JP6166279B2 - トロンビン産生の測定方法 - Google Patents
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Description
(1)(a)多血小板血漿(Platelet Rich Plasma)(以下、「PRP」という場合がある。)に、抗凝固剤、P2Y12受容体阻害剤、アデノシン二リン酸(以下、「ADP」という場合がある。)および組織因子(以下、「TF」という場合がある。)を添加する工程、(b)蛍光標識したトロンビン基質、および、カルシウム含有溶液を添加する工程、および、(c)蛍光強度を測定する工程、を含む、トロンビン産生を測定する方法;
(2)抗凝固剤が第Xa因子阻害剤である、前記(1)に記載の方法;
(3)第Xa因子阻害剤がエドキサバンである、前記(2)に記載の方法;
(4)P2Y12受容体阻害剤がクロピドグレルまたはチカグレロルである、前記(1)〜(3)いずれか1項に記載の方法;
(5)工程(a)におけるADPの最終濃度が5〜20μMである、前記(1)〜(4)いずれか1項に記載の方法;
(6)工程(a)におけるTFの最終濃度が0.05〜0.25pMである、前記(1)〜(5)いずれか1項に記載の方法;
(7)工程(c)で得られた蛍光強度をトロンビン濃度に変換する工程をさらに含む、前記(1)〜(6)いずれか1項に記載の方法;
(8)(d)抗凝固剤およびP2Y12受容体阻害剤が投与された哺乳動物から採取された血液からPRPを得る工程、(e)得られたPRPにADPおよびTFを添加する工程、(f)さらにカルシウム含有溶液および蛍光標識したトロンビン基質を添加する工程、および、(g)蛍光強度を測定する工程、を含む、トロンビン産生を測定する方法;
(9)工程(g)で得られた蛍光強度をトロンビン濃度に変換する工程をさらに含む、前記(viii)に記載の方法;
(10)(h)抗凝固剤およびP2Y12受容体阻害剤が投与された哺乳動物から採取された血液からPRPを得る工程、(i)得られたPRPにADPおよびTFを添加する工程、(j)さらにカルシウム含有溶液および蛍光標識したトロンビン基質を添加する工程、(k)蛍光強度を測定する工程、(l)抗凝固剤またはP2Y12受容体阻害剤が投与された、あるいは、いずれの薬剤も投与されていない哺乳動物から採取された血液からPRPを得る工程、(m)得られたPRPにADPおよびTFを添加する工程、(n)さらにカルシウム含有溶液および蛍光標識したトロンビン基質を添加する工程、(o)蛍光強度を測定する工程、(p)工程(k)で得られた値と工程(o)で得られた値を比較する工程、を含む、抗凝固剤およびP2Y12受容体阻害剤の併用効果を評価する方法;
(11)(q)抗凝固剤およびP2Y12受容体阻害剤が投与された哺乳動物から採取された血液からPRPを得る工程、(r)得られたPRPにADPおよびTFを添加する工程、(s)さらにカルシウム含有溶液および蛍光標識したトロンビン基質を添加する工程、(t)蛍光強度を測定する工程、(u)工程(t)で得られた蛍光強度をトロンビン濃度に換算する工程、(v)抗凝固剤またはP2Y12受容体阻害剤が投与された、あるいは、いずれの薬剤も投与されていない哺乳動物から採取された血液からPRPを得る工程、(w)得られたPRPにADPおよびTFを添加する工程、(x)さらにカルシウム含有溶液および蛍光標識したトロンビン基質を添加する工程、(y)蛍光強度を測定する工程、(z)工程(y)で得られた蛍光強度をトロンビン濃度に換算する工程、(aa)工程(u)で得られた値と工程(z)で得られた値を比較する工程、を含む、抗凝固剤およびP2Y12受容体阻害剤の併用効果を評価する方法;ならびに
(12)(q)抗凝固剤およびP2Y12受容体阻害剤を含有する多血小板血漿に、アデノシン二リン酸および組織因子を添加する工程、(r)蛍光標識したトロンビン基質、および、カルシウム含有溶液を添加する工程、および、(s)蛍光強度を測定する工程を含む、トロンビン産生を測定する方法;
を提供する。
(i)得られた多血小板血漿にアデノシン二リン酸および組織因子を添加する工程、
(j)さらにカルシウム含有溶液および蛍光標識したトロンビン基質を添加する工程、
(k)蛍光を測定する工程、
(l)抗凝固剤またはP2Y12受容体阻害剤が投与された、あるいは、いずれの薬剤も投与されていない哺乳動物から採取された血液から多血小板血漿を得る工程、
(m)得られた多血小板血漿にアデノシン二リン酸および組織因子を添加する工程、
(n)さらにカルシウム含有溶液および蛍光標識したトロンビン基質を添加する工程、
(o)蛍光強度を測定する工程、および
(p)(k)で得られた値と(o)で得られた値を比較する工程。
20mMのHEPESおよび140mMの塩化ナトリウムになるように両試薬を蒸留水に溶解し、1mol/Lの水酸化ナトリウム溶液を用いてpH7.4に調整した。得られた溶液を4℃で保存し、使用時にウシ血清アルブミン(BSA)(最終濃度0.5%)を添加した。
BSAを添加したHEPES緩衝液に10mMとなるように溶解し、-30℃で保存した。使用時に解凍し、BSAを添加したHEPES緩衝液(で必要な濃度に希釈して使用した。
