FR2970417A1 - Association de proteine c et d'alpha1-antitrypsine pour le traitement du sepsis ou du choc septique - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un kit ou une composition pharmaceutique comprenant de la protéine C (PC) et de l'alphal-antitrypsine (AAT). Le kit ou la composition pharmaceutique selon l'invention est utile pour le traitement du sepsis sévère et du choc septique, et notamment du sepsis sévère associé à un risque élevé de mortalité.

Description

DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se situe dans le domaine des traitements thérapeutiques du sepsis sévère et du choc septique. Elle concerne un kit comprenant de la protéine C et de l'alphal-antitrypsine, et l'utilisation en association de la protéine C et de l'alphalantitrypsine dans le traitement du sepsis sévère et du choc septique.

ART ANTERIEUR Le sepsis, le sepsis sévère et le choc septique sont des maladies fréquentes (plusieurs centaines de milliers de cas chaque année en Europe occidentale) et grevées d'une mortalité importante allant de 30 à plus de 70 %. Ils sont provoqués par une réaction excessive du corps du patient en réponse à une infection généralisée d'origine bactérienne, virale, parasitique ou fongique, même si la plupart des cas sont d'origine bactérienne. Cette réaction excessive qui, en association avec une infection généralisée, est caractéristique du sepsis, implique notamment une inflammation généralisée (appelée aussi syndrome de réponse inflammatoire systémique ou SRIS) et une coagulation excessive du sang (coagulation intravasculaire disséminée ou CIVD), phénomènes qui peuvent rapidement conduire à la défaillance d'un ou plusieurs organes, auquel cas on parle de sepsis sévère. Le choc septique se complique d'une brusque chute de la pression artérielle malgré un remplissage vasculaire adéquat. La prise en charge du sepsis, du sepsis sévère et du choc septique implique des traitements visant à juguler l'infection (percée d'abcès, retrait de tissus nécrosés, administration d'antibiotiques), et des traitements symptomatiques (oxygène, remplissage vasculaire, médicaments augmentant la pression sanguine). De plus, la progression de notre connaissance de la physiopathologie du sepsis et des mécanismes associés à cette physiopathologie a permis de concevoir de nouveaux médicaments visant à corriger certains dysfonctionnements liés à la réaction excessive de l'organisme du sujet. Ainsi, des médicaments ayant une influence sur la coagulation et/ou l'inflammation ont été proposés. Cependant, le sepsis est un phénomène extrêmement complexe, faisant intervenir de nombreuses cascades de signalisation, dont certaines sont reliées entre elles, et il est donc très difficile de prédire l'effet global qu'aura in vivo un composé ayant une action positive ou négative sur au moins une de ces cascades ou, plus difficile encore, l'effet qu'aura la combinaison de deux composés ayant chacun un effet sur au moins une de ces cascades. La Protéine C Activée (l'abréviation « PCA » est utilisée dans toute la présente demande) a été approuvée en 2001 par la Federal Drug Administration (FDA) dans le traitement du sepsis sévère à haut risque de mortalité. La Protéine C (l'abréviation « PC » est utilisée dans toute la présente demande), glycoprotéine dépendante de la vitamine K, est une sérine protéase et un anticoagulant naturel jouant un rôle dans la régulation de l'hémostase via l'inactivation de deux facteurs importants de la cascade de la coagulation, les facteurs Va et VIIIa. La PC humaine circule dans le plasma sous la forme d'un zymogéne (précurseur inactif) à deux chaines, et ne remplit ses fonctions de régulation de l'hémostase à la surface des cellules endothéliales et des plaquettes qu'après sa conversion en PCA par clivage du peptide d'activation par la thrombine associée à son récepteur, la thrombomoduline. En conjonction avec d'autres protéines, la PCA est peut-être le plus important régulateur négatif de la coagulation sanguine, jouant ainsi un rôle majeur dans la prévention de la thrombose. Outre ses fonctions anticoagulantes, la PCA possède également des propriétés pro-fibrinolytiques qui facilitent la dissolution des caillots, des effets anti-inflammatoires et cytoprotecteurs.. De part sa capacité à diminuer la formation de thrombine, la PCA inhibe l'activation du TAFI (pour « thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor »), favorisant la fibrinolyse de façon indirecte. La fibrinolyse est aussi stimulée par une autre activité de la PCA, sa capacité à inhiber le PAI-1 (pour «plasminogen activator inhibitor-1 »). De récentes études ont montré que, fixée à son récepteur membranaire EPCR (pour « endothelial protein C receptor »), la PCA était capable d' inhiber la sécrétion de TF, d'interleukine 1 (IL-1), d'interleukine 6 (IL-6), d'interleukine 8 (IL-8) et de TNFa (pour « Tumor necrosis factor a ») par les monocytes, ainsi que de réprimer l'expression de molécules d'adhésion à la surface des cellules endothéliales telles E-sélectine, I-CAM ou VCAM-1, induisant une inhibition du roulement des neutrophiles et une inhibition de leur recrutement. Ces différentes activités de la PC sont décrites notamment dans la Figure 1 de Bernard et al, publication décrivant la 1è" étude clinique (appelée «PROWESS ») de l'utilisation de la protéine C activée dans le traitement du sepsis sévère et du choc septique. Ces activités, ainsi que le rôle cytoprotecteur et anti-apoptotique de la protéine C activée, sont également décrits notamment dans Danese S et al.

Ainsi, le système enzymatique de la PCA représente un mécanisme physiologique majeur d'anti-coagulation, d'anti-inflammation et de fibrinolyse. Dans le traitement du sepsis sévère ou du choc septique, la PCA ou la PC (son zymogéne in vivo) ont été proposées en association avec d'autres molécules. Ainsi, US 2002/0044929 suggère d'utilisation la PC en association avec la protéine BPI (pour « Bactericidal permeability increasing protein »), une protéine ayant des effets bactéricides, pour le traitement du sepsis et du choc septique. US 5,093,117 suggère d'utiliser dans le traitement du sepsis et du choc septique la combinaison de PC et d'une quantité bactéricide d'immunoglobulines polyclonales dirigées contre les bactéries à Gram négatif. WO 00/37022 décrit l'utilisation d'une combinaison de PCA et d'un inhibiteur de sPLA2 (pour «non-pancreatic secretory phospholipase A2 »). US2006/0127387 décrit l'utilisation combinée de PCA et d'au moins un polysaccharide macromoléculaire choisi parmi l'amidon hydroxyéthylé, le dextran, le glycogène, et leurs mélanges. Aucun de ces documents ne suggère d'utiliser une combinaison de PC ou de PCA et d'alphal-antitrypsine pour le traitement du sepsis sévère ou du choc septique. L'alphal-antitrypsine (encore appelée «inhibiteur de protéase alphal », l'abréviation « AAT » étant utilisée dans toute la présente demande) est un inhibiteur à large spectre de sérine protéases, sécrété principalement par le foie et présent dans le plasma et dans de nombreux tissus. L'AAT inhibe de nombreuses sérine protéases, telles que l'élastase, la cathepsine G ou la protéinase 3. Elle a été décrite comme possédant des propriétés anti-inflammatoires (WO2005/112989, EP0943338, US2008/0312136), anti-apoptotiques (WO00/51624) et anti-nécrotiques (WO2010/029537) et a été, à ces différents titres, proposée comme agent thérapeutique dans le traitement du sepsis ou du choc septique.

