KR20090033329A - 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품을 사용한 급성 혈액 손실 빈혈의 치료 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 급성 혈액 손실의 치료를 위한 혈액 대용품의 신규 사용 방법 및 상기 혈액 대용품을 포함하는 신규 제약 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 유용한 혈액 대용품은 (1) 정상산소 조건 하에 세포 배양물에서 시험시 에리쓰로포이에틴의 발현을 유도하고/거나, (2) (a) 대상체의 적혈구용적률 또는 헤모글로빈의 배가 시간의 감소, 및/또는 (b) 대상체의 순환 에리쓰로포이에틴 수준의 증가에 의해 측정시 정상산소 조건 하에 적혈구생성을 유도할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물에 유용한 혈액 대용품은 (1) HIF-1 알파 발현을 안정화시키고/거나, (2) NF-카파 B를 하향조절할 수 있다. 바람직하게는, 상기 혈액 대용품은 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품이거나, 보다 바람직하게는 퍼요오데이트-산화된 ATP5와 분자내 가교되고, 퍼요오데이트-산화된 아데노신과 분자간 가교되고, 환원된 글루타티온과 접합된 헤모글로빈을 포함하는 가교된 헤모글로빈이다.
혈액 대용품, 급성 혈액 손실, 빈혈, 저산소증

Description

가교된 헤모글로빈 혈액 대용품을 사용한 급성 혈액 손실 빈혈의 치료 방법 {METHODS OF TREATING ACUTE BLOOD LOSS ANEMIA WITH A CROSS-LINKED HEMOGLOBIN BLOOD SUBSTITUTE}
본 발명은 급성 혈액 손실, 바람직하게는 급성 혈액 손실 빈혈, 또는 보다 바람직하게는 (i) 질병으로 인한 급성 혈액 손실, (ii) 수술 중 발생하는 급성 혈액 손실, 또는 (iii) 외상에 의한 급성 혈액 손실에 의해 유발되는 빈혈을 치료하거나 예방하기 위한 신규한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은, 혈액 부피를 증가시키고, 급성 혈액 손실과 연관된 저산소증을 완화시키고, 정상산소 조건 하에 적혈구생성(erythropoiesis)을 유도하기에 유효한 양의 혈액 대용품을 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특히, 본 발명의 방법에 유용한 혈액 대용품은 (1) 정상산소 조건 하에 세포 배양물에서 시험시 에리쓰로포이에틴(erythropoietin)의 발현을 유도할 수 있고/거나 (2) (a) 대상체의 적혈구용적률 또는 헤모글로빈의 배가 시간의 감소, 또는 (b) 대상체의 순환 에리쓰로포이에틴 수준의 증가에 의해 측정시 정상산소 조건 하에 적혈구생성을 유도할 수 있다.
본 발명은 또한 제약상 허용되는 담체 내에 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품의 치료 또는 예방적 유효량 또는 유효 부피를 포함하며, 정상산소 조건 하에 세포 배양물에서 시험시 상기 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품이 에리쓰로포이에틴의 발현을 유도하는 것인 신규한 제약 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 제약상 허용되는 담체 내에 가교된 헤모글로빈의 치료 또는 예방적 유효량 또는 유효 부피를 포함하며, 상기 가교된 헤모글로빈이 퍼요오데이트-산화된 ATP와 분자내 가교되고, 퍼요오데이트-산화된 아데노신과 분자간 가교되고, 환원된 글루타티온과 접합된 헤모글로빈을 포함하는 것인 신규한 제약 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 제약 조성물에 유용한 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품 및 가교된 헤모글로빈은 세포 배양물에서 시험시 (1) HIF-1 알파 발현을 안정화시키고/거나 (2) NF-카파 B를 하향조절할 수 있다.
적혈구에 대한 대체물로서의 무세포 헤모글로빈 (인간 및 소)의 사용 가능성이 19세기 후반 이래로 고려되었기는 하지만, 단지 지난 수십년 동안에 혈액 대용품에 대한 연구에 집중적인 노력이 수행되었다. 이러한 늦은 노력의 주요 이유는 혈액 매개 감염성 제제의 잠재적 전파의 우려 및 전세계적인 공여자 혈액의 부족 때문이었다 (문헌 [Sellards et al. (1916) J Med Res 34:469]; [Amberson WR (1934) J Cell Compar Physiol 5:359-382]; [Amberson WR (1937) Biol Rev 12:48-86]; [Winslow RM (2002) Curr Opin Hematol 9(2):146-151]; [Winslow RM (2003) J Intern Med 253:508-517]).
