JPH0933523A - 活性化因子の定量方法 - Google Patents
活性化因子の定量方法Info
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- JPH0933523A JPH0933523A JP19263896A JP19263896A JPH0933523A JP H0933523 A JPH0933523 A JP H0933523A JP 19263896 A JP19263896 A JP 19263896A JP 19263896 A JP19263896 A JP 19263896A JP H0933523 A JPH0933523 A JP H0933523A
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＰＰＳＢのような因子濃縮物すなわち活性化
および非活性化因子の混合物中の単一因子（活性化凝固
プロテアーゼ）の選択的定量のための高感度な方法。 【解決手段】 サンプル中の活性化酵素を検出および定
量するための不均一免疫化学的方法において、以下の工
程： ａ）活性化状態の酵素に特異的な第一の結合パートナー
とサンプルのインキュベーション、および ｂ）酵素／結合パートナー複合体を、活性化状態の酵素
に特異的な第一の結合パートナーと特異的に反応し、シ
グナル産生標識が直接的または間接的に付与されている
第二の特異的結合パートナーと反応させることによる、
酵素／結合パートナー複合体の形成の検出、を包含する
方法。
および非活性化因子の混合物中の単一因子（活性化凝固
プロテアーゼ）の選択的定量のための高感度な方法。 【解決手段】 サンプル中の活性化酵素を検出および定
量するための不均一免疫化学的方法において、以下の工
程： ａ）活性化状態の酵素に特異的な第一の結合パートナー
とサンプルのインキュベーション、および ｂ）酵素／結合パートナー複合体を、活性化状態の酵素
に特異的な第一の結合パートナーと特異的に反応し、シ
グナル産生標識が直接的または間接的に付与されている
第二の特異的結合パートナーと反応させることによる、
酵素／結合パートナー複合体の形成の検出、を包含する
方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、たとえばＰＰＳＢ
のような因子濃縮物、すなわち活性化および非活性化因
子の混合物中の単一因子（活性化凝固プロテアーゼ）を
選択的に定量するための高感度な方法に関する。
のような因子濃縮物、すなわち活性化および非活性化因
子の混合物中の単一因子（活性化凝固プロテアーゼ）を
選択的に定量するための高感度な方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】血漿タンパク質または血液細胞の先天的
および後天的欠損は現在、血漿プールによって精製され
た血漿、血球濃縮物ならびにタンパク質および因子濃縮
物の注入によって置換されている。単一ドナー試験なら
びに適当なウイルス排除および不活性化方法によって最
小限には抑えられているウイルス伝播の潜在的な危険に
加えて、望ましくない反応、たとえば、血圧降下および
血栓形成または出血促進作用が観察されている。これら
の副作用はいわゆる活性化因子の存在が原因となって起
こることがある。これらの製品が可能な限り穏和な条件
下で精製され、適当な品質検査および許可基準に従って
いるとしても、上述の副作用が個々の症例で報告されて
きた。過去のデータを振り返って見ると、分析結果はこ
れらの製品中に活性化因子の存在が疑われることを確認
している場合が多い。
および後天的欠損は現在、血漿プールによって精製され
た血漿、血球濃縮物ならびにタンパク質および因子濃縮
物の注入によって置換されている。単一ドナー試験なら
びに適当なウイルス排除および不活性化方法によって最
小限には抑えられているウイルス伝播の潜在的な危険に
加えて、望ましくない反応、たとえば、血圧降下および
血栓形成または出血促進作用が観察されている。これら
の副作用はいわゆる活性化因子の存在が原因となって起
