BRPI0612967A2 - mÉtodo para a determinaÇço in vitro da atividade de trombina em uma amostra e kit - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA A DETERMINAÇçO IN WTRO DA ATIVIDADE DE TROMBINA EM UMA AMOSTRA E KIT A presente invenção refere-se a um método para a determinação ín vitro da atividade da trombina em uma amostra, em que a amostra é uma amostra sangúínea e a geração da trombina é medida pelas etapas de: colocar uma camada de dita amostra em contato com um substrato fluorogênico da trombina, em que dita camada possui uma espessura dentro de um intervalo de 0,05 a 5 mm e uma superfície dentro de um intervalo de 10 a 500 mm2; permitir a geração de trombina em dita amostra; medir a fluorescência emitida a partir da superfície da camada, pelo grupo fluorescente liberado a partir do substrato fluorogênico como um resultado da ação enzimática da trombina gerada em dito substrato fluorogênico.

Description

"MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE DETROMBINA EM UMA AMOSTRA E KIT"

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a um método de determinação, emespecial, da medida do tempo de curso da atividade da trombina in vitro, isto é,da medida da trombina ativa em uma amostra, em especial, conforme ela sedesenvolve em uma amostra de coagulação que consiste em sangue total. Oresultado da medida da atividade da trombina pode ser denominado "curva deatividade da trombina", ilustrada na Figura 1.

A presente invenção também se refere a meios que permitem amedida da trombina ativa seguindo esta geração em uma amostra in vitro. Elatambém é direcionada ao uso de dito método de medida para a detecção ou amonitoramento da condição de um paciente, incluindo para a detecção ou omonitoramento de uma condição patológica relacionada à deficiência nacoagulação sangüínea.

A presente invenção também se refere ao uso do método de medidapara a seleção de substâncias, incluindo a seleção de drogas que poderiaminteragir no processo de coagulação, em especial, com a atividade da trombina.

Antecedentes da Invenção

As doenças trombóticas, tais como o infarto coronário, derrame,embolismo pulmonar e diversos outros são responsáveis por cerca de metadede todas as mortes e deficiências na sociedade ocidental. Nos países emdesenvolvimento, elas aumentam com o grau de desenvolvimento. As doençashemorrágicas, embora numericamente menos importantes, também são umacausa significativa das mortes. Desta forma, a sobre- e a subfunção do sistemahomeostático é um mecanismo patogenético extremamente importante.

Portanto, ele é mais surpreendente do que um bom teste de função clínica enão está disponível.Papel da Trombina nas Doenças Homeostáticas ε Trombóticas

Na homeostase e na trombose, a trombina desempenha um papelessencial. Na doença trombótica venosa, isto têm sido reconhecido (1) há muitotempo e é, de maneira convincente, demonstrado pelo fato da prevenção e dotratamento da trombose venosa ser melhor ocasionada pela diminuição daatividade da trombose, pela inibição direta (hirudina, melagastran) ou pela menorsíntese (antagonistas da vitamina K) ou pelo decaimento aumentado (heparinas).

No último decênio, tornou-se muito claro que a trombina é tão importante nadoença arterial quanto na doença venosa. Os testes clínicos mostraram que osantagonistas da vitamina K (2) bem como da heparina (3) diminuem a taxa denova ocorrência do enfarto do miocárdio. Uma papel da trombina na hemorragiaé sugerido pelo tempo de hemorragia prolongado observado quando a geraçãode trombina é tão profundamente afetada quanto nas superdosagens graves deanticoagulantes orais (4) ou de heparina (5). Da mesma maneira, as hemofiliassão doenças do sistema formador de trombina (6).

Todos os Elementos do Sangue Participam na Formação da Trombina

Pesquisas modernas levaram ao reconhecimento de que atrombina é formada através da cooperação dos elementos formados do sanguee do plasma. As células sangüíneas vermelhas (RBCs) são as menos ativasneste aspecto, embora em uma pequena porcentagem delas, a membranaexterna exiba atividade procoagulante (7). Muito mais importante é que ascélulas sangüíneas brancas carregam o fator de atividade do tecido. Est aatividade é normalmente codificada, mas na lesão, ela se manifesta através deinterações com as plaquetas sangüíneas (8, 9). Os principais participantes sãoindubitavelmente as plaquetas e o sistema de coagulação plasmático. Noscompêndios, ainda é encontrado que as plaquetas são responsáveis pelahomeostase primária e a trombose arterial, enquanto que a coagulação doplasma serve para a consolidação da obstrução homeostática e é o mecanismoatrás da trombose venosa. Este enfoque é devido ao fato de que o plasma e asplaquetas foram estudados separadamente de cada um. Na realidade, acooperação entre as plaquetas e o plasma e as outras células do sangue éessencial em ambas a homeostase primária e secundária e na trombosearterial e venosa. A formação da obstrução das plaquetas desempenha umpapel na geração da trombina porque os interstícios em um agregado deplaquetas forma um nicho não agitado em que a trombina pode se formar semser arrastada pelo fluxo sangüíneo. Isto é o porquê a medida da geração detrombina no sangue total de coagulação está tão próximo à realidadefisiológica.

Aparte da formação de uma "esponja" em que a trombina pode seformar, as plaquetas também contribuem ativamente para a geração datrombina. Elas liberam o fator V e apresentam a superfície de fosfolipídio pró-coagulante requerida para a conversão de pró-trombina, vem como para asdiferentes etapas no mecanismo de coagulação que levam à formação deprotrombinase (10). A velocidade de geração da trombina e a quantidadeformada desta maneira, depende da atividade da plaqueta, bem como dasproteínas do plasma envolvidas. Particularmente interessante é o papel dafibrina de polimerização. O fator de Von Willebrand (vWf) interage com a fibrinade polimerização e sofre uma mudança conformacional que o torna reativopara o receptor de plaqueta GPIb e através deste ligante, coopera com aplaqueta, se tornando um pró-coagulante (11, 12). Isto mostra que a formaçãode um coágulo de fibrina não é o encerramento da homeostase e que aformação da trombina em uma obstrução (ou trombo, ou coágulo) é o eventochave no processo. De fato, como será visto abaixo, menos de 95% de toda atrombina formada é formada após a coagulação ter ocorrido e esta trombina éessencial na homeostase e no processo de trombose (H&T). Talvez, a melhorprova das fortes ligações entre as plaquetas e o sistema de coagulaçãoplasmático é o fato de que todos os "inibidores da agregação" e outros agentesanti-plaquetas também inibem a geração da trombina em plasma rico emplaqueta (ou sangue total). Isto foi mostrado para a aspirina (13), abciximab(14), MK383 (15) e o clopidogrel (16). Inversamente, o fato de que a excelênciado par de drogas anti-paquetas, aspirina, previne a trombose venosa (17) eilustra adicionalmente a conexão próxima entre a função da plaqueta e acoagulação sangüínea.

Desta maneira, em resumo, a quantidade de trombina formadaem um coágulo é uma característica essencial no processo de homeostase etrombose e todos os elementos do sangue fazem parte de sua formação.

Um maior TG indica invariavelmente o risco trombótico, se ele édevido à deficiência da antitrombina ou um excesso de protombina. Da mesmamaneira, as doenças na via da proteína C (deficiência de proteína S e C, fatorVi_eiden) da geração da trombina é maior do que o normal. Ist o controla acoagulação do plasma como tal, mas se torna especialmente óbvio se a via daproteína C for ativada pela trombomodulina (Figura 1). A tendência trombóticainduzida pelos contraceptivos orais pode ser atribuída a uma resistênciaadquirida à proteína C ativada que causa um aumento de 10% da geração detrombina que se tona mais óbvia quando é adicionado o TM ou o APC (18, 19).