미국에서, 민감성 스크리닝 시험의 이용은 C형 간염 및 인간 T-세포 백혈병 바이러스에 대한 중간 정도의 전파율로 감염성 질환 전파의 위험을, B형 간염에 대 한 혈액 수혈에서 1:63,000으로, 그리고 HIV에 대해 1:493,000으로 감소시켰다 (문헌 [Schreiber et al. (1996) N Engl J Med 334 (26): 1685-1690]). 혈액이 크로이츠펠트-야콥 질환 또는 그의 소 변이체를 전달시킬 수 있는지에 대한 질문이 아직도 답해져야 하는 가운데, 선진 세계에서 여전히 혈액 안전성의 극적인 향상이 일어나고 있다 (문헌 [Hoots et al. (2001) Transfus Med Rev 15(2 Suppl l):45-59]).
한편, 후진 세계에서의 혈액 공급의 안전성의 결여는 긴급한 이유에서 세계 보건 기구 및 국제 과학 학회의 관심사임이 틀림없다. 감염된 인구가 많은 개발도상국에서는, 약 6백만 단위의 기증된 혈액이 HIV, 간염 및 매독에 대해 시험되지 않았다 (세계 보건 기구 웹 페이지 (2005) www.who.int.; 문헌 [Wake et al. (1998) Trop Doct 28(1):4-8]).
세계 보건 기구는 1년에 전세계적으로 1억 단위의 혈액이 요구되는 것으로 추정하고, 매 3.75초마다 미국 시민 한 명이 수혈을 필요로 한다. 동시에, 혈액 기증률은 떨어졌다. 매우 빈번히 혈액 은행은 낮은 기증률 때문에 요구량을 맞추지 못한다. 미국은 이미 유럽으로부터 혈액을 수입하고 있다. 연간 대략 1200만 단위를 사용하는 미국에서, 1년 당 3백만 내지 4백만 단위의 부족은 2030년까지 예측된다. 이러한 기증된 혈액의 예측된 결핍은 자연 재해, 테러리스트 공격 및 전쟁에서의 보다 급한 혈액의 요구를 고려하지 않은 것이다. 혈액 요구량이 1년에 1％의 속도로 증가하는 동안, 미국 혈액 기증률은 연간 1％의 속도로 감소하고 있다 (문헌 [Surgenor et al. (1990) N Engl J Med 322(23):1646-1651]; [Hawkins D. (1999) US News World Rep 126(3):34]; 국립 혈액 데이터 공급 센터 웹 페이지 (2005) www.nbdrc.org; 북부 중앙 혈액 서비스 웹 페이지 (2005) www.yourbloodcenter.org).
혈액 입수 및 시험 비용은 극적으로 상승되었다. 현재, 한 단위의 혈액을 수집, 시험 및 수혈하는 비용은 약 $1,000이고, 이것은 스크리닝되었으나 부패된 혈액을 투여받은 사람들에 의한 소송 비용을 고려하지 않은 것이다 (문헌 [Blumberg et al. (1996) Am J Surg 171:324-330]).
수혈을 위해 적혈구를 사용하는 것의 또다른 불리함은 그들은 냉장 유지되어야 하고, 심지어 포장된 세포도 단지 42일의 저장 수명을 갖는다는 사실이다. 또한, 이의 수혈은 혈액형 검사 및 교차 시험을 필요로 하는데, 이는 사고 현장 또는 전쟁터에서는 수행될 수 없다 (문헌 [Williams et al. (1977) Preservation and Clinical Use of Blood and Blood Components. Hematology. McGraw-Hill Book Company, New York]).
2.1. 혈액 대용품
수혈 의학에서의 상기 문제점 및 기타 문제점 때문에, 혈액 대용품의 신규한 대안을 찾는 것이 필요하게 되었다. 효과적인 혈액 대용품은 수혈로 전파되는 질환의 위험을 제거하고, 세계 혈액 공급을 관리하는데 이용가능한 선택방안을 변화시킬 것이다. 교차 매칭(matching)의 필요없이 보편적으로 상용가능한 무병원체 혈액 대용품은 민간 및 군에서의 적용 모두에 대한 상당한 글로벌 시장을 열 것이다. 실행가능한 산소 운반 용액을 갖는다는 것의 의미는 어떠한 병원체도 없는 잠 재적으로 무한한 혈액 대용품으로 시작하여 광범위하다. 보편적인 혈액 대용품은 출혈성 쇼크에서 환자에 대한 응급 처치 과정을 바꿀 수 있고; 선택(elective) 수술 과정 동안에 수술중 혈액희석법에 사용될 수 있고; 이식을 위해 기증된 장기의 생존 시간을 연장시킬 수 있고; 삶을 위협하는 질병, 예컨대 심장 경색 및 졸중을 치료하기 위한 혈액의 산소 운반 능력을 향상시킬 수 있고; 종양 방사선감작에 사용될 수 있고; 빈혈 및 다른 혈액학적 장애의 치료에 사용될 수 있다 (문헌 [Winslow RM. (2002) Curr Opin Hematol 9(2): 146-151]).