Cependant, l'ART n'a pas été proposée comme agent thérapeutique dans le traitement du sepsis ou du choc septique en association avec la PCA. Au contraire, il est bien connu que l'ART est aussi l'un des deux inhibiteurs physiologiques de la PCA in vivo (Heeb et al, 1988), l'autre étant héparine-dépendant et étant appelé « inhibiteur de protéine C ». L'homme du métier aurait donc toutes les raisons de penser que l'ajout d'ART à un traitement de sepsis ou de choc septique à base de PCA inhiberait l'effet de la PCA et aurait donc un effet négatif sur l'efficacité du traitement.

Il a d'ailleurs été proposé, au contraire, de modifier la PC ou la PCA pour augmenter sa résistance à l'ART in vivo, par sa conjugaison à un groupement non protéique de type PEG ou sucre (US2005/0095668), ou par des mutations au niveau de sa séquence protéique (Berg et al, 2003). Il a également été proposé d'utiliser, en sus de la PCA, des anticorps non-neutralisants ayant un effet de suppression de l'inactivation de la PCA par l'ART (US2006/0121022). En outre, un mutant de l'ART (AAT Pittsburgh, porteur d'une mutation en position 358, le résidu méthionine étant remplacé par un résidu arginine), dont l'effet d'inactivation sur la PCA est fortement augmenté et qui possède en outre des effets d'inhibition de la coagulation intrinsèque que l'ART normale n'a pas, a été proposé, du fait de ses nouveaux effets sur la cascade de coagulation intrinsèque, comme agent thérapeutique dans le traitement du sepsis. Cependant, une étude chez des primates a montré que ce traitement ne diminue pas les effets du choc et semble même exacerber la CIVD (coagulation intravasculaire disséminée). Les auteurs proposent deux explication pour l'effet négatif sur la CIVD, l'une étant que l'ART mutante inhibe la PCA, une telle inhibition étant connue pour exacerber le choc septique (Harper et al).

Pourtant, les inventeurs ont trouvé de façon surprenante qu'un traitement associant la PC et l'ART fournit des bénéfices inattendus dans le traitement du sepsis sévère ou du choc septique, notamment du choc septique d'origine bactérienne à gram- négatif. En effet, l'ajout d'ART au traitement par la PC conduit à un bénéfice hémodynamique supérieur à la PC seule, et possède également un effet positif sur la CIVD.

DESCRIPTION DE L'INVENTION La présente invention concerne donc un kit ou une composition pharmaceutique comprenant de la protéine C (PC) et de l'alphal-antitrypsine (AAT).

Par « Protéine C » ou « PC », on entend toute protéine, naturelle isolée ou recombinante, glycosylée de diverses manières ou non glycosylée, ayant une séquence d'acides aminés de protéine C animale ou humaine, sous forme précurseur ou mature, ou un variant d'une telle protéine dans lequel la séquence d'acides aminés comprend au moins une délétion, insertion et/ou substitution et qui possède in vivo au moins une des activités (de préférence toutes les activités) de la protéine C activée telles que décrites sur les Figures 1 de Bernard et al et de Danese et al (inactivation des Facteurs Va et VIIIa dans la cascade de la coagulation, activité pro-fibrolytique par l'activation de TAFI (pour « thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor ») et l'inhibition du PAI-1(pour «plasminogen activator inhibitor-1 »), inhibition de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires (TNF-a, IL-113, IL-6, IL-8) et cytoprotection de la barrière vasculaire). Cela inclut les différentes formes de la protéine C, telles que les formes inactives simple-chaine et sous forme de dimère, ainsi que la forme activée (PCA) de la protéine C. La protéine C humaine inactive est d'abord synthétisée sous la forme d'un polypeptide simple chaine de 461 acides aminés de séquence NCBI de référence NP 000303.1 et correspondant à SEQ ID NO :1 (voir Figure lA et 1B). Ce polypeptide subit ensuite de nombreuses modifications post-traductionnelles, et notamment : a) le clivage des 42 premiers acides aminés (positions 1-42 de SEQ ID NO :1) et le clivage d'un dipeptide lysine-arginine aux positions 198-198 de SEQ ID NO :1, situé entre les futures chaines lourdes et légères, pour générer un dimère inactif formé d'une chaine légère de 155 acides aminés (positions 43 à 197 de SEQ ID NO :1) liée par un pont disulfure (entre les cystéines en positions 183 et 319 de SEQ ID NO :1) à une chaine lourde de 262 acides aminés (positions 200 à 461 de SEQ ID NO :1) (voir Figure 1C), b) la carboxylation dépendante de la vitamine K de 9 résidus d'acide glutamique de la partie N-terminale de la chaine légère (positions 48, 49, 56, 58, 61, 62, 67, 68, et 71 de SEQ ID NO :1), et c) l'attachement de carbohydrates sur 4 sites de glycosylation (un dans la chaine légère en position 139 de SEQ ID NO :1, et trois dans la chaine lourde, en positions 290, 355 et 371 de SEQ ID NO :1).

Parmi les variants de la protéine C inclus dans la portée de la présente invention, on peut notamment citer ceux décrits dans US 5,453,373 et US 5,516,650.

Par « Protéine C activée » ou « PCA », on entend la forme activée de la protéine C, qui est formée par protéolyse de la protéine C inactive par le complexe thrombine/thrombomuduline et qui possède au moins une des activités (de préférence toutes les activités) de la protéine C activée telles que décrites sur les Figures 1 de Bernard et al et de Danese et al (inactivation des Facteurs Va et VIIIa dans la cascade de la coagulation, activité pro-fibrolytique par l'activation de TAFI (pour «thrombinactivatable fibrinolysis inhibitor ») et l'inhibition du PAI-1 (pour «plasminogen activator inhibitor-1 »), inhibition de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires (TNF-a, IL-lb, IL-6, IL-8) et cytoprotection de la barrière vasculaire). La protéine C activée (PCA) humaine est obtenue in vivo par clivage d'un dodécapeptide (le peptide d'activation) à l'extrémité N-terminale de la chaine lourde (positions 200 à 211 de SEQ ID NO :1). La PCA humaine est donc un dimère formé d'une chaine lourde dont la séquence d'acides aminés correspond aux positions 212 à 461 de SEQ ID NO :1 et d'une chaine légère dont la séquence d'acides aminés correspond aux positions 43 à 197 de SEQ ID NO :1, liées par un pont disulfure entre les cystéines en positions 183 et 319 de SEQ ID NO :1 (voir Figure ID). La séquence complète du précurseur simple chaine de la PC humaine, la structure de ce précurseur, ainsi que la structure de la PC humaine sous forme de dimère inactif et de la PCA humaine sont représentées sur la Figure 1.