Um caso particularmente interessante é o lúpus anticoagulante.

Este tipo de anticorpo induz um aumento do tempo de latência (Iag) daformação da trombina e, portanto, um aumento do tempo de coagulação, mastambém uma importante resistência à atividade do sistema da proteína C (20).

Isto explica o "paradoxo LE", isto é, um efeito anticoagulante que éacompanhado por uma tendência trombótica.

Foi descoberto que as quantidades em excesso dos fatores II, Vllle Vll se correlacionam com a ocorrência do infarto do miocárdio (21-24). Damesma maneira, os níveis maiores do que o normal de vWf que aumentam ageração de trombina (12) é um fator de risco para a trombose arterial (25, 26).

Em uma sub população de pacientes jovens com derrame (cercade 30%), ambos a geração de trombina na Plaqueta Rica em Plasma (PRP) e ovWf foram demonstrados como sendo significativamente maiores do que onormal (27). Em todas as deficiências do fator de coagulação congênitas, ageração de trombina é diminuída. Isto foi demonstrado para as hemofilias A, Be C (deficiência do fator VIII, IX ou XI; 28-31) bem como para todas asdeficiências raras (protrombina, fatores V, VII, Χ, XII; 32). Uma tendência àhemorragia é observada logo que o TG está abaixo de 20% do normal. Nahemofilia A, não apenas a infusão do fator Vlll ou a administração do DDAVPaumenta a capacidade do sangue de formar a trombina, mas também a terapiade superação do inibidor com produtos que contêm protrombina e/ou o fator Vllaumenta a geração de trombina.

A trombopenia severa (menor de 50.000 μΙ-1) causa umadiminuição da geração de trombina bem como as trombopatias Glanzman eBernard-Soulier. Na doença de von Willebrand, - até o momento conhecida porinduzir uma disfunção na adesão da plaqueta em altos níveis de cisalhamento- a geração da trombina no plasma rico em plaqueta é significativamenteprejudicado (vide acima). O defeito no PRP é muito maior do que na PlaquetaPobre em Plasma (PPP), o que indica que ele não pode ser explicado peladiminuição concomitante - geralmente suave - do fator VIII.

O Trombograma

As seguintes características devem ser levadas em consideraçãocom relação ao mecanismo da geração da trombina quando localizado oproblema a ser resolvido de acordo com a presente invenção.

Mesmo um esquema simplificado do mecanismo da formação datrombina (Figura 1) mostra que ela é extremamente complexa e repleta dereações de feedback positivo e negativo. Realmente, tão complexo de modo ase tornar um sistema não linear, isto é, não há relações simples entre aconcentração dos reagentes, e as conseqüências e o fenômeno do limiarpodem fazer com que o sistema reaja essencialmente de forma não prevista. Areação do todo para uma dada ativação pode, portanto, não ser deduzida apartir dos conhecimentos das concentrações individuais dos reagentesrelevantes (que podem até não ser conhecidos) e apenas um teste que mede afunção do sistema completo conforme contido no sangue de um pacienterevela o estado homeostático/ trombótico daquele paciente.

O resultado de todo o processo da geração de trombina é oaparecimento e o desaparecimento de uma atividade de trombina transiente. Acurva de atividade da trombina contra o tempo ou Thrombogram™ (TG) écaracterizada ρ or uma fase de iniciação, ou fase lag, durante a qual apenasminúsculas quantidades de trombina são formadas; segue então um surto deatividade, conhecido fase de propagação (Figura 1). O sangue forma um coágulo noprimeiro instante do surto e quase toda a trombina é formada após o coágulo tersido formado. Toda a trombina formada é subseqüentemente inativada pela anti-trombose do sangue. Estas proteínas se ligam estequiometricamente à trombina emuma reação lenta. A velocidade de inativação é proporcional à concentração datrombina e da antitrombina. Contanto que a taxa de conversão da protrombina sejamaior do que a taxa de inativação da trombina, o nível de trombina aumenta.

Conforme o nível de trombina aumenta, a taxa de inativação também aumenta. Nopico, ambas as velocidades são iguais, a partir de então predomina o decaimento. Acurva obtida da atividade de trombina mostra as diversas fases e, em especial,mostra o pico da geração de trombina, o tempo para atingir o pico e o potencial detrombina endógena (ETP).

Estado da Técnica

A necessidade de medida da função da homeostase e do sistemade trombose não escapou à atenção da profissão médica ao longo dõ últimoséculo. As soluções para este problema não mudou essencialmente até adécada de 1990, oferecendo meios que eram práticos mas inadequados ouadequados mas não práticos.

As soluções práticas se referem à medida do tempo de coagulaçãoe o tempo de hemorragia. O tempo de hemorragia mede o comprimento da fasede iniciação da geração de trombina e, portanto, reflete apenas parte da função(33, vide também acima). O único fato que muitas variedades do teste estão emuso no laboratório clínico, cada um útil apenas em uma situação específica,apenas mostra que um tempo de coagulação não reflete o mecanismo decoagulação como um todo. Para o tempo de hemorragia, pode ser dito que ele éextremamente impreciso, possuindo um coeficiente de variação de cerca de40%, que limita fortemente seu uso prático (34).

Desde a década de 1950, foi reconhecido que a medida do tempode curso da trombina no sangue de coagulação é a melhor para estimar afunção H&T (35-37). Até 1992, o único modo de medir o TG foi ao tirar asamostras do sangue de coagulação ou do plasma e determinar o teor detrombina no mesmo. Isto leva uma hora homem por curva e, portanto, pode serapropriado para os propósitos de pesquisa, mas não para o uso epidemiológicoou clínico moderno.

Em 1990, Hemker e Béguin et al. (EP-B1 0.420.332) lançaram aidéia de adicionar ao sangue de coagulação um substrato cromogênico(produção de cor) que possui alta especificidade pela trombina, mas uma baixataxa de movimentação (Kcat baixo) e pouca afinidade de ligação pela trombina(alto Km). Tal substrato permanece presente durante todo o processo de TG ea soma (isto é, o número inteiro) da atividade de trombina sobre o tempo podeser medida a partir da quantidade total de produto formado. Idealmente, istomede o Potencial de Trombina Endógena (ETP), isto é, a Área Sob a geraçãode trombina (AUC).Posteriormente, Hemker et al., desenvolveu ainda este métodopara obter o todo da curva de TG (38). Isto foi baseado na princípio de que, seas constantes cinéticas dos substratos forem favoráveis, a velocidade da reaçãopode, em uma boa aproximação, permanecer proporcional à concentração detrombina durante o todo do processo de coagulação, tal que o primeiro derivadoda concentração do produto fornece um curva que é proporcional à atividade datrombina. Este método, descrito no documento WO 03/093831A1, era umaextensão e elaboração do procedimento descrito previamente no documento EP-B2 0.420.332, onde apenas o nível final do produto é medido, de cuja maneira aárea sob a curva do TG, isto é, o ETP é obtido.

O substrato utilizado neste método gera um produto amarelo, amonitoração do qual requer a medida da densidade óptica e, portanto, um meiode reação opticamente transparente. A turbidez causada pela coagulação dofibrinogênio deve, portanto, ser evitada e o fibrinogênio deve ser removido ousua polimerização deve ser evitada pela adição de inibidores da polimerização.Entretanto, a remoção do fibrinogênio possui a desvantagem de remover umimportante reagente e não pode ser realizado sem a remoção dos elementoscelulares, tal como as importantes plaquetas sangüíneas. Além disso, a adiçãodos inibidores da polimerização, nas altas concentrações requeridas paraprevenir completamente a formação de fibrina, inibe a enzima de conversão deprotrombina e as reações bioquímicas que levam a sua formação.

