curva y de
este modo puede ser apropiado para propósitos de investigación pero
no para el moderno uso clínico y epidemiológico.
En 1990 Hemker and Béguin et al.
(EP-B1- 0 420 332) lanzaron la idea de añadir a la
sangre coagulada un substrato cromógeno (que produce color) que
tenga alta especificidad por la trombina pero un bajo porcentaje de
participación (baja K_{cat}) y poca afinidad de unión para
trombina (alta Km). Tal substrato está presente durante todo el
procedimiento de TG y la suma (es decir la integral) de la actividad
de la trombina con el tiempo se puede medir de la cantidad total de
producto formado. Idealmente esto mide el potencial de trombina
endógena (ETP), es decir, el área bajo la curva de generación de
trombina (AUC).
Posteriormente, Hemker et al.
desarrollaron adicionalmente este método para obtener el total de la
curva de TG (38). Este estaba basado en el principio de que, si las
constantes cinéticas del substrato son favorables, la velocidad de
reacción puede, en buena aproximación, permanecer proporcional a la
concentración de trombina durante todo el procedimiento de
coagulación, de modo que la primera derivada de la concentración de
producto da una curva que es proporcional a la actividad de la
trombina. Este método, descrito en el documento WO 03/093831A1, era
una extensión y elaboración del procedimiento descrito anteriormente
en el documento EP-B2-0420332, en
el que solo se mide el nivel final de producto, de cuyo modo se
obtiene el área bajo la curva de la TG, es decir, el ETP.
Los substratos usados en este método dan un
producto amarillo, cuya monitorización requiere medir la densidad
óptica y por tanto un medio de reacción ópticamente transparente. La
turbidez provocada por la coagulación de fibrinógeno se tiene que
evitar por lo tanto y el fibrinógeno tiene que ser retirado o se
tiene que evitar su polimerización añadiendo inhibidores de
polimerización. La retirada de fibrinógeno tiene sin embargo la
desventaja de retirar un reactante importante y no se puede llevar a
cabo sin retirar elementos celulares tales como las importantes
plaquetas de la sangre. Además, la adición de inhibidores de
polimerización, en las altas concentraciones requeridas para
prevenir completamente la formación de fibrina, inhibe la enzima
que convierte protrombina y las reacciones bioquímicas que conducen
a su formación.
En contraste con la densidad óptica, se puede
medir la fluorescencia en medios turbios. Al contrario de los
substratos cromógenos, los substratos que dan un producto
fluorescente (substratos fluorógenos) se pueden usar por lo tanto
en plasma que no está desfibrinado y por lo tanto también en plasma
rico en plaquetas (PRP) (33, 39-43). El uso de un
substrato fluorógeno introduce dos desventajas importantes sin
embargo: 1) la intensidad de fluorescencia no es proporcional a la
concentración del fluoróforo debido al denominado efecto de filtro
interno; 2) con los substratos disponibles la velocidad de formación
de producto no es necesariamente proporcional a la concentración de
enzima. La última desventaja se puede superar usando substratos que
no se consumen significativamente, como en el método cromógeno.
Tales substratos no están disponibles en este momento. En la
práctica real en este momento ambos problemas se resuelven
conjuntamente por comparación continua de la señal experimental con
la de una actividad del tipo trombina constante que actúa en
condiciones exactamente idénticas a las de la muestra medida (WO
03/093831
A1).
A1).
El método cromógeno obviamente no se puede usar
con sangre entera porque la sangre no es traslúcida. Se ha
publicado que los substratos fluorógenos son aplicables para medir
la TG en sangre entera (44). En la práctica real este método
publicado la mayoría de las veces da señales erráticas que no se
parecen a la secuencia de generación de trombina tal como se conoce
del método (fig. 2) de submuestreo establecido. También la relación
cuantitativa entre la señal obtenida y la cantidad de trombina
presente varía de experimento a experimento. En pocas palabras, el
método descrito no da resultados reproducibles y cuantificables.
Otra posibilidad es la fuerte dilución de la
sangre (10 veces o más), de modo que los glóbulos rojos RBC tengan
menos influencia (45). Esto da curvas que son ciertamente mejores
que aquellas que son obtenidas con sangre mínimamente diluida. Sin
embargo no se puede pensar que este enfoque representa la situación
fisiológica por dos razones. En primer lugar, después de formar un
coágulo (es decir, durante la fase más importante de la generación
de trombina), las reacciones que forman trombina están limitadas por
difusión porque tienen lugar en interfases insolubles (superficie
de plaquetas y otras células inmovilizadas en la red de fibrina).
Esto las hace más sensibles a la dilución que las reacciones en
disolución libre tales como las reacciones de inactivación de
trombina. En sangre diluida el equilibrio entre las reacciones de
formación de trombina y de inactivación de trombina no es
representativo de la situación que existe in vivo. Esto es
incluso más importante en el caso de que estén contenidos en la
sangre inhibidores patológicos (por ejemplo, inhibidor en hemofilia
refractaria a terapia o en lupus eritematoso). Es bien conocido, en
la práctica clínica que los inhibidores de coagulación pierden su
efecto al diluirlos in vitro.
Por consiguiente queda el problema de cómo
obtener una señal de la que se pueda determinar la cambiante
concentración de trombina en una muestra de sangre coagulada que
está diluida menos de diez veces. La presente invención pretende
proporcionar una solución a este problema que supere por lo menos
algunos de los inconvenientes planteados en la técnica
anterior.
Se encontró por los inventores que los
resultados erráticos e irreproducibles obtenidos antes de la
presente invención, eran por lo menos debidos a dos causas; a:
sedimentación antes de los coágulos de sangre y b: retracción del
coágulo después de que ha tenido lugar la coagulación (véase fig.
