JP5606435B2 - トロンビン基質およびサンプル中の生体活性トロンビンのレベルを測定するためのアッセイ - Google Patents

Description

本発明は、トロンビンの新規基質、およびサンプル中の生体活性トロンビンのレベルを測定するためのアッセイに関する。

トロンビンは、プロトロンビン上の２つの部位の、活性化第Ｘ（Ｘａ）因子による酵素切断によってもたらされる。
トロンビンは、フィブリノゲンを活性型に転化させ、これが集合してフィブリンとなる。トロンビンはさらに、第ＸＩ因子、第Ｖ因子、および第ＶＩＩＩ因子を活性化する。こうした正のフィードバックがトロンビンの生成を促進する。

第ＸＩＩＩ因子はさらに、トロンビンによって活性化される。第ＸＩＩＩａ因子は、リシンとフィブリン中のグルタミン残基との間の共有結合の形成を触媒するトランスグルタミナーゼである。共有結合により、フィブリン塊の安定性が高まる。

凝固カスケードにおける活性に加えて、トロンビンはさらに、血小板上のプロテアーゼ活性化受容体の活性化によって血小板活性化を促進する。
臨床業務において、プロトロンビン時間（ＰＴ）（すなわち、血液が凝固するのに要する時間）の測定は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）と活性化凝固時間（ＡＣＴ）に関して、凝固経路の異常を調べるのに、および抗凝固療法をモニターするのに広く使用されている。

血液凝固試験の結果を標準化するために、国際標準化比（ＩＮＲ）が考案されている。組織因子の各メーカーは、メーカーが製造する全ての組織因子に対してＩＳＩ（国際感度指数）を与えている。ＩＳＩ値は、組織因子の特定のバッチと国際的に標準化されたサンプルとの間の比較を示す。ＩＮＲは、患者のプロトロンビン時間と対照標準サンプルのプロトロンビン時間との比に、使用されるトロンボプラスチン試薬のＩＳＩ値を乗じて得られる値である。
ＩＮＲ＝（ＰＴ_ｔｅｓｔ／ＰＴ_{ｎｏｒｍａｌ}）^ＩＳＩ
ＰＴの測定に対して利用可能なアッセイが２種ある。

１つ目のアッセイは凝固（ｃｏａｇｕｌｏｍｅｔｒｉｃ）アッセイであり、フィブリノゲンからフィブリンへの転化による血塊形成のエンドポイントに基づいている。しかしながら、アッセイの結果は変わりやすく、特に、患者におけるフィブリノゲン／フィブリン転化の障害によって影響される。もう１つのアッセイは非凝固アッセイであり、トロンビン切断に適した合成基質の使用に基づいている。後者のアッセイの結果は変動がより少なく、フィブリノゲンのレベルによって影響されない。

米国特許第４，０６１，６２５号は、
式：
Ｄ−Ｐｈｅ−環状イミノ酸−Ａｒｇ−ｐＮＡ
［式中、環状イミノ酸は、２−アゼチジンカルボン酸、プロリン、および２−ピペリジンカルボン酸から選ばれ、ｐＮＡはｐ−ニトロアニリドである］
の発色性トロンビン基質を開示している。該基質は、トロンビンの定量的測定に、あるいはトロンビンが形成、阻害、もしくは消費される反応の研究に、あるいはこのような反応に影響を及ぼすかもしくは関与する因子の測定（例えば、抗トロンビン、プロトロンビン、およびヘパリンの測定）に適していると記載されている。

発色性基質が使用されるとき、反応は約４０５ｎｍにて検出される。この波長では、全血自体が紫外線の吸収を起こすために、全血は分析することができない。したがって発色性基質は、使用されるサンプルタイプが全血であるときには適切ではない。

イムノアッセイやＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイにおいては、ランタニドキレート等のキレートを使用する時間分解ルミネッセンス分光法が、ここ数年にわたって利用されている。全血の吸収特性により、このキレート検出技術は、発色性基質の場合と比較して、サンプルが全血であるときに適している。なぜなら、この技術を使用すると、６１５ｎｍ（この波長では、全血の吸収は少ない）での吸光度を測定することができるからである。

このようなキレートは、時間分解蛍光分析（ＴＲＦ）への応用に適した改良された蛍光ランタニドキレートを開示している米国特許第７，０１８，８５１Ｂ１号において記載されている。これらのキレートは、特異的バイオアフィニティベースの結合アッセイ（例えばイムノアッセイ）において使用されている。

ＴＲＦは、高い感度と広いダイナミックレンジを必要とするアッセイに対して極めて適切な検出技術である。従来の蛍光検出を使用するイムノアッセイ法においては、例えば、サンプルの生物学的成分からの光散乱によって引き起こされる高い非特異的バックグラウンドは、アッセイの感度にとって深刻な制約となる。

蛍光ランタニドキレートは、検出原理が、こうしたキレートの捕捉とキレートの検出をベースとするイムノアッセイにおいて従来から使用されている。これとは対照的に、蛍光ランタニドキレートは、検出原理が、キレート担体の切断およびアッセイにおいて残留している捕捉された（切断していない）担体の検出をベースとする酵素アッセイには使用されていない。

このようなシステムの重要な特徴は、一方では安定であって、他方ではトロンビンによって特異的に切断可能であるような担体を提供することである。

米国特許第４，０６１，６２５号 米国特許第７，０１８，８５１Ｂ１号

したがって、トロンビンによって特異的に切断可能であって、長い寿命を有する（このため、全血での検出が容易になり、障害はより少なくなる）本質的に安定なルミネッセンス成分を含む酵素基質が求められている。

さらに、実施するのが速やかで、単純かつ簡単であり、ばらつきが小さく、簡単に自動化することができ、そして低コストであるようなアッセイが求められている。
驚くべきことに、トロンビンによって特異的に切断可能であるペプチドとルミネッセンスキレートとを、ある特定のリンカーを介して結びつけることによって、サンプルタイプが全血であるときに使用することができる、長い寿命を有する安定な基質が得られる、ということが見出された。