Em contraste com a densidade óptica, a fluorescência pode sermedida em meios túrbidos. Ao contrário dos substratos cromogênicos, ossubstratos que geram um produto fluorescente (substratos fluorogênicos)podem, portanto, ser utilizados no plasma que não é defibrinado e, portanto,também em Plasma Rico em Plaqueta (PRP) (33, 39-43). O uso de umsubstrato fluorogênico introduz duas importantes desvantagens, entretanto: (1)a intensidade de fluorescência não é proporcional à concentração do fluoróforopor causa do denominado efeito do filtro interno; (2) com os substratosdisponíveis, a taxa de formação do produto não é necessariamenteproporcional à concentração de enzima. A última desvantagem pode sersuperada ao utilizar os substratos que não são significativamente consumidos,como no método cromogênico. Tais substratos não estão disponíveis nomomento. Na prática atual deste momento, ambos os problemas sãosolucionados juntos pela comparação contínua do sinal experimental a aquelede uma atividade do tipo trombina constante agindo sob condições exatamenteidênticas que aquelas na amostra medida (documento WO 03/093831 A1).

O método cromogênico obviamente não pode ser utilizado com osangue total porque o sangue não é transparente. Foi relatado que ossubstratos fluorogênicos são aplicáveis para medir TG no sangue total (44). Naprática atual, este método publicado, gera sinais instáveis mais freqüentes quenunca e não se assemelha ao curso da geração de trombina como ele éconhecido a partir do método de subamostragem estabelecido (Figura 2). Domesmo modo, a relação quantitativa entre o sinal obtido e a quantidade detrombina presente varia de experimento para experimento. Em resumo, ométodo descrito não gera resultados reprodutíveis e quantificáveis.

Outra possibilidade é a forte diluição do sangue (10 vezes oumais), tal que as células sangüíneas vermelhas RBC possuem menosinfluência (45). Isto gera curvas que são, de fato, melhores do que aquelas quesão obtidas do sangue minimamente diluído. Esta abordagem não pode,entretanto, ser considerada como representante da situação fisiológica porduas razões. E m primeiro lugar, após a formação de um coágulo (isto é,durante a fase mais importante da geração da trombina), as reações deformação de trombina são de difusão limitada porque elas ocorrem eminterfaces insolúveis (superfície de plaquetas e outras células imobilizadas narede de fibrina). Isto as torna mais sensíveis à diluição do que as reações emsolução livre, tal como as reações de inativação de trombina. No sanguediluído, o equilíbrio entre a formação de trombina e as reações de inativação detrombina, portanto, não é representativo para a situação existente in vivo. Isto éainda mais importante no caso em que os inibidores patológicos estão contidosno sangue (por exemplo, na hemofilia de terapia refrativa ou no inibidor delúpus eritematosos). É bem conhecido na prática clínica que os inibidores dacoagulação perdem ser efeito na diluição in vitro.

Portanto, o problema permanece em como obter um sinal a partir doqual a concentração de proteína mutável pode ser determinada em uma amostrade sangue de coagulação que é menos do que dez vezes diluído. A presenteinvenção pretende fornecer uma solução para este problema que supera pelomenos algumas das desvantagens encaradas no estado da técnica anterior.

Descrição da Invenção

Foi revelado pelos inventores que os resultados irreprodutíveis eerráticos obtidos antes da presente invenção foram pelo menos devido a duascausas; (a) sedimentação antes dos coágulos de sangue e (b) retração docoágulo após a coagulação ter ocorrido (vide Figura 4). Segue depois disto queo volume do qual a fluorescência é obtida muda durante a reação e que aforma geométrica da superfície muda, causando a concentração errática e areflexão da luz que perturba o sinal recuperado. Inesperadamente, foidescoberto pelos Depositantes que estes fenômenos não ocorrem quando setrabalha com uma camada fina de sangue e, em especial com uma camadafina que possui uma rede e/ou microgrânulos. A forma geométrica de umacamada fina, junta ou não com dita rede e/ou grânulos, previne de fato asedimentação e a retração. Entretanto, o volume da reação permanecedesconhecido, portanto ele deve ser determinado durante a medida. Isto é feitopela adição, no início da experiência, de uma concentração conhecida de umamolécula fluorescente. O sinal é pequeno e, portanto, a razão do sinal para oruído é vantajosamente aumentada pela medida sobre uma ampla área desuperfície com qualquer dispositivo apropriado conhecido no estado da técnica.

Além disso, uma grande razão do volume para a superfície tende àevaporação, e vantajosamente devem ser tomadas medidas apropriadas paraprevenir a mesma.

De acordo com a presente invenção, um método é descrito que éum método para a determinação in vitro do curso de atividade da trombina pelotempo em uma amostra, em que a amostra é uma amostra de sangue e ageração da trombina é medida pelas etapas de:

- colocar uma camada de dita amostra em contato com umsubstrato fluorogênico da trombina em que dita camada possui uma espessuradentro de um intervalo de 0,05 a 5 mm e uma superfície dentro de um intervalode 10 a 500 mm2;

- permitir a geração de trombina em dita amostra;

- medir a fluorescência emitida a partir da superfície da camada,pelo grupo fluorescente liberado a partir do substrato fluorogênico como umresultado da ação enzimática da trombina gerada em dito substratofluorogênico.

O método de determinação da atividade de trombina permite amedida do tempo de curso da concentração de trombina conforme ela resultade sua formação e subseqüente inativação, de acordo com o esquema decoagulação.

O método da presente invenção pode ser realizado em amostrasangüínea, tal como amostras de sangue total ou amostras de Plasma Rico emPlaqueta (PRP).

A trombina é deixada para ser gerada na amostra geralmenteapós o contato de dita amostra com componentes apropriados para o inicio degeração de trombina. Tais componentes podem compreender fatores decoagulação, tais como o fator do tecido e, possivelmente, íons cálcio.

Enquanto a trombina é gerada e está presente na mistura dareação (trombina ativa), ela reage com seu substrato fluorogênico, resultandona liberação do grupo fluorescente do substrato.

A reação é planejada de tal modo que o substrato fluorogênicoestá presente durante toda a duração da reação, em quantidades altas osuficiente para permitir a medida da atividade de trombina. Por exemplo, aconcentração do substrato é de cerca de ou acima do Km do substrato paratrombina, tal que o consumo do substrato não possui muita influencia navelocidade da reação. O substrato é convertido pela trombina, levando a umaumento da fluorescência emitida a partir da superfície da amostra analisada.

O método definido na presente invenção permite que a geraçãoda trombina ocorra em uma amostra de sangue, em especial, em uma amostrade sangue total, de tal modo que é essencialmente comparável à geração detrombina que ocorre no corpo. Portanto, ela fornece um método confiável demedida para aplicação nos estudos de homeostase e trombóticos.

A etapa de medida do aumento da fluorescência emitida a partirda superfície da camada da amostra analisada, como resultado da liberação dogrupo fluorescente a partir do substrato através da ação da trombina, érealizada especialmente utilizando um dispositivo ótico que permite tanto ailuminação de amplas superfícies, tais como as superfícies que possuem de 10a 500 mm2 e que permitem coletar a luz emitida a partir da superfície. Ocomprimento de onda selecionada para a medida da fluorescência édeterminado pelo grupo fluorescente selecionado. Um comprimento de onda édeterminado para a excitação da luz que é fornecida à amostra para procedercom a medida. Outro comprimento de luz é determinado para a luz emitidaresultando na liberação do grupo fluorescente do substrato fluorogênico datrombina. Um dispositivo óptico, tal como um leitor de prato fluorescenteconhecido pelos técnicos no assunto (por exemplo, o leitor de pratofluorescente Ascent, Thermolabsystems) é apropriado para a medida dafluorescência.