4). Se deduce de ello que el volumen del que se obtiene
fluorescencia cambia durante la reacción y que la forma geométrica
de la superficie cambia, provocando la focalización y reflexión
errática de la luz que perturba la señal recuperada. Inesperadamente
fue encontrado por los inventores que estos fenómenos no ocurren
cuando se opera sobre una capa delgada de sangre y especialmente en
una capa delgada provista de una malla y/o microbolas. La forma
geométrica de una capa delgada, con o sin dicha malla y/o
microbolas, ciertamente previene la sedimentación y retracción. El
volumen de reacción sin embargo permanece desconocido, por
consiguiente tiene que ser determinado durante la medida. Esto se
realiza añadiendo, al comienzo del experimento, una concentración
conocida de una molécula fluorescente. La señal es pequeña y de
este modo la relación señal/ruido se incrementa ventajosamente
midiendo en una gran área superficial con cualquier dispositivo
apropiado conocido en la técnica. Además, como las grandes
relaciones de superficie a volumen tienden a la evaporación, se
deben tomar ventajosamente medidas apropiadas para medir esto.
El documento WO 93/22453 describe un artículo de
ensayo para determinar la capacidad de coagulación en una muestra
de sangre.
Wielders et al., Arterioscler. Thromb.
Vasc. Biol 24, 1138-1142 (2004); Vanschoonbeek et
al., J. Thrombosis Haemostasis 2, 476-484
(2004); Dargaud et al., Thrombosis Res. 116,
483-498 (2005); Tanaka et al.,
Anesthesiology 99, A158 (2003); Dargaud et al, Thromb Haemost
93, 475-480 (2005) and Furugohri et al, Eur.
J. Pharmacology 514, 35-42 (2005) describen ensayos
fluorógenos de generación de trombina.
Según la invención, se describe un método que es
un método para determinar in vitro la secuencia de la
actividad de la trombina en el tiempo en una muestra en la que la
muestra es una muestra de sangre y se mide la generación de
trombina por las etapas de:
- -
- poner en contacto una capa de dicha muestra con un substrato fluorógeno de trombina, y con una concentración conocida de fluoróforo en el que dicho fluoróforo está en el intervalo de la cantidad de molécula fluorescente unida al substrato fluorógeno de trombina y en el que dicha capa tiene un grosor dentro de un intervalo de 0,05 a 5 mm y una superficie dentro de un intervalo de 10 a 500 mm^{2} y en el que dicha muestra se introduce en un recipiente que contiene medios que ayudan a la dispersión de la muestra;
- -
- dejar que la trombina se genere en dicha muestra;
- -
- medir la fluorescencia emitida de la superficie de la capa, por el grupo fluorescente desprendido del substrato fluorógeno como resultado de la acción enzimática de la trombina generada sobre dicho substrato fluoróge- no.
El método de determinar la actividad de la
trombina permite la medida de la secuencia temporal de la
concentración de trombina tal como resulta de su formación y
subsecuente inactivación, según el esquema de coagulación.
El método de la invención se puede llevar a cabo
en muestras de sangre tales como muestras de sangre entera o
muestras de plasma rico en plaquetas (PRP).
Se deja generar la trombina en la muestra
usualmente después del contacto de dicha muestra con componentes
apropiados para la iniciación de la generación de trombina. Tales
componentes pueden comprender factores de coagulación tales como el
factor tisular, y posiblemente iones calcio.
Mientras la trombina es generada y está presente
en la mezcla de reacción (trombina activa), reacciona con su
substrato fluorógeno, con el resultado de que se desprende el grupo
fluorescente del substrato.
La reacción está diseñada de un modo tal que el
substrato fluorógeno está presente durante toda la duración de la
reacción, en cantidades suficientemente altas para permitir medir la
actividad de la trombina. Por ejemplo, la concentración de
substrato está alrededor o por encima de la Km del substrato para
trombina, de modo que el consumo del substrato no tiene mucha
influencia en la velocidad de reacción. El substrato es convertido
por trombina, conduciendo a un incremento de la fluorescencia
emitida desde el substrato de la muestra analizada.
El método definido en la invención, permite que
tenga lugar la generación de trombina en una muestra de sangre,
especialmente en una muestra de sangre entera, de un modo que es
esencialmente comparable a la generación de trombina que ocurre en
el cuerpo. Por lo tanto proporciona un método fiable de medida para
aplicación en estudios de hemostasia y trombóticos.
La etapa de medir el incremento de la
fluorescencia emitida desde la superficie de la capa de la muestra
analizada, como resultado del desprendimiento del grupo
fluorescente del substrato por la acción de la trombina, se lleva a
cabo especialmente usando un dispositivo óptico que permite tanto
iluminar superficies grandes, tales como las superficies que tienen
de 10 a 500 mm^{2} como recoger la luz emitida de esa superficie.
La longitud de onda seleccionada para la medida de la fluorescencia
está determinada por el grupo fluorescente seleccionado. Se
determina una longitud de onda para la luz de excitación que se
suministra a la muestra para seguir adelante con la medida. Se
determina otra longitud de onda para la luz emitida que es el
resultado del desprendimiento del grupo fluorescente del substrato
fluorógeno de trombina. Es apropiado para medir la fluorescencia un
dispositivo óptico, tal como un lector de placas fluorescentes
conocido por expertos en la técnica (por ejemplo, el lector de
placas Ascent Fluorescent, Thermolabsystems).
Según una realización de la invención, la
muestra que se va a analizar, especialmente la muestra de sangre
entera, se introduce en uno o más recipientes que permiten
ventajosamente que se analicen varias muestras al mismo tiempo.
Tales recipientes están diseñados para permitir que la muestra se
introduzca según las condiciones definidas de grosor y superficie
de la capa de la muestra que se va a analizar. Por ejemplo, se
pueden usar microplacas de fondo plano que contienen pocillos o un
recipiente o soporte que tiene otro diseño geométrico apropiado,
conocidos por el experto en el campo de dichos análisis.
Se pueden usar otros dispositivos como soporte
para las muestras si cumplen el requisito de permitir que dichas
muestras se proporcionen para el análisis en forma de una capa que
cumple con las definiciones de la invención. Por lo tanto, la
descripción del método y medios de llevar a cabo la invención, que
se hace con referencia a pocillos (de microplacas) que contienen
las muestras puede valer para otros dispositivos (recipiente o
soporte) que contienen las muestras.
Según el método de la invención, la
concentración de trombina durante el ensayo es una función de la
fluorescencia medida del grupo fluorescente desprendido del
substrato de trombina fluorógena. Es especialmente proporcional a
la tasa de incremento de la aparición de fluorescencia.