第１の側面では、本発明は、
一般式：
Ａ−Ｘ−Ｚ−Ａ’
［式中、ＡとＡ’の一方が、ルミネッセンスキレートを含み、そして
ＡとＡ’の他方が、場合によってはスペーサーを含み、ペプチド結合を介して基質の残りの部分に連結されている、結合対の第１のパートナーを含み；
Ｘは、Ｘ’−Ｐｈｅ−Ａｚｅ−Ａｒｇ、Ｘ’−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ、およびＸ’−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇから選ばれるトリ−ペプチドもしくはテトラ−ペプチドを形成し、
ここで、Ｘ’は、存在しないか又はＬｙｓ、Ａｈｘ、Ｉｌｅ、およびＶａｌから選ばれ；
ＺはＮＨ−Ｒ−Ｚ’であり、
ここで、Ｒは、Ｃ_１−６アルキレン、Ｃ_１−６アルキレンオキシ、Ｃ_１−６チオアルキレン、Ｃ_１−６チオアルキレンオキシ、カルボニル−Ｃ_１−６アルキレン、カルボニル−Ｃ_１−６アルキレンオキシ、Ｃ_１−６アルキレン−カルボニル、Ｃ_１−６アルキレンオキシ−カルボニル、Ｃ_１−６アルキレン−アリーレン、Ｃ_１−６アルキレンオキシ−アリーレン、Ｃ_１−６アルキレン−ＮＨ、Ｃ_１−６アルキレンオキシ−ＮＨ、Ｃ_１−６アルキレン−ＮＨＣＯ、Ｃ_１−６アルキレンオキシ−ＮＨＣＯ、Ｃ_１−６アルキレン−ＣＯＮＨ、Ｃ_１−６アルキレンオキシ−ＣＯＮＨ、Ｃ_１−６アルキレン−ＣＯＳ、Ｃ_１−６アルキレンオキシ−ＣＯＳ、Ｃ_１−６アルキレン−ＣＯＮＨ−Ｃ_１−６アルキレン−アリーレン、アリーレン、アリーレン−Ｃ_１−６アルキレン、アリーレン−Ｃ_１−６アルキレンオキシ、Ｒ^１ _ａ−アリーレン−（ＮＨＣＯ−Ｒ^２）_ｂ、Ｒ^３ _ｃ−アリーレン−（ＣＯＮＨ−Ｒ^４）_ｄ、（Ｒ^５−ＣＯＮＨ）_ｅ−アリーレン−Ｒ^６ _ｆ、および（Ｒ^７−ＮＨＣＯ）_ｇ−アリーレン−Ｒ^８ _ｈからなる群から選ばれ、ここで、それぞれの場合における各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、およびＲ^８は、Ｃ_１−６アルキレン、Ｃ_１−６アルキレンオキシ、Ｃ_１−６チオアルキレン、Ｃ_１−６チオアルキレンオキシ、カルボニル−Ｃ_１−６アルキレン、カルボニル−Ｃ_１−６アルキレンオキシ、Ｃ_１−６アルキレン−カルボニル、アリーレン、またはアリーレン−Ｃ_１−６アルキレンから独立して選ばれ、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、およびｈのそれぞれが、０〜６の整数から独立して選ばれ、
ここで、アリーレンは、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ_２、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルコキシ、もしくはＣ_１−６アルコキシカルボニルから選ばれる１つ以上の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されてもよいフェニレン、ビフェニレン、またはナフチレンであって、
Ｚ’は、Ｎ、Ｓ、およびカルボニルのうちの１つを含み、
ここで、Ｚ’がＮを含むとき、Ｚ’は、チオウレア（−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−）、アミノアセトアミド（−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_２−ＮＨ−）、アミド（−ＮＨ−ＣＯ−）、メチルアミド（−ＮＣＨ_３−ＣＯ−）、または置換−トリアジン−ジアミン（−ＮＨ−（Ｒ^９Ｃ_３Ｎ_３）−ＮＨ−）から選択され、
Ｚ’がＳを含むとき、Ｚ’は、チオエーテル（−Ｓ−）、チオアセトアミド（−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＯ−ＮＨ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、（−Ｓ−ＣＯ−ＣＨ_２−ＮＨ−）、または（−Ｓ−（Ｒ^９Ｃ_３Ｎ_３）−ＮＨ−）から選択され、あるいは
Ｚ’がカルボニルを含むとき、Ｚ’は、アミド（−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＯ−ＮＣＨ_３−）またはエステル（−ＣＯ−Ｏ−）から選ばれ、
Ｒ^９は、水素、ハロゲン、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６チオアルキル、Ｃ_１−６アルコキシ、Ｃ_１−６チオアルコキシ、アリールオキシ、およびアミノからなる群から選ばれ、アルキル基、チオアルキル基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、またはアリールオキシ基は、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ_２、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルコキシ、またはＣ_１−６アルコキシカルボニルから選ばれる１つ以上の置換基でモノ置換、ジ置換、またはトリ置換されてもよく、アミノ基は、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルコキシ、またはＣ_１−６アルコキシカルボニルから選ばれる１つ以上の置換基でモノ置換またはジ置換されてもよい］
を有する、トロンビンの基質に好適である。

本発明の文脈においては、Ｃ_１−６アルキル基は、１〜６個の炭素原子で構成される直鎖基または分岐鎖基を意味しており、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、およびヘキシル等があるが、これらに限定されない。好ましいのは、メチル基、エチル基、プロピル基、およびイソプロピル基である。

本発明の文脈においては、Ｃ_１−６アルキレン基は、１〜６個の炭素原子で構成される直鎖基または分岐鎖基を意味しており、メチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ｔ−ブチレン、ペンチレン、およびヘキシレン等があるが、これらに限定されない。好ましいのは、メチレン基、エチレン基、およびプロピレン基である。

本発明の文脈においては、Ｃ_１−６アルコキシ基は、酸素原子に連結した１〜６個の炭素原子で構成される直鎖基または分岐鎖基を意味しており、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｔ−ブトキシ、ペントキシ、およびヘキソキシ等があるが、これらに限定されない。好ましいのは、メトキシ基、エトキシ基、およびプロポキシ基である。

本発明の文脈においては、Ｃ_１−６アルキレンオキシ基は、酸素原子に連結した１〜６個の炭素原子で構成される直鎖基または分岐鎖基を意味しており、メチレンオキシ、エチレンオキシ、プロピレンオキシ、イソプロピレンオキシ、ブチレンオキシ、イソブチレンオキシ、ｔ−ブチレンオキシ、ペンチレンオキシ、およびヘキシレンオキシ等があるが、これらに限定されない。好ましいのは、メチレンオキシ基、エチレンオキシ基、およびプロピレンオキシ基である。

本発明の文脈におけるアミノ酸残基は、従来の３文字略語を有する。したがってＡｈｘは２−アミノヘキサン酸（ノルロイシン）を表わし、Ａｌａはアラニンを表わし、Ａｒｇはアルギニンを表わし、Ａｓｎはアスパラギンを表わし、Ａｓｐはアスパラギン酸を表わし、Ａｚｅは、アゼチジン−２−カルボン酸を表わし、Ｃｙｓはシステインを表わし、Ｇｌｎはグルタミンを表わし、Ｇｌｕはグルタミン酸を表わし、Ｇｌｙはグリシンを表わし、Ｈｉｓはヒスチジンを表わし、Ｉｌｅはイソロイシンを表わし、Ｌｅｕはロイシンを表わし、Ｌｙｓはリシンを表わし、Ｍｅｔはメチオニンを表わし、Ｐｈｅはフェニルアラニンを表わし、Ｐｉｐはピペリジン−２−カルボン酸を表わし、Ｐｒｏはプロリンを表わし、Ｓｅｒはセリンを表わし、Ｔｈｒはトレオニンを表わし、Ｔｒｐはトリプトファンを表わし、Ｔｙｒはチロシンを表わし、そしてＶａｌはバリンを表わす。

本発明の文脈においては、ハロゲンは、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードを表わす。
本発明の基質は、切断された基質を非切断／非損傷（ｉｎｔａｃｔ）の基質から分離するために、固定化マトリックスに付着させることができるものでなければならない。したがって本発明の基質は、結合対の第１のパートナーによって終結されていて、つまり、結合対の第２のパートナーに結合する。該結合対のこの第２のパートナーが、固定化マトリックス上に固定化される。

本発明の基質は、優れた特異性を有するトロンビンによって速やかに切断することができる。その中央部は、トリもしくはテトラペプチドを単位とする小さなペプチドであり、Ａｒｇ−部分とＺ−部分との間に位置する切断可能結合においてトロンビンによって切断される。

本発明の基質は、サンプルが血漿であるときに使用することができ、サンプルが全血であるときに適しているので特に有利である。なぜなら本発明の基質は、使用されているキレート技術により、６１５ｎｍにて検出することができるからである。