De acordo com uma realização da presente invenção, a amostraa ser analisada, em especial a amostra de sangue total, é preenchida em umou mais recipientes permitindo vantajosamente a realização da análise dediversas amostras ao mesmo tempo. Tais recipientes são projetados parapermitir que a amostra preencha, de acordo com as condições definidas deespessura e superfície da camada de amostra a ser analisada. Por exemplo,micropratos de fundo chato contendo cavidades ou um recipiente ou suporteque possui outra forma geométrica apropriada, conhecida pelo técnico noassunto de tal análise podem ser utilizados.

Outros dispositivos podem ser utilizados como suporte para asamostras se eles preencherem os requisitos de permitir que ditas amostrassejam fornecidas para a análise como uma camada de acordo com asdefinições da presente invenção. Portanto, a descrição do método e dos meiospara realizar a presente invenção, que é feita com referência às cavidades (dosmicropratos) contendo as amostras pode ser aplicada a outros dispositivos(recipiente ou suporte) contendo as amostras.

De acordo com o método da presente invenção, a concentraçãode trombina durante a análise é uma função da medida da fluorescência dogrupo fluorescente liberado do substrato de trombina fluorogênico. Ele éespecialmente proporcional a taxa de aumento do aparecimento dafluorescência.

Consequentemente, o método da presente invenção permite amedida da concentração de trombina durante todo o tempo da atividade datrombina da amostra, contanto que o substrato fluorogênico esteja presente emquantidades apropriadas.Portanto, o curso da atividade de trombina, antes e após a coagulaçãode sangue, até o pico da trombina e também durante a diminuição da concentraçãode trombina após o pico de trombina que foi obtida como um resultado da inativaçãoda trombina, é representada pela medida da curva de concentração de trombinadependente do tempo. Durante diversas etapas da atividade da trombina, o substratofluorogênico reage com a trombina que está presente e é especialmente hidrolisado,resultando na liberação do grupo fluorescente.

Uma vantagem particular da presente invenção é que o métodopermite a medida da geração de trombina em uma amostra, em especial em umaamostra de sangue total que não é diluído ou que é minimamente diluído, dentro deum intervalo de no máximo 10 vezes, em especial, menor ou igual que 4 vezes.

Em uma realização particular do método descrito, a espessura dacamada da amostra a ser analisada, em especial do sangue total é de 1 a 3mm, de preferência, de cerca de 2 mm ou menos.

Em uma realização particular do método, a superfície da amostra,especialmente da amostra de sangue total, quando é preenchida nascavidades dos micropratos ou qualquer recipiente ou suporte apropriado émaior que 20 mm2, por exemplo, de 30 mm2 a 200 mm2, de preferência, maiordo que 100 mm2, em particular dentro de um intervalo de 150 a 200 mm2.

Como um exemplo a amostra é preenchida em cavidades demicropratos, cada cavidade possuindo um diâmetro de 15 mm e a espessurada amostra de sangue é inferior a 2 mm, permitindo a medida em umasuperfície de cerca de 175 mm2.

A medida da atividade de trombina é realizada de uma maneira quepermita múltiplos pontos de leitura da fluorescência na superfície de cada amostra.

De acordo com uma realização da presente invenção, o método érealizado com uma amostra, em especial uma amostra de sangue total que épreenchida nas cavidades de um prato ou outro recipiente ou suporte, em queditas cavidades também contêm uma rede, especialmente com um tamanho demalha de 50 μm.

Alternativamente ou em adição a tal rede em uma realização dapresente invenção, a amostra, em especial a amostra de sangue total, épreenchida dentro de uma cavidade ou um prato ou outro recipiente ou suporteque contém microgrânulos.

A presença de dita rede e/ou microgrânulos é vantajosa paraauxiliar na dispersão do sangue na cavidade e, especialmente, para prevenir aretração do coagulo no sangue de coagulação. Em outras palavras, a presençada rede ou dos microgrânulos pode prevenir os distúrbios da superfície dosangue de coagulação que perturbam o sinal que é medido durante a atividadeda trombina. Tal rede e/ou microgrânulos pode melhorar a atenuação dosefeitos da retração que são obtidos utilizando uma ampla superfície para amedida. Outros meios que permitem tal efeito também podem ser utilizados.

Em uma realização particular da presente invenção, as cavidadescontendo a amostra, em especial as amostras de sangue total são cobertaspara evitar a secagem do sangue durante o tempo de medida da atividade datrombina, como um resultado da evaporação. Tal cobertura pode ser realizadacom materiais usuais, tais como tipos de filme plástico fino, contanto que elesnão interfiram na medida da fluorescência.

A medida da atividade de trombina na amostra sangüínea érealizada a partir do tempo onde a amostra é preenchida dentro de cavidades(ou qualquer outro dispositivo apropriado tal como uma fenda) e oscomponentes requeridos para iniciar a geração de trombina são fornecidos adita amostra, incluindo o fator do tecido, até o tempo onde a trombina foiconsumida no processo de coagulação.

Em uma realização particular do método da presente invenção, aquantidade de substrato fluorogênico de trombina adicionado à amostra estádentro de um intervalo de 50 a 1.000 μΜ. De acordo com o método descrito, afim de ser capaz de conhecer a concentração de trombina ativa em termosabsolutos (isto é, em nM/L), é necessário conhecer o volume da amostra desangue dentro da qual a medida da fluorescência é realizada. Para estafinalidade, uma concentração conhecida de um fluoróforo pode ser adicionadaao substrato fluorogênico da trombina, em que as proporções respectivas dosubstrato de trombina para o fluoróforo estão no intervalo de 1% a 10% daquantidade de molécula fluorescente ligada ao substrato de trombina, emespecial, no intervalo de 1% a 5%.

Em uma realização particular da presente invenção, o fluoróforo éda mesma natureza que a molécula fluorescente que é liberada pela ação datrombina sob o substrato fluorogênico.

Em outra realização, este fluoróforo é uma espécie diferente doque a molécula fluorescente do substrato fluorogênico. Neste caso, a medidada fluorescência leva em consideração a presença desta nova espécie defluoróforo; isto inclui especialmente a medida da fluorescência do fluoróforo.

A adição de uma concentração conhecida de tal fluoróforofornece um padrão interno na amostra a ser analisada e permite a avaliação dovolume de amostra em que a fluorescência é realmente medida.

A fim de realizar o método de determinação da geração datrombina em uma amostra, em especial em uma amostra de sangue total, umsubstrato sintético para a trombina que consiste em um acoplamento químicoorgânico com a molécula fluorescente é vantajosamente utilizado.

O substrato fluorogênico sintético pode ser um oligopeptídeo quepossui a seqüência de 2 a 30 resíduos de aminoácidos acoplados com umamolécula fluorescente.

Pode ser especialmente útil que o grupo fluorogênico estejaligado ao um terminal de resíduo de Iisina ou arginina no substrato por causadas divisões da trombina, de preferência, grupos ligados a estes resíduos deaminoácidos.

De acordo com uma realização particular, a molécula fluorescenteutilizada é a AMC (7-amino-4 metilcumarina) ou o p-nitroanilida. Os substratossintéticos foram descritos por Rijkers, D. T., H. C. Hemker, et al., (1996), Int JPept Protein Res 48 (2): 182-93; Rijkers, D. T., S. J. Wielders, et al., (1995),Thromb Res 79 (5-6): 491-9; Wielders, S. M. Mukherjee, et al., (1997), ThrombHaemost 77(4): 629-36.

Um substrato de trombina fluorogênica sintética particularapropriada para realizar a presente invenção é a Z-GIy-GIy-Arg-AMC(disponível pela BACHEM).