La PC sous forme inactive (précurseur simple chaine ou dimère zymogène) peut être activée in vivo et peut donc être utilisée. Néanmoins, la PC peut aussi être utilisée sous forme activée, c'est-à-dire qu'on utilise directement la PCA. La PC (sous forme inactive simple chaine ou dimérique, ou sous forme activée) utilisée en combinaison avec l'AAT peut provenir de différentes espèces. En particulier, des séquences d'acides aminés de PC de souris (Séquences de référence NCBI NP 001036232.1, NP 001036233.1, et NP 032960.2 correspondant à SEQ ID NO :3 à 5 respectivement), de rat (Séquence de référence NCBI NP_036935.1, correspondant à SEQ ID NO :6), de chien (Séquence de référence NCBI NP 001013871.1, correspondant à SEQ ID NO :7), de poulet (Séquence de référence NCBI NP 989772.1, correspondant à SEQ ID NO :8), de cochon (Séquence de référence NCBI NP 999083.1, correspondant à SEQ ID NO :9), de lapin (Séquence de référence NCBI NP 001182730.1, correspondant à SEQ ID NO :10), de bovin (Séquence de référence NCBI NP 001159984.1, correspondant à SEQ ID NO :11) sont connues dans l'art antérieur. Néanmoins, dans un mode de réalisation avantageux, la PC est d'origine humaine. La PC (sous forme inactive simple chaine ou dimérique, ou sous forme activée) peut être obtenue par purification à partir du sang, du sérum ou du plasma, ou bien sous forme recombinante. Elle est avantageusement sous forme recombinante, c'est-à-dire qu'elle a été obtenue par clonage et expression d'une séquence codant pour la PC (sous forme inactive simple chaine ou dimérique, ou sous forme activée) ou ses variants tels que décrits ci-dessus dans un système d'expression approprié (culture cellulaire, animal transgénique). Des exemples de production de protéine C recombinante sont décrits dans US 4,775,624.

Dans un mode de réalisation avantageux, c'est une protéine C humaine purifiée à partir du plasma humain qui est associée à l'AAT dans un kit ou une composition pharmaceutique selon l'invention. Une telle composition est notamment commercialisée par le Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies (LFB) sous le nom commercial Protexel®, et est donc accessible à l'homme du métier. Dans un autre mode de réalisation préféré, c'est une PCA humaine recombinante qui est associée à l'AAT dans un kit ou une composition pharmaceutique selon l'invention. Une telle PCA recombinante humaine, appelée « drotecogin alpha (activated) » est notamment commercialisée par Eli Lilly sous le nom commercial Xigris®. La drotecogin alpha (activated) est une glycoprotéine d'environ 55 kilodaltons (kDa), constituée d'une chaine lourde et d'une chaine légère liées par un pont disulfure, ayant les séquences d'acides aminés décrites ci-dessus. La drotecogin alpha (activated) et la PCA humaine dérivée du plasma ont les mêmes sites de glycosylation, même s'il existe des différences dans les structures de glycosylation des deux protéines.

Par « alphal -antitrypsine », « a 1-antitrypsine » ou « AAT », on entend toute protéine, naturelle isolée ou recombinante, glycosylée de diverses manières ou non glycosylée, ayant une séquence d'acides aminés d'alphal-antitrypsine animale ou humaine, sous forme précurseur ou mature, ou un variant d'une telle protéine dans lequel la séquence d'acides aminés comprend au moins une délétion, insertion et/ou substitution et qui conserve au moins une des activités (de préférence toutes les activités) de l'AAT (inactivation de l'élastase, la cathepsine G, la protéinase 3 et/ou de la PCA, et/ou inhibition de la dégranulation des mastocytes pulmonaires, inhibition de la sécrétion d'histamine, inhibition de la sécrétion de TNF et /ou inhibition de la sécrétion de leucotriene B4). L'AAT humaine est une glycoprotéine simple chaine existant sous la forme d'un précurseur de 418 acides aminés ou d'un polypeptide mature de 394 acides aminés, dans lequel les 24 premiers résidus d'acides aminés du précurseur ont été clivés. Des exemples spécifiques de séquences d'AAT naturelle isolée sont décrits dans US 4,599,311 et US 4,711,848. Une séquence d'acides aminés particulière du précurseur d'ART humaine native est représentée par la séquence de référence NCBI NP_000286.3 et par SEQ ID NO :2, qui comprend 418 acides aminés. La forme mature de cette protéine correspond aux positions 25 à 418 de SEQ ID NO :2. La protéine précurseur ou mature comporte trois sites de glycosylation, en positions 70, 107 et 271 de SEQ ID NO :2, et est connue pour présenter différents types de glycosylations. Les 3 sites portent généralement des N-glycanes de type biantennés, mais le site en position 107 de SEQ ID NO :2 présente parfois des N-glycans avec trois voire quatre antennes.

L'AAT utilisée en combinaison avec la PC (notamment la PCA) peut provenir de différentes espèces. En particulier, des séquences d'acides aminés de PC de souris (Séquence de référence NCBI AAA37128.1, correspondant à SEQ ID NO :12), de rat (Séquence de référence NCBI AAA40788.1, correspondant à SEQ ID NO :13), de chien (Séquence de référence NCBI BAF42652.1, correspondant à SEQ ID NO :14), de cochon (Séquence de référence NCBI NP_999560.1, correspondant à SEQ ID NO :15), de lapin (Séquence de référence NCBI NP 001164552.1, correspondant à SEQ ID NO :16), de bovin (Séquence de référence NCBI CAA44840.1, correspondant à SEQ ID NO :17), et de cheval (Séquence de référence NCBI AAC83412.1, correspondant à SEQ ID NO :18) sont connues dans l'art antérieur. Néanmoins, dans un mode de réalisation avantageux, elle est d'origine humaine. L'AAT peut être obtenue par purification à partir de différents tissus (notamment le foie) ou fluides biologiques (notamment le sang, le sérum ou le plasma), ou bien être sous forme recombinante, c'est-à-dire qu'elle a été obtenue par clonage et expression d'une séquence codant pour l'AAT ou ses variants tels que décrits ci-dessus dans un système d'expression approprié (culture cellulaire, animal transgénique). Trois préparations lyophilisées d'ART naturelle purifiée obtenues à partir du plasma humain ont été approuvées par la FDA dans le traitement des déficiences en AAT sous les noms commerciaux Prolastin®-C, Zemaira®, et AralastTM, et sont donc accessibles à l'homme du métier. Une préparation liquide d'AAT naturelle purifiée obtenues à partir du plasma humain a également été approuvée par la FDA sous le nom commercial GlassiaTM et est donc également accessible à l'homme du métier. En outre, une préparation lyophilisée d'AAT naturelle purifiée obtenue à partir du plasma humain commercialisée sous le nom commercial Alfastin® par le Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies (LFB) bénéficie en France depuis 2005 d'une Autorisation de Mise sur le Marché pour le traitement des formes graves de déficit primitif en alphal antitrypsine chez les sujets de phénotype PiZZ ou PiSZ avec emphysème pulmonaire (maladie rare). Généralement, l'AAT recombinante est un polypeptide de 395 acides aminés correspondant aux 394 acides aminés de la protéine AAT native mature (positions 25- 418 de SEQ ID NO :2), avec en plus un résidu N-acétylméthionine en position N- terminale. Des exemples de procédés de synthèse d'AAT recombinante sont décrits notamment dans US 4,599,311 ; US 4,931,373, US 5,218,091 ; US 5,399,684 ; US 5,736,379 ; W02005/047323 ; W02007/062270 ; W02007/112953 ; W02008/151845 ; et W02010/127939. De plus, plusieurs préparations d'ART recombinante sont actuellement en cours de test dans des essais cliniques. L'AAT recombinante peut être non glycosylée ou glycosylée de façons variées, en fonction de la cellule et des conditions de production.