図１は、事前に基質を固定化しない１ステップアッセイ法の概略図を示す。 図２は、事前に基質を固定化する１ステップアッセイ法の概略図を示す。 図３は、２ステップアッセイ法の概略図を示す。 図４は、本発明の基質であるＳ１Ｖ６ｃの合成の反応スキームを示す。 図５は、本発明の他の基質であるＳ１Ｖ１２ａの合成の反応スキームを示す。 図６は、本発明の基質であるＳ１Ｖ６ｃとＳ１Ｖ９ｂの標準的な曲線を示す。

本発明の１つの実施態様では、基質は、Ｘ’が存在せず、ＰｈｅがＤ−Ｐｈｅであり、そしてＡｒｇがＬ−Ａｒｇである、という基質である。
本発明の１つの実施態様では、ＸはＤ−Ｐｈｅ−Ｌ−２−Ａｚｅ−Ｌ−ＡｒｇまたはＤ−Ｐｈｅ−Ｌ−２−Ｐｉｐ−Ｌ−Ａｒｇである。

これらの基質は、速い切断速度論をもたらすことが示されており、および／または、トロンビンに対して高度に特異的である。
本発明の１つの実施態様では、Ｚ’がＮであり、Ｒがアリーレン、Ｃ_１−６アルキレン−アリーレン、またはＲ^１ _ａ−アリーレン−（ＮＨＣＯ−Ｒ^２）_ｂであって、Ｒ^１とＲ^２が上記したとおりであり、ａとｂが０、１、または２である。

したがって、切断可能な結合におけるＺが芳香族部分を含む場合の基質は、極めて良好で速い切断速度論をもたらすことが示されている。
本発明の１つの実施態様では、Ｚ’が６−置換−１，３，５−トリアジン−２，４−ジアミン（ＮＨ−（Ｒ^９Ｃ_３Ｎ_３）−ＮＨ）結合または（Ｓ−（Ｒ^９Ｃ_３Ｎ_３）−ＮＨ）結合であって、Ｒ^９が、クロロ、フルオロ、エトキシ、２−メトキシエトキトシ、２−シアノエトキシ、２，２，２−トリフルオロエトキシ、チオフェノキシ、およびエトキシカルボニルチオメトキシからなる群から選ばれる。

本発明の実施態様に従った基質は、トロンビンに対して特に特異的である。
本発明の１つの実施態様では、ルミネッセンスキレートは蛍光ランタニドキレートである。例えば米国特許第７，０１８，８５１Ｂ２号に開示されているように、適切な波長での高い吸収率；同じリガンド構造における幾つかの別個のＵＶ吸収部；ＵＶ吸収部からランタニドイオンへの効果的なエネルギー伝達；熱力学的安定性と高い速度論的安定性をつくりだすための強固なキレート部分；および、結合試剤として使用するキレート化合物の効果的なカップリングを、その結合特性を損なうことなく可能にする官能基；をもたらすこのようなルミネッセンスランタニドキレートは、本発明に対して極めて適している。

本発明の好ましい実施態様では、前記ランタニドキレートＡまたはＡ’は、

と

から選ばれる。
このようなキレートはさらに、例えば、ピリジン、ビピリジン、ターピリジン、もしくはフェノール化合物の誘導体をエネルギー媒介基として、そしてポリカルボン酸をキレート部分として構成される安定なキレートを含んでよい。さらに、種々のジカルボン酸塩誘導体、大環状クリプテート、カリックスアレーン、ＤＴＰＡカルボスチリル１２４コンジュゲート、および大環状シッフ塩基が特許出願および／または特許に開示されている。

本発明の１つの実施態様では、結合対は、第１のパートナーとしてのビオチンと第２のパートナーとしてのストレプトアビジン（ビオチン／ストレプトアビジン）、ビオチン／アビジン、ビオチン／ビオチン受容体ペプチド、およびストレプトアビジン誘導体／受容体ペプチドから選ばれる。

結合対の上記リストは限定的なものであり、本発明の基質を固定化マトリックスに固定化することができる全ての結合対を含む。市販の結合対の例としては、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ、Ｓｔｅｒｅｐ−ｔａｇＩＩ／Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ、またはビオチン／ビオチン受容体ペプチドなどがあるが、これらに限定されない。

好ましい実施態様では、前記第１のパートナーはビオチンである。
好ましい実施態様では、前記第２のパートナーはストレプトアビジンである。
固定化マトリックスは、当業者には公知であり、マイクロウェルやマイクロ粒子（例えば、ポリスチレンやポリプロピレン等のプラスチック材料で造られたビーズ、あるいはガラスで造られたビーズ）などがある。

本発明の１つの実施態様では、結合対の前記第１のパートナーが、スペーサーを介して基質の残部に連結される。立体的な理由から特に有用であるスペーサーを利用することで、基質の溶解性が改良される。したがってスペーサーの役割は、トロンビン酵素に課される立体障害を減ずるように、基質のペプチド／リンカー／キレート部分を溶解させることである。

本発明の１つの実施態様では、スペーサーは、式ＮＨ−Ｒ^１０−ＣＯＮＨ−Ｒ^１１−ＣＯ−（ＮＨ−Ｒ^１２−ＮＨ）_ｉで表わされ、ここでＲ^１０、Ｒ^１１、およびＲ^１２のそれぞれは、Ｃ_１−６アルキレン、Ｃ_１−６アルキレンオキシ、Ｃ_１−６チオアルキレン、Ｃ_１−６チオアルキレンオキシ、カルボニル−Ｃ_１−６アルキレン、カルボニル−Ｃ_１−６アルキレンオキシ、Ｃ_１−６アルキレン−カルボニル、アリーレン、またはアリーレン−Ｃ_１−６アルキレンから独立して選ばれ、ここで、アリーレンは、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ_２、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルコキシ、またはＣ_１−６アルコキシカルボニルから選ばれる１つ以上の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されてもよいフェニレン、ビフェニレン、またはナフチレンであり、ｉは０〜６の整数である。

本発明の１つの実施態様では、Ｒ^１０、Ｒ^１１、およびＲ^１２は、同一もしくは異なった、直鎖Ｃ_１−６アルキレン、アリーレン、またはアリーレン−Ｃ_１−６アルキレンであり、ｉは０または１である。

これとは別に、スペーサーはＷ−ｍｅｒペプチドであって、Ｗは１〜４０の整数である。
好ましい実施態様では、本発明の基質は、

から選ばれる。
本発明の基質は、実施するのが速やかで、単純かつ簡単で、ばらつきが小さく、簡単に自動化することができ、そして低コストであるようなアッセイにおいて使用することができる。

本発明の基質は、先行技術のアッセイと比較して、速やかで正確なアッセイをもたらすので、本発明のアッセイは、吸光度が任意に定めた特定の値に達するのに必要とする時間を測定する必要がない。代わりに、先行技術のアッセイと比較してアッセイ時間をより短い時間に固定することができ、時間分解ルミノメトリーを使用してルミネッセンスシグナルを測定することができる。好ましい実施態様では、前記ルミノメトリーはフルオロメトリーである。こうしたより短い時間でも、より正確な結果が得られる。エンドポイントは、標準サンプルにおいて、基質分子の約８０％が、アクチベータが存在下にてトロンビンによって切断される、という状態に達するのに必要な時間を表わすことができる。