Por consiguiente, el método de la invención
permite la medida de la concentración de trombina durante todo el
tiempo de actividad de la trombina en la muestra, con tal de que el
substrato fluorógeno esté presente en cantidades apropiadas.
Por lo tanto, la secuencia de la actividad de la
trombina, antes y después de la coagulación de la sangre, hasta el
máximo de trombina y también durante la disminución de la
concentración de trombina después de que se ha obtenido el máximo
de trombina como resultado de la inactivación de trombina, está
representado por una medida de la curva de concentración de
trombina dependiente del tiempo. Durante las distintas etapas de la
actividad de la trombina, el substrato fluorógeno reacciona con la
trombina que está presente y se hidroliza especialmente, dando como
resultado el desprendimiento del grupo fluorescente.
Una ventaja particular de la invención es que el
método permite la medida de la generación de trombina en una
muestra, especialmente en una muestra de sangre entera que no está
diluida o que está mínimamente diluida, dentro de un intervalo de
máximo de diez veces, especialmente menor o igual a 4 veces.
En una realización particular del método
descrito, el grosor de la capa de muestra que se va a analizar,
especialmente de sangre entera es de 1 a 3 mm, especialmente
alrededor de 2 mm o menos.
En una realización particular del método, la
superficie de la muestra, especialmente de la muestra de sangre
entera, cuando se introduce en los pocillos de la microplaca o
cualquier recipiente o soporte apropiado, es mayor de 20 mm^{2},
por ejemplo, de 30 mm^{2} a 200 mm^{2}, especialmente mayor de
100 mm^{2}, en particular dentro de un intervalo de 150 a 200
mm^{2}.
Como ejemplo, la muestra se introduce en
pocillos de microplacas, teniendo cada pocillo un diámetro de 15 mm
y el grosor de la muestra de sangre es menor de 2 mm, permitiendo la
medida sobre una superficie de alrededor de 175 mm^{2}.
La medida de la actividad de la trombina se
realiza de un modo que permite múltiples puntos de lectura de la
fluorescencia en la superficie de cada muestra.
Según una realización de la invención, el método
se lleva a cabo con una muestra, especialmente una muestra de
sangre entera que se introduce en los pocillos de una placa u otro
recipiente o soporte en el que dichos pocillos también contienen
una malla especialmente con un tamaño de malla de 50 \mum.
Alternativamente o además de tal malla en una
realización de la invención, la muestra, especialmente la muestra
de sangre entera, se introduce en un pocillo o placa u otro
recipiente o soporte que contiene microbolas.
La presencia de dicha malla y/o microbolas es
ventajosa para ayudar a la dispersión de la sangre en el pocillo y
especialmente para prevenir la retracción del coágulo en la sangre
coagulada. En otras palabras, la presencia de la malla o microbolas
puede prevenir alteraciones de la superficie de la sangre coagulada
que hacen borrosa la señal que es medida durante la actividad de la
trombina. Tal malla y/o microbolas puede mejorar la atenuación de
los efectos de retracción que se obtiene usando una gran superficie
para la medida. Se pueden usar también otros medios que permiten
dicho efecto.
En una realización particular de la invención,
los pocillos que contienen la muestra, especialmente las muestras
de sangre entera se cubren para evitar el secado de la sangre
durante el tiempo de medida de la actividad de la trombina, como
resultado de la evaporación. Tal cubierta se puede realizar con
materiales usuales, tales como tipos de película plástica delgada,
con tal de que no interfieran con la medida de fluorescencia.
La medida de la actividad de la trombina en la
muestra de sangre se lleva a cabo desde el instante en el que se
introduce la muestra dentro de los pocillos (o cualquier otro
dispositivo apropiado tal como una hendidura) y se proporcionan a
dicha muestra los componentes requeridos para iniciar la generación
de trombina, incluyendo el factor tisular, hasta el instante en el
que se ha consumido la trombina en el procedimiento de
coagulación.
En una realización particular del método de la
invención, la cantidad de substrato fluorógeno de trombina añadido
a la muestra está dentro de un intervalo de 50-1000
\muM. Según el método descrito, para ser capaces de conocer la
concentración de trombina activa en términos absolutos (es decir, en
nM/L), es necesario conocer el volumen de la muestra de sangre
dentro del que se lleva a cabo la medida de fluorescencia. Para este
fin se puede añadir una concentración conocida de un fluoróforo al
substrato fluorógeno de trombina en el que las respectivas
proporciones de substrato de trombina a flouróforo están en el
intervalo de 1% a 10% de la cantidad de la molécula fluorescente
unida al substrato de trombina, especialmente en el intervalo de 1%
a 5%.
En una realización particular de la invención,
el fluoróforo es de la misma naturaleza que la molécula fluorescente
que se desprende por la acción de trombina sobre el substrato
fluorógeno.
En otra realización este fluoróforo es una
especie diferente de la molécula fluorescente del substrato
fluorescente. En este caso, la medida de la fluorescencia tiene en
cuenta la presencia de esta nueva especie de fluoróforo; incluye
especialmente la medida de la fluorescencia del fluoróforo.
La adición de una concentración conocida de tal
fluoróforo proporciona un estándar interno en la muestra que se va
a analizar y permite la evaluación del volumen de la muestra en el
que se mide de hecho la fluorescencia.
Para llevar a cabo el método de determinar la
generación de trombina en una muestra especialmente una muestra de
sangre entera, se usa ventajosamente un substrato sintético para
trombina que consiste en un compuesto químico orgánico acoplado a
la molécula fluorescente.
El substrato fluorógeno sintético puede ser un
oligopéptido que tiene la secuencia de 2 a 30 restos aminoácido
acoplados con una molécula fluorescente.
Puede ser especialmente útil que el grupo
fluorógeno esté unido a una lisina terminal o a un resto arginina
en el substrato porque la trombina divide preferentemente grupos
unidos a estos restos aminoácido.
Según una realización particular, la molécula
fluorescente usada es AMC (7-amino-4
metilcumarina) o p-nitroanilida. Los substratos
sintéticos han sido descritos por Rijkers, D.T., H.C. Hemker, et
al. (1996), Int J Pept Protein Res 48(2):
182-93; Rijkers, D.T., S.J. Wielders, et al.