Dans un kit pharmaceutique selon l'invention, la PC (sous forme inactive simple chaine ou dimérique, ou sous forme activée) et l'AAT peuvent être dans une même composition, ou bien dans des compositions distinctes. Avantageusement, dans un kit pharmaceutique selon l'invention, la PC (sous forme inactive simple chaine ou dimérique, ou sous forme activée) et l'ART sont dans des compositions distinctes.

La présente invention concerne également un kit ou une composition pharmaceutique selon l'invention tel(le) que décrit(e) ci-dessus, pour son utilisation comme médicament dans le traitement du sepsis sévère ou du choc septique. Par « sepsis », on entend le syndrome clinique défini par la coexistence d'une infection systémique (septicémie) et d'une réponse inflammatoire systémique, encore appelée syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS). La septicémie peut être suspectée ou prouvée (par culture, marquage, ou PCR). D'autres indices spécifiques d'infection sont notamment : la présence de leucocytes dans des fluides normalement stériles (urine ou fluide cérébrospinal), un viscus perforé, une radiographie thoracique anormale cohérente avec une pneumonie (opacification focale), des pétéchies, un purpura ou un purpura fulminans. Le SIRS est diagnostiqué par la présence d'au moins deux signes cliniques ou biochimiques parmi : - une température inférieure à 36°C (hypothermie) ou supérieure à 38°C (fièvre), tachycardie avec plus de 90 battements de coeur / minute, - tachypnée avec plus de 20 respirations / minute ou, dans les gaz du sang, une valeur de PaCO2 inférieure à 32 mm Hg (4,3 kPa), - leucocytes supérieurs à 12000 cellules / mm3 ou inférieurs à 4000 cellules / mm3, ou leucocytose comprenant plus de 10% de formes immatures. Par « sepsis sévère », on entend un sepsis avec au moins une défaillance d'organe par hypoperfusion ou hypotension, telles que : troubles de la conscience, oligurie, pression artérielle systolique inférieure à 90 mmHg ou 40 mmHg en dessous du chiffre habituel, acidose lactique, hypoxémie.

Par « choc septique », on entend un sepsis sévère avec une hypotension résistante à un remplissage vasculaire bien conduit, c'est-à-dire une injection par voie veineuse d'un liquide de remplissage, et nécessitant un traitement basé sur des amines vasopressives.

LA PCA a été approuvée par la FDA dans le traitement du sepsis sévère ayant un risque élevé de mortalité ou du choc septique. Par « sepsis sévère ayant un risque élevé de mortalité », on entend un sepsis avec un score APACHE II 25, un sepsis sévère avec au moins deux défaillances d'organes, ou un sepsis sévère accompagné d'un syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA). Par conséquent, les kits ou compositions pharmaceutiques selon l'invention sont particulièrement utiles dans le traitement du choc septique ou du sepsis sévère associé à un score APACHE 25, à au moins deux défaillances d'organe, ou à un syndrome de détresse respiratoire aiguë. Par « score APACHE II », on entend un système de classification de la sévérité d'une maladie développé pour classer les patients arrivant dans une unité de soins intensifs et bien connu des praticiens de ces unités intensives. Le score APACHE II varie entre 0 et 71 et est calculé à partir de 12 mesures physiologiques de routine, l'âge, et l'état de santé antérieur. Plus le score est élevé, plus le risque de mortalité est élevé. Plus précisément, le score APACHE II peut être calculé en utilisant le Tableau 1 ci-dessous : +.,e 3HD Y 'e aee'»e:ee,4'j e'.)Ue6e: eNt We,,.0 '15 r 4: ! ris! /4 W'.04ta 1 6U.100 Z .:.ee..ee. e. .K> wee -. rl woe qu. .!ed 5.;:'. e - :.,;.* : s ,..; e<>l: =: ?.KelOd -:f fFFh .0. = e e,p .5e e.»51 e e : .eeuuee. nbe. 66beele:ef, q :( `.,f' .. . . ... ... IOIZMMZIM B ... IM MI 1MM e Wep 5 ie> 6:'e-5 'ie e-o,-o 1- 1 1 .e.::7.6Z e;. 0g i. ',. 00. (»--so .. . .4,73? . .. 1X.14 ... ÿ 5r .Ç:. '.,e ..ge rr .f 1;6.1:-Orfr 6D-rO5;' Pîi;-qe /J ç eo voi 6K:-OOZ. Ee.frl'Ye eo.(.j'ie <:(..''M e;, 0, 01-, 00" xeJ,wur9eje<.f.> r ,S ., a;W ne;,,,,,,,,, , eeepe> ks 'f aie .,ee"Z£ o voi 6Z -01 1 1 D'6'. t£-06 0,leSt-O6 SeS.'8e D.eOtreE Les kits ou compositions pharmaceutiques selon l'invention associant la PC (notamment la PCA) et l'ART pour le traitement du sepsis sévère (notamment associé à un risque élevé de moralité tel que décrit ci-dessus) ou du choc septique, peuvent en particulier être utilisés dans le traitement du sepsis sévère (notamment associé à un risque élevé de moralité tel que décrit ci-dessus) ou du choc septique d'origine bactérienne, notamment impliquant des bactéries à gram négatif, surtout celles exprimant du lipopolysaccharide (LPS), telles que les bactéries de type Bordetella, Salmonella, Escherichia coli, Yersinia (notamment Yersinia pestis), Vibrio (notamment Vibrio cholerae), Pseudomonas, Neisseria (notamment Neisseria meningitidis), Shigella, Hemophilus, Klebsiella, Legionella, Enterobacter, Helicobacter, Acinetobacter, Moraxella. Dans un mode de réalisation de la présente invention, lorsque la PC (sous forme inactive simple chaine ou dimérique, ou sous forme activée) et l'ART sont utilisées en association dans le traitement du sepsis sévère ou du choc septique, la PC (sous forme inactive simple chaine ou dimérique, ou sous forme activée) et l'ART sont administrées simultanément. Dans un autre mode de réalisation, lorsque la PC (sous forme inactive simple chaine ou dimérique, ou sous forme activée) et l'ART sont utilisées en association dans le traitement du sepsis sévère ou du choc septique, la PC (sous forme inactive simple chaine ou dimérique, ou sous forme activée) et l'ART sont administrées séquentiellement. La PC (sous forme inactive simple chaine ou dimérique, ou sous forme activée) peut alors être administrée avant l'ART, ou bien l'inverse. Les deux produits peuvent aussi être administrés d'abord simultanément, puis le traitement poursuivi avec seulement l'un des deux produits. Notamment, il est possible d'administrer d'abord la PC (sous forme inactive simple chaine ou dimérique, ou sous forme activée) et l'ART simultanément, puis ensuite seulement la PC (sous forme inactive simple chaine ou dimérique, ou sous forme activée).