これとは別に、エンドポイントはさらに、標準サンプルにおいて、トロンビンによる切断反応の定常状態に達するのに必要な時間を表わすことができる。
したがって第２の側面においては、本発明は、テストサンプル中の生体活性トロンビンのレベルを測定するための１ステップアッセイ法に関し、該アッセイ法は、
ａ）本発明の基質、アクチベータ、および該テストサンプルを、連続して、同時に、または実質的に同時に混合する工程；
ｂ）得られる反応混合物を、トロンビン切断されたキレート含有基質フラグメントを放出するようインキュベートし、結合パートナー含有基質フラグメントとトロンビン切断されない非損傷基質を固定化マトリックス上に固定化する工程；
ｃ）固定化されずトロンビン切断されたキレート含有基質フラグメントと、固定化されずトロンビン切断されない基質が存在する場合は、これらを洗い落とす工程；
ｄ）固定化された非損傷基質からのルミネッセンス発光のレベルを測定する工程；および
ｅ）トロンビン非含有の標準サンプルと比較したときの、ルミネッセンス発光の強度の減少から、トロンビン活性を算出する工程；
を含む。

したがって、固定化されないトロンビン切断されたキレート含有基質フラグメントと、固定化されないトロンビン切断されない基質（後者は、固定化マトリックスの結合容量が基質分子の量より低いときに存在する）とを洗い落とすことによって、トロンビン非含有の標準サンプルからのルミネッセンスと比較したときの、サンプルにおけるルミネッセンス発光の減少（切断パーセント）を、サンプルにおけるトロンビン活性と直接相関づけることが可能となる。

これとは別に、基質は、マイクロウェルやマイクロ粒子等の固定化マトリックスの表面上に固定化される。全血や血漿等のテストサンプルを、アクチベータとともに固定化マトリックスに、連続して、同時に、あるいは実質的に同時に加える。得られる反応混合物を、トロンビンが基質に対して作用できるようにインキュベートし、これによりトロンビン切断されたキレート含有基質フラグメントを放出させ、結合パートナー含有基質フラグメントとトロンビン切断されない非損傷基質を、引き続き固定化マトリックス上に残存させる。

使用するアクチベータのアイデンティティは、決定しようとするパラメーターＰＲ、ＡＰＴＴ、またはＡＣＴに依存する。使用するアクチベータの例としては、トロンボプラスチン、部分トロンボプラスチン試薬（例えばリン脂質）、およびコンタクトアクチベータ（例えば、シリカ、カオリン、セライト、エラグ酸等）などがあるが、これらに限定されない。

未知サンプル中の生体活性トロンビン（すなわち、いかなる阻害剤（例えば抗トロンビン）にも結合しておらず、したがってタンパク質分解作用において活性であるトロンビン）の量は、生体活性トロンビンの標準曲線から、その切断パーセント（全ルミネッセンス強度に対するルミネッセンス強度の減少）によって決定することができる。その後、生体活性トロンビンのレベルは、標準サンプルの群（ｎ≧２０）からの生体活性トロンビンと、未知サンプルからの生体活性トロンビンとの比として表示することができる。この比は、使用されるアクチベータがトロンボプラスチンである場合は、プロトロンビン時間比（ＰＲ）に等しく、使用されるアクチベータが部分トロンボプラスチン試薬（例えばリン脂質）とコンタクトアクチベータ（例えば、シリカ、カオリン、セライト、エラグ酸等）である場合は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）比に等しく、あるいは、使用されるアクチベータがコンタクトアクチベータであって、使用されるサンプルタイプが天然の全血である場合は、活性化凝固時間（ＡＣＴ）比に等しい。

本発明の１つの実施態様では、テストサンプルとアクチベータの添加は、固定化マトリックスへの基質の添加と同時に、または実質的に同時に行われる。
事前に基質を固定化しない１ステップアッセイ法を、図１に概略的に示す。図１については詳細に後述する。

１ステップアッセイ法は、固定化マトリックス上に固定化されたときに当該基質がそれほど切断可能ではないが、液相においてはトロンビンによって切断可能であるときに（すなわち、液相における基質の切断速度論が、結合パートナーの結合速度論より速やかであるか、あるいは少なくとも同等程度に速やかであるときに）、特に有用である。したがって、基質分子とトロンビン分子との間の切断反応と、固定化結合パートナー分子と切断された非損傷基質分子との間の結合反応の両方が、次のインキュベーション工程時に起こる。

本発明の他の実施態様では、テストサンプルの添加は、固定化マトリックスに基質を固定化させた後に行われる。事前に基質を固定化する１ステップアッセイ法を、図２に概略的に示す。図２については詳細に後述する。

このようなアッセイは、単純さ、速さ、およびロバスト性等の多くの利点を有する。しかしながら、この実施態様のための必須条件であると考えられる条件は、基質が固定化マトリックス上に固定化されたときに、基質が切断可能でなければならない、ということである。

その後、固定化されずトロンビン切断されたキレート含有基質フラグメントを洗い落とす。固定化された非損傷基質のルミネッセンス発光を測定し、トロンビン非含有の標準サンプルのルミネッセンスと比較する。サンプルにおけるルミネッセンス強度の減少のパーセント（切断パーセント）は、サンプルにおけるトロンビン活性と直接的に相関する。

本発明の第３の側面は、テストサンプル中の生体活性トロンビンのレベルを測定するための２ステップアッセイ法に関し、該アッセイ法は、
ａ）該サンプルとアクチベータを、液相中にて本発明の基質に加える工程；
ｂ）得られる反応混合物を、トロンビン切断されたキレート含有基質フラグメントを放出するようインキュベートする工程；
ｃ）反応混合物を固定化マトリックスに加える工程；
ｄ）固定化されないトロンビン切断されたキレート含有基質フラグメントと、固定化されないトロンビン切断されない基質が存在する場合は、これらを洗い落とす工程；
ｅ）固定化された非損傷基質からのルミネッセンス発光のレベルを測定する工程；および
ｆ）トロンビン非含有の標準サンプルと比較したときの、ルミネッセンス発光の強度の減少から、トロンビン活性を算出する工程；
を含む。

２ステップアッセイは、当該基質が液相においてのみ機能するときに有利に使用することができる。２ステップアッセイを図３に概略的に示す。図３については詳細に後述する。

本実施態様では、テストサンプル（例えば、血漿や全血）、アクチベータ、および基質を含む反応混合物を液相中にて反応させる。引き続き、該反応混合物の一部または全部を固定化マトリックスに移し、そこでトロンビン切断された基質フラグメントとトロンビン切断されない非損傷トロンビンの固定化が行われる。トロンビン切断されたキレート含有基質フラグメントと固定化されないトロンビン切断されない基質を洗い落とした後、固定化非損傷基質からのルミネッセンスのレベルを上記のように測定する。

１ステップアッセイと２ステップアッセイのどちらのタイプのアッセイを選択するかは、主として、基質、アクチベータ、およびサンプルの固定化マトリックスへ同時に添加を行うことがどの程度困難であるかによって決まる。同時添加が困難であるときは、２ステップアッセイを使用するのが好ましい。同時添加が困難でないときは、１ステップアッセイを使用することができる。さらに、２ステップアッセイは、基質の溶解性が許す限り、利用する基質の量がかなり多くてよいという、１ステップアッセイを凌ぐ利点を有する。

本発明の第４の側面は、サンプル中の生体活性トロンビンのレベルを測定するために、本発明の基質を使用することを提供する。したがって本発明の基質は、トロンビンの優れた特異性を示し、トロンビンによって速やかに切断することができる。したがって、実施するのが簡単で、自動化することができ、そして短時間で信頼性の高い結果をもたらすアッセイにおいて該基質を使用することが可能となる。