こることがある。これらの製品が可能な限り穏和な条件
下で精製され、適当な品質検査および許可基準に従って
いるとしても、上述の副作用が個々の症例で報告されて
きた。過去のデータを振り返って見ると、分析結果はこ
れらの製品中に活性化因子の存在が疑われることを確認
している場合が多い。
【０００３】血漿から調製された濃縮物は、その製品の
有効性および安全性には通常顕著な影響は与えない他の
血漿タンパク質の痕跡を含有する場合がある。これらの
タンパク質、すなわち酵素／プロテアーゼが活性化され
た状態で存在する場合には、これが適用後の患者に致命
的な結果を招来することも考えられる。活性化された型
のプロトロンビン、すなわちトロンビンに加えて、活性
化された凝固因子VII、IX、Ｘ、XI、XII、またはプレカ
リクレインもしくはプロテインＣ（ＦVIIａ、ＦIXａ、
ＦＸａ、ＦXIａ、ＦXIIａ、カリクレイン、ＡＰＣ）あ
るいは補体系の痕跡も存在する可能性がある。しかしな
がら、精製されたタンパク質自体、それらが血漿もしく
は他の原料からの慣用の沈殿もしくはクロマトグラフィ
ー法でまたは組換え技術で調製されたかに関係なく、部
分的に活性化されている可能性もある。同様に重要なこ
とは、これらの活性化された因子の検出である。これら
がすでに微量濃度で活性であり、インビボ作用の誘導ま
たは増強を生じる可能性があるという事実から可能な限
り高感度で特異的な試験が要求されている。
有効性および安全性には通常顕著な影響は与えない他の
血漿タンパク質の痕跡を含有する場合がある。これらの
タンパク質、すなわち酵素／プロテアーゼが活性化され
た状態で存在する場合には、これが適用後の患者に致命
的な結果を招来することも考えられる。活性化された型
のプロトロンビン、すなわちトロンビンに加えて、活性
化された凝固因子VII、IX、Ｘ、XI、XII、またはプレカ
リクレインもしくはプロテインＣ（ＦVIIａ、ＦIXａ、
ＦＸａ、ＦXIａ、ＦXIIａ、カリクレイン、ＡＰＣ）あ
るいは補体系の痕跡も存在する可能性がある。しかしな
がら、精製されたタンパク質自体、それらが血漿もしく
は他の原料からの慣用の沈殿もしくはクロマトグラフィ
ー法でまたは組換え技術で調製されたかに関係なく、部
分的に活性化されている可能性もある。同様に重要なこ
とは、これらの活性化された因子の検出である。これら
がすでに微量濃度で活性であり、インビボ作用の誘導ま
たは増強を生じる可能性があるという事実から可能な限
り高感度で特異的な試験が要求されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】現在用いられている方
法は、たとえばこれらの因子の酵素／タンパク分解活性
を記録するものであり、したがって、それらの酵素前駆
体は不活性である。これらの活性は、通常、色素原基
質、たとえばｐ−ニトロフェニルアニリドのアミド分解
遊離、または光学的に記録され評価される蛍光原基の補
助によって記録することが試みられている。これらの基
質は特定のプロテアーゼまたは活性化因子に至適化され
てはいるものの、他のプロテアーゼによっても多かれ少
なかれ、ある程度は切断される。これが、複合タンパク
質（プロテアーゼ）混合物、たとえばプロトロンビン複
合体濃縮物中の単一成分−すなわち多少とも「有害な」
活性−の識別および定量が困難な理由である。それはト
ロンビン＋／−ヒルジンの場合のように、特異的活性を
消失させることができる高度に特異的なインヒビターの
存在下に比較試験が行われる場合にのみ可能になる。こ
れは、他のプロテアーゼの場合には、利用可能なインヒ
ビターがきわめて強力ではあっても十分に特異的ではな
いことから、現在まで可能にはなっていない。
法は、たとえばこれらの因子の酵素／タンパク分解活性
を記録するものであり、したがって、それらの酵素前駆
体は不活性である。これらの活性は、通常、色素原基
質、たとえばｐ−ニトロフェニルアニリドのアミド分解
遊離、または光学的に記録され評価される蛍光原基の補
助によって記録することが試みられている。これらの基
