JP5871487B2 - 酵素反応を測定するための均質な活性試験 - Google Patents
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Description
別途記載しない限り、全ての試薬はSigma−Aldrich社(米国ミズーリ州セントルイス)から入手した。
以下のFSAP感受性ペプチドは、標準Fmocペプチド合成方法によって調製した:
1.アルギニン、プロリン、アルギニン、フェニルアラニン及びリシンの順序の配列のアミノ酸残基でビオチンに結合し、C末端リシン残基上にビオチンを有するペンタペプチド(ペプチドI);
2.イソロイシン、プロリン、アルギニン及びリシンの順序の配列のアミノ酸残基でビオチンに結合し、C末端リシン残基上にビオチンを有するテトラペプチド(ペプチドII);
3.N末端リシン残基とビオチンとの間に12エチレングリコール単位(PEG12スペーサー)のポリエチレングリコールを有する、1又は2のペプチド(1によるペプチドIII及び2によるペプチドIV)。
本明細書で使用したシグナル形成系は、公知のLOCI(登録商標)技術(発光酸素チャネリングアッセイ、欧州特許出願公開(EP−A1)第0515194号明細書をも参照されたい)に基づいている。本系は、感光剤及び化学発光物質を含んでいる。感光剤の光線による励起は、化学発光物質を活性化し得る短寿命一重項酸素の生成を誘発し、これにより発光シグナルが放出される。
シグナル形成系の第1成分は、以下では「ケミビーズ」と称する。ケミビーズは、粒子状ラテックス固相と結び付けられた化学発光物質を含んでいる。ケミビーズは、ハイブリドーマ細胞系DSM ACC2453(欧州特許出願公開(EP−A1)第1650305号明細書を参照されたい)から形成されるモノクローナル抗FSAP抗体(Siemens Healthcare Diagnostics Products社、MAk番号1102−677(26))と、以下の方法によって、接合させた:抗体は、Sephadex(登録商標)G−25カラム内の300mMのNaCl、0.05%のTween(登録商標)20、10mMリン酸緩衝液(pH 7.0)中で緩衝し、20mg/mLに濃縮した。4mgの抗体を、25mg/mLのNaCNBH3を添加して20mgのケミビーズに共有結合させた。インキュベーション工程及びまだ遊離している反応物質のブロッキング後に、抗体と接合したケミビーズを透析濾過によって精製し、次に50mMのHEPES、300mMのNaCl、1mMのEDTA、0.1%のTriton(登録商標)X−405、1mg/mLのBSA、0.15%のPROCLIN(登録商標)300、0.1mg/mLの硫酸ネオマイシン(pH8.0)中に採取した。
シグナル形成系の第2成分は、以下では「センシビーズ」と称する。センシビーズは、感光剤(トリヘキシル)シリコーン−t−ブチルフタロシアニンを含んでいるが、このものは、粒子状ラテックス固相と結び付けられ、その後に、ストレプトアビジンで被覆される。
二本鎖FSAP(tc−FSAP)は、Kannemeierら(Kannemeier, C.ら(2001)Factor VII and single−chain plasminogen activator−activating protease: activation and autoactivation of the proenzyme. Eur. J. Biochem. 268(13):3789−3796)に記述されているように調製した。
FSAP活性を測定するための本発明による方法
上述したFSAP感受性ペプチドI〜IVを、蒸留水中に2mg/mLの濃度で溶解し(濃縮液)、試験のために試験バッファー(25mMのHEPES、140mMのNaCl、10mMのCaCl2、1%のTween(登録商標)20、1%のBSA及び1%のデキストランT−500(pH6.3))中に、およそ20μg/mLに希釈した。試験バッファー中で、ケミビーズを200μg/mLに、そして、センシビーズを400μg/mLに希釈した。
120μLの試験バッファーを10μLの抗FSAPケミビーズ、試験バッファー(10μg/mL)中の10μLの精製tc−FSAP、10μLのビオチン化ペプチド基質及び10μLのセンシビーズと混合し、DIMENSION VISTA(登録商標)反応キュベット(Siemens Healthcare Diagnostics Products社、独国マールブルク(Marburg,Germany))内で10分間に亘り37℃でインキュベートした。この後に、反応混合物の化学発光(以下ではLOCI(登録商標)シグナルとも呼ぶ)の動力学的測定を、30分間に亘り、市販で入手可能なDIMENSION VISTA(登録商標)LOCI(登録商標)測定ユニット(Siemens Healthcare Diagnostics Products社)内で、実施した。各測定点について、反応混合物を200msに亘り波長680nmの光線で照射し、生じたLOCI(登録商標)シグナルを1,000msに亘り612nmで測定した。
酵素活性の阻害剤を測定するための本発明による方法