第５の側面では、本発明は、
ａ）上記のようなルミネッセンス基質；および
ｂ）固体固定化マトリックス；
を含む、サンプル中の生体活性トロンビンのレベルを測定するためのテストキットを提供する。

本発明の基質が、トロンビンの場合に特異的に採用されるとしても、異なった酵素の場合にも同様に適用することができる。したがって本出願人は、トリ−もしくはテトラ−ペプチド（Ｘ）と本発明のリンカー（Ｚ）との結合を、同様に他の酵素によって簡単に切断することができる、ということを実際に示した。

したがって本発明の基質は、基質の小さな修飾によって（具体的にはペプチドを選択することによって）所望の用途に応用することができる。
例えば、活性型および不活性型のＦＩＩ、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、およびＦＸＩＩ、ならびに、活性型および不活性型の、これらのフラグメントと、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、およびＣ９の組み合わせ等の、種々の凝固因子を測定することができる。ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）、カスパーゼ−１、およびグルタチオンペルオキシダーゼ−１（ＧＰｘ−１）等の酵素も測定することができる。

したがって第６の側面では、本発明は、
一般式：
Ａ−Ｘ−Ｚ−Ａ’
［式中、ＡとＡ’の一方が、ルミネッセンスキレートを含み、そして
ＡとＡ’の他方が、場合によってはスペーサーを含みペプチド結合を介して基質の残りの部分に連結されている、結合対の第１のパートナーを含み；
Ｘは、トリ−ペプチドもしくはテトラ−ペプチドを形成し；
Ｚは、ＮＨ−Ｒ−Ｚ’であり、
ここで、Ｒは、Ｃ_１−６アルキレン、Ｃ_１−６アルキレンオキシ、Ｃ_１−６チオアルキレン、Ｃ_１−６チオアルキレンオキシ、カルボニル−Ｃ_１−６アルキレン、カルボニル−Ｃ_１−６アルキレンオキシ、Ｃ_１−６アルキレン−カルボニル、Ｃ_１−６アルキレンオキシ−カルボニル、Ｃ_１−６アルキレン−アリーレン、Ｃ_１−６アルキレンオキシ−アリーレン、Ｃ_１−６アルキレン−ＮＨ、Ｃ_１−６アルキレンオキシ−ＮＨ、Ｃ_１−６アルキレン−ＮＨＣＯ、Ｃ_１−６アルキレンオキシ−ＮＨＣＯ、Ｃ_１−６アルキレン−ＣＯＮＨ、Ｃ_１−６アルキレンオキシ−ＣＯＮＨ、Ｃ_１−６アルキレン−ＣＯＳ、Ｃ_１−６アルキレンオキシ−ＣＯＳ、Ｃ_１−６アルキレン−ＣＯＮＨ−Ｃ_１−６アルキレン−アリーレン、アリーレン、アリーレン−Ｃ_１−６アルキレン、アリーレン−Ｃ_１−６アルキレンオキシ、Ｒ^１ _ａ−アリーレン−（ＮＨＣＯ−Ｒ^２）_ｂ、Ｒ^３ _ｃ−アリーレン−（ＣＯＮＨ−Ｒ^４）_ｄ、（Ｒ^５−ＣＯＮＨ）_ｅ−アリーレン−Ｒ^６ _ｆ、および（Ｒ^７−ＮＨＣＯ）_ｇ−アリーレン−Ｒ^８ _ｈからなる群から選ばれ、ここで、それぞれの場合における各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、およびＲ^８は、Ｃ_１−６アルキレン、Ｃ_１−６アルキレンオキシ、Ｃ_１−６チオアルキレン、Ｃ_１−６チオアルキレンオキシ、カルボニル−Ｃ_１−６アルキレン、カルボニル−Ｃ_１−６アルキレンオキシ、Ｃ_１−６アルキレン−カルボニル、アリーレン、またはアリーレン−Ｃ_１−６アルキレンから独立して選ばれ、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、およびｈのそれぞれが、０〜６の整数から独立して選ばれ、
ここで、アリーレンは、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ_２、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルコキシ、もしくはＣ_１−６アルコキシカルボニルから選ばれる１つ以上の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されてもよいフェニレン、ビフェニレン、またはナフチレンであって、
Ｚ’は、Ｎ、Ｓ、およびカルボニルのうちの１つを含み、
ここで、Ｚ’がＮを含むとき、Ｚ’は、チオウレア（−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−）、アミノアセトアミド（−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_２−ＮＨ−）、アミド（−ＮＨ−ＣＯ−）、メチルアミド（−ＮＣＨ_３−ＣＯ−）、または置換−トリアジン−ジアミン（−ＮＨ−（Ｒ^９Ｃ_３Ｎ_３）−ＮＨ−）から選択され、
Ｚ’がＳを含むとき、Ｚ’は、チオエーテル（−Ｓ−）、チオアセトアミド（−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＯ−ＮＨ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、（−Ｓ−ＣＯ−ＣＨ_２−ＮＨ−）、または（−Ｓ−（Ｒ^９Ｃ_３Ｎ_３）−ＮＨ−）から選択され、あるいは
Ｚ’がカルボニルを含むとき、Ｚ’は、アミド（−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＯ−ＮＣＨ_３−）またはエステル（−ＣＯ−Ｏ−）から選ばれ、
Ｒ^９は、水素、ハロゲン、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６チオアルキル、Ｃ_１−６アルコキシ、Ｃ_１−６チオアルコキシ、アリールオキシ、およびアミノからなる群から選ばれ、アルキル基、チオアルキル基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、またはアリールオキシ基は、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ_２、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルコキシ、またはＣ_１−６アルコキシカルボニルから選ばれる１つ以上の置換基でモノ置換、ジ置換、またはトリ置換されてもよく、アミノ基は、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ_２、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルコキシ、またはＣ_１−６アルコキシカルボニルから選ばれる１つ以上の置換基でモノ置換またはジ置換されてもよい］
を有する酵素基質を提供する。

以下に、図面を参照しつつ本発明を開示する。
事前に基質を固定化しない１ステップアッセイを図１に示す。使用される基質１は、本発明によれば、４つの部分（（１ａ、１ｂ、１ｃ、および１ｄ）（Ａ−Ｘ−Ｚ−Ａ’））を含む。１ａは結合対の第１のパートナーを表わし、また１ａは場合によってはスペーサーを含み、１ｂはトリペプチドもしくはテトラペプチドを表わし、１ｃはリンカーを表わし、そして１ｄはルミネッセンスキレートを表わす。２は、固定化マトリックス３の表面に結合する結合対の第２のパートナーを表わす。４は、テストサンプル中のトロンビンの存在を表わし（Ａは、高レベルのトロンビンを含有する、Ｂは、低レベルのトロンビンを含有する）、５はトロンビン非含有のテストサンプル（Ｃ）を表わす。

高レベルのトロンビンを示すＡにおいては、基質１がテストサンプル４と反応する。この結果、基質の切断が起こる。切断された基質は２つの部分（第１の部分（１ａ、１ｂ）と第２の部分（１ｃ、１ｄ））を含む。基質の第１の部分（１ａ、１ｂ）は固定化マトリックスに固定化されるが、第２の部分（１ｃ、１ｄ）は洗い落とされる。次いで、固定化された非損傷基質（１ａ、１ｂ）からのルミネッセンス発光を測定し、トロンビン非含有サンプル５（Ｃ）のルミネッセンスと比較する。洗浄工程と測定工程は図１には示されていない。