質は特定のプロテアーゼまたは活性化因子に至適化され
てはいるものの、他のプロテアーゼによっても多かれ少
なかれ、ある程度は切断される。これが、複合タンパク
質（プロテアーゼ）混合物、たとえばプロトロンビン複
合体濃縮物中の単一成分−すなわち多少とも「有害な」
活性−の識別および定量が困難な理由である。それはト
ロンビン＋／−ヒルジンの場合のように、特異的活性を
消失させることができる高度に特異的なインヒビターの
存在下に比較試験が行われる場合にのみ可能になる。こ
れは、他のプロテアーゼの場合には、利用可能なインヒ
ビターがきわめて強力ではあっても十分に特異的ではな
いことから、現在まで可能にはなっていない。
【０００５】免疫化学的検出系、たとえばＲＩＡ、ＥＬ
ＩＳＡ等は、きわめて選択性の高い高感度な方法であ
る。活性化されたプロテアーゼを特異的に定量できるこ
のような試験系があれば適当であろう。しかしながら、
一方では、活性化された型の因子を排他的に認識する抗
体を得ることは困難である場合が多く、また多くの場合
その実施はこれまで成功していない。しかしながら、こ
れは、酵素前駆体と活性化型の混合物が存在することか
ら、上述の製品のために必須である。他方では、存在す
るプロテアーゼインヒビター複合体が、遊離の生物学的
活性型の定量結果を誤らせることがないように、それら
が同時に測定されるものであってはならない。これらの
複合体は、タンパク質の精製の際にもしくは検討の上で
添加されたインヒビターによって形成される。すなわ
ち、その目的は、これらの活性因子／プロテアーゼ、と
くに因子ＦVIIａ、ＦIXａ、ＦＸａ、ＦXIａ、ＦXIIａ、
カリクレインおよびＡＰＣならびに補体系のプロテアー
ゼを定量するのに適当なアッセイ系を提供することにあ
る。液相における均一アッセイ法は、トロンビン／抗ト
ロンビンIII複合体を用いた凝固生成物中の遊離トロン
ビンの定量について記載がある（Foehlerら、Thromb. R
es. 1990，60：63-70）。
ＩＳＡ等は、きわめて選択性の高い高感度な方法であ
る。活性化されたプロテアーゼを特異的に定量できるこ
のような試験系があれば適当であろう。しかしながら、
一方では、活性化された型の因子を排他的に認識する抗
体を得ることは困難である場合が多く、また多くの場合
その実施はこれまで成功していない。しかしながら、こ
れは、酵素前駆体と活性化型の混合物が存在することか
ら、上述の製品のために必須である。他方では、存在す
るプロテアーゼインヒビター複合体が、遊離の生物学的
活性型の定量結果を誤らせることがないように、それら
が同時に測定されるものであってはならない。これらの
複合体は、タンパク質の精製の際にもしくは検討の上で
添加されたインヒビターによって形成される。すなわ
ち、その目的は、これらの活性因子／プロテアーゼ、と
くに因子ＦVIIａ、ＦIXａ、ＦＸａ、ＦXIａ、ＦXIIａ、
カリクレインおよびＡＰＣならびに補体系のプロテアー
ゼを定量するのに適当なアッセイ系を提供することにあ
る。液相における均一アッセイ法は、トロンビン／抗ト
ロンビンIII複合体を用いた凝固生成物中の遊離トロン
ビンの定量について記載がある（Foehlerら、Thromb. R
es. 1990，60：63-70）。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明においては、製品
または濃縮物を、抗体が結合できる酵素／プロテアーゼ
結合パートナー好ましくはインヒビターによって処理
し、混合物を必要に応じてインキュベートし、発生した
酵素／プロテアーゼ−インヒビター複合体を固相ＥＬＩ
ＳＡ（固相酵素免疫測定法）によって定量する。
または濃縮物を、抗体が結合できる酵素／プロテアーゼ
結合パートナー好ましくはインヒビターによって処理
し、混合物を必要に応じてインキュベートし、発生した
酵素／プロテアーゼ−インヒビター複合体を固相ＥＬＩ
ＳＡ（固相酵素免疫測定法）によって定量する。
【０００７】
【発明の実施の形態】適当なプロテアーゼインヒビター
は既知の結合パートナー、たとえば抗トロンビンIII