Dans les études cliniques où la PC (sous forme inactive simple chaine ou dimérique, ou sous forme activée) a été utilisée pour le traitement du sepsis sévère ou du choc septique, il a été montré que le bénéfice apporté par le traitement par la PC était augmenté si la PC était administrée dans les 24 heures suivant la 1 ère défaillance d'organe. Par conséquent, dans un mode de réalisation avantageux, lorsqu'un kit ou une composition pharmaceutique selon l'invention est utilisé pour le traitement du sepsis sévère ou du choc septique, la PC (sous forme inactive simple chaine ou dimérique, ou sous forme activée) est administrée dans les 24 heures suivant la 1 ère défaillance d'organe.

Lorsqu'elle est utilisée en association avec l'ART pour le traitement du sepsis sévère ou du choc septique, la PC sous forme inactive simple chaine ou dimérique, est avantageusement administrée à une dose : - - de 50 à 500 UI/kg/jour, avantageusement de 50 à 400 UI/kg/jour, avantageusement de 100 à 200 UI/kg/jour, notamment de 150 UI/kg/jour, - pendant 24 à 168 heures, avantageusement pendant 48 à 144 heures, notamment pendant environ 48 à 96 heures.

Lorsqu'elle est utilisée en association avec l'ART pour le traitement du sepsis sévère ou du choc septique, la PC sous forme activée est avantageusement administrée à une dose : - de 10 à 100 UI/kg/jour, avantageusement de 15 à 50 UI/kg/jour, avantageusement de 20 à 30 UI/kg/jour, notamment de 24 UI/kg/jour, - pendant 24 à 168 heures, avantageusement pendant 48 à 144 heures, notamment pendant environ 48 à 96 heures.

Lorsqu'elle est utilisée en association avec l'ART pour le traitement du sepsis sévère ou du choc septique, la PC (sous forme inactive simple chaine ou dimérique, ou sous forme activée) est avantageusement administrée par voie parentérale, notamment par injection intraveineuse, en perfusion continue éventuellement précédée d'un bolus. ,

Lorsqu'elle est utilisée en association avec la PC (sous forme inactive simple chaine ou dimérique, ou activée) pour le traitement du sepsis sévère ou du choc 30 septique, l'ART est avantageusement administrée à une dose : - de 30 à 120 mg/kg/heure, avantageusement de 30 à 80 mg/kg/heure et notamment de 60 mg/kg/heure. - pendant 24 à 168 heures, avantageusement pendant 24 à 144 heures, notamment pendant environ 24 à 96 heures,

Lorsqu'elle est utilisée en association avec la PC (sous forme inactive simple chaine ou dimérique, ou sous forme activée) pour le traitement du sepsis sévère ou du choc septique, l'ART est avantageusement administrée par voie parentérale, notamment par injection intraveineuse, perfusion, ou bolus ; ou par voie respiratoire, notamment par inhalation ou instillation intra-trachéale ; de préférence l'ART est administrée par perfusion.

Un traitement particulièrement avantageux comprend l'administration d'une combinaison de : - PC (sous forme inactive simple chaine ou dimérique) à une dose de 50 à 500 Ul/kg/jour, avantageusement de 50 à 400 Ul/kg/jour, avantageusement de 100 à 200 Ul/kg/jour, notamment de 150 Ul/kg/jour pendant 24 à 168 heures, avantageusement pendant 48 à 144 heures, notamment pendant environ 48 à 96 heures ; notamment à une dose de 150 Ul/kg/jour pendant 48 à 96 heures, et - d'ART à une dose de 30 à 120 mg/kg/heure, avantageusement de 30 à 80 mg/kg/heure et notamment de 60 mg/kg/jour, pendant 24 à 144 heures, notamment 24 à 96 heures ; avantageusement à une dose de 60 mg/kg/jour, pendant 24 à 96 heures.

Un autre traitement particulièrement avantageux comprend l'administration 25 d'une combinaison de : - PC activée (PCA) à une dose de 10 à 100 Ul/kg/jour, avantageusement de 15 à 50 Ul/kg/jour, avantageusement de 20 à 30 Ul/kg/jour, notamment de 24 Ul/kg/jour pendant 24 à 168 heures, avantageusement pendant 48 à 144 heures, notamment pendant environ 48 à 96 heures ; notamment à une dose 30 de 24 Ul/kg/jour pendant 48 à 96 heures, et - d'ART à une dose de 30 à 120 mg/kg/heure, avantageusement de 30 à 80 mg/kg/heure et notamment de 60 mg/kg/jour, pendant 24 à 144 heures, notamment 24 à 96 heures ; avantageusement à une dose de 60 mg/kg/jour, pendant 24 à 96 heures.

DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1. (A) Séquence d'acides aminés du précurseur simple chaine de la protéine C humaine (SEQ ID NO :1) (B) Structure du précurseur simple chaine de la protéine C humaine, (C) Structure de la PC humaine inactive sous forme de dimère. (D) Structure de la PCA humaine. Les abréviations suivantes sont utilisées : Gla : domaine comprenant des résidus glutamates carboxylés, EGF-1 : domaine de type EGF (« Epidermal Grwth Factor (EGF)-like ») n°l, EGF-2 : domaine de type EGF (« Epidermal Grwth Factor (EGF)-like ») n°2. Figure 2. Séquence d'acides aminés du précurseur de l'ART humaine (SEQ ID NO :2). La partie de la séquence correspondant à l'ART humaine mature est soulignée. Figure 3. Protocole expérimental. Les abréviations suivantes sont utilisées : LPS : lipopolysaccharide, SSI : sérum salé isotonique, AAT : alphal-antitrypsine (Alfalastiri - LFB, Courtaboeuf, France), al-AT : alphal-antitrypsine (Alfalastiri - LFB, Courtaboeuf, France), PC : protéine C (Protexel® - LFB, Courtaboeuf, France). Figure 4. Influence des différents traitements testés sur la pression artérielle moyenne (PAM, en mmHg, voir (A)) en fonction du temps en minutes après le début du protocole expérimental. (B) Remplissage vasculaire global en litre, des animaux en fonction du groupe d'appartenance. Figure 5. Influence des différents traitements testés sur l'hypertension artérielle pulmonaire (PAPM, voir (A)) et sur le taux de lactate (% de variation par rapport à la valeur de base, voir (B)), en fonction du temps en minutes après le début du protocole expérimental.

Figure 6. Influence des différents traitements testés sur 4 paramètres biologiques. (A) Leucocytes (nombre/mm3) en fonction du temps en minutes après le début du protocole expérimental. (B) Taux de prothrombine (TP, % de variation par rapport à la valeur de base) en fonction du temps en minutes après le début du protocole expérimental. (C) Plaquettes (% de variation par rapport à la valeur de base ) en fonction du temps en minutes après le début du protocole expérimental. (D) Fibrinogène (% de variation par rapport à la valeur de bases) en fonction du temps en minutes après le début du protocole expérimental. Figure 7. Influence des différents traitements testés sur la CIVD. (A) Monomères de fibrine (µg/ml) en fonction du temps en minutes après le début du protocole expérimental. (B) D-Dimères de fibrine (mg/ml) en fonction du temps en minutes après le début du protocole expérimental.

EXEMPLES

EXEMPLE 1. Effet d'un traitement associant la PC et l'ART dans sun modèle de choc endotoxinique chez le porc 1.1. Matériels et méthodes Ce travail était réalisé en accord avec les normes de l'expérimentation animale et avait reçu l'accord du comité d' Ethique Animal Régional.

