RU2007137972A

RU2007137972A - Измерение активности тромбина в цельной крови

Info

Publication number: RU2007137972A
Application number: RU2007137972/15A
Authority: RU
Inventors: Хендрик Коенрад ХЕМКЕР (NL); Хендрик Коенрад ХЕМКЕР; Сьюзет БЕГУИН (NL); Сьюзет БЕГУИН; Раед АЛЬ-ДИЕРИ (NL); Раед АЛЬ-ДИЕРИ; Роберт ВАГЕНВУРД (NL); Роберт ВАГЕНВУРД; Сабастиан НИЖУИС (NL); Сабастиан НИЖУИС; Питер ГИСЕН (NL); Питер ГИСЕН
Original assignee: Синапс Б.В. (Nl); Синапс Б.В.
Priority date: 2005-04-29
Filing date: 2006-04-26
Publication date: 2009-06-10
Also published as: EP1875249B1; US8916356B2; AU2006243283A1; ATE483984T1; AR053371A1; ES2354086T3; JP2008539400A; BRPI0612967A2; KR20080025043A; RU2422835C2; DE602006017350D1; EP1717588A1; MX2007013497A; AU2006243283B2; CA2606906A1; WO2006117246A1; CN101171519A; BRPI0612967B1; CA2606906C; EP1875249A1

Abstract

1. Способ in vitro определения активности тромбина в образце, причем образец представляет собой образец крови, а измерение выработки тромбина включает следующие стадии: ! приведение слоя указанного образца в контакт с флюорогенным субстратом тромбина, при этом толщина указанного слоя составляет от 0,05 до 5 мм, а площадь поверхности составляет от 10 до 500 мм2; ! обеспечение условий для выработки тромбина в указанном образце; ! измерение флюоресценции, испускаемой с поверхности указанного слоя флюоресцентной группой, которую высвобождает флюорогенный субстрат в результате ферментативного воздействия вырабатываемого тромбина на указанный флюорогенный субстрат. ! 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрацию тромбина, выработанного в ходе анализа, определяют как функцию измеренной флюоресценции от высвобождаемой флуоресцентной группы. ! 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанный образец цельной крови разбавляют в пределах до максимум 10 раз. ! 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что толщина слоя указанного образца составляет примерно 2 мм или меньше. ! 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что при проведении анализа указанный образец крови помещают в лунку планшета, которая также содержит решетку с размером отверстий от 50 до 500 мкм. ! 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что при проведении анализа указанный образец крови помещают в лунку планшета, которая также содержит микрогранулы. ! 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что при определении активности тромбина лунку, содержащую образец крови, накрывают сверху. ! 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что к флюорогенному субстрату тромбина добавляют флуорофор, причем относитель�

Claims

1. Способ in vitro определения активности тромбина в образце, причем образец представляет собой образец крови, а измерение выработки тромбина включает следующие стадии:

приведение слоя указанного образца в контакт с флюорогенным субстратом тромбина, при этом толщина указанного слоя составляет от 0,05 до 5 мм, а площадь поверхности составляет от 10 до 500 мм²;

обеспечение условий для выработки тромбина в указанном образце;

измерение флюоресценции, испускаемой с поверхности указанного слоя флюоресцентной группой, которую высвобождает флюорогенный субстрат в результате ферментативного воздействия вырабатываемого тромбина на указанный флюорогенный субстрат.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрацию тромбина, выработанного в ходе анализа, определяют как функцию измеренной флюоресценции от высвобождаемой флуоресцентной группы.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанный образец цельной крови разбавляют в пределах до максимум 10 раз.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что толщина слоя указанного образца составляет примерно 2 мм или меньше.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что при проведении анализа указанный образец крови помещают в лунку планшета, которая также содержит решетку с размером отверстий от 50 до 500 мкм.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что при проведении анализа указанный образец крови помещают в лунку планшета, которая также содержит микрогранулы.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что при определении активности тромбина лунку, содержащую образец крови, накрывают сверху.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что к флюорогенному субстрату тромбина добавляют флуорофор, причем относительная доля добавленного флюорофора составляет от 1 до 10% количества флуоресцентной молекулы, связанной с субстратом тромбина.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что количество субстрата тромбина, добавляемого к образцу, составляет от 50 до 1000 мкМ.

10. Способ по п.8, отличающийся тем, что флюорогенный субстрат представляет собой синтетический субстрат тромбина, соединенный с флуоресцентной молекулой.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанный субстрат тромбина селективно гидролизуется тромбином и обладает умеренной аффинностью связывания с тромбином и низкой кинетической константой.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что флюорогенный субстрат представляет собой олигопептид, последовательность которого содержит 2-30 остатков аминокислот и который соединен с флуоресцентной молекулой.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанный олигопептид на своем конце содержит лизин или аргинин для соединения с флуоресцентной молекулой.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанная флуоресцентная молекула представляет собой АМС (7-амино-4-метилкумарин).

15. Способ согласно любому из пп.1 2, 4-14, отличающийся тем, что указанная лунка дополнительно содержит гель, возможно, содержащий ионы кальция, причем указанный гель не вызывает разбавления крови образца.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что тканевой фактор и ионы кальция добавляют к образцу крови в количествах, обеспечивающих возможность выработки тромбина.

17. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанный образец крови представляет собой образец цельной крови.

18. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанный образец крови представляет собой образец плазмы, в частности, богатой тромбоцитами плазмы (PRP).

19. Способ согласно п.17, отличающийся тем, что указанный образец цельной крови представляет собой кровь, обработанную цитратом.

20. Способ согласно любому из пп.1-2, 4-14, 16-19, который применяют для обнаружения или мониторинга гомеостатического или тромботического заболевания.

21. Способ согласно п.20, который применяют для обнаружения или мониторинга воздействия определенного вещества (веществ) на активность тромбина в образце цельной крови, причем указанное определенное вещество (вещества) добавляют в образец, который предстоит анализировать, или добавляют во время выработки тромбина.

22. Способ по п.20, который применяют для мониторинга воздействия факторов свертывания крови или препаратов-коагулянтов.

23. Способ по п.20, который применяют для скрининга веществ с целью определить их способность воздействовать на выработку тромбина.

24. Способ по п.20, который применяют для измерения Потенциала Эндогенного Тромбина (ПЭТ) в образце цельной крови.

25. Способ по п.21, который применяют для измерения времени достижения пиковой концентрации тромбина.

26. Способ по п.22, который применяют для измерения времени образования сгустка крови.

27. Способ по п.23, который применяют для измерения уровня пиковой концентрации выработанного тромбина.

28. Способ по п.24, который включает стадию калибровки.

29. Набор для осуществления способа согласно любому из пп.1-21, который содержит флуорогенный субстрат тромбина, тканевой фактор и ионы кальция для обеспечения выработки тромбина, возможно, решетку или микрогранулы, которые предотвращают уплотнение сгустка крови и способствуют диспергированию цельной крови, возможно, гель, возможно, содержащий ионы кальция.