（ＡＴIII）、α２−マクログロブリン、α１−抗トリ
プシン、α２−抗プラスミン、インターα−トリプシン
インヒビター、Ｃ１−インヒビター、プロテインＣイン
ヒビター等であり、所望によりヘパリンの存在下におけ
るＡＴIIIおよびα１−抗トリプシンが好ましい。ＡＴI
IIは活性化された因子と様々な親和性／速度で反応して
複合体を形成する凝固系の最も重要な生理学的レギュレ
ーター／インヒビターである。たとえば、トロンビンと
の反応は比較的速やかに進行し、よく知られているよう
にヘパリンで加速されるが、たとえばＦVIIａとの相互
作用は室温もしくは３７℃ではきわめて徐々にしか進行
せず、またＦVIIａがトロンボプラスチンとの複合体と
して存在する場合にのみ進行する。他の可能性は Godal
ら（Thromb. Res. 1974，5：773-775）により記載され
ていて、ＦVIIａをＡＴIII／ヘパリンと数時間冷却条件
下にインキュベートすると、ついで残留する凝固促進Ｆ
VIIａを適当な活性アッセイによって定量できるとい
う。
は既知の結合パートナー、たとえば抗トロンビンIII
（ＡＴIII）、α２−マクログロブリン、α１−抗トリ
プシン、α２−抗プラスミン、インターα−トリプシン
インヒビター、Ｃ１−インヒビター、プロテインＣイン
ヒビター等であり、所望によりヘパリンの存在下におけ
るＡＴIIIおよびα１−抗トリプシンが好ましい。ＡＴI
IIは活性化された因子と様々な親和性／速度で反応して
複合体を形成する凝固系の最も重要な生理学的レギュレ
ーター／インヒビターである。たとえば、トロンビンと
の反応は比較的速やかに進行し、よく知られているよう
にヘパリンで加速されるが、たとえばＦVIIａとの相互
作用は室温もしくは３７℃ではきわめて徐々にしか進行
せず、またＦVIIａがトロンボプラスチンとの複合体と
して存在する場合にのみ進行する。他の可能性は Godal
ら（Thromb. Res. 1974，5：773-775）により記載され
ていて、ＦVIIａをＡＴIII／ヘパリンと数時間冷却条件
下にインキュベートすると、ついで残留する凝固促進Ｆ
VIIａを適当な活性アッセイによって定量できるとい
う。
【０００８】これに対し、形成されたプロテアーゼイン
ヒビター複合体を免疫学的アッセイを用いて定量する
と、特異性および感度が増大する。したがってポリクロ
ーナル（Ｐａｂ）もしくはモノクローナル（Ｍａｂ）抗
体またはそれらのＦ（ａｂ′）もしくはＦ（ａｂ）フラ
グメント、好ましくは、モノクローナルａｂまたはその
Ｆａｂを既知の方法で固相にカップリングまたは吸着さ
せ、これと標準またはサンプル溶液をインキュベート
し、固相を洗浄し、ついで、結合した複合体を複合体パ
ートナー（プロテアーゼまたはインヒビター）に対する
ポリクローナルまたはモノクローナルａｂまたはＦａｂ
とインキュベートする。このａｂは酵素たとえばＰＯＤ
と接合する。適当な酵素基質の添加後、基質の転換率を
測定し、結合した複合体の濃度を標準曲線を用いて決定
する。それから製品中に遊離型で存在するプロテアーゼ
の濃度は計算することができる。
ヒビター複合体を免疫学的アッセイを用いて定量する
と、特異性および感度が増大する。したがってポリクロ
ーナル（Ｐａｂ）もしくはモノクローナル（Ｍａｂ）抗
体またはそれらのＦ（ａｂ′）もしくはＦ（ａｂ）フラ
グメント、好ましくは、モノクローナルａｂまたはその
Ｆａｂを既知の方法で固相にカップリングまたは吸着さ
せ、これと標準またはサンプル溶液をインキュベート
し、固相を洗浄し、ついで、結合した複合体を複合体パ
ートナー（プロテアーゼまたはインヒビター）に対する
ポリクローナルまたはモノクローナルａｂまたはＦａｂ
とインキュベートする。このａｂは酵素たとえばＰＯＤ
と接合する。適当な酵素基質の添加後、基質の転換率を
測定し、結合した複合体の濃度を標準曲線を用いて決定
する。それから製品中に遊離型で存在するプロテアーゼ
の濃度は計算することができる。
【０００９】プロテアーゼインヒビター複合体の限られ
た量が（たとえば調製上の理由で）適当に高濃度の（遊