Préparation des animaux L'expérimentation a été effectuée sur des porcs de race « Large White » âgés de trois mois et pesant entre 20 et 25 Kgs. Les animaux ont reçu systématiquement une prémédication par injection intramusculaire de chlorydrate de kétamine (Kétalar , Parke-Davis) à raison de 2,5 mg par kilogramme de poids. Ils ont d'abord été positionnés en décubitus dorsal, ont ensuite été endormis au gaz (Isoflurané , NPIL, India), ce qui a permis une intubation orotrachéale avec une sonde de diamètre interne 7,5 mm (Mallinckrodte, Athlone, Irlande), et ventilés par l'intermédiaire d'un ventilateur (VMSe, Hallowell, USA) Une perfusion a été posée sur la veine marginale de l'oreille afin mettre en place une sédation comprenant une association de midazolam (Hypnovele, Roche) à 1-2 mg/kg/h et de tramadol (Topalgic , Sanofi-Aventis fiance) à 1-2 mg/kg/h. Une curarisation par vécuronium bromure (Norcurori , Organon) à 0,4 mg/kg/h a été associée à la sédation et à l'analgésie.

Après dissection et exposition des vaisseaux du cou, un cathéter de Swan-Ganz (Baxter 130 H 7.5Fr) a été positionné au niveau de l'artère pulmonaire via la veine jugulaire externe droite pour permettre les mesures de pression dans l'oreillette droite (POD), de pression artérielle pulmonaire moyenne (PAPM), de saturation veineuse pulmonaire en oxygène (SvO2), et du débit cardiaque en continu. Ceci a également permis la réalisation de prélèvements sanguins avec mesure des gaz du sang veineux- mêlé. Un cathéter veineux de gros calibre 16 F (SLX Cathéter - Medcompe, Germany) a été placé au niveau de la carotide interne droite afin de mesurer et de monitorer la pression artérielle systémique (systolique, diastolique et moyenne soit PAS, PAD et PAM) et de réaliser des prélèvements sanguins artériels répétés. En cas d'échec de pose à droite, les cathéters ont été positionnés en controlatéral. 10 La température a été mesurée en continu par mise en place d'une sonde thermique endorectale et également par la sonde thermique du cathéter de Swan-Garez.

Enregistrement des paramètres hémodynamiques et d'oxygénation Un cardiotachymétre standard de type PC Express (Spacelab, USA) a été utilisé 15 afin de mesurer la fréquence cardiaque, la pression artérielle, les pressions artérielles pulmonaire, capillaire et auriculaire droite. Un moniteur de type Vigilance (Baxter, USA) assurait la mesure et le monitorage du débit cardiaque et de la SvO2. Les résistances vasculaires systémiques (RVS) et pulmonaires (RVP) ont été calculées à partir des pressions moyennes et du débit cardiaque selon les formules 20 classiques et exprimées en dynes/sec-'/cm s. Les prélèvements sanguins artériels et veineux-mêlés ont été réalisés de manière simultanée et permettaient, immédiatement sur place, la mesure des gaz du sang grâce à un analyseur acide-base (modèle ABL-520, Radiometer, Copenhague, Danemark). Une correction des mesures a été réalisée par l'analyseur en fonction de la température de 25 l'animal au moment du prélèvement. A partir de ces mesures, les concentrations artérielles et veineuses en oxygène (CaO2 et CvO2) ont été calculées selon la formule usuelle : C(a,v)Oz = (Hb(a,v) x 1,34 x S(a,v)Oz) + (P(a,v)Oz x 0,003) L'extraction d'Oz (EO2), exprimée en pourcentage, a été calculée comme la 30 différence artério veineuse des concentrations en oxygène divisée par la concentration artérielle en oxygène comme suit EOz = (CaO2-CvO2)/CaO2.

Conduite du protocole expérimental Une fois la préparation des animaux réalisée, une période de stabilisation de 30 minutes a été alouée. A la fin de la période de stabilisation, le recueil des paramètres cliniques et biologiques de départ (TO) a été réalisé. Le protocole a alors été commencé et s'est déroulé sur une période de 5 heures (300 minutes). Le recueil des paramètres hémodynamiques et des prélèvements biologiques a ensuite été effectué à 30 (T30), 60 (T60), 90 (T90), 150 (T150) et 300 (T300) minutes de la base.

Six groupes d'animaux ont été constitués.

D Le groupe LPS : le nombre d'animaux étudié était de quatre (n = 4). Dans ce groupe, les animaux ont reçu, en perfusion continue, une dose de 5µg/kg/minute d'endotoxine (LPS) d'Escherichia Coli (sérotype O55:B5, Sigma, France) sur une durée de 30 minutes. Le LPS était dilué dans 50 ml de sérum salé isotonique (SSI). Au décours immédiat de l'administration de LPS, les porcs de ce groupe ont reçu 50 ml de sérum salé isotonique sur 30 minutes puis à nouveau 50 ml de sérum salé isotonique sur les quatre heures restantes. 2j Le groupe LPS et AAT (LPS + AAT) : les animaux de ce groupe, également au nombre de quatre (n = 4), ont reçu l'endotoxine de la même manière que le groupe précédent suivi d'une dose de charge d'ART (Alfalastiri - LFB, Courtaboeuf, France) de 60 mg/kg sur une période de 30 minutes, relayée par une dose d'entretien à nouveau de 60 mg/kg sur les 4 heures restantes en lieu et place du sérum salé isotonique. D Le groupe LPS et Protéine C (LPS + PC) : les quatre animaux de ce groupe (n = 4) ont reçu le bolus d'endotoxine, suivi de l'administration d'une dose de charge de Protéine C à raison de 150 UI/kg sur 30 minutes (Protexele - LFB, Courtaboeuf, France). Cette dose de Protéine C n'a pas été relayée par une dose d'entretien et les animaux ont ainsi reçu 50 ml de sérum salé isotonique sur les quatre heures restantes. Il n'a pas été administré d'ART aux animaux de ce groupe.

Le groupe LPS, AAT et Protéine C (LPS+AAT+PC): les quatre animaux de ce groupe (n = 4) ont également bénéficié de l'administration de l'endotoxine, puis ont reçu, de façon concomitante, les administrations d'ART et de Protéine C selon les mêmes modalités que pour les deux groups précédents. Le groupe témoin : il comprenait cinq animaux (n = 5) qui n'ont reçu que l'administration de sérum salé isotonique en volume équivalent à l'administration des différentes molécules (LPS, AAT, PC) administrées dans les autres groupes. Le groupe AAT seul : il comprenait trois animaux (n = 3) qui n'ont reçu que de l'ART. Ainsi, après une perfusion de sérum salé isotonique en lieu et place de l'endotoxine, les porcs ont reçu la dose de charge d'ART sur 30 minutes suivie de la dose d'entretien sur les quatre heures restantes, comme décrit ci-dessus pour le groupe LPS+AAT. La décision de se limiter à trois animaux a reposé sur la forte similarité des données recueillis pour les trois animaux et sur l'absence de modifications observées sur les paramètres hémodynamiques et biologiques au cours des cinq heures d'expérimentation Le déroulement du protocole pour chaque groupe est représenté sur la Figure 3.