수년 동안, 혈액 대용품 연구는 공상 과학 영역에서 실제 영역으로 이동되었다. 그러나, 사용가능한 혈액 대용품의 상업적 개발은 어느정도 제한적이고, 아직 성공적이지 않다. 혈액 대용품에 기반한 여러 다양한 유리 헤모글로빈이 개발되었지만, 이들은 부작용 때문에 제한된 인간 안전성 시험에서 불만족스럽다고 밝혀졌다. 이들 제품이 갖는 주요 문제점은 이들의 혈관수축 활성이다. 다른 보고된 문제점들은 산화성 스트레스의 악화 및 전신성 염증 반응의 증폭이다 (문헌 [Workshop on Criteria for Safety and Efficacy Evaluation of Oxygen Therapeutics as Red Cell Substitutes (1999) NIH, Bethesda MD]; [Winslow RM. (2000) Vox Sang 79(1): 1-20]).
실제로, 헤마시스트(HEMASSIST)™ (벡스터 헬스케어(Baxter Healthcare; 미국 일리노이주 라운드 레이크)) (미국 특허 제4,598,064호 및 제4,600,531호 (Walder); 제4,831,012호 및 제5,281,579호 (Estep))의 상업적 개발이 중지되었고, 헤모링크(HEMOLINK)™ (라피노스 중합된 인간 헤모글로빈 용액, 헤모솔(Hemosol; 캐나다 미시소가)) (미국 특허 제4,857,636호 (Hsia))의 개발은 인간에서 높은 사망률 또는 심근경색증의 증가 때문에 중단되었다. 보다 먼저, 옵트로(OPTRO™, 재조합 Hb, 소마토겐(Somatogen; 미국 콜로라도주 볼더)) (미국 특허 제5,028,588호, 제5,563,254호 및 제5,661,124호 (Hoffman 등); 제5,631,219호 (Rosenthal 등))의 상업적 개발은 시험된 환자에서 관측된 심각한 전신성 염증 반응 때문에 취소되었다. 헤모퓨어(HEMOPURE®, 소 글루타르알데히드 중합된 헤모글로빈 용액, 바이오퓨어 인크.(Biopure Inc.; 미국 메사추세츠주 캠브리지)) (미국 특허 제5,084,558호, 제5,296,465호 및 제5,753,616호 (Rausch 등); 제5,895,810호 (Light 등))는 "안전성 우려"로 임상이 보류되었다. 2002년에, 노스필드 레보래토리즈 (Northfield Laboratories; 미국 일리노이주 에반스톤) (미국 특허 제4,826,811호, 제5,194,590호, 제5,464,814호, 제6,133,425호, 제6,323,320호 및 제6,914,127호 (Sehgal 등))는 선택 수술 환자에 사용된 그의 폴리헴(POLYHEME®, 글루타르알데히드 중합된 인간 헤모글로빈 용액)에 대해 미국 규제 승인을 획득하는데 실패하였다. 현재, 폴리햄®은 교통사고 피해자의 중증 출혈을 치료하기 위한 동정적 사용(compassionate use) 기준 상에서 임상 시험되고 있다 (문헌 [Workshop on Criteria for Safety and Efficacy Evaluation of Oxygen Therapeutics as Red Cell Substitutes. September 27-29, 1999. NIH, Bethesda, MD]; [Simoni J. (2005) In: Artificial Oxygen Carrier. Its Front Line. K. Kobayashi et al. (Eds.). Springer-Verlag, Tokyo 2005 pp. 75-126]; [Moore E. (2003) J Am Coll Surgeons 196:1-17]).