(1995), Thromb Res 79 (5-6): 591-9;
Wielders, S.M. Mukherjee, et al. (1997), Thromb Haemost
77(4): 629-36.
Un substrato de trombina fluorógeno sintético
particular apropiado para realizar la invención es
Z-Gly-Gly-Arg-AMC
(disponible de BACHEM).
En una realización particular de la invención,
los pocillos (o cualquier otro dispositivo apropiado) que contienen
la muestra pueden comprender adicionalmente un gel, posiblemente un
gel que contiene iones calcio, estando preparado dicho gel de modo
que no permita la dilución de la sangre entera de la muestra. Se
pueden usar geles tales como Sefadex o geles de agarosa hasta el
punto de que no se secan de tal modo que permitirían que se
introdujera líquido o plasma dentro del gel.
Cuando se usa un gel, se puede introducir en los
pocillos previamente o junto con la muestra de sangre entera.
Los compuestos que se pueden añadir a la muestra
para permitir la generación de trombina comprenden el factor
tisular e iones calcio, tales compuestos son añadidos en cantidades
que permiten que comience la coagulación.
Tales cantidades pueden estar dentro del
intervalo de 0,05 picomol/l a 15 nanomol/l para el factor tisular,
y alrededor de 10 mM de iones Ca^{++} cuando se usa sangre
citrada. La invención también cubre explícitamente el caso en el
que se usa sangre nativa no anticoagulada, en tal caso no se
necesita añadir iones Ca^{++}. Alternativamente, en ciertas
aplicaciones es provechoso no añadir factor tisular para investigar
la coagulabilidad espontánea de la sangre. El factor tisular,
cuando es necesario, se añade justo antes de comenzar la medida.
Los iones calcio y/o el substrato fluorógeno se
pueden añadir directamente con la muestra de sangre especialmente
cuando se usa calcio y substrato fluorógeno en una disolución. El
factor tisular se puede añadir también alternativamente a la
muestra de sangre.
Cuando se introducen en el pocillo la muestra y
varios compuestos, se lleva a cabo inmediatamente la medida.
En una realización particular del método de la
invención, la sangre entera que se analiza es sangre citrada.
El método de medida de la actividad de la
trombina en la muestra de sangre entera se puede usar ventajosamente
para detectar o monitorizar una enfermedad hemostática o una
enfermedad trombótica o para detectar o monitorizar la posibilidad
de que tal enfermedad aparezca en un paciente.
El método permite también la detección o
monitorización de la interacción de determinada(s)
substancia(s) sobre la actividad de la trombina en una
muestra de sangre entera, en el que dicha(s)
substancia(s) determinada(s) se
añade(n)
a la muestra que se va a analizar o se añade(n) durante la generación de trombina.
a la muestra que se va a analizar o se añade(n) durante la generación de trombina.
Las substancias que se pueden analizar según el
método de la invención son por ejemplo compuestos farmacéuticos u
otros compuestos que tienen un efecto sobre la coagulación de la
sangre, tales como factores o fármacos de coagulación o factores o
fármacos anticoagulantes. Los inhibidores de la trombina se pueden
analizar especialmente según el método de la invención.
En otro aspecto, el método de la invención se
puede usar para examinar substancias para determinar su capacidad
de interacción con la actividad de la trombina.
Según la invención, el método que ha sido
descrito anteriormente y que se ilustrará en los ejemplos se puede
usar especialmente para la medida del potencial de trombina endógena
(ETP) de la muestra de sangre entera.
También se puede usar para la medida del tiempo
hasta el máximo para trombina o para medir el tiempo de
coagulación.
También es útil medir el nivel del máximo de
trombina generada durante el ensayo.
El método de la invención ciertamente permite la
medida de la denominada curva de trombina que es la primera
derivada de la fluorescencia medida resultante de la reacción entre
trombina y substrato fluorógeno.
En un método particular de la invención, se
realiza una etapa de calibración tal como la calibración descrita
en la solicitud de patente WO 03/093831
El método de la invención ha sido descrito en
relación a la muestra biológica que es la muestra de sangre entera.
También se podría usar para analizar una muestra que podría ser
plasma, especialmente plasma rico en plaquetas (PRP) o incluso
plasma pobre en plaquetas (PPP).
La invención se refiere también a un kit para
llevar a cabo el método descrito anteriormente y en los ejemplos a
continuación en el que dicho kit comprende
- -
- un substrato fluorógeno para trombina,
- -
- una concentración conocida de fluoróforo como estándar interno, en el que dicho fluoróforo está en el intervalo de 1-10% de la cantidad de molécula fluorescente unida a substrato fluorógeno de trombina,
- -
- factor tisular e iones calcio para permitir la generación de trombina,
- -
- medios que ayudan a la dispersión de la muestra tales como una malla o microbolas que previenen la retracción del coágulo de sangre y ayudan a la dispersión de la sangre entera,
- -
- opcionalmente un gel que comprende posiblemente iones calcio.
Opcionalmente, el kit comprende también
instrucciones para su uso para proporcionar una guía específica
para llevar a cabo el método de la invención. Otras características
de la invención y sus ventajas serán descritas en los ejemplos y en
las figuras a continuación.
Fig. 1: Un trombograma obtenido de un
experimento de submuestreo. Las principales características son:
Tiempo de retraso (=tiempo de coagulación), altura de pico y área
bajo la curva (=potencial de trombina endógena, ETP).
Fig. 2: Un ejemplo de curvas de generación de
trombina obtenidas en plasma pobre en plaquetas por trombinografía
automática calibrada.
AVK: tratamiento anti-vitamina
K; TM: trombomodulina.
Fig. 3: Un esquema simplificado de la formación
de trombina: son evidentes las retroalimentaciones positiva y
negativa.
Fig. 4: Representación esquemática de los
efectos de sedimentación y retracción del coágulo en la señal
fluorescente de sangre entera coagulada.