離プロテアーゼを完全に複合体に転換する）インヒビタ
ーの添加に先立って既に存在する場合には、対照値（さ
らにインヒビターを添加していない製品希釈物）をサン
プル値から差し引くと、遊離の活性化プロテアーゼの濃
度が計算される。
た量が（たとえば調製上の理由で）適当に高濃度の（遊
離プロテアーゼを完全に複合体に転換する）インヒビタ
ーの添加に先立って既に存在する場合には、対照値（さ
らにインヒビターを添加していない製品希釈物）をサン
プル値から差し引くと、遊離の活性化プロテアーゼの濃
度が計算される。
【００１０】好ましい実施態様（Ａ）においては、イン
ヒビターを、固相に直接カップリングさせるかまたは固
相にカップリングしている抗体（インヒビターに対す
る）を用いて固相に結合させるために既知の方法を使用
し、溶液中の遊離プロテアーゼに露出させる。インキュ
ベーションおよびこの時点で固定化されたインヒビター
プロテアーゼ複合体の形成後に、固相を洗浄し、プロテ
アーゼまたは複合体のネオエピトープに対する適当な
（接合）抗体（またはこれらの抗体に対する接合抗体）
によって複合体が検出される。必要に応じて検出用の抗
体／Ｆａｂは、固相のサンプル溶液とのインキュベート
時に、既に存在させてもよい。
ヒビターを、固相に直接カップリングさせるかまたは固
相にカップリングしている抗体（インヒビターに対す
る）を用いて固相に結合させるために既知の方法を使用
し、溶液中の遊離プロテアーゼに露出させる。インキュ
ベーションおよびこの時点で固定化されたインヒビター
プロテアーゼ複合体の形成後に、固相を洗浄し、プロテ
アーゼまたは複合体のネオエピトープに対する適当な
（接合）抗体（またはこれらの抗体に対する接合抗体）
によって複合体が検出される。必要に応じて検出用の抗
体／Ｆａｂは、固相のサンプル溶液とのインキュベート
時に、既に存在させてもよい。
【００１１】さらに好ましい実施態様（Ｂ）において
は、検出すべき酵素／プロテアーゼは適当な抗体／Ｆａ
ｂを固相（またはこの抗体に対する抗体、たとえば特異
的抗体を提供するヤギ−抗−マウス抗体）に結合させ
る。遊離酵素／プロテアーゼからなる溶液を、固相と接
触させてインキュベートする。遊離の活性化されたプロ
テアーゼ（ならびに溶液中の非活性化酵素／プロテアー
ゼ）が結合したのち、固相を洗浄し、ついで相当するイ
ンヒビターからなる溶液とインキュベートする。固相を
洗浄したのち、複合体は、インヒビターまたは複合体の
ネオエピトープに結合する接合抗体によって検出され
る。同様に、活性化された遊離プロテアーゼからなる溶
液は、接触相とのインキュベーション前（ついでインキ
ュベートする）またはインキュベーション時にインヒビ
ターで処置することができる。必要に応じて、検出用の
抗体／Ｆａｂは、固相のインヒビターとのインキュベー
ション時に既に存在させてもよい。
は、検出すべき酵素／プロテアーゼは適当な抗体／Ｆａ
ｂを固相（またはこの抗体に対する抗体、たとえば特異
的抗体を提供するヤギ−抗−マウス抗体）に結合させ
る。遊離酵素／プロテアーゼからなる溶液を、固相と接
触させてインキュベートする。遊離の活性化されたプロ
テアーゼ（ならびに溶液中の非活性化酵素／プロテアー
ゼ）が結合したのち、固相を洗浄し、ついで相当するイ
ンヒビターからなる溶液とインキュベートする。固相を
洗浄したのち、複合体は、インヒビターまたは複合体の
ネオエピトープに結合する接合抗体によって検出され
る。同様に、活性化された遊離プロテアーゼからなる溶
液は、接触相とのインキュベーション前（ついでインキ
ュベートする）またはインキュベーション時にインヒビ
ターで処置することができる。必要に応じて、検出用の
抗体／Ｆａｂは、固相のインヒビターとのインキュベー
ション時に既に存在させてもよい。
【００１２】上述の実施態様は、意図された目的に応じ
て使い分けられる：実施態様（Ａ）においては、固定化
された結合パートナー（この場合はインヒビター）は排
他的に活性化されたプロテアーゼに結合し、これらの非
複合体分子の痕跡の検出可能にするが、実施態様（Ｂ）