Le remplissage vasculaire a été réalisé au moyen de sérum salé isotonique (SSI). Le débit de ce remplissage a été ajusté afin de maintenir un débit cardiaque supérieur à 20 deux litres par minute et des pressions de remplissage normales. Au terme de la période de cinq heures de protocole, les animaux, toujours endormis et analgésiés, ont été sacrifiés. Des prélèvements histologiques ont été effectués au niveau du foie, du rein et du poumon en vu d'être étudiés et comparés.

25 Prélèvements sanguins et dosages biologiques Les prélèvements sanguins pour les dosages biologiques ont été réalisés sur tubes EDTA (2,5 ml) pour la cytologie et sur tubes citratés 3.8 % (un volume pour quatre volumes) pour les bilans d'hémostase. Le sang était recueilli sur le cathéter positionné en carotidien. Le bilan biologique standard comprenait la numération 30 leucocytaire, l'hémoglobine, les plaquettes, le taux de prothrombine (TP), et le fibrinogène.

Les dosages spécialisés comprenaient : le dosage des monomères de fibrine comme marqueur d'activation de la coagulation et le dosage des D-dimères comme marqueur de la fibrinolyse. Le dosage des monomères de fibrine a été réalisé par méthode immuno-turbidimétrique (Liatest FM®, Stago) avec des essais préalables qui avaient permis de s'assurer de la compatibilité de ce test chez le porc. Le dosage des DDiméres a également été fait par immuno-turbidimétrie (Liatest DDI®, Stago) avec, de la même façon, la confirmation avant dosage que ce test était applicable chez le porc. Le choix de se baser sur les monomères de fibrine comme critère de fibrinoformation plutôt que sur les complexes solubles a été lié à la possibilité d'avoir un dosage quantitatif plus fin que pour les complexes solubles (qui rendait des dosages semi quantitatifs). La validité de cette nouvelle technique de dosage est reconnue. Pour les mesures des gaz du sang (artériel et veineux mêlé), les prélèvements ont été effectués sur seringues héparinées (Pro-vent®, Smith Medical). L'analyseur permettait de mesurer les pressions partielles en oxygène (PO2) et dioxyde de carbone (PCO2), le pH, le taux de bicarbonate et la saturation en oxygène de l'hémoglobine (SO2). Il mesurait également le taux d'hémoglobine, la natrémie, la kaliémie et la glycémie. En revanche, le lactate artériel ne pouvait être mesuré sur notre analyseur. L'échantillon sanguin a été conservé à 4°C et dosé secondairement sur un autre analyseur (modèle ABL-800 Flex, Radiometer, Copenhague, Danemark).

Les dosages spécialisés comprenant le taux de protéine C, les complexes thrombine-antithrombine, l'al-AT, les complexes élastase-al-AT, les cytokines pro inflammatoires (TNFa et IL-6) ainsi que les études histologiques rénales, pulmonaires et hépatiques seront réalisés dans un second temps.

Analyses statistiques L'analyse statistique a été réalisée avec le logiciel Statview. Pour l'ensemble des paramètres évalués et pour chaque groupe, les résultats sont exprimés en moyennes affectées de leur erreur standard. La comparaison des groupes indépendants et des séries indépendantes a été effectuée par analyse de variance (ANOVA). Pour le risque alpha, le degré de significativité retenu était d'être inférieur à cinq pour cent (p < 0,05).

Lorsqu'il existait une différence significative entre les groupes pour un paramètre biologique à T0, l'analyse entre les groupes a été faite sur la cinétique de croissance ou de diminution des valeurs mesurées au cours du suivi afin de limiter le facteur confondant. 1.2. Résultats Influence des traitements sur les paramètres hémodynamiques L'influence des différents traitements a été testée sur différents paramètre hémodynamiques. Les résultats sont en partie présentés sur les Figures 4 et 5.

Pression artérielle moyenne (PAM, voir Figure 4A et B) : Le choc septique induit par le LPS conduit dans un premier temps à une augmentation de la PAM (T = 30 minutes), suivie d'une chute de la PAM (T = 30 à 90 minutes). En absence de traitement (groupe LPS), les porcs restent hypotendus à la fin du protocole (T = 300 minutes), la PAM à T = 300 minutes étant significativement inférieure à celle à T = 0 minutes (voir Figure 4A). Dans le groupe LPS+AAT, qui comprend un traitement par AAT, les porcs sont également toujours hypotendus à T = 300 minutes (voir Figure 4A). Le groupe LPS+PC, traité à la protéine C, montre une tendance à la normalisation de la PAM à T = 300 minutes, comparé à la PAM à T = 0 minutes, même si la PAM à T = 300 minutes est inférieure à la PAM à T = 0 minutes (voir Figure A4). Enfin, le groupe LPS+AAT+PC, traité par une association de PC et d'ART, présente une normalisation complète de la PAM à T = 300 minutes, avec déjà un début de remontée de la PAM à T = 150 minutes, alors qu'aucune remontée de la PAM n'est visible à ce stade dans le groupe LPS+PC (voir Figure 4A).

Ainsi, alors que l'ART seule ne permet pas d'obtenir une remontée de la PAM à T = 300 minutes, lorsque l'ART est associée à la PC, elle amplifie la remontée à la normale de la PAM induite par la PC seule. De plus, cela n'est pas dû à un remplissage vasculaire plus important dans les deux groupes qui restaurent leur hémodynamique (LPS+PC et LPS+AAT+PC). Le remplissage vasculaire est même significativement moins important dans le groupe LPS+PC par rapport aux deux groupes où les animaux restent hypotendus (LPS et LPS+AAT). Il apparaît également moins important dans le groupe LPS+AAT+PC sans que cela soit significatif au niveau statistique (voir Figure 4B).

Fréquence cardiaque (données non montrées) En ce qui concerne la fréquence cardiaque (FC), on note une absence de tachycardie significative dans le groupe LPS+AAT+PC, en comparaison des autres groupes ayant reçu le LPS, confirmant l'amélioration liée à l'association AAT+PC sur ce plan là également (données non montrées).

Hypertension artérielle pulmonaire (PAPM, voir Figure 5A) L'administration de LPS conduit à l'installation d'une hypertension artérielle pulmonaire (PAPM) majeure (voir Figure 5A). Cette donnée est conforme aux études antérieures et aux données de la littérature. Après la fin de l'injection de LPS, la PAPM régresse d'abord puis augmente à nouveau de façon progressive au cours de l'expérimentation, avec installation d'un oedème pulmonaire avec syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) secondaire à l'état de choc endotoxinique. Le traitement par PC et/ou AAT n'induit pas d'amélioration de ce paramètre, avec même une augmentation de la PAPM à T = 300 minutes dans les groupes recevant de la PC (LPS+PC ou LPS+AAT+PC).

Lactate (Figure 5B) Aucune variation significative du taux de lactate n'est observée dans les différents groupes ayant reçu du LPS. Cela peut notamment être dû à la brièveté du délai d'observation, au caractère explosif du choc induit, ou au fait que le taux de lactate reflète davantage l'hypoperfusion que la microcirculation.