혈액 대용품이 효과적인 산소 운반 혈장 증량제이기 위해서는 수많은 필요조건을 만족시켜야 한다. 무병원체, 비독성, 비-면역원성 및 비-발열원성이고, 연장된 저장 수명을 갖는 것 이외에도, 이들 제품은 효과적인 조직 산소화 및 24시간 이상의 순환 체류 시간을 허용하기에 충분한, 전혈의 능력에 가까운 만족스러운 산소 운반 능력을 가져야 한다. 혈액 대용품 제품의 콜로이드 삼투압 및 점도는 혈장의 콜로이드 삼투압 및 점도를 초과하면 안된다 (문헌 [Workshop on Criteria for Safety and Efficacy Evaluation of Oxygen Therapeutics as Red Cell Substitutes (1999) NIH, Bethesda, MD]; [Guidance for Industry. Criteria for Safety and Efficacy Evaluation of Oxygen Therapeutics as Red Cell Substitutes (2004) U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Biologies Evaluation and Research, Rockville, MD]).
효과적인 혈액 대용품은 혈류 (혈관확장) 및 조직/장기 관류 (산소화)를 즉시 최대화시킬 수 있는 것 이외에도, 이들 제품은 또한 적혈구생성을 자극해야 한다. 혈액 대용품의 순환 체류 시간이 짧고 (24시간 미만의 반감기), 헴(heme) 자가산화율은 높기 (1일 당 30％ 초과)때문에, 이들 제품의 적혈구생성 활성은 혈액 손실 빈혈 치료의 필수 구성요소이다. 산화된 헴은 산소 수송 능력이 약화되므로, 적혈구생성의 자극은 혈액 대용품으로의 치료의 가장 중요한 요소가 된다. 혈액 손실을 내생 적혈구로 신속히 대체하는 것은 혈액 대용품의 가장 매력적인 미래일 것으로 보인다. 즉, 급성 빈혈의 치료에서, 혈액 대용품은 신체에서 적합한 조직 산소화를 유지하기 위한 충분한 적혈구를 생성할 수 있을 때까지 임시 "산소" 브릿지로서 작용해야 한다 (문헌 [Workshop on Criteria for Safety and Efficacy Evaluation of Oxygen Therapeutics as Red Cell Substitutes (1999) NIH, Bethesda, MD]).
조혈(hemopoiesis)에서 없어서는 안 될 부분인 적혈구생성은 여러 단계의 세포 분열 및 분화를 통한 혈구모세포로부터의 적혈구의 발생이다. 혈구모세포는 골수모세포 (CFU-GEMM)를 생성하며, 이는 버스트-형성 단위 적혈구 (BFU-E), 이후에 콜로니 형성 단위 적혈구 (CFU-E) 및 전(pro)-적혈구모세포가 된다. 전-적혈구모세포는 세포가 헤모글로빈을 생성하기 시작할 때 호염기성 정상적혈구모세포 및 다염성 적혈구모세포가 된다. 이후에, 세포질이 더욱 호산구성이 될 때 정염성(orthochromatic) 적혈구모세포가 된다. 그의 핵을 배출한 후에, 세포는 그물적혈구로서 순환에 들어가고, 수일 내에 그의 폴리리보좀을 느슨하게 한 후에 성숙 적혈구가 된다. 정상 조건에서, 전체 적혈구생성 과정은 5일이 넘지 않아야 한다. 성숙 적혈구의 수명은 대략 90 내지 120일이고, 그의 연속 대체를 필요로 한다 (문헌 [Hillman RS, Finch CA: Red Cell Manual. 7th ed., Philadelphia: F.A. Davis, c1996, viii, 190 pp.]).
적혈구생성의 조절은 산소 분압 (농도), 및 산소 및 산화환원 조절된 전사 인자 및 다수의 성장 인자 (에리쓰로포이에틴-EPO, IL-3, IL-9, SCF, GM-CSF) 및 미네랄, 특히 철을 포함하는 세포 산화환원 상태에 기반한 고도 민감성 피드백 시 스템에 의해 조절되는 복합 과정이다 (문헌 [Adamson JW (1991) Biotechnology 19:351-361]; [Sasaki R (2003) Int Med 42(2): 142-149]; [Lacombe C et al. (1998) Haematologica 83(8):724-732]).
EPO가 적혈구생성을 담당하는 단독 성장 인자는 아니지만, 수임(committed) 전구세포 증식의 가장 중요한 조절자 및 항-아폽토시스 보호자이다. EPO 수용체 (EpoR)를 통한 EPO의 주요 기능은 아폽토시스로부터 수임 적혈구 전구세포를 구조하는 것이다. 항-아폽토시스 단백질 Bcl-X(L)의 EPO-의존성 상향조절은 임의의 외인성 신호와는 무관하게 아폽토시스-보호된 수임 적혈구모세포의 "디폴트(default)" 말단 분화를 허용한다 (문헌 [Socolovsky et al. (1999) Cell 98(2):181-91]; [Dolznig et al. (2002) Curr Biol 12(13):1076-1085]).