ではさらにインヒビターが添加される前にも存在する可
能性がある限定された酵素／プロテアーゼインヒビター
複合体の測定をも可能にするものである。サンプル溶液
（＋／−インヒビター）の平行した試験に続いて差引き
計算［（＋）インヒビター引く（−）インヒビター］を
行えば、両者の情報を得ることができる。
て使い分けられる：実施態様（Ａ）においては、固定化
された結合パートナー（この場合はインヒビター）は排
他的に活性化されたプロテアーゼに結合し、これらの非
複合体分子の痕跡の検出可能にするが、実施態様（Ｂ）
ではさらにインヒビターが添加される前にも存在する可
能性がある限定された酵素／プロテアーゼインヒビター
複合体の測定をも可能にするものである。サンプル溶液
（＋／−インヒビター）の平行した試験に続いて差引き
計算［（＋）インヒビター引く（−）インヒビター］を
行えば、両者の情報を得ることができる。
【００１３】活性化因子の定量に好ましい結合パートナ
ーの組合せには、 ＡＴIII、必要に応じてヘパリン添加：ＦVIIａ、ＦIX
ａ、ＦＸａ、ＦXIａ、ＦXIIａ Ｃ１インアクティベーター：ＦXIａ、カリクレイン、
Ｃ１ｒ α１抗トリプシン：活性化プロテインＣ、エラスター
ゼ、他のセリンプロテアーゼ プロテインＣインヒビター：活性化プロテインＣ がある。
ーの組合せには、 ＡＴIII、必要に応じてヘパリン添加：ＦVIIａ、ＦIX
ａ、ＦＸａ、ＦXIａ、ＦXIIａ Ｃ１インアクティベーター：ＦXIａ、カリクレイン、
Ｃ１ｒ α１抗トリプシン：活性化プロテインＣ、エラスター
ゼ、他のセリンプロテアーゼ プロテインＣインヒビター：活性化プロテインＣ がある。
【００１４】
実施例： ＦIXａ−ＡＴIII複合体（ｃｘ）の定量 材料：マイクロタイタープレートをＦIX／ＦIXａへのモ
ノクローナル抗体（Ｍａｂ、１０μｇ／ml）でコート
し、洗浄した。ＡＴIIIに対するペルオキシダーゼ（Ｐ
ＤＯ）−接合ＭａｂをＦIXａ−ＡＴIII−ｃｘの検出に
用いた。ＡＴIII［Kybernin（登録商標）］ならびにＦI
XおよびＡＴIIIに対するＭａｂはBehringwerke AG（ド
イツ）より入手した。ヘパリン［Liquemin（登録商
標）］はHoffmann-La-Roch GmbH（ドイツ）より入手さ
れた。因子IXならびにIXａは、Calbiochem（米国）なら
びに Serbio（フランス）より入手した。色素原基質のS
-2765はChromogenix AB（スエーデン）より入手した。
ノクローナル抗体（Ｍａｂ、１０μｇ／ml）でコート
し、洗浄した。ＡＴIIIに対するペルオキシダーゼ（Ｐ
ＤＯ）−接合ＭａｂをＦIXａ−ＡＴIII−ｃｘの検出に
用いた。ＡＴIII［Kybernin（登録商標）］ならびにＦI
XおよびＡＴIIIに対するＭａｂはBehringwerke AG（ド
イツ）より入手した。ヘパリン［Liquemin（登録商
標）］はHoffmann-La-Roch GmbH（ドイツ）より入手さ
れた。因子IXならびにIXａは、Calbiochem（米国）なら
びに Serbio（フランス）より入手した。色素原基質のS
-2765はChromogenix AB（スエーデン）より入手した。
【００１５】ＦIXａ−ＡＴIII−ｃｘ標準の調製：ＦIX
ａ（２μｇ／ml）を含む 500μｌの緩衝液溶液を、１０
倍モル過剰のＡＴIII／ヘパリンからなる溶液（２０ I.
U.／mlのＡＴIIIと１０ I.U.／mlのヘパリンから希釈）
の等容量と90分間室温（ＲＴ）でインキュベートした。
ＦIXａのＡＴIIIによる完全な複合体化は、対照のバッ
チ（ＡＴIIIなし）と比較して、ＦIXａのアミド分解活
性をS-2765による光学的定量法でモニタリングした。上
記インキュベーション時間後には、ＦIXａ／ＡＴIII／
ヘパリンからなるバッチには活性はもはや検出できなか
った─すなわち、ＦIXａは完全にＦIXａ−ＡＴIII−ｃ
ｘに変換されていた。
ａ（２μｇ／ml）を含む 500μｌの緩衝液溶液を、１０
倍モル過剰のＡＴIII／ヘパリンからなる溶液（２０ I.