酵素の比活性の測定は、活性調節剤の存在の可能性についての情報を提供することもできる。しかし、本発明による方法は、更にまた、影響の定量化及び従って活性調節剤の定量的測定も可能にする。これを、以下に、FSAPの阻害剤であるアプロチニンの例について示す。シグナル又はその経過は、阻害剤の濃度の関数として変動する。酵素−阻害剤相互作用の動力学は、阻害剤の量の関数として酵素活性を測定することによって調査した。tc−FSAP阻害アッセイにおいては、酵素−阻害剤錯体の形成を可能にするために、一定量の酵素(tc−FSAP、μg/mL)を、阻害剤(ウシ肺由来アプロチニン、Fluka社)濃度を変えて、プレインキュベートした。また別のアッセイは、プレインキュベーションを行なわずに実施した。残留プロテアーゼ活性は、実施例1に記載したように、ペプチド基質を加えた後に測定した。
120μLの試験バッファー(pH6.3)、10μLの抗FSAPケミビーズ(試験バッファー中、200μg/mL)及び10μLの精製tc−FSAP(10μg/mL)を、それぞれ、0、4.7及び47.2U/mLのアプロチニンを含む10μLの試験バッファーと、DIMENSION VISTA(登録商標)LOCI(登録商標)反応キュベット内で混合した。10μLのビオチン化ペプチド基質及び10μLのセンシビーズ(試験バッファー中の400μg/mL)の試験バッファー中への添加は、プレインキュベーションを行なわずに、又は37℃での10分間のプレインキュベーション後に実施した。生じたLOCI(登録商標)シグナルは、市販のDIMENSION VISTA(登録商標)LOCI(登録商標)測定ユニット(Siemens Healthcare Diagnostics Products社)において、680nmでの200msの照射及び612nmでの測定時間1,000msを用いて、動力学的に、37℃で15分間に亘って、測定した。アプロチニンは、強度のシグナル低減作用を、主として、tc−FSAPを用いたプレインキュベーション後に示す(表5)。
Claims (9)
- 試料中の血液凝固因子の阻害剤の測定方法であって、以下の工程(a)及び(b)を備えてなる方法。
(a)下記を含有する反応混合物の調製及びインキュベーション。;
(i)前記試料、
(ii)前記反応混合物に加えられる別個の試薬中に含有される活性化された血液凝固因子であって、その活性が測定対象の前記阻害剤によって直接的又は間接的に影響され得る活性化された血液凝固因子の規定量、
(iii)前記添加された活性化された血液凝固因子によって結合され及び修飾され得る基質、及び
(iv)シグナル形成系の第1及び第2成分であって、前記シグナル形成系の前記第1成分が前記基質と結び付けられているか又は結び付けられるようになり、前記シグナル形成系の前記第2成分が前記添加された活性化された血液凝固因子と結び付けられており、前記シグナル形成系が、前記シグナル形成系の前記第1及び第2成分が、前記活性化された血液凝固因子と前記基質との結合によって、相互に空間的に近づけられたときのみに検出可能なシグナルが生成されるようなシグナル形成系である、前記シグナル形成系の第1及び第2成分、並びに
(b)前記試料中の前記阻害剤の活性と相関している前記シグナルの測定。 - ヘパリン、アルガトロバン、メラガトラン、キシメラガトラン、ビバリルジン、ダビガトラン、リバロキサバン及びヒルジンを含む群からの血液凝固因子の阻害剤を測定するための請求項1に記載の方法。
- 前記基質が第1結合対A/Bの第1結合パートナーAを有し、前記シグナル形成系の前記第1成分が前記結合対A/Bの第2結合パートナーBを有し、前記第1結合パートナーA及びBの結合によって、前記基質が前記シグナル形成系の前記第1成分に結合されているか又はインキュベーション中に結合されるようになる、請求項1に記載の方法。
- 前記結合パートナーA及びBが、それらが結合対A/Bを形成するように、FLAGタグ/抗FLAGタグ抗体、HISタグ/抗HISタグ抗体、フルオレセイン/抗フルオレセイン抗体、ビオチン/アビジン及びビオチン/ストレプトアビジンを含む群から選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記測定対象の活性化された血液凝固因子が第2結合対X/Yの第1結合パートナーXを有し、前記第2結合対X/Yの第2結合パートナーYが前記シグナル形成系の前記第2成分と結び付けられ、前記活性化された血液凝固因子が、前記結合パートナーX及びYの結合によって、前記シグナル形成系の前記第2成分に結合される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記結合パートナーX及びYが、Xが活性化された血液凝固因子特異的な構造又は配列エピトープであり、Yが前記活性化された血液凝固因子特異的な構造又は配列エピトープに対する特異性を備える抗体又は抗体フラグメントであるように、選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記シグナル形成系の前記第1成分が第1粒子状固相と結び付けられ、前記シグナル形成系の前記第2成分が第2粒子状固相と結び付けられる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記シグナル形成系の前記第1成分が化学発光物質であり前記シグナル形成系の前記第2成分が感光剤であるか、又はその逆である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 血液凝固因子IIa又はXaの阻害剤を決定するための請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
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