Óvalos grandes: glóbulos rojos
Círculos estrellados: moléculas fluorescentes
que están excitadas
Cuadrados: moléculas fluorescentes que no están
excitadas
Línea superior horizontal (c.q. curvada):
superficie del fluido
Línea horizontal de fondo: fondo transparente
del pocillo de medida
Etapa A: sangre fluida justo después de
introducirla en el pocillo (fig.1 t=0)
Etapa B: sangre fluida justo antes de la
coagulación (fig. 1 t=B)
Etapa C: sangre justo después de la coagulación
(fig.1 t=C)
Etapa D: sangre después del comienzo de la
retracción (fig. 1 t=D)
Fig. 5: Ocular de Huygens y condensador.
Fig. 6: Capa delgada (3 mm) de sangre en
pocillos de placa de microtitulación normal. Siete experimentos
idénticos.
Fig. 7: Capa delgada de sangre en pocillos de
placa de microtitulación de gran superficie.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 8: Capa delgada de sangre en pocillo de
placa de microtitulación de gran superficie con malla y cubierta.
Un punto de lectura a través de dispositivo de recogida de luz
(ocular de Huygens) (1) curva experimental, (2) después de la
corrección para \alpha2M-trombina.
Fig. 9: De unidades arbitrarias para
trombina.
Fig. 10 A: El diseño del cartucho de muestra
muestra un posible diseño de un cartucho de medida de dos
compartimentos. Una delgada pieza de material (preferentemente
rígida, por ejemplo, vidrio) (denominada "vidrio") posiblemente
revestida con un revestimiento biocompatible, está dividida en
compartimentos con un separador apropiado. Este separador puede
actuar también como electrodo para detectar la inyección de muestra
por la caída de resistencia y/o el incremento de corriente
eléctrica. Cada compartimento puede estar revestido con substancias
como el calibrador y/o el substrato (o cualquier otra substancia
necesaria como inhibidores y factor tisular). Se une un segundo
vidrio sobre el otro vidrio. El espacio entre los dos vidrios es
5-1000 \mum, preferentemente 50 \mum.
El cartucho puede estar revestido sobre uno o
más lados por un revestimiento especular dicroico apropiado que
permite la amplificación óptica. Esto permite que la luz de
excitación entre en el cartucho, mientras que la luz de emisión es
reflejada dentro del cartucho (véase la figura 10B) y se concentrará
en un lado no revestido del cartu-
cho.
cho.
Fig. 11: Un diseño de cartucho alternativo
muestra una pieza de matriz sólida, por ejemplo, se pone entre dos
vidrios un polímero poroso o celulosa. Esta matriz puede contener
substrato y/o calcio (o cualquier otra substancia como factor
tisular, inhibidores). Estas substancias pueden estar presentes
junto con un disolvente, en forma seca o liofilizada.
La Fig. 12 muestra una curva de TG medida en una
capa delgada de sangre en una celda de papel de filtro, convertida
en trombina nM por un calibrador de Estafilocoagulasa.
Cuando se usa un substrato fluorógeno, la
fluorescencia se puede provocar y medir solo en la medida en que la
luz no es interceptada por los glóbulos rojos, es decir, en el
espacio del plasma accesible a la luz de excitación, que es también
el espacio desde el cual puede ser observada la luz emitida. Por
simplicidad, suponemos que los glóbulos rojos son completamente
impenetrables a ambos tipos de luz. Si sin embargo hasta cierto
punto los RBC son penetrables, el razonamiento no necesita ser
alterado fundamentalmente.
La sangre entera forma un coágulo al final de la
fase de iniciación, es decir, al comienzo de la explosiva
generación de trombina en masa. En la fig. 4 se representan cuatro
etapas de la situación en las superficies inferior y superior de la
sangre en el pocillo de una placa de fluorímetro en presencia de un
substrato fluorógeno e iluminado desde la parte superior o
alternativamente desde el fondo.
En la etapa A la sangre agitada acaba de
depositarse y los glóbulos rojos están dispersos homogéneamente en
el plasma fluido (fig. 4 A). En el transcurso del tiempo de retraso
antes de la coagulación (típicamente 3-12 minutos)
tiene lugar la sedimentación de los glóbulos rojos; en la parte
superior más plasma se vuelve accesible a la luz y menos en el
fondo (fig. 4 B). Tan pronto como se coagula la sangre (fig. 4 C) el
estatus quo alcanzado en B se "congela" por la
aparición del coágulo de fibrina. Debido a la acción de la trombina
en las plaquetas de la sangre se inicia la retracción del coágulo
tan pronto como se forma un coágulo. La sedimentación y la
formación de coágulo son fenómenos que son visibles a simple vista
en una escala de mm por hora. En el dominio micrométrico ocurren en
el transcurso de minutos, es decir, en la escala de tiempo de los
experimentos de TG. La retracción provoca una distribución desigual
de los RBCs y también un cambio en la superficie, de tal modo que
ya no es plana sino que se vuelve ondulada. Esta ondulación provoca
un reparto desigual de plasma y coágulo en la superficie y causa
efectos ópticos impredecibles. Las irregularidades de la superficie
son en una escala de mm visibles a simple vista. Por lo tanto son
del mismo orden de magnitud que el área de excitación de la luz en
fluorometría normal.
La sedimentación y retracción inducen un cambio
del volumen de fluido en el que las moléculas fluorescentes pueden
ser alcanzadas por la luz de excitación. Debido a este cambio el
volumen real en el que tiene lugar la medida es variable y
desconocido. Por consiguiente, es imposible la cuantificación
reproducible de la cantidad de trombina a partir del porcentaje de
producción de señal obtenida en estas condiciones, incluso si fueran
despreciables los efectos de sedimentación y retracción.
Los experimentos llevados a cabo usando pocillos
de placa de microtitulación ordinaria y un volumen que llenaba
estos pocillos hasta la altura (6 mm) normal permitió que se
obtuvieran resultados satisfactorios solo en un pequeño porcentaje
de los pocillos. Esto se explica por el hecho de que en la
fluorimetría ordinaria se obtiene una señal suficiente solo si el
punto de superficie medida (alrededor de 4 mm^{2}) coincide con
un área en la que se puede obtener suficiente señal porque hay
suficiente plasma disponible; que no está encima de una masa de
coágulo retraída sino en un "valle" de la superficie (véase
fig. 4 D). Las publicaciones positivas en la bibliografía de medida
deben ser el resultado de una cuidadosa selección de los datos
obtenidos. En aquellos casos en los que se obtiene una señal de la
forma correcta, la medida cuantitativa de la trombina es imposible
porque el volumen de medida es desconocido y variable. La medida
desde el fondo a través de una hoja transparente resolvería el
problema de las irregularidades de la superficie pero, debido a la
sedimentación de RBC, la señal se vuelve tan pequeña que se ahoga
en el ruido de fondo.