U.／mlのＡＴIIIと１０ I.U.／mlのヘパリンから希釈）
の等容量と90分間室温（ＲＴ）でインキュベートした。
ＦIXａのＡＴIIIによる完全な複合体化は、対照のバッ
チ（ＡＴIIIなし）と比較して、ＦIXａのアミド分解活
性をS-2765による光学的定量法でモニタリングした。上
記インキュベーション時間後には、ＦIXａ／ＡＴIII／
ヘパリンからなるバッチには活性はもはや検出できなか
った─すなわち、ＦIXａは完全にＦIXａ−ＡＴIII−ｃ
ｘに変換されていた。
【００１６】ＦIXａ−ＡＴIII−ｃｘ標準曲線の確立：
ＦIXａ−ＡＴIII−ｃｘ標準溶液のアリコート（１.０μ
ｇ／ml）を段階的にファクター1250まで希釈し、希釈液
を標準曲線の作成に用いた。各場合とも、５０μｌのサ
ンプル緩衝液を抗−ＦIXａ−Ｍａｂでコートされたマイ
クロタイタープレートのウェルに導入し、各場合とも、
５０μｌのｃｘ溶液を添加した。
ＦIXａ−ＡＴIII−ｃｘ標準溶液のアリコート（１.０μ
ｇ／ml）を段階的にファクター1250まで希釈し、希釈液
を標準曲線の作成に用いた。各場合とも、５０μｌのサ
ンプル緩衝液を抗−ＦIXａ−Ｍａｂでコートされたマイ
クロタイタープレートのウェルに導入し、各場合とも、
５０μｌのｃｘ溶液を添加した。
【００１７】１時間３７℃にてインキュベートしたの
ち、固相を３回洗浄し、各場合とも抗−ＡＴIII−Ｍａ
ｂ−ＰＯＤからなる溶液１００μｌを添加した。１時間
３７℃にて再インキュベートしたのち、プレートを３回
洗浄した。各場合ともＰＯＤ−基質溶液（塩酸ｏ−フェ
ニレンジアミン）１００μｌをピペットで各ウェルに加
え、プレートを２０分間ＲＴにて（暗所で）インキュベ
ートし、反応停止させ、ＯＤ492を測定した。
ち、固相を３回洗浄し、各場合とも抗−ＡＴIII−Ｍａ
ｂ−ＰＯＤからなる溶液１００μｌを添加した。１時間
３７℃にて再インキュベートしたのち、プレートを３回
洗浄した。各場合ともＰＯＤ−基質溶液（塩酸ｏ−フェ
ニレンジアミン）１００μｌをピペットで各ウェルに加
え、プレートを２０分間ＲＴにて（暗所で）インキュベ
ートし、反応停止させ、ＯＤ492を測定した。
【００１８】
【表１】 すなわち、これは少なくとも１.５〜１５０ng／mlの間
に線状の測定範囲を与えた（ｃｘの濃度の対数をＯＤ
492の対数に対してプロットした場合）。
に線状の測定範囲を与えた（ｃｘの濃度の対数をＯＤ
492の対数に対してプロットした場合）。
【００１９】ＦIX／ＦIXａ混合物中のＦIXａ−ＡＴIII
−ｃｘの定量： 以下のＦIX、ＦIXａおよびＡＴIII／ヘパリンの混合物
を調製し、９０分間室温でインキュベートし、サンプル
として上記のように処理した。
−ｃｘの定量： 以下のＦIX、ＦIXａおよびＡＴIII／ヘパリンの混合物
を調製し、９０分間室温でインキュベートし、サンプル
として上記のように処理した。
【表２】
【００２０】因子IX、IXａおよびＡＴIII／Ｈｅｐから
なる対照バッチも各場合ごとに別個に１〜３に示す濃度
で調製した。ＦIXもＦIXａも、またＡＴIII／Ｈｅｐ
も、このアッセイ系では反応を示さなかった。これはＦ
IX／ＦIXａの混合物（続くＡＴIII／Ｈｅｐとのインキ
ュベーションを行わない）にも同様に適用され、それは
ＦIXａ−ＡＴIII−ｃｘに対する選択性を保証するもの
であった。
なる対照バッチも各場合ごとに別個に１〜３に示す濃度
で調製した。ＦIXもＦIXａも、またＡＴIII／Ｈｅｐ
も、このアッセイ系では反応を示さなかった。これはＦ
IX／ＦIXａの混合物（続くＡＴIII／Ｈｅｐとのインキ
ュベーションを行わない）にも同様に適用され、それは
ＦIXａ−ＡＴIII−ｃｘに対する選択性を保証するもの
であった。
【００２１】形成されたＦIXａ−ＡＴIII−ｃｘは上述
の標準曲線を用いて定量した。表には試験稀釈の結果の
平均値を示す。
の標準曲線を用いて定量した。表には試験稀釈の結果の
平均値を示す。
【表３】
Claims (9)
- 【請求項１】 ａ） サンプルと活性化状態の酵素に特
異的な第一の結合パートナーとのインキュベーション、
および ｂ） 酵素／結合パートナー複合体を、活性化状態の酵
素に特異的な第一の結合パートナーと特異的に反応し、
シグナル産生標識が直接的または間接的に付与されてい
る第二の特異的結合パートナーと反応させることによ
る、酵素／結合パートナー複合体の形成の検出、を包含
するサンプル中の活性化酵素を検出および定量するため
の不均一免疫化学的方法。 - 【請求項２】 酵素／結合パートナー複合体は固定化さ
れた請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 固定化は固相に結合する第一の結合パー
トナーによって行われる請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 固定化された酵素／結合パートナー複合
体は酵素成分または酵素／結合パートナー複合体に対し
て特異的な抗体によって検出され、この抗体はシグナル
産生標識が直接的または間接的に付与されている請求項
３に記載の方法。 - 【請求項５】 活性化酵素は固相に結合する酵素特異的
抗体によって固定化され、固定化された活性化酵素は活
性化状態の酵素に特異的な結合パートナーとインキュベ
ートされ、この結合パートナーはシグナル産生標識が直
接的または間接的に付与されている請求項１に記載の方
法。 - 【請求項６】 活性化酵素はは活性化凝固因子である請
求項１〜５のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７】 シグナル産生標識は化学ルミネセンスま