Em uma realização particular da presente invenção, as cavidades(ou qualquer outro dispositivo apropriado) contendo a amostra pode aindacompreender um gel, possivelmente um gel contendo íons cálcio, dito gelsendo preparado tal que ele não permite a diluição do sangue total da amostra.O gel, tal como o Sefadex ou os géis de agarose podem ser utilizados namedida em que eles não são secos, de tal modo que eles permitiriam que olíquido do plasma penetre no gel.

Quando um gel é utilizado, ele pode ser preenchido nascavidades antes ou junto com a amostra de sangue total.

Os compostos que podem ser adicionados à amostra, a fim depermitir a geração da trombina, compreendem o fator do tecido e os íonscálcio, cujos compostos são adicionados em quantidades que permitem que acoagulação inicie.

Tais quantidades podem estar dentro do intervalo de 0,05picomol/L a 15 nanomol/L para o fator do tecido, e cerca de 10 mM de íonsCa++ quando é utilizado sangue citrado. A presente invenção também cobreexplicitamente o caso em que o sangue nativo, não anticoagulado é utilizado,em cujo caso não precisa ser adicionado nenhum Ca++. Alternativamente, emcertas aplicações é mais vantajoso economicamente, não adicionar o fator dotecido a fim de investigar a capacidade de coagulação espontânea do sangue.

O fator do tecido, quando necessário, é adicionado pouco antes de iniciar amedida.

Os íons cálcio e/ou o substrato fluorogênico pode ser adicionadotanto diretamente com a amostra de sangue, em especial quando o substratode fluorogênico e o cálcio são utilizados em uma solução. O fator do tecidotambém pode ser adicionado alternativamente à amostra de sangue.

Quando a amostra e os diversos compostos são preenchidos nascavidades, a medida é imediatamente realizada.

Em uma realização particular do método da presente invenção, osangue total que é analisado é o sangue citrado.

O método de medida da atividade de trombina na amostra desangue total pode ser vantajosamente utilizado para a detecção oumonitoramento de uma doença homeostática ou uma doença trombótica oupara a detecção ou monitoramento da possibilidade que tal doença aparentaem um paciente.

O método também permite a detecção ou o monitoramento dainteração de determinada(s) substância(s) na atividade de trombina em umaamostra de sangue total, em que dita(s) substância(s) determinada(s) é(são)adicionadas à amostra a ser analisada ou é (são) adicionadas durante ageração da trombina.

As substâncias a serem testadas, de acordo com o método são,por exemplo, substâncias farmacêuticas ou outros compostos que possuem umefeito de coagulação no sangue, tal como os fatores de coagulação ou drogasou fatores anticoagulantes ou drogas. Os inibidores de trombina podem, emespecial, ser testados de acordo com o método da presente invenção.Em outro aspecto, o método da presente invenção pode serutilizado para selecionar substâncias a fim de determinar sua capacidade deinteração com a atividade da trombina.

De acordo com a presente invenção, o método que foi descritoacima e que será ilustrado nos exemplos, pode ser utilizado especialmentepara a medida do Potencial de Trombina Endógena (ETP) da amostra desangue total.

Ele também pode ser utilizado para a medida do tempo do picopara a trombina ou para a medida do tempo de coagulação.

Ele também é útil para a medida do nível do pico de trombinagerada durante o teste.

O método da presente invenção permite, de fato, a medida dadenominada curva da trombina que é o primeiro derivado da medida dafluorescência que resulta da reação entre a trombina e o substratofluorogênico.

Em um método particular da presente invenção, uma etapa decalibração é realizada tal como a calibração descrita no documento WO03/093831.

O método da presente invenção foi descrito em relação à amostrabiológica que é a amostra de sangue total. Isso também poderia ser utilizadopara avaliar uma amostra que seria o Plasma Rico em Plaqueta (PRP) oumesmo o Plasma Pobre em Plaqueta (PPP).

A presente invenção também se refere a um kit para a realizaçãodo método descrito acima e nos exemplos que seguem, em que dito kicompreende:

- um substrato fluorogênico para a trombina,

- o fator do tecido e os íons cálcio para permitir a geração datrombina,- opcionalmente, uma rede ou microgrânulos que previnem aretração do coágulo sangüíneo e auxiliam na dispersão do sangue total,

- opcionalmente um gel, possivelmente compreendendo íonscálcio.

Opcionalmente, o kit também compreende as instruções para ouso a fim de fornecer as diretrizes especificas para realizar o método dapresente invenção. Outras características da presente invenção e suasvantagens serão descritas nos exemplos e nas figuras que seguem.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1: Um Trombograma obtido a partir de um experimento desubamostragem. As características principais são: tempo Iag (= tempo decoagulação), altura do pico e área sob a curva (= Potencial de TrombinaEndógena, ETP).

Figura 2: Uma amostra das curvas de geração da trombina obtidano plasma pobre em plaquetas pela trombinografia automatizada calibrada.

AVK: tratamento de anti-vitamina Κ; TM: Trombomodulina.Figura 3: Um esquema simplificado da formação da trombina: sãoapresentados feedbacks positivo e negativo.

Figura 4: representação esquemática dos efeitos dasedimentação e da retração do coágulo no sinal fluorescente a partir do sanguetotal de coágulo.

Legenda: larvas ovais: células sangüíneas vermelhasCírculos estrelados: moléculas fluorescentes que são excitadasQuadrados: moléculas fluorescentes que não são excitadas

Linha horizontal superior (c. q. curvado): fluido da superfície

Linha horizontal inferior: fundo transparente da cavidade demedida

Estágio A: fluido sangüíneo logo após o preenchimento dacavidade (Figura 1, t = 0)

Estágio B: fluido sangüíneo pouco antes da coagulação (Figura 1, t=B)

Estágio C: sangue logo após a coagulação (Figura 1, t = C)

Estágio D: sangue após o início da retração (Figura 1, t = D)

Figura 5: ocular de Huygens e condensador

Figura 6: camada fina (3 mm) de sangue em cavidades de pratode microtitulação normal. Sete experimentos idênticos.

Figura 7: camada fina de sangue em uma ampla superfície decavidades de prato de microtitulação.

32 pontos de leitura por cavidade de experimentos idênticos.

Figura 8: camada fina de sangue em uma ampla superfície decavidades de prato de microtitulação com malha e cobertura. Um ponto deleitura através do dispositivo de coleta da luz (ocular de Huygens) (1) curvaexperimental, (2) após a correção para a a2M-trombina.

Figura 9: unidades arbitrárias para a trombina.

Figura 10A: Projeto do cartucho da amostra que mostra umpossível formato de um cartucho de medida de dois compartimentos. Umapeça fina (de preferência, rígida, por exemplo, vidro) de material (referido como"lâmina") possivelmente revestido com um revestimento com um revestimentobiocompatível, é dividida em compartimentos com um espaçador apropriado.Este espaçador também pode agir como um eletrodo para detectar a injeção daamostra por resistência da gota e/ou aumento da corrente elétrica. Cadacompartimento pode ser revestido com substâncias do tipo calibrador e/ousubstrato (ou qualquer outra substância necessária como os inibidores e o fatordo tecido). Uma segunda lâmina é ligada em cima de outra lâmina. O espaçoentre as duas lâminas é de 5 a 1.000 μιτι, de preferência, de 50 μιη.

O cartucho pode ser revestido em um ou mais lâminas por umrevestimento espelho dicróico apropriado permitindo a amplificação óptica. Istopermite que a luz excitada entre no cartucho, enquanto a emissão da luz érefletida dentro do cartucho (vide Figura 10B) e será concentrada a uma lâminanão revestida do cartucho.