적혈구생성 사건 및 관련 인자의 도식적 표현:
CFU-GEMM → (EPO, SCF, IL-9) → BFU-E → (EPO, SCF, GM-CST, IL-3) → CFU-E → (EPO, GM-CSF) → 적혈구모세포 (EPO) → 그물적혈구 → RBC
빈혈은, 저산소증을 유발하는, 혈액의 산소 운반 능력의 병리학적 결핍으로 정의된다. 빈혈의 주요 원인은 급성 혈액 손실, 불응성 빈혈에 대해 2차적인 만성 질병, 암, 혈관내 용혈, 및 적혈구 분리의 증가 또는 적혈구 생성의 감소이다. 저산소증에 대한 자연적인 반응은 적혈구생성 반응의 증가이다 (문헌 [Campbell K. (2004) Nurs Times 100(47):40-43]).
저산소증은 EPO를 생성하기 위해 신장 (피질)의 세관주위(peritubular) 간질성 세포를 자극한다. EPO는 또한 간에서, 그리고 뉴론 아폽토시스 및 저산소증 동 안의 손상에 대해 이를 보호하는 뇌에서의 별아교세포에서 합성된다. 산소-조절된 전사 인자; 저산소증 유발가능 인자-1 알파 (HIF-1 알파) 및 -1 베타 (HIF-1 베타)는 인간 염색체 7 상의 단일 유전자의 통제하에서 이러한 과정을 매개한다. EPO 코딩 유전자의 3' 인핸서에 특이적으로 결합하는 HIF-1은 또한 저산소증에의 적응에 중요한 다른 유전자의 프로모터이다 (문헌 [Semenza et al. (1992) Mol Cell Biol 12;5447-5454]; [Brines et al. (2005) Nat Rev Neurosci 6(6):484-494]).
세멘자(Semenza) 및 왕(Wang)에 의해 동정된 HIF-1은 두 개의 기본 나선 루프-나선/PAS 단백질 (HIF-1 알파) 및 아크릴 탄화수소 핵 전위자 HIF-1 베타로 구성된 이종이량체이다. HIF-1 알파가 저산소성 조건에서만 존재하는 반면, HIF-1 베타는 산소에 의해 그렇게 영향받지 않는다. 정상산소에서, HIF-1 알파의 분해는 피롤-4-히드록실라제에 의한 그의 프롤린 잔기의 산소 매개 히드록실화에 따라 달라진다. HIF-1 알파의 히드록실화는 히드록실화된 도메인에 결합하지만 비-히드록실화된 도메인에는 결합하지 않는 폰 히펠-린다우(von Hippel-Lindau) 종양 억제 단백질에 의한 그의 신속한 분해를 개시한다. 폰 히펠-린다우 종양 억제 단백질은 유비퀴틴화 기계에 대한 유비퀴틴 리가제(ligase) 연결 HIF-1 알파의 일부이다 (문헌 [Wang et al. (1995) J Biol Chem 270; 1230-1237]; [Wang et al. (1993) J Biol Chem 268;21513-21518]; [Kallio et al. (1999) J Biol Chem 274(10):6519-6525]).
그러나, 저산소성 조건에서, 산소의 결핍은, 세포질에서 핵으로 신속하게 전위하고,
1) 산소 수송: 적혈구생성 (EPO); 철 수송 (트랜스페린); 철 흡수 (트랜스페린 수용체),
2) 혈관 조절: 혈관신생 (VEGF, EG-VEGF, PAI-1); 혈관 긴장도의 조절 (iNOS, 알파 1 B-아드레날린 수용체, ET-1); 혈관 리모델링 (HO-1),
3) 혐기성 에너지: 글루코스 흡수 (글루코스 수송체 1); 해당작용 조절 (PFKFB3); 해당작용 (포스포프룩토키나제 1, 알돌라제, GAPDH, 포스포글리세레이트 키나제 1, 에놀라제 1, 락테이트 데히드로게나제 A
에 관여하는 여러 산소-조절된 표적 유전자의 마스터 조절자로서 작용하는 HIF-1 알파의 분해를 억제한다 (문헌 [Wenger RH (2002) FASEB J 16;1151-1162]; [Gleadle et al. (1997) Blood 89(2):503-509]; [Gleadle et al. (1998) Mol Med Today 4(3): 122-129]).