図１はさらに、低トロンビンレベル場合（Ｂに示す）とトロンビンレベルゼロ（Ｃに示す）の１ステップアッセイを示す。Ｃは対照標準として使用される。
図２は、上記のような１ステップアッセイを示すが、ここではテストサンプル４または５の添加が、本発明の基質１を固定化マトリックス３に固定化した後に行われる。

図３は２ステップアッセイを示す。のステップＩは、基質１がテストサンプル４（トロンビン含有（Ａ））またはテストサンプル５（トロンビン非含有（Ｂ））と反応することを示している。この結果、トロンビン切断された基質が生成するか（Ａ）、また非損傷の基質が生成する（Ｂ）。ステップＩＩでは、該反応混合物の一部または全部が固定化マトリックスに移動され、そこでトロンビン切断された基質フラグメント（１ａ、１ｂ）の固定化（Ａ）と、トロンビン切断されない非損傷トロンビン基質（１ａ、１ｂ、１ｃ、および１ｄ）の固定化（Ｂ）が起こる。トロンビン切断されたキレート含有基質フラグメント（１ｃ、１ｄ）を洗い落とした後、固定化された非損傷基質１からのルミネッセンス発光を、１ステップアッセイの場合と同様に測定する。洗浄工程と測定工程は図３には示されていない。

したがって（Ａ）の場合は、低レベルのキレート（ルミネッセンス／蛍光）が測定され、このことは高レベルのトロンビンが存在することを示している。（Ｂ）の場合は対照的に、高レベルのキレート（ルミネッセンス／蛍光）が測定され、このことはトロンビンが存在しないことを示している。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これら特定の実施例によって本発明が限定されることはない。
以下の実施例に対しては、下記のような材料と計測機器を使用した。

材料
ピアース社からのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン、アクロス社からのｐ−フェニレンジアミン、アルドリッチ社からの（７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ）、およびフルカ社からのＮ−エチルジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）はＲｉｅｄｅｌ−ｄｅ−Ｈａｅｎから購入し、酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＦＡＡ）はフルカ社から購入した。使用したアセトニトリル（ＭｅＣＮ）は、Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒからのＨＰＬＣグレード品であった。ＤＭＦは、Ｌａｂ−Ｓｃａｎから購入し、モレキュラーシーブ（４Å）上で乾燥した。使用した他の薬品は全て、分析グレード品であった。

Ｈ−Ｐｈｅ（Ｄ）−Ｐｉｐ−ＡｒｇはＫＪ Ｒｏｓｓ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ＡｐＳから購入した。Ｎ−末端ビオチン化長鎖ペプチドベースのＤ−ｐｈｅ−Ｌ−Ａｚｅ−Ａｒｇ−ＯＨ（例えば、ビオチン−（Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）_２）_７Ｄ−ｐｈｅ−Ｌ−Ａｚｅ−Ａｒｇ−ＯＨ）はインビトロジェン社から購入した。イノビンはデイド・ベーリング社（シーメンス社）から購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）はシグマ社から購入した。

９−デンテートユーロピウム−キレート（２，２’，２”，２’’’−｛［２−（４−イソチオシアナートフェニル）−エチルアミノ］−ビス（メチレン）ビス｛４−｛［４−（α−ガラクトピラノキシ）フェニル］エチニル｝−ピリジン−６，２−ジイル｝ビス（メチレンニトリロ）｝テトラキス（アセタート）ユーロピウム（ＩＩＩ））、洗浄液、およびストレプトアビジンで被覆された単一カップは、インノトラック・ダイアグノスティクス社（フィンランド）から購入した。

低蛍光１２ウェルのマキシソープマイクロタイトレーションストリップと単一マキシソープマイクロタイトレーションウェル（紫外線クエンチ）はヌンク社（デンマーク）から購入した。

計測機器
質量分析（ＭＳ）は、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸をマトリックスとして使用して、パーセプティブバイオシステムズ社からのＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＰＲＯ（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ）により操作した。アッセイが手操作で行われるときは、Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ社、パーキンエルマーライフサンエンス社からの１４２０マルチラベルカウンター（ビクター）を使用して時間分解蛍光を６１５ｎｍにて測定したが、アッセイが半自動で行われるときは、インノトラック・ダイアグノスティクス社からのＡｉｏイムノアナライザーを使用して時間分解蛍光を６１５ｎｍにて測定した。

実施例１
Ｓ１Ｖ６ｃの合成
Ｓ１Ｖ６ｃの合成は、図４に示すように、Ｈ−Ｐｈｅ（Ｄ）−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ＯＨを含むトリペプチドの使用からスタートして３つの工程を含む。まず、直鎖状のスペーサーを有するビオチン基を、トリペプチドのＮ−末端α−アミノ基に結合させた。次いで、ジアミンリンカー（すなわち４−フェニレンジアミン）を、トリペプチドのＣ−末端カルボキシル基にカップリングさせた。最後に、９−デンテートユーロピウムキレートを、導入されたリンカー分子の芳香族アミノ基とコンジュゲートさせた。

合成手順
ｉ）ビオチン化
Ｈ−Ｐｈｅ（Ｄ）−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ＯＨ（５．０ｍｇ、１１．６μｍｏｌ）をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０、１ｍｌ）中に溶解した。スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（１２．０ｍｇ、１７．３μｍｏｌ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣで精製した。収量：５．５ｍｇ（５４％）。ＭＳ：実測値８８５．６７、計算値８８５．１５。

ｉｉ）ジアミンリンカーのカップリング
ｉ）のビオチン化生成物（２．４ｍｇ、２．７μｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（０．５ｍｌ）中に溶解した。４−フェニレンジアミン（１．２ｍｇ、１０．８４μｍｏｌ）、ＰｙＡＯＰ（１．７ｍｇ、３．３μｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（０．６μｌ、３．３μｍｏｌ）を加え、混合物を室温で一晩撹拌した。ＤＭＦを蒸発除去し、反応混合物を、ＨＰＬＣカラム（Ｔｈｅｒｍｏ ＯＤＳ Ｈｉｐｅｒｓｉｌ、サイズ：１５０×１０ｍｍ）により精製した。Ａ（０．１％ＴＦＡ）とＢ（ＭｅＣＮ）を使用して２０分にて５％Ｂから５０％Ｂまで変えて得られる直線的勾配を使用して、２．５ｍｌ／分の流量にて溶出した。

収量は２．４ｇ（９２％）であった。ＭＳの実測値（９７５．８３）は、ＭＳの計算値（９７５．２８）とよく一致した。
ｉｉｉ）標識化
ｉｉ）から生成物（２．０ｍｇ、２．１μｍｏｌ）を５０ｍＭの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．８、０．５ｍｌ）中に溶解した。９−デンテートユーロピウム−キレート（２，２’，２”，２’’’−｛［２−（４−イソチオシアナートフェニル）−エチルアミノ］−ビス（メチレン）ビス｛４−｛［４−（α−ガラクトピラノキシ）フェニル］エチニル｝−ピリジン−６，２−ジイル｝ビス（メチレンニトリロ）｝テトラキス（アセタート）ユーロピウム（ＩＩＩ））（３．３ｍｇ、２．５μｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を、ＨＰＬＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ１８、サイズ：２５０×１０ｍｍ）により精製した。Ａ（２０ｍＭ ＴＥＡＡ）とＢ（２０ｍＭ ＴＥＡＡ＋５０％ＭｅＣＮ）を使用して３０分にて５％Ｂから１００％Ｂまで変えて得られる直線的勾配を使用して、３ｍｌ／分の流量にて溶出した。収量は１．３ｍｇ（２７％）であった。