PRP reagent(Thrombinoscope BV社製)1バイアルを1mLの蒸留水で溶解し(TF濃度6pM)、BSAを添加していないHEPES緩衝液で希釈して使用した。
エドキサバントシル酸水和物をジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解した後、DMSO濃度が1%となるように生理食塩水で希釈した。
クロピドグレルの活性代謝物(2-{1-[(1S)-1-(2-クロロフェニル)-2-メトキシ-2-オキソエチル]-4-スルファニル-3-ピペリジニリ-ジエン}酢酸、Thromb Haemost 2000; 84:891-6)をメタノールに溶解した後、メタノール濃度が5%となるように生理食塩水で希釈した。
チカグレロルをDMSOに溶解した。
クエン酸ナトリウム38mg/mLを含む溶液を2mL充填したシリンジを用いて健常ボランティアの橈骨静脈から18mLの血液を採取した。得られた血液を室温で150×g、10分間遠心し、上清液をPRPとして得た。PRPを分取した後の残渣を室温で2000×g、10分間遠心し、上清液を乏血小板血漿(Platelet poor plasma)(以下、「PPP」という場合がある)として得た。PRP中の血小板数が2×105platelets/μLとなるように、PRPをPPPで希釈した。得られたPRPは16℃で30分以上放置した後、トロンビン産生の測定に用いた。
96-wellプレートに1%DMSO含有生理食塩水を10μL添加後、上記で得られたヒトPRPを70μL添加した。さらに、ADP溶液(最終濃度5、10または20μM)を20μL、または、ADP溶液(最終濃度10μM)およびTF溶液(最終濃度0.05または0.25pM)を等容量で混合した溶液を20μL添加し、37℃でインキュベートした。
96-wellプレートに、エドキサバンおよびクロピドグレルのPRP中での濃度が表1に示す値になるように、エドキサバン溶液および/またはクロピドグレル溶液を各5μL、および、ヒトPRPを70μL添加した。さらに120μMのADP溶液(最終濃度10μM)と3pMのTF溶液(最終濃度0.25pM)を等容量で混合した溶液を20μL添加し、37℃でインキュベートした。
ヒトPRPに1/200容量のチカグレロル溶液を添加し、室温で15分間インキュベートした。96-wellプレートに、チカグレロルを含有するPRPを75μL添加した後、エドキサバン溶液5μLを添加した。120μMのADP(最終濃度10μM)と3pMのTF(最終濃度0.25pM)を等容量で混合した溶液をさらに20μL添加し、37℃でインキュベートした。
Claims (9)
- (a)多血小板血漿に、抗凝固剤、P2Y12受容体阻害剤、アデノシン二リン酸および組織因子を添加する工程、
(b)蛍光標識したトロンビン基質、および、カルシウム含有溶液を添加する工程、および
(c)蛍光強度を測定する工程
を含む、トロンビン産生を測定する方法。 - 抗凝固剤が第Xa因子阻害剤である、請求項1に記載の方法。
- 第Xa因子阻害剤がエドキサバンである、請求項2に記載の方法。
- P2Y12受容体阻害剤がクロピドグレルまたはチカグレロルである、請求項1〜3いずれか1項に記載の方法。
- 工程(a)におけるアデノシン二リン酸の最終濃度が5〜20μMである、請求項1〜4いずれか1項に記載の方法。
- 工程(a)における組織因子の最終濃度が0.05〜0.25pMである、請求項1〜5いずれか1項に記載の方法。
- (d)抗凝固剤およびP2Y12受容体阻害剤が投与された哺乳動物から採取された血液から多血小板血漿を得る工程、
(e)得られた多血小板血漿にアデノシン二リン酸および組織因子を添加する工程、
(f)さらにカルシウム含有溶液および蛍光標識したトロンビン基質を添加する工程、および
(g)蛍光強度を測定する工程、
を含む、トロンビン産生を測定する方法。 - (h)抗凝固剤およびP2Y12受容体阻害剤が投与された哺乳動物から採取された血液から多血小板血漿を得る工程、
(i)得られた多血小板血漿にアデノシン二リン酸および組織因子を添加する工程、
(j)さらにカルシウム含有溶液および蛍光標識したトロンビン基質を添加する工程、
(k)蛍光強度を測定する工程、
(l)抗凝固剤またはP2Y12受容体阻害剤が投与された、あるいは、いずれの薬剤も投与されていない哺乳動物から採取された血液から多血小板血漿を得る工程、
(m)得られた多血小板血漿にアデノシン二リン酸および組織因子を添加する工程、
(n)さらにカルシウム含有溶液および蛍光標識したトロンビン基質を添加する工程、および
(o)蛍光強度を測定する工程、
(p)工程(k)で得られた値と工程(o)で得られた値を比較する工程、
を含む、抗凝固剤およびP2Y12受容体阻害剤の併用効果を評価する方法。 - (q)抗凝固剤およびP2Y12受容体阻害剤を含有する多血小板血漿に、アデノシン二リン酸および組織因子を添加する工程、
(r)蛍光標識したトロンビン基質、および、カルシウム含有溶液を添加する工程、および
(s)蛍光強度を測定する工程
を含む、トロンビン産生を測定する方法。
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