Legenda da figura 10A:

1 - Lâmina de revestimento revestida com camada biocompatível;

2 - Lâmina de revestimento grande é dividida em doiscompartimentos com fitas de dupla face;

3 - Dois compartimentos são revestidos com cálcio e/ou substratoe secos em baixo do nitrogênio;

4 - Espaçadores de metal são colocados na fita de dupla face.Esses espaçadores também atuam como eletrodo;

5 - Lâmina de revestimento pequena é viscosa no topo da fita dedupla face e eletrodos.

Figura 11:0 projeto do cartucho alternativo mostra uma peça dematriz sólida, por exemplo, um polímero poroso ou celulose, que é colocadaentre duas lâminas. Essa matriz pode conter substrato e/ou cálcio (ou qualqueroutra substância do tipo fator do tecido, inibidores). Estas substâncias podemestar presentes junto com um solvente, na forma seca ou liofilizada.

Figura 12: mostra a curva TG medida em uma camada fina desangue em uma célula de papel filtro, convertida a trombina nM por umcalibrador Staphylocoagulase.

Exemplos

(I) Medida do TG no Sangue Total: O Fenômeno Observado ε asDificuldades Técnicas para a Medida do TG

Quando um substrato fluorogênico é utilizado, a fluorescênciapode ser provocada e medida até o momento, apenas enquanto a luz não forinterceptada por células sangüíneas vermelhas, isto é, no espaço do plasmaacessível à luz de excitação, que também é o espaço do qual a luz emitidapode ser observada. Para a finalidade da simplificação, assume-se que ascélulas sangüíneas vermelhas são completamente impenetráveis a ambos ostipos de luz. Se, entretanto, até certo ponto o RBC for penetrável, fundamentonão precisa ser substancialmente alterado.

O sangue total forma um coagulo no final da fase de iniciação, isto é,no início do volume explosivo da geração de trombina. Na Figura 4, quatro estágiossão ilustrados da situação da superfície superior e inferior do sangue, coagulandoem uma cavidade de um prato do fluorímetro na presença de um substratofluorogênico e iluminado a partir do topo ou alternativamente do fundo.

No estágio A, o sangue agitado foi apenas colocado paradescansar e as células sangüíneas vermelhas são homogeneamente dispersasno plasma fluído (Figura 4A). No curso do tempo lag, antes de ocorrer asedimentação da coagulação (tipicamente de 3 a 12 minutos) das célulassangüíneas vermelhas; em cima mais plasma se torna acessível à luz e menosno fundo (Figura 4B). Assim que sangue coagula (Figura 4C), o status quoaumentado em B é "congelado" pela aparência do coagulo de fibrina. Porcausa da ação da trombina nas plaquetas sangüíneas, a retração do coagulose sedimenta assim que um coágulo é formado. A sedimentação e a retraçãodo coágulo são fenômenos que são visíveis a olho nu em uma escala mm porhora. No domínio do micrômero, eles ocorrem em questão de minutos, isto é,na escala de tempo dos experimentos TG. A retração ocasiona umadistribuição desigual dos RBCs e também uma mudança na superfície, tal queele deixa de ser plano, mas se torna ondulado. A ondulação ocasiona umapartição desigual do plasma e do coágulo na superfície e causa efeitos ópticosnão previsíveis. As irregularidades da superfície estão em uma escala de mm evisíveis a olho nu. Portanto, eles estão na mesma ordem de magnitude que oponto de luz de excitação na fluorometria normal.A sedimentação e a retração induzem uma mudança no volumedo fluído em que as moléculas fluorescentes podem ser atingidas pela luz deexcitação. Devido a esta mudança, o volume real em que a medida ocorre évariável e desconhecido. Portanto, a quantificação reprodutível da quantidadede trombina a partir da taxa de produção do sinal obtida nestas condições éimpossível, mesmo se os efeitos da sedimentação e da retração fossemdesprezíveis.

Os experimentos realizados pela utilização de cavidades de pratode microtitulação comum e um volume que preenche essas cavidades a umaaltura normal (6mm) permitiu resultados satisfatórios a ser obtidos apenas emuma pequena porcentagem de todas as cavidades. Isto é explicado pelo fatode que na fluorometria comum, um sinal suficiente obtido apenas se o ponto dasuperfície medida (cerca de 4mm2) coincidir com a área onde pode ser obtidosinal suficiente, pois está disponível plasma suficiente; isto é não acima de umcoágulo-massa retraído, mas em um "vale" da superfície (vide Figura 4D). Osrelatórios positivos na literatura da medida devem resultar de uma seleçãocuidadosa dos dados obtidos. Nestes casos onde um sinal da forma correta éobtido, a medida quantitativa de trombina é impossível por causa do volume demedida que é desconhecido e variável. A medida a partir do fundo através deuma folha resolveria o problema das irregularidades da superfície, mas devidoa sedimentação de RBC, o sinal se torna tão pequeno que ele some no ruídode fundo.

Foi observado que, com o preenchimento normal das cavidadesde um prato de 96 cavidades de um tipo disponível na data, é possível obterum sinal interpretável em 1 ou 2 de 10 cavidades. Se as cavidades forempreenchidas a menos de 2 mm de altura como a altura normalmente útil, o sinalé obtido próximo em todas as medidas. Apesar disso, o sinal que é obtidodesta maneira em um fluorímetro normal é bastante variável e pequeno, isto é,corresponde de 1 a 5% do sinal obtido com plasma e mostra uma ampla razãosinal para ruído (Figura 6). Foi concluído que não há maneira prática dedeterminar o TG no sangue total utilizando as configurações ópticas de umfluorímetro normal.

II O Projeto do Método da Presente Invenção

(1) Princípio da Invenção

Inesperadamente, foi descoberto que (a) os efeitos dasedimentação e da retração diminuem progressivamente com a espessura dacamada do sangue de coagulação e, (b) a medida da fluorescência a partir deuma superfície mais ampla do que cerca de 10 mm2, tende a igualar asirregularidades remanescentes da superfície ocasionada pela retração.Igualmente de maneira inesperada, os efeitos da sedimentação e da retraçãopodem ainda ser reduzidos ao conter o sangue em labirintos ou interstício, talcomo uma rede de filtro (possuindo uma abertura de malha de 50 a 500 μιτι) ouesferas embaladas (de diâmetro de 50 a 500 Mm). Consequentemente, osdepositantes fornecem condições para obtenção de um sinal fluorescente nãoperturbado a partir do produto de atividade de trombina ao permitir que amedida seja realizada em uma camada fina de sangue (especialmente inferiora 2 mm) espalhada sobre uma superfície mais ampla do que cerca de 10 mm2.

Para resolver o problema do volume desconhecido em que areação é medida, os depositantes decidiram ainda não utilizar o substrato puro,mas ao invés, o substrato que já continha uma concentração de produtofluorescente fixa baixa, mas conhecida e prontamente mensurável.

(2) Dispositivo Óptico para Medida

A medida sobre uma superfície mais ampla do que o normalrequer dispositivos ópticos que permitam iluminar as superfícies amplas ecoletar a luz emitida daquela superfície. Um dispositivo tal não é diferente deum ocular de Huygens, outro tipo um condensador microscópico (Figura 5).Para aumentar o sinal fluorescente, o sangue pode ser espalhável em umasuperfície refletora, e tal superfície pode ser uma parte integral do dispositivodescrito abaixo.

(3) Dispositivo Contendo Amostra de Sangue

O uso de um dispositivo que contém sangue nos interstícios desua estrutura permite a simulação da situação do derramamento de sangue emuma ferida, ele pode ser feito para conter o fator do tecido, trombomodulina eoutros elementos conhecidos existentes na parede dos vasos normais queafetam o processo de TG (por exemplo, colágeno). Para fins de comparação, omaterial do qual o dispositivo é feito pode ser selecionado entre o materialinerte, tal como, por exemplo, náilon, ou polipropileno.