実施例２
Ｓ１Ｖ１２ａの合成
Ｓ１Ｖ１２ａの合成は、出発物質がアミノ酸で造られたスペーサー基とビオチン基を既に有するので、２工程のみを含む（図５を参照）。同じジアミンリンカー（すなわち４−フェニレンジアミン）をトリペプチドのＣ−末端カルボキシル基にカップリングさせた後、９−デンテートユーロピウムキレートを、導入されたジアミンリンカー分子の芳香族アミノ基とコンジュゲートさせた。Ｓ１Ｖ１２ａの合成に対して使用した実験条件は、Ｓ１Ｖ６ｃの合成のための関連工程において使用した条件と同じであった。

実施例３
その後のトロンビン測定において使用する３つの異なった参照基準曲線を作成した。
基準曲線Ａは、２００ｎＭの濃度でのＳ１Ｖ６ｃを表わし、基準曲線Ｂは、１０ｎＭの濃度でのＳ１Ｖ９ｂを表わし、基準曲線Ｃは、２５ｍＭの濃度でのＳ１Ｖ９ｂを表わす。基質は、実施例１に記載の条件に従って作製した。

組み換えトロンボプラスチン（イノビン）をアクチベータとして使用した。アッセイ緩衝液は従来のＨＥＰＥＳ緩衝液であった。
０〜１１．９ＩＵ／ｍｌのトロンビン標準濃度を適用した。

アッセイは、２ステップアッセイとして行った。工程Ｉにおいては、基準濃度を有するトロンビンを、異なったトロンビン濃度にて、アクチベータおよび基質とともにアッセイ緩衝液に加えた。試薬を十分に混合し、３７℃で数分インキュベートした。

工程ＩＩにおいては、反応混合物の一部をマイクロウェルに移し、そこで捕捉を行った。基質をマイクロウェルに、３７℃にて約３分にわたって固定化／捕捉してから、洗浄と乾燥を行った。捕捉されなかった基質ならびにキレートを含有する切断基質を洗い落とし、次いでマイクロウェルを乾燥した。最後に、乾燥したマイクロウェルからの蛍光カウント数を、蛍光カウンターを使用して測定した。

検出された蛍光カウント数を、トロンビンを含有しない対照標準サンプルと比較し、基準曲線を作成するために、対照標準（トロンビン非含有）と比較してシグナルの減少を算出した。

図６に示す結果は、Ｓ１Ｖ６ｃとＳ１Ｖ９ｂの濃度を増大させると、シグナルの減少が大きくなるということを示している。このことは、Ｓ１Ｖ６ｃ基質とＳ１Ｖ９ｂ基質が共に、トロンビンに対して極めて有効な基質であるということを示している。Ｓ１Ｖ９ｂは、Ｓ１Ｖ６ｃと比較して、より低いトロンビン濃度ではシグナルの減少がより大きくなる。しかしながらそれでも、どちらの基質も極めて適切なトロンビン基質であり、したがってどちらの基質も、サンプル中のトロンビンのレベルを測定するのに使用することができる。

実施例４
全血での測定に対しては、全血ヘマトクリット値の補正を施すことを条件として、実施例３における基準曲線を適用することができる。検体としての二人の健康な女性からの全血サンプルと血漿サンプルを、本発明に従ってトロンビンに関して試験した。

一人の検体からの血漿サンプルの４回の個別の測定は、８７．７％±０．５％という対照標準シグナルと比較して検出シグナルの減少を示した。もう一人の検体に対しては、減少は９１．５％±０．１％であった。

全血サンプルの場合も、ほぼ同等の結果が得られた（それぞれ、一人の検体に対しては８０．７％±０．９％、もう一人の検体に対しては８６．３％±０．２％）。
これらの結果は、本発明の基質とアッセイが全血サンプルと血漿サンプル中のトロンビンを測定できること、および本発明の基質とアッセイの不変性を示している。

１ 基質
１ａ 結合対の第１のパートナー
１ｂ トリペプチドまたはテトラペプチド
１ｃ リンカー
１ｄ ルミネッセンスキレート
２ 結合対の第２のパートナー
３ 固定化マトリックス
４ トロンビンを含有するテストサンプル
５ トロンビン非含有のテストサンプル
Ａ 高レベルのトロンビンを含有するテストサンプル
Ｂ 低レベルのトロンビンを含有するテストサンプル
Ｃ トロンビン非含有のテストサンプル

Claims (17)

1. トロンビンの基質であって、
   一般式：
   Ａ−Ｘ−Ｚ−Ａ’
   ［式中、
   ＡとＡ’の一方が、ルミネッセンスキレートを含み、そして
   ＡとＡ’の他方が、場合によってはスペーサーを含みペプチド結合を介して基質の残りの部分に連結されている、結合対の第１のパートナーを含み；
   Ｘは、Ｘ’−Ｐｈｅ−Ａｚｅ−Ａｒｇ、Ｘ’−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ、およびＸ’−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇから選ばれるトリ−ペプチドもしくはテトラ−ペプチドを形成し、
   ここで、Ｘ’は、存在しないか又はＬｙｓ、Ａｈｘ、Ｉｌｅ、およびＶａｌから選ばれ；
   Ｚは、ＮＨ−Ｒ−Ｚ’であり、
   ここで、Ｒは、Ｃ_１−６アルキレン−アリーレン、Ｃ_１−６アルキレンオキシ−アリーレン、Ｃ_１−６アルキレン−ＣＯＮＨ−Ｃ_１−６アルキレン−アリーレン、アリーレン、アリーレン−Ｃ_１−６アルキレン、アリーレン−Ｃ_１−６アルキレンオキシ、Ｒ^１ _ａ−アリーレン−（ＮＨＣＯ−Ｒ^２）_ｂ、Ｒ^３ _ｃ−アリーレン−（ＣＯＮＨ−Ｒ^４）_ｄ、（Ｒ^５−ＣＯＮＨ）_ｅ−アリーレン−Ｒ^６ _ｆ、および（Ｒ^７−ＮＨＣＯ）_ｇ−アリーレン−Ｒ^８ _ｈからなる群から選ばれ、ここで、それぞれの場合における各Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、およびＲ^８は、Ｃ_１−６アルキレン、Ｃ_１−６アルキレンオキシ、Ｃ_１−６チオアルキレン、Ｃ_１−６チオアルキレンオキシ、カルボニル−Ｃ_１−６アルキレン、カルボニル−Ｃ_１−６アルキレンオキシ、Ｃ_１−６アルキレン−カルボニル、アリーレン、またはアリーレン−Ｃ_１−６アルキレンから独立して選ばれ、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、およびｈのそれぞれが、０〜６の整数から独立して選ばれ、
   ここで、アリーレンは、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ_２、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルコキシ、もしくはＣ_１−６アルコキシカルボニルから選ばれる１つ以上の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されてもよいフェニレン、ビフェニレン、またはナフチレンであって、
   Ｚ’は、Ｎ、Ｓ、およびカルボニルのうちの１つを含み、
   ここで、Ｚ’がＮを含むとき、Ｚ’は、チオウレア（−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−）、アミノアセトアミド（−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_２−ＮＨ−）、アミド（−ＮＨ−ＣＯ−）、メチルアミド（−ＮＣＨ_３−ＣＯ−）、または置換−トリアジン−ジアミン（−ＮＨ−（Ｒ^９Ｃ_３Ｎ_３）−ＮＨ−）から選択され、
   Ｚ’がＳを含むとき、Ｚ’は、チオエーテル（−Ｓ−）、チオアセトアミド（−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＯ−ＮＨ−）、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、（−Ｓ−ＣＯ−ＣＨ_２−ＮＨ−）、または（−Ｓ−（Ｒ^９Ｃ_３Ｎ_３）−ＮＨ−）から選択され、あるいは
   Ｚ’がカルボニルを含むとき、Ｚ’は、アミド（−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＯ−ＮＣＨ_３−）またはエステル（−ＣＯ−Ｏ−）から選ばれ、
   ここで、Ｒ^９は、水素、ハロゲン、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６チオアルキル、Ｃ_１−６アルコキシ、Ｃ_１−６チオアルコキシ、アリールオキシ、およびアミノからなる群から選ばれ、アルキル基、チオアルキル基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、またはアリールオキシ基は、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ_２、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルコキシ、またはＣ_１−６アルコキシカルボニルから選ばれる１つ以上の置換基でモノ置換、ジ置換、またはトリ置換されてもよく、アミノ基は、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ_２、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルコキシ、またはＣ_１−６アルコキシカルボニルから選ばれる１つ以上の置換基でモノ置換またはジ置換されてもよい］
   を有する、上記基質。
2. Ｘが、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−２−Ａｚｅ−Ｌ−ＡｒｇまたはＤ−Ｐｈｅ−Ｌ−２−Ｐｉｐ−Ｌ−Ａｒｇである、請求項１に記載の基質。
3. Ｚ’がＮであり、Ｒがアリーレン、Ｃ_１−６アルキレン−アリーレン、またはＲ^１ _ａ−アリーレン−（ＮＨＣＯ−Ｒ^２）_ｂであって、ａとｂが０、１、または２である、請求項１または２に記載の基質。
4. 前記ルミネッセンスキレートが、蛍光ランタニドキレートである、請求項１〜３のいずれかに記載の基質。
5. 前記ランタニドキレートが、
   