HIF-1 알파는 또한 정상산소에서도 안정화될 수 있다. 예를 들면, 산화 스트레스에서, NF-카파 B를 활성화하고 염증성 유전자 (즉, TNF-알파, IL-1 베타, IL-6)를 유도하는 세포 산화환원 평형을 변화시킴으로써, 반응성 산소 종 (ROS)은 HIF-1 알파를 안정화시킬 수 있다. 그러나, 또한 이들 염증성 사이토킨은, VEGF 유전자 유도를 촉진하고 따라서 적혈구생성을 억제하고 혈관신생을 가속화하면서 EPO 유전자에 결합하는 HIF-1 알파를 억제할 수 있다. 암 환자에서, 이러한 현상은 효과적인 혈관신생에 기인하여 중증 빈혈 및 과도한 종양 성장을 초래할 수 있다. 유사하게, 정상산소 조건 하에 HIF-1 알파를 안정화시킨다고도 공지되어 있는 다른 염증성 매개자 TGF-베타는 EPO의 적혈구생성 활성을 감소시키면서 적혈구 전 구세포의 분화를 차단할 수 있다 (문헌 [Hellwing-Burgel et al. (1999) Am Soc Hematol 94:1561-1567]; [Linch DC (1989) Schweiz Med Wochenschr 119(39): 1327-1328]).
염증은 또한 말기 신장 질환을 갖는 환자의 EPO 내성의 발병기전과 연관되어 있다. TNF-알파, IL-1 베타 및 IL-6은 요독증에서 적혈구생성을 억제하는 것으로 시사된다. 동물 모델 및 인간에서, IL-6의 투여는 적혈구 전구세포 상의 직접 억제에 의한 저증식성 빈혈을 유발한다 (문헌 [Trey et al. (1995) Crit Rev Oncol Hematol 21:1-8]; [Yuen et al. (2005) ASAIO J 51(3):236-241]).
정상산소 조건 하에 HIF-1 알파를 안정화시키는 것으로 공지된 다른 인자들에는 NO, PDGF 및 oxLDL이 있다. HIF-1 알파 정상산소 조절을 제어하는 분자적 경로는 ROS, PI3K, TOR 및 MAP 키나제, 특히 ERK 1/2에 의해 매개된다 (문헌 [Haddad et al. (2000) J Biol Chem 275(28):21130-21139]; [Haddad et al. (2001) FEBS Lett 505(2):269-274]; [Lando et al. (2000) J Biol Chem 275(7):4618-4627]; [Richard et al. (1999) J Biol Chem 274(46):32631-32637]).
적혈구생성 반응에서 유리 헤모글로빈이 관련될 수 있다는 것에 대한 첫번째 발견은 조 헤모글로빈 용액의 투여후 인간에서의 적혈구생성 지표 (그물적혈구 개수 및 적혈구용적률)의 증가를 관측한 앰버슨(Amberson)으로부터 1949년에 시작되었다. 이 실험은 신부전증에 기인한 환자의 죽음으로 비극적으로 끝났다 (문헌 [Amberson et al. (1949) J Appl Physiol 1:469-489]). 무-기질(stroma-free) 헤모글로빈 용액을 정상 인간 자원자에게 주입하였던 사비츠키(Savitsky)에 의해 30 년 후에 수행된 임상 시험도 유사한 비극적 결과를 나타내었다. 상기 헤모글로빈으로 처치된 모든 대상체는 전신성 고혈압증 및 신부전증을 나타내었고, 한 명의 사람이 사망하였다 (문헌 [Savitsky et al. (1978) Clin Pharmacol Ther 23:73-80]).
이들 초기 임상적 실험들은 가교되지 않은 헤모글로빈이 치명적이고, 수혈에 적합하지 않다는 것을 입증하였다. 당시에 발명자들은 상기 병리학적 사건들의 메카니즘을 설명할 수 없었다. 현재 지식을 적용함으로써, 앰버슨 및 사비츠키의 임상 시험에서 나타났던 병리학적 반응, 특히 혈압의 빠른 상승은 헤모글로빈의 내인성 독성의 결과임을 시사하는 것이 온당하다. 이제, 산화질소를 포착하고 다른 혈관 긴장도 조절-메카니즘에 영향을 줌으로써 헤모글로빈-기반 혈액 대용품이 심장 박출량의 감소 및 총 혈관 말초 내성의 증가와 관련된 혈압의 심각한 상승을 발생시킬 수 있다는 것은 명백하다 (문헌 [Simoni J. (2005) In: Artificial Oxygen Carrier. Its Front Line. K. Kobayashi et al. (Eds.). Springer-Verlag, Tokyo, 2005 pp. 75-126]).