たは蛍光原標識である請求項１〜６のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項８】 シグナル産生標識は酵素、好ましくは西
洋ワサビペルオキシダーゼである請求項１〜７のいずれ
かに記載の方法。 - 【請求項９】 活性化および非活性化酵素の混合物中の
活性化凝固因子を定量するための請求項１〜８のいずれ
かに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19526700:1 | 1995-07-24 | ||
| DE19526700 | 1995-07-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0933523A true JPH0933523A (ja) | 1997-02-07 |
Family
ID=7767450
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19263896A Pending JPH0933523A (ja) | 1995-07-24 | 1996-07-23 | 活性化因子の定量方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0759556A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0933523A (ja) |
| AU (1) | AU714952B2 (ja) |
| CA (1) | CA2181875A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2970417A1 (fr) * | 2011-01-19 | 2012-07-20 | Lfb Biotechnologies | Association de proteine c et d'alpha1-antitrypsine pour le traitement du sepsis ou du choc septique |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3016575A1 (de) * | 1980-04-30 | 1981-11-05 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Verfahren zur immunologischen bestimmung von enzymen, mittel zur durchfuehrung des verfahrens und seine verwandung |
| US4849353A (en) * | 1980-09-30 | 1989-07-18 | Cornell Research Foundation, Inc. | Immunocapture of enzyme inhibitor, enzyme complexes and uses thereof |
| CA1176560A (en) * | 1980-09-30 | 1984-10-23 | Peter C. Harpel | Process for determining inhibitor-enzyme complexes and composition for use therein |
| NL8802710A (nl) * | 1988-11-04 | 1990-06-01 | Tno | Werkwijze voor het bepalen van een enzym en daarvoor geschikte kit en stof. |
| GB8901859D0 (en) * | 1989-01-27 | 1989-03-15 | Shield Diagnostics Limited | Diagnostic test |
| AU628960B2 (en) * | 1989-04-07 | 1992-09-24 | Teijin Limited | Method of immunologically assaying human thrombin- antithrombin III complex, assay reagent and kit therefor |
| GB9119102D0 (en) * | 1991-09-07 | 1991-10-23 | Biosyn Ltd | Bioimmunassay |
-
1996
- 1996-06-25 EP EP96110212A patent/EP0759556A3/de not_active Withdrawn
- 1996-07-22 AU AU60615/96A patent/AU714952B2/en not_active Ceased
- 1996-07-23 JP JP19263896A patent/JPH0933523A/ja active Pending
- 1996-07-23 CA CA 2181875 patent/CA2181875A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0759556A3 (de) | 1998-05-20 |
| AU6061596A (en) | 1997-01-30 |
| EP0759556A2 (de) | 1997-02-26 |
| CA2181875A1 (en) | 1997-01-25 |
| AU714952B2 (en) | 2000-01-13 |
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