Se ha observado que, con el llenado normal de
los pocillos de una placa de 96 pocillos del tipo disponible hasta
ahora, es posible obtener una señal interpretable en 1 o 2 de cada
10 pocillos. Si los pocillos se llenan hasta menos de 2 mm de
altura como altura normalmente útil, se obtiene señal en casi todas
las medidas. Sin embargo la señal que se obtiene de esta manera en
un fluorímetro normal es muy variable y pequeña, es decir,
corresponde a 1-5% de la señal obtenida con plasma,
y muestra una gran relación señal/ruido (fig. 6). Concluimos que no
hay un modo práctico de determinar la TG en sangre entera usando el
sistema óptico de un fluorímetro normal.
Inesperadamente se encontró que (a) los efectos
de sedimentación y retracción disminuyen progresivamente con el
grosor de la capa de sangre coagulada y, (b) que medir la
fluorescencia de una superficie mayor de alrededor de 10 mm^{2}
tiende a compensar las restantes irregularidades de la superficie
provocadas por la retracción. Igual e inesperadamente, los efectos
de sedimentación y retracción se pueden reducir adicionalmente
conteniendo la sangre en laberintos o intersticios, tales como una
malla de filtro (que tiene aberturas de malla de
50-500 \mum) o esferas empaquetadas (diámetro
50-500 \mum). Consecuentemente, los inventores
proporcionan condiciones para obtener una señal fluorescente no
perturbada del producto de la actividad de la trombina permitiendo
que se lleve a cabo la medida en una capa delgada de sangre
\hbox{(especialmente inferior a 2 mm) extendida sobre una
superficie mayor de alrededor de 10 mm ^{2} .}
Para resolver el problema del volumen
desconocido en el que se mide la reacción, los inventores decidieron
adicionalmente no usar substrato puro sino substrato que ya
contenía una concentración baja fija pero desconocida y fácilmente
medible de producto fluorescente.
Medir sobre una superficie más grande de lo
normal requiere dispositivos ópticos que permitan iluminar las
superficies más grandes y recoger la luz emitida de esa superficie.
Uno de tales dispositivos no es distinto de un ocular de Huygens,
otro como un condensador de microscopio (fig. 5). Para incrementar
la señal fluorescente la sangre se puede extender sobre una
superficie reflectora, y tal superficie puede ser una parte integral
del dispositivo descrito a continuación.
El uso de un dispositivo que contiene la sangre
en los intersticios de su estructura permite la simulación de la
situación de la sangre derramada en una herida, se puede hacer que
contenga factor tisular, trombomodulina y/u otros elementos que se
sabe que existen en la pared de los vasos normales que afectan al
proceso de TG (por ejemplo, colágeno). Para comparar, el material
del que está hecho el dispositivo se puede escoger entre material
inerte tal como, por ejemplo, nailon o polipropileno.
Para evitar el secado de la superficie, la capa
delgada de sangre se puede cubrir con una película delgada de
material sólido o fluido. Alternativamente la sangre se puede guiar
a una hendidura dentro de un material traslúcido, por ejemplo, por
fuerzas capilares.
Es una ventaja de medir en una capa delgada que
la señal fluorescente es proporcional a la concentración de
moléculas fluorescentes; en otras palabras, el efecto de filtro
interno no desempeña un papel. Sin embargo el consumo de substrato
si que desempeña un papel. Se puede compensar de tres modos: (a)
Como en el método cromógeno (38), es decir, proporcionando
substratos con constantes cinéticas de tal modo que el consumo de
substrato tiene un efecto despreciable, (b) corrigiendo el consumo
de substrato matemáticamente, es decir, aplicando la ecuación de
tasa integrada y (c) usando un calibrador como se describe en la
patente WO 03/093831.
La secuencia de la concentración de trombina al
coagular sangre entera se determina a partir de la acción
enzimática de la trombina sobre un substrato fluorógeno añadido a la
sangre. Se ha obtenido una señal estable y suficiente midiendo en
una capa delgada ilustrada por una capa de menos de 2 mm de grosor
en una gran superficie (ilustrada por una superficie que tiene más
de 10 mm^{2}). Para medir el volumen real en el que tiene lugar
la reacción se añade una pequeña cantidad de fluoróforo al
substrato. Se requiere un dispositivo óptico especializado para
iluminar toda la superficie y otro para recoger la luz emitida por
la superficie.
La capa delgada se podría estabilizar y prevenir
que se secara por una serie de medios mecánicos, entre los cuales
se pueden usar una malla inerte o una malla de material escogido tal
como para imitar ciertas propiedades de la pared del vaso.
Alternativamente se puede usar una pequeña hendidura.
El sistema se puede usar también para medir la
generación de trombina en plasma pobre en plaquetas y rico en
plaquetas.
El factor tisular relipidado recombinante (rTF)
que no contiene polibreno o Ca^{++} es de Dade Behring (Marburg,
Alemania). El substrato fluorógeno
Z-Gly-Gly-Arg-AMC
se obtiene de Bachem (Suiza). Al romperse con trombina desprende
7-amino-4-metilcumarina
(AMC) fluorescente que se mide por un conjunto de filtro de
excitación de 390 nm y emisión de 460 nm.
Se prepara una mezcla fresca de substrato
fluorógeno y CaCl_{2} (FluCa) para cada experimento como sigue: a
875 \mul de tampón (Hepes 20 mM, pH 7,35) que contiene 60 g/l de
BSA (Sigma, A-7030) se añadieron 100 \mul de
CaCl_{2} 1M. A 37ºC, se echó un chorro de 25 \mul de una
disolución en DMSO 100mM del substrato fluorógeno e inmediatamente
se mezcló vigorosamente. La disolución transparente resultante,
denominada FluCa, de este modo es 2,5 mM en substrato fluorógeno y
100 mM en CaCl_{2}.