Para evitar a secagem da superfície, a camada fina de sanguepode ser coberta por um filme fino de material sólido ou fluído.

Alternativamente, o sangue pode ser guiado em uma fenda dentro de ummaterial translúcido, por exemplo, por uma força capilar.

(4) Medida

É uma vantagem da medida em uma camada fina que o sinalfluorescente seja proporcional à concentração das moléculas fluorescentes; emoutras palavras, o efeito do filtro interno não desempenha nenhum papel.

Entretanto, o consumo do substrato não desempenha um papel. Ele pode sercompensado de três maneiras: (a) como no método cromogênico (38), isto é,ao fornecer substratos com constantes cinéticas tal que o consumo desubstrato possui um efeito desprezível, (b) ao corrigir matematicamente oconsumo do substrato, isto é, pela aplicação da equação da taxa integrada e(c) ao utilizar um calibrador conforme descrito na patente WO 03/093831.

O curso da concentração de trombina na coagulação do sanguetotal é determinado a partir da ação enzimática da trombina em um substratofluorogênico adicionado ao sangue. Um sinal estável e suficiente foi obtido aomedir em uma camada fina ilustrada por uma camada de menos de 2 mm deespessura sobre uma superfície ampla (ilustrada por uma superfície que possuimais de 10 mm2). Para medir o volume real em que a reação ocorre, umapequena quantidade de fluoróforo é adicionada ao substrato. Um dispositivoóptico especializado é requerido para a iluminação do todo da superfície eoutra para coleta da luz emitida a partir da superfície.

A camada fina poderia ser estabilizada e evitada a partir dasecagem por uma série de meios mecânicos, entre os quais uma rede inerte ouuma rede de material selecionado tal como para imitar certas propriedades daparede do vaso. Alternativamente, uma pequena fenda pode ser utilizada.

A configuração também pode ser utilizada para medir a geraçãode trombina em plasma rico em plaqueta e pobre em plaqueta.

(5) Mistura da Reação

Substâncias químicas:

O fator do tecido relipidado recombinante (rTF) que não contémpolibreno ou Ca++ é da Dade Behring (Marburg, Alemanha). O substratofluorogênico, Z-GIy-GIy-Arg-AMC é obtido pela Bachem (Suíça). Na divisão pelatrombina, ela libera o 7-amino-4-metilcumarina (AMC) fluorescente que é medidopor uma excitação de 390 nm e um conjunto de filtro de emissão de 460 nm.

Uma mistura fresca de substrato fluorogênico e CaCI2 (FIuCa) épreparado para cada experimento conforme segue: para 875 pL de tampão(Hepes 20 mM, pH 7,35) contendo 60 g/ L de BSA (Sigma, A-7030), 100 pL deCaCI2 a 1 M foi adicionado. A 37° C, 25 pL de uma solução de DMSO a 100mM do substrato fluorogênico foi respingado e imediatamente agitado demaneira vigorosa. A solução clara resultante, referida como FIuCa1 portanto éde 2,5 mM em substrato fluorogênico e 100 mM em CaCI2.

O tampão A contém 20 mM de hepes, 140 mM de NaCI1 5 mg/ mLde BSA, pH = 7,35.O tampão B contém 20 mM de hepes, 140 mM de NaCI1 60 mg/ml_, pH = 7,35.

Sangue ε Plasma

O sangue é obtido através de uma punção na veia (1 volume decitrato trissódico a 0,13 M para 9 volumes de sangue). O fluxo livre da sucçãomínima deve ser empregado; os recipientes a vácuo devem ser evitados.

As medidas são realizadas em um prato de fluorimetro (leitorAscent, Thermolabsystems OU1 Helsinki, Finlândia) equipado com um conjuntode filtro de 390/460 (excitação/ emissão). Ao invés de um prato de 96cavidades, um prato de cavidade é utilizado com 24 cavidades redondas comum diâmetro de 15 mm e, portanto, uma superfície de 175 mm2. As cavidadessão preparadas ao lavar diversas vezes com o tampão A e ao secar ascavidades.

Então, a mistura do sangue e do substrato é adicionada em que ageração de trombina ocorre. A mistura contém, por cavidade a ser preenchida:80 pL de sangue total citrado.

20 pL de Innovin® 1:1.000 diluído no tampão A, 20 pL de FIuCaou, como sendo o caso, um múltiplo destes volumes.

Imediatamente após a adição de FIuCa, a mistura é agitada emum misturador Vortex e adicionada às cavidades. O prato é inserido nofluorimetro e agitado durante 10 s a 1.200 rpm e então, medido a cada doisminutos a 390/ 460 nm a 37° C durante uma hora.

Para cada cavidade de 120 pL, a mistura é adicionada.

Exemplo 1

Pontos de Leitura Múltiplos. Adição da Malha ε da Cobertura

A geração da trombina foi desencadeada conforme indicadoacima nas três cavidades. Os pontos de 24 cavidades foram iluminados umapós o outro. Os sinais de 24 pontos a cada leitura foram adicionados. Osresultados são mostrados na Figura 7. É observado que o sinal é aumentado eestabilizado pela adição de uma rede, onde um filtro de náilon com umaabertura de malha de 600 μΜ, 51% de área aberta e espessura de 445 μΜ(Spectrum Laboratories Inc. Rancho Dominguez Califórnia, EUA). Entretanto, osinal aumenta de forma artificial com o tempo devido à evaporação e aconcentração da camada superior. Isto é evitado pela cobertura com uma folhaplástica (Fita selante de limpeza óptica Thermosprint para QPCR (Bilatec AG1Mannheim1 Alemanha)).

Exemplo 2

Múltiplos Pontos de Leitura. Adição a um Gel ε uma Cobertura

A geração de trombina foi desencadeada conforme indicadoacima em três cavidades. Os pontos de 24 cavidades foram iluminados emedidos um após o outro. Os sinais a partir de 24 pontos em cada leituraforam adicionados. Para duas cavidades, 700 pL de um Spehadex-25 a 50%(v/v) em solução de NaCI a 150 mM são adicionados e o pó é deixadoassentar por 5 minutos. O sobrenadante (300 - 400 pL) é removido dacavidade com uma pipeta.

Então, 120 pL da mistura de sangue de coagulação sãoadicionados. Em cima de uma destas duas cavidades, foi aplicada uma folhaplástica. (Fita selante de limpeza óptica Thermosprint para QPCR (Bilatec AG,Mannheim, Alemanha)). Os resultados são comparáveis a aqueles da Figura 7.

Exemplo 3

Coleta da Luz com um Dispositivo Óptico

Para este experimento, uma cavidade, com rede e coberturacomo no Exemplo 1, conforme medido com o auxilio de um fluorímetro optimaFluostar (BGM Labtech1 Offenburg, Alemanha). A luz a partir da amostra foicoletada em um ocular de Huygens (10 χ de amplificação) e lida após passaratravés deste dispositivo óptico. Os resultados são mostrados na Figura 8.Exemplo 4

Das Unidades Arbitrárias para a Trombinas

Este experimento foi essencialmente realizado como aquele noExemplo 1 com rede e cobertura, mas uma quantidade conhecida de AMC (10nM) foi adicionada ao substrato Z-GIy-GIy-Arg-AMC. Devido à sedimentaçãodos eritrócitos, o volume em que a medida ocorre aumenta tal que o sinal apartir do AMC presente aumenta. No momento da coagulação, a situação"congela" e nenhuma sedimentação ocorre. Neste momento, conhecido a partirde um repentino aumento no sinal, nós medimos a quantidade de fluorescênciadevido ao AMC a 10 nM adicionado. Desta forma, nós conhecemos comoconverter as unidades de fluorescência (F) na concentração de AMC. Assim, odF/ dt medido pode ser convertido em d[AMC]/ dt. A partir de um experimentoindependente, sabe-se o que d[AMC]/ dt corresponde ao qual concentração detrombina. Assim, a velocidade de mudança da fluorescência (Figura 9, linhapreta) pode ser convertida na concentração de trombinina da amostra.