헤모글로빈은 혈압상승 성분이고, 현재 사용되는 화학적 또는 재조합 변형 기술은 이 문제를 바로잡지 못하였다. 헤마시스트™, 옵트로™-rHb1.1, 폴리헴®, 헤모퓨어® 및 헤모링크™를 비롯한 시험된 모든 혈액 대용품 제품들은 혈관 수축 (혈액 대용품 개발자의 주요한 응보이었던 부작용)을 유발하였다. 상기 혈액 대용품의 주사후 관측된 혈압의 증가는 혈관수축으로부터 기인한 말초 혈관 내성의 증가에 의해 유발된다 (문헌 [Winslow RM (1994) Transf Clin Biol 1(1);9-14]; [Hess et al. (1994) Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol 22(3):361-372]; [Kasper et al. (1996) Cardiovasc Anesth 83(5):921-927]; [Kasper et al. (1998) Anesth Anal 87(2):284-291]; [Winslow RM (2003) J Intern Med 253:508-517]). 또한, 일부 제품이, 조직/장기 관류 속도를 저하시키고 저산소증을 생성할 수 있는 모세관 흐름을 폐쇄하는 경향을 갖고 있다고 보고되었다 (문헌 [Cheung et al. (2001) Anesth Anal 93(4):832-838]).
저산소성 환경이 HIF-1 알파를 안정화시키기 때문에, 혈관수축을 촉진하고 저산소증을 생성하는 혈액 대용품이 HIF-1 알파 조절된 유전자를 유도할 수 있다는 것은 이론상 가능하다. 그러나, 상기 메카니즘은 공기가 필요한 조직에 충분한 양의 산소를 전달해야 하는 혈액 대용품의 주요 역할과 모순된다. 허혈성 장기로의 산소의 적당한 전달은 혈액 대용품으로서의 헤모글로빈 용액의 규제 승인에 주요 필요조건이다. 따라서, 그러한 "적혈구생성 효과"는 병리학적으로 고려되어야 한다. 비독성이고 효능적이라고 고려되기 위하여, 혈액 대용품 제품은 혈류 및 조직 관류을 최대화시켜야 하고, 이에 따라 산소화를 최대화시켜야 한다 (문헌 [Workshop on Criteria for Safety and Efficacy Evaluation of Oxygen Therapeutics as Red Cell Substitutes (1999) NIH, Bethesda, MD]; [Guidance for Industry. Criteria for Safety and Efficacy Evaluation of Oxygen Therapeutics as Red Cell Substitutes (2004) U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Biologies Evaluation and Research, Rockville, MD]).
또한, 보다 많은 용량이 사용되었을 때 그러한 혈액 대용품이 그들의 초기 저산소성-구동 적혈구생성 반응을 억제할 수 있는 염증성 반응을 촉발할 수 있다는 것도 이론상 가능하다.
1990년대에, 시모니(Simoni) 등은 헤모글로빈이 염증에 관여하는 유전자의 조절과 연관된 산화환원 조절된 전사 인자 NF-카파 B의 강력한 유도인자라는 것을 발견하였다. 그는 내피 NF-카파 B의 활성화가 헤모글로빈의 전-산화성 포텐셜, 및 GSH/GSSG를 산화적 평형으로 이동시키는 헤모글로빈-매개 세포 산화 스트레스의 정도에 따라 달라질 수 있다는 것을 발견하였다. 이 연구에서, 글루타르알데히드 중합된 소 헤모글로빈은 비변형 헤모글로빈보다 강력한 NF-카파 B의 유도인자인 것으로 보인다. 시모니 등은 글루타르알데히드 중합된 헤모글로빈이 가장 높은 내피 지질 과산화 및 가장 큰 세포내 GSH 결핍을 생성한다는 사실과 상기 효과를 연결시켰다. 이들 연구에 기반하여, 시모니 등은 NF-카파 B의 활성화가 헤모글로빈-유도성 산화 스트레스와 헤모글로빈-매개 염증성 반응 간의 "브릿지"로서 고려될 수 있다고 제안하였다. 또한, 그의 발견은 헤모글로빈을 신호전달 분자로서 보는 기초를 확립하였다 (문헌 [Simoni et al. (1997) Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol 25(1-2): 193-210]; [Simoni et al. (1997) Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol 25(1-2):211-225]; [Simoni et al. (1998) ASAIO J 44(5):M356-367]; [Simoni et al. (1994) Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol 22(3):525-534]; [Simoni et al. (2000) ASAIO J 46(6):679-692]; [Simoni et al. (1994) Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol 22(3):777- 787]; [Pahl HL (1999) Oncogene 18:6853-6866]; [Gilmore TD (2005)]).