   

   と
   

   

   から選ばれる、請求項４に記載の基質。
6. 前記結合対の第１のパートナーが、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／アビジン、ビオチン／ビオチン受容体ペプチド、およびストレプトアビジン誘導体／受容体ペプチドから選ばれる結合対のパートナーである、請求項１〜５のいずれかに記載の基質。
7. 前記結合対の第１のパートナーが、式ＮＨ−Ｒ^１０−ＣＯＮＨ−Ｒ^１１−ＣＯ−（ＮＨ−Ｒ^１２−ＮＨ）_ｉ［式中、Ｒ^１０、Ｒ^１１、およびＲ^１２のそれぞれは、Ｃ_１−６アルキレン、Ｃ_１−６アルキレンオキシ、Ｃ_１−６チオアルキレン、Ｃ_１−６チオアルキレンオキシ、カルボニル−Ｃ_１−６アルキレン、カルボニル−Ｃ_１−６アルキレンオキシ、Ｃ_１−６アルキレン−カルボニル、アリーレン、またはアリーレン−Ｃ_１−６アルキレンから独立して選ばれ、アリーレンは、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ_２、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルコキシ、またはＣ_１−６アルコキシカルボニルから選ばれる１つ以上の置換基でモノ置換、ジ置換、もしくはトリ置換されてもよいフェニレン、ビフェニレン、またはナフチレンであり、ｉは０〜６の整数である］のスペーサー、あるいはＷ−ｍｅｒペプチドであって、Ｗが１〜４０の整数であるスペーサーを介して基質の残部に連結されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の基質。
8. Ｒ^１０、Ｒ^１１、およびＲ^１２が、同一もしくは異なった、直鎖Ｃ_１−６アルキレン、アリーレン、またはアリーレン−Ｃ_１−６アルキレンであり、ｉが０または１である、請求項７に記載の基質。
9. Ｓ１Ｖ６（ａ、ｂ、ｃ）、Ｓ１Ｖ８、Ｓ１Ｖ９（ａ、ｂ）、およびＳ１Ｖ１２（ａ、ｂ、ｃ）：
   

   

   

   

   

   

   

   

   

   

   から選ばれる、請求項１〜８のいずれかに記載の基質。
10. テストサンプル中の生体活性トロンビンのレベルを測定するための１ステップアッセイ法であって、
    ａ）請求項１〜９のいずれかに記載の基質、アクチベータ、およびテストサンプルを、連続して、同時に、または実質的に同時に混合する工程；
    ｂ）得られる反応混合物を、トロンビン切断されたキレート含有基質フラグメントを放出するようインキュベートし、結合パートナー含有基質フラグメントとトロンビン切断されない非損傷基質を固定化マトリックス上に固定化する工程；
    ｃ）固定化されずトロンビン切断されたキレート含有基質フラグメントと、固定化されずトロンビン切断されない基質が存在する場合は、これらを洗い落とす工程；
    ｄ）固定化された非損傷基質からのルミネッセンス発光のレベルを測定する工程；および
    ｅ）トロンビン非含有の標準サンプルと比較したときの、ルミネッセンス発光の強度の減少から、トロンビン活性を算出する工程；
    を含む、上記アッセイ法。
11. 前記サンプルとアクチベータの添加が、固定化マトリックスへの基質の添加と同時に、もしくは実質的に同時に行われる、請求項１０に記載のアッセイ法。
12. 前記サンプルとアクチベータの添加が、固定化マトリックスへの基質の固定化後に行われる、請求項１０に記載のアッセイ法。
13. テストサンプル中の生体活性トロンビンのレベルを測定するための２ステップアッセイ法であって、
    ａ）テストサンプルとアクチベータを、液相中にて、請求項１〜９のいずれかに記載の基質に加える工程；
    ｂ）得られる反応混合物を、トロンビン切断されたキレート含有基質フラグメントを放出するようインキュベートする工程；
    ｃ）反応混合物を固定化マトリックスに加える工程；
    ｄ）固定化されずトロンビン切断されたキレート含有基質フラグメントと、固定化されずトロンビン切断されない基質が存在する場合は、これらを洗い落とす工程；
    ｅ）固定化された非損傷基質からのルミネッセンス発光のレベルを測定する工程；および
    ｆ）トロンビン非含有の標準サンプルと比較したときの、ルミネッセンス発光の強度の減少から、トロンビン活性を算出する工程；
    を含む、上記アッセイ法。
14. 前記アクチベータが、トロンボプラスチン試薬、部分トロンボプラスチン試薬、およびコンタクトアクチベータからなる群から選ばれる、請求項１０〜１３のいずれかに記載のアッセイ法。
15. 前記部分トロンボプラスチン試薬がリン脂質を含み、前記コンタクトアクチベータが、シリカ、カオリン、セライト、エラグ酸を含む、請求項１４に記載のアッセイ法。
16. サンプル中の生体活性トロンビンのレベルを測定するための、請求項１〜９のいずれかに記載の基質の使用。
17. ａ）請求項１〜９のいずれかに記載の発光基質；および
    ｂ）固体の固定化マトリックス；
    を含む、サンプル中の生体活性トロンビンのレベルを測定するためのテストキット。

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