El tampón A contiene hepes 20 mM, NaCl 140 mM, 5
mg/ml de BSA, pH=7,35.
El tampón B contiene hepes 20 mM, NaCl 140 mM,
60 mg/ml de BSA, pH=7,35.
La sangre se obtiene por punción en vena (1
volumen de citrato de trisodio 0,13 M a 9 volúmenes de sangre). Se
debe emplear el flujo libre o una mínima succión; se deben evitar
los recipientes a vacío.
\newpage
Las medidas se llevan a cabo en un fluorímetro
de placas (Ascent reader, Thermolabsystems OY, Helsinki, Finland)
equipado con un conjunto de filtro 390/460 (excitación/emisión). En
lugar de una placa normal de 96 pocillos, se usa una placa de
pocillos con 24 pocillos redondos con un diámetro de 15 mm y por lo
tanto una superficie de 175 mm^{2}. Los pocillos se preparan
lavando varias veces con tampón A y secando los pocillos.
A continuación se añade la mezcla de sangre y
substrato en la que tiene lugar la generación de trombina. Esta
mezcla contiene, por pocillo que se va a llenar: 80 \mul de sangre
entera citrada,
20 \mul de Innovin® diluido 1:1000 en tampón
A, 20 \mul de FluCa o, según sea el caso, un múltiplo de estos
volúmenes.
Inmediatamente después de la adicción del FluCa,
la mezcla se agita en un mezclador Vortex y se añade a los
pocillos. La placa se inserta en el fluorímetro y se agita durante
10 s a 1200 rpm y a continuación se mide cada dos minutos a 390/460
nm y 37ºC durante una hora.
A cada pocillo se añaden 120 \mul de la
mezcla.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
La generación de trombina se desencadenó como se
indicó anteriormente en tres pocillos. Se iluminaron 24 puntos por
pocillo y se midieron uno tras otro. Se sumaron las señales de los
24 puntos en cada lectura. Los resultados se muestran en la fig. 7.
Se ve que la señal aumenta y se estabiliza añadiendo una malla, aquí
un filtro de nailon con una abertura de malla de 600 \mum, 51% de
área abierta y un grosor de 445 \muM (Spectrum Laboratories Inc.
Rancho Dominguez California, USA). Sin embargo, la señal se
incrementa espuriamente con el tiempo debido a la evaporación y
concentración de la capa superior. Esto se evita cubriendo con una
lámina de plástico (Thermosprint Optical Clear Sealing Tape para
QPCR (Bilatec AG, Manheim, Germany).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La generación de trombina se desencadenó como se
indicó anteriormente en tres pocillos. Se iluminaron 24 puntos por
pocillo y se midieron uno tras otro. Se sumaron las señales de los
24 puntos en cada lectura. A dos pocillos se añaden 700 \mul de
una disolución de Spehadex-25 al 50% (v/v) en NaCl
150 mM y se deja sedimentar el polvo durante 5 minutos. Se retira
el sobrenadante (300-400 \mul) del pocillo con una
pipeta.
A continuación se añaden 120 \mul de la mezcla
de sangre coagulada. Encima de uno de estos dos pocillos se aplicó
una lámina de plástico (Thermosprint Optical Clear Sealing Tape para
QPCR (Bilatec AG, Manheim, Germany). Los resultados son comparables
a los de la fig. 7.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Para este experimento se midió un pocillo con
malla y cubierta como en el ejemplo 1 con la ayuda de un flourímetro
Fluostar optima (BMG Labtech, Offenburg, Germany). La luz de la
muestra se recogió en un ocular de Huygens (x10 aumentos) y se leyó
después de pasar a través de este dispositivo óptico. Los resultados
se muestran en la fig. 8.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Este experimento se llevó a cabo esencialmente
como el del ejemplo 1 con malla y cubierta pero se añadió una
cantidad conocida (10 nM) de AMC al substrato
Z-Gly-Gly-Arg-AMC.
Debido a la sedimentación de los eritrocitos, aumenta el volumen en
el que tiene lugar la medida de modo que aumenta la señal de AMC
presente. En el momento de la coagulación la situación se
"congela" y no tiene lugar sedimentación adicional. En ese
momento, conocido por un repentino aumento de señal, medimos la
cantidad de fluorescencia debida a los 10 nM de AMC añadido. De
este modo sabemos como convertir unidades de fluorescencia (F) en
concentración de AMC. De este modo la dF/dt medida se puede
convertir en d[AMC]/dt. De un experimento independiente
sabemos qué d[AMC]/dt corresponde a qué concentración de
trombina. De este modo la velocidad de cambio de la fluorescencia
(fig. 9, línea negra) se puede convertir en concentración de
trombina de la muestra.
\newpage
Ejemplo
5
Se prepara una celda de papel de filtro que
contiene substrato e iones Ca^{++} añadiendo 50 \mul de una
disolución de DMSO 100 mM del substrato fluorógeno y 100 \mul de
una disolución de CaCl_{2} 1M en 5850 \mul de etanol. Se
extienden 11 \mul de esta disolución sobre un trozo de matriz
sólida (papel cromatográfico Whatman 1MM) de 7x9 mm y se seca en
nitrógeno. A continuación se cubre entre dos trozos de plástico
(Thermosprint Optical Clear Sealing Tape para QPCR (Bilatec AG,
Manheim, Germany) como se muestra en la Figura 11.
Se usa el mismo procedimiento para preparar una
celda de papel de filtro que solo contiene substrato, en este caso
se añaden 50 \mul de una disolución de DMSO 100 mM del substrato
fluorógeno a 5950 \mul de etanol, de los cuales se extienden 11
\mul sobre un trozo de matriz sólida y se seca en nitrógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon recientemente como se describe
anteriormente dos celdas de papel de filtro, una que contiene
substrato fluorógeno e iones calcio (A) y una que solo contiene
substrato (B).