Conclusion Bien que la PC seule ou la PC en association avec l'ART n'aient pas d'effet bénéfique sur certains paramètres hémodynamiques (PAPM, lactate) dans le modèle testé, le traitement par AAT en association avec PC permet une normalisation améliorée et plus rapide de la pression artérielle moyenne (PAM) par rapport au traitement PC seule, et possède également un effet bénéfique sur la fréquence cardiaque par rapport aux autres traitements testés. L'association AAT et PC améliore donc le bénéfice obtenu par rapport à un traitement PC seule pour certains paramètres hémodynamiques (pression artérielle moyenne et fréquence cardiaque), sans générer d'effet désavantageux sur les autres paramètres hémodynamiques testés. Influence des traitements sur les paramètres biologiques (Figure 6)

Paramètres non améliorés L'administration de LPS conduit à l'établissement d'un choc endotoxinique 10 caractérisé par une activation de la réponse inflammatoire et de la coagulation, avec notamment une chute rapide des leucocytes circulants (voir Figure 6A, phénomènes de rolling et d'adhésion leucocytaire), une baisse des plaquettes (voir Figure 6C), du fibrinogène (voir Figure 6D) et du taux de prothrombine (TP, voir Figure 6B)). La même tendance est observée pour tous les groupes traités au LPS (LPS, LPS+AAT, 15 LPS+PC, et LPS+AAT+PC). Néanmoins, il est intéressant de noter que : 1. Le phénomène d'inflammation et de coagulation semble être amplifié dans le groupe LPS+AAT traité à l'ART, les valeurs du nombre de leucocytes (voir Figure 6A), du taux de prothrombine (voir Figure 6B), des plaquettes (voir 20 Figure 6C) et du fibrinogène (voir Figure 6D) étant inférieures ou égales aux valeurs obtenues dans le groupe LPS (sans traitement) à T = 300 minutes. 2. Malgré cela, l'association d'ART à la PC ne modifie pas significativement les valeurs de ces paramètres par rapport à un traitement PC seule. Ainsi, malgré l'effet plutôt délétère de l'ART seule sur l'inflammation et la 25 coagulation induites par le LPS, lorsque l'ART est utilisée en association avec la PC, aucun effet délétère par rapport au traitement par la PC seule n'est observé.

Effet sur la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) La CIVD est notamment caractérisée par une fibrinogénése augmentée et une 30 fibrinolyse diminuée. L'influence des différents traitements sur la fibrinogénése et la fibrinolyse a donc été étudiée.5 L'analyse de la fibrinogénése est représentée par le dosage des monomères de fibrine (voir Figure 7A). A T = 150 minutes, la quantité de monomères de fibrine chez les animaux ayant reçu du LPS (choc endotoxinique) n'est pas modifiée par un traitement par la PC seule par rapport aux animaux non traités, et est augmentée par un traitement par l'ART seule. Pourtant, de façon surprenante, elle est significativement diminuée par un traitement associant l'ART et la PC. Ainsi, malgré l'effet positif sur la fibrinogénése (effet pro-coagulant) de l'ART seule et l'absence d'effet de la PC seule sur la fibrinogénése, l'association AAT+PC permet de diminuer la fibrinogénése, supportant ainsi un effet anticoagulant de cette association.

La significativité de ces résultats ne se retrouve plus à T= 300 minutes compte tenu d'un facteur limitant qui est l'impossibilité de rendre un dosage de monomère de fibrine au-delà de 200µg/ml par les méthodes de dilution disponibles. L'analyse est de ce fait biaisée à T= 300 minutes. La fibrinolyse est analysée par mesure du taux de dimères de fibrine (voir Figure 7B). La fibrinolyse est significativement plus importante dans les groupes LPS+AAT+PC (dés T = 150 minutes) et LPS+PC (à T= 300 minutes) par rapport aux deux autres groupes d'animaux ayant reçu le LPS. L'apport seul d'ART ne modifie pas les variations de ce paramètre par rapport au groupe LPS, avec une limitation de la fibrinolyse dans ces deux groupes de façon similaire.

Ainsi, malgré l'absence d'effet du traitement AAT seul chez les porcs ayant reçu du LPS, l'association AAT+PC conduit à une fibrinolyse (effet anti-coagulant) significativement plus importante que le traitement par le PC seule. Au total, l'association AAT+PC conduit à un effet bénéfique sur la CIVD (diminution de la fibrinogénése et augmentation de la fibrinolyse), qui n'est pas observé en cas de traitement par la PC seule, l'administration d'ART seule conduisant au contraire à une aggravation de la CIVD.

Conclusion L'apport d'ART seule au cours de l'état de choc endotoxinique (induit par le LPS) dans le modèle expérimental testé n'améliore pas les paramètres hémodynamiques, ni le développement de la CIVD septique associée également à une tendance à l'aggravation de la fibrinoformation.

La PC seule est bénéfique sur ce modèle tant sur le plan hémodynamique que sur le plan de la coagulation, ce qui est conforme avec ce qui a déjà été démontré dans la littérature par l'utilisation de la forme activée de cette molécule. En outre, malgré l'absence d'effet ou les effets délétères de l'ART seule, et aussi malgré les risques attendus d'annulation des effets de la PC par l'ART, qui est connu pour être un inhibiteur de la PC activée in vivo, les résultats présentés ci-dessus montrent une synergie d'amélioration des paramètres hémodynamiques lors de l'association d'ART et de PC, avec un effet bénéfique sur la coagulation qui semble également plus marqué que lors de l'utilisation de PC seule.

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Claims (16)

1. REVENDICATIONS1. Kit pharmaceutique comprenant de la protéine C (PC) et de l'alphalantitrypsine (AAT).
2. 2. Kit pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisé en ce que la PC est d'origine humaine.
3. 3. Kit pharmaceutique selon la revendication 1 ou la revendication 2, 10 caractérisé en ce que la PC est sous forme de Protéine C inactive.
4. 4. Kit pharmaceutique selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la PC est sous forme de Protéine C activée (PCA). 15
5. 5. Kit pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la PC est sous forme recombinante.
6. 6. Kit pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la PC est purifiée à partir du plasma humain.
7. 7. Kit pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'ART est d'origine humaine.
8. 8. Kit pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, 25 caractérisé en ce que l'AAT est purifiée à partir du plasma.
9. 9. Kit pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'AAT est sous forme recombinante. 30
10. 10. Kit pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la PC et l'AAT sont dans une même composition. 20
11. 11. Kit pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la PC et l'AAT sont dans des compositions distinctes.
12. 12. Kit pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour son utilisation comme médicament dans le traitement du sepsis sévère ou du choc septique.
13. 13. Kit pharmaceutique pour le traitement du sepsis sévère ou du choc septique selon la revendication 12, caractérisé en ce que le sepsis sévère est associé à un score APACHE >_ 25, à au moins deux défaillances d'organe, ou à un syndrome de détresse respiratoire aiguë.
14. 14. Kit pharmaceutique pour le traitement du sepsis sévère ou du choc septique selon la revendication 12 ou la revendication 13, caractérisé en ce que le sepsis est d'origine bactérienne à gram négatif.
15. 15. Kit pharmaceutique pour le traitement du sepsis sévère ou du choc septique selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que la PC et l'ART 20 sont d'abord administrées simultanément, la PC étant ensuite administrée seule.
16. 16. Kit pharmaceutique pour le traitement du sepsis sévère ou du choc septique selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, caractérisé en ce que la PC est administrée dans les 24 heures suivant la lè' défaillance d'organe. 25