Exemplo 5

Dispositivo Contendo a Amostra de Sangue

Uma célula de filtro de papel contendo substrato e íons Ca2+ épreparada pela adição de 50 μ[_ de uma solução de DMSO a 100 mM dosubstrato fluorogênico e 100 pl_ de uma solução de CaCI2 a 1M para 5.850 pl_de etanol. 11 pL desta solução é espalhada em um pedaço de matriz sólida(Whatman 1MM de papel de cromatografia) de 7x9 mm e seca sob nitrogênio.

Depois é coberta entre os pedaços de plástico (Fita selante de limpeza ópticaThermosprint para QPCR (Bilatec AG, Mannheim, Alemanha)) conformemostrado na Figura 11.

O mesmo procedimento é utilizado para preparar uma célula depapel filtro contendo apenas substrato, neste caso, 50 pL de uma solução deDMSO de 100 mM de substrato fluorogênico é adicionado a 5.950 pL de etanol,do qual 11 μL é espalhado em um pedaço de matriz sólida e seco sobnitrogênio.

Múltiplos Pontos de Leitura, Utilizando uma Célula de Papel Filtro

Duas células de papel filtro, uma contendo substrato fluorogênicoe íons cálcio (A) e outra contendo apenas substrato (B) foram preparado demodo fresco conforme descrito acima.

Uma mistura 4:1:1 de sangue total citrado, tampão B e Innovin®(1:1.000 diluído em tampão A) foi preparada. Como um calibrador, uma misturade 4:1:1 de sangue total citrado, inibidor de polimerização (H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH . AcOH) (Bachem feinchemikalien AG, Bubendorf1 Suiça) em tampão B (1,0mM) e 20 μΜ de staphylocoagulase foi preparado pela mistura de sangue totale inibidor da polimerização. Pouco antes de iniciar o experimento, aStaphylocoagulase foi adicionada e a amostra foi bem misturada.

Imediatamente após a adição de Staphylocoagulase, oexperimento é iniciado pela adição de 11 μΙ_ de amostra de TG à célula A e 11pL do calibrador à célula B. Isto é feito pela pipetagem das gotas próximo àmatriz sólida em uma maneira que a gota toca a matriz (vide Figura 11) e éabsorvida pelas forças capilares. Por célula, 4 pontos são iluminados emedidos um após o outro.

O sinal do calibrador é uma linha reta, a inclinação é utilizadapara converter o sinal da célula da amostra em trombina nM. Esta é acalibração de sinal convencional como é conhecido no estado da técnica e nãoa calibração contínua como na acepção do pedido de patente EP 03/04705. Osresultados são mostrados na Figura 12.

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Claims (29)

1. MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO IN VITRO DAATIVIDADE DE TROMBINA EM UMA AMOSTRA, caracterizado pelo fato deque a amostra é uma amostra de sangue e a geração da trombina é medidapelas etapas de:- colocar uma camada de dita amostra em contato com umsubstrato fluorogênico da trombina em que dita camada possui uma espessuradentro de um intervalo de 0,05 a 5 mm e uma superfície dentro de um intervalode 10 a 500 mm2;- permitir a geração de trombina em dita amostra;- medir a fluorescência emitida a partir da superfície da camada,pelo grupo fluorescente liberado a partir do substrato fluorogênico como umresultado da ação enzimática da trombina gerada em dito substratofluorogênico.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a concentração de trombina gerada durante o ensaio édeterminada como uma função da fluorescência medida do grupo fluorescenteliberado.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que a amostra de sangue total é diluída dentro deum intervalo de no máximo 10 vezes.

4. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a espessura da camada da amostra é decerca de 2 mm ou menos.

5. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que, para o ensaio, a amostra de sangue épreenchida dentro de uma cavidade de um prato que também contém umarede com um tamanho de malha de 50 a 500 pm.

6. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a-5, caracterizado pelo fato de que, para o ensaio, a amostra de sangue épreenchida dentro de uma cavidade de um prato que também contémmicrogrânulos.

7. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a-6, caracterizado pelo fato de que a cavidade contendo a amostra de sangue écoberta para a determinação da atividade de trombina.

8. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a-7, caracterizado pelo fato de que um fluoróforo é adicionado ao substratofluorogênico da trombina, em que as respectivas proporções do fluoróforoadicionado estão no intervalo de 1 a 10% da quantidade de moléculafluorescente ligada ao substrato de trombina.

9. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a-8, caracterizado pelo fato de que a quantidade de substrato de trombinaadicionada à amostra está dentro de um intervalo de 50 a 1.000 pm.

10. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a-8, caracterizado pelo fato de que o substrato fluorogênico é um substratosintético para a trombina, acoplada com uma molécula fluorescente.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que o substrato de trombina que é hidrolisadoseletivamente pela trombina, possui uma afinidade de ligação moderada para atrombina e uma baixa constante de cinética.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que o substrato fluorogênico é um oligopeptídeo quepossui uma seqüência de 2 a 30 resíduos de aminoácidos acoplados àmolécula fluorescente.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o oligopeptídeo possui uma Iisina ou argininaterminal para o acoplamento com uma molécula fluorescente.

14. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 10 a 13, caracterizado pelo fato de que a molécula fluorescente é o AMC (7-amino-4-metilcumarina).

15. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a cavidade compreende ainda um gel,possivelmente contendo íons cálcio, em que dito gel não permite a diluição dosangue da amostra.

16. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o fator do tecido e os íons cálcfô sãoadicionados à amostra de sangue em quantidades que permitem que ocorra ageração da trombina.

17. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a amostra de sangue é uma amostra desangue total.

18. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a amostra de sangue é uma amostra deplasma, em especial de Plasma Rico em Plaqueta (PRP).

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que a amostra de sangue total é citrada.

20. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizado pelo fato de ser para a detecção ou monitoramento de umadoença homeostática ou uma doença trombótica.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de ser para a detecção ou monitoramento da interação de determinada(s)substância(s) na atividade de trombina em uma amostra de sangue total, em quedita(s) substância(s) determinada(s) é(são) adicionada(s) à amostra a ser analisadaou é(são) adicionada(s) durante a geração da trombina.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de ser para o monitoramento da interação dos fatoresde coagulação ou drogas.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de ser para a seleção de substâncias para determinarsua capacidade de interação com a geração de trombina.

24. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a-20, caracterizado pelo fato de ser para a medida do Potencial de TrombinaEndógena (ETP) da amostra de sangue total.

25. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 1a 21, caracterizado pelo fato de ser para a medida do tempo do pico datrombina.

26. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a-22, caracterizado pelo fato de ser para a medida do tempo de coagulação.

27. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 1a 23, caracterizado pelo fato de ser para a medida do nível do pico detrombina gerada.

28. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a-24, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de calibração.

29. KIT para a realização do método conforme descrito emuma das reivindicações de 1 a 21, caracterizado pelo fato de que compreende:- um substrato fluorogênico para a trombina,- o fator do tecido e os íons cálcio para permitir a geração datrombina,- opcionalmente, uma rede ou microgrânulos que previnem aretração do coágulo sangüíneo e auxiliam na dispersão do sangue total,- opcionalmente um gel, possivelmente compreendendo íonscálcio.