Se preparó una mezcla 4:1:1 de sangre entere
citrada, tampón B e Innovin® (diluida 1:1000 en tampón A). Como
calibrador, se preparó una mezcla 4:1:1 de sangre entera citrada,
inhibidor de polimerización
(H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH
. AcOH) (Bachem feinchemikalien AG, Bubendorf, Switserland) en
tampón B (1,0 mM) y estafilocoagulasa 20 \muM mezclando sangre
entera e inhibidor de polimerización. Justo antes de comenzar el
experimento, se añadió la estafilocoagulasa y se mezcló bien la
muestra.
Inmediatamente después de añadir la
estafilocoagulasa, se inicia el experimento añadiendo 11 \mul de
la muestra de TG a la celda A y 11 \mul del calibrador a la celda
B. Esto se efectúa pipeteando los gotas cerca de la matriz sólida
de un modo que la gota toca la matriz (véase la Figura 11) y es
absorbida dentro de ella por fuerzas capilares. Por celda, se
iluminan 4 puntos y se miden uno tras otro.
La señal del calibrador es una línea recta, la
pendiente se usa para convertir la señal de la celda de la muestra
en trombina nM. Esta es la calibración convencional de la señal como
se conoce en la técnica y no la calibración continua en el sentido
de la solicitud de patente PCT/EP 03/04705. Los resultados se
muestran en la Figura 12.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (28)
1. Un método para determinar in vitro la
actividad de la trombina en una muestra biológica que es una muestra
de sangre entera o una muestra de plasma y en el que la generación
de trombina se mide por las etapas de:
- -
- poner en contacto una capa de dicha muestra con un substrato fluorógeno de trombina y con una concentración conocida de fluoróforo en el que dicho fluoróforo está en el intervalo de 1-10% de la cantidad de molécula fluorescente unida al substrato fluorógeno de trombina, y en el que dicha capa tiene un grosor dentro de un intervalo de 0,05 a 5 mm y una superficie dentro de un intervalo de 10 a 500 mm^{2}, y en el que dicha muestra se introduce en un recipiente que contiene medios que ayudan a la dispersión de la muestra;
- -
- permitir que se genere trombina en dicha muestra;
- -
- medir la fluorescencia emitida desde la superficie de la capa, por el grupo fluorescente desprendido del substrato fluorógeno como resultado de la acción enzimática de la trombina generada sobre dicho substrato fluorógeno.
2. Un método de la reivindicación 1, en el que
la concentración de trombina generada durante el ensayo se
determina como una función de la fluorescencia medida del grupo
fluorescente desprendido.
3. Un método de la reivindicación 1 o 2, en el
que la muestra de sangre entera se diluye dentro de un intervalo de
un máximo de 10 veces.
4. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el grosor de la capa de la muestra
es de alrededor de 2 mm o menos.
5. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que, para el ensayo, la muestra de
sangre se introduce dentro de un pocillo de una placa que también
contiene una malla con tamaño de malla de 50 a 500 \mum.
6. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que, para la muestra, la muestra de
sangre se introduce en un pocillo de una placa que también contiene
microbolas.
7. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el pocillo que contiene la muestra
de sangre está cubierto para la determinación de la actividad de la
trombina.
8. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que la cantidad de substrato de
trombina añadida a la muestra está dentro de un intervalo de 50 a
1000 \muM.
9. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que el substrato fluorógeno es un
substrato sintético para trombina, unido a una molécula
fluorescente.
10. Un método según la reivindicación 9, en el
que el substrato de trombina es un compuesto químico orgánico,
unido a una molécula fluorescente.
11. Un método según la reivindicación 10, en el
que el substrato fluorógeno es un oligopéptido que tiene una
secuencia de 2 a 30 residuos aminoácido unidos a una molécula
fluorescente.
12. Un método según la reivindicación 11, en el
que el oligopéptido tiene una lisina o arginina terminal para
unirse a una molécula fluorescente.
13. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 12, en el que la molécula fluorescente es AMC
(7-amino4-metilcumarina).
14. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que el pocillo comprende
adicionalmente un gel, que contiene posiblemente iones calcio, en
el que dicho gel no permite la dilución de la sangre de la
muestra.
muestra.
15. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en el que el factor tisular y los iones
calcio se añaden a la muestra de sangre en cantidades que permiten
que ocurra la generación de trombina.
16. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que la muestra de sangre, es una
muestra de sangre entera.
17. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que la muestra de sangre es una
muestra de plasma, especialmente plasma rico en plaquetas
(PRP).
18. El método según la reivindicación 16, en el
que la muestra de sangre entera está citrada.
19. El uso del método según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 18, para detectar o monitorizar una
enfermedad hemostática o una enfermedad trombótica.
20. El uso según la reivindicación 19, para
detectar o monitorizar la interacción de determinada(s)
substancia(s) sobre la actividad de la trombina en una
muestra de sangre entera, en el que dicha(s)
substancia(s) determinada(s) se añade(n) a la
muestra que se va a analizar o se añade(n) durante la
generación de trombina.
21. El uso según la reivindicación 19 para
monitorizar la interacción de factores de coagulación o
fármacos.
22. El uso según la reivindicación 19 para
examinar substancias para determinar su capacidad de interacción
con la generación de trombina.
23. El uso del método según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 19, para la medida del potencial de
trombina endógena (ETP) de la muestra de sangre entera.
24. El uso del método según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 20, para la medida del tiempo hasta el
máximo de trombina.
25. El uso del método según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 21, para la medida del tiempo de
coagulación.
26. El uso del método según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 22, para la medida del nivel del máximo de
trombina generada.
27. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 23, que comprende una etapa de calibración.
28. Un kit para llevar a cabo un método según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, que comprende:
- -
- un substrato fluorógeno para trombina,
- -
- una concentración conocida de fluoróforo como estándar interno, en el que dicho fluoróforo está en el intervalo de 1-10% de la cantidad de molécula fluorescente unida al substrato fluorógeno de trombina,
- -
- factor tisular e iones calcio para permitir la generación de trombina,
- -
- medios que ayudan a la dispersión de la muestra tales como una malla o microbolas que previenen la retracción del coágulo de sangre y ayuda a la dispersión de la sangre entera,
- -
- opcionalmente un gel, que comprende posiblemente iones calcio.
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