시모니에 의한 후속적 연구에서 NF-카파 B를 촉발하는 헤모글로빈 용액이 HIF-1 알파 조절된 유전자, 특히 EPO를 억제할 수 있다는 증거가 확립되었다 (문헌 [Simoni et al (2003) Artificial Blood 11(1):69]; [Simoni et al. (2003) ASAIO J 49(2):181]; [Simoni J. (2005) In: Artificial Oxygen Carrier. Its Front Line. K. Kobayashi et al. (Eds.). Springer-Verlag, Tokyo, 2005 pp. 75-126]).
또한, 초기 적혈구 전구세포에서 NF-카파 B 경로의 높은 활성이 적혈구-특이적 유전자의 억제와 연관된다는 것이 보고되었다 (문헌 [Liu et al. (2003) J Biol Chem 278(21):19534-19540]).
염증은 EPO 내성의 발병기전, 특히 빈혈 및 암에 기여하는 것으로 일반적으로 인정된다 (문헌 [Yuen et al. (2005) ASAIO J 51 (3):236-241]; [Hellwig-Burgel et al. (1999) 94(5): 1561-1567]).
따라서, 세포 산화환원 상태를 변화시키는 혈액 대용품이 NF-카파 B 조절된 유전자 (즉, 사이토킨)를 촉발시키고 정상산소 환경에서조차 HIF-1 알파를 안정화시킬 수 있다는 것이 이론상 가능하다. 그러나, 그러한 조건에서, HIF-1 알파의 EPO 유전자로의 효과적인 결합은 염증성 사이토킨에 의해 억제된다. 헤모글로빈이 염증성 사이토킨의 생성과 연결되어 있고, 염증성 사이토킨이 강력한 항-적혈구생성제이기 때문에, 높은 친-염증성 포텐셜을 갖는 혈액 대용품이 적혈구생성 반응을 억제할 수 있다고 제안하는 것이 가능하다.
실제로, 현재 시험된 일부의 혈액 대용품이 혈관수축성 사건을 매개할 뿐만 아니라, 염증성 반응을 유도할 수도 있다는 것이 보고되었다. 상기 반응은 단계적 용량 상승 연구(dose escalation study; 임상 시험 후기) 동안에 보다 명백해졌고, 벡스터의 헤마시스트™, 바이오퓨어의 헤모퓨어®, 소마토겐의 rHb1.1-옵트로™ 및 노스필드의 폴리헴®으로 관측되었다. 혈관수축 및 허혈성/염증성 반응은 상기 혈액 대용품의 임상적 개발의 방향을 다시 정하거나 중지하거나 중단하는 주요 이유로서 인용된다 (문헌 [Simoni J. (2005) In: Artificial Oxygen Carrier. Its Front Line. K. Kobayashi et al. (Eds.). Springer-Verlag, Tokyo, 2005 pp. 75-126]).
현재 시험된 혈액 대용품의 가능한 적혈구생성 활성에 대한 또다른 과학 이론적 근거는 헤모글로빈이 천연 친-아폽토시스 포텐셜을 갖는다는 사실이다. 이러한 관찰은 친-적혈구생성 제제로서의 EPO의 주요 기능이 아폽토시스로부터 수임 적혈구모세포를 보호하여 적혈구생성이 일어나게 하는 것이기 때문에 매우 중요하다 (문헌 [Socolovsky et al. (1999) Cell 98(2): 181-91]; [Dolzniget al. (2002) Curre Biol 12(13): 1076-1085]).
비변형 헤모글로빈이 인간 내피 세포에 대해 친-아폽토시스 포텐셜을 갖고, 카스파제-8 및 -9가 세포내 GSH의 고갈을 가속화시킬 수 있는 이러한 효과를 제어한다는 것이 보고되었다 (문헌 [Meguro et al. (2001) J Neurochem 77(4):1128-1135]; [Simoni et al. (2002) ASAIO J 48(2):193]). 디아스피린 변형된 헤모글로빈 (헤마시스트™) 및 그의 글루타르알데히드-중합된 버전 또한 아폽토시스 세포사를 나타내면서 형태학적 변화, G2/M 억제 및 DNA 분해를 유도한다 (문헌 [Goldman et al. (1998) Am J Physiol 275(3 Pt2):H1046-53)]; [D'Agnillo et al. (2001) Blood 98(12):3315-3323]). 생체외 심장 관류 모델에 사용되는 헤모퓨어® (바이오퓨어)의 수의(veterinary) 버전인 옥시글로빈은 관상 동맥 내성의 상당한 증가와 관련되어 있는 아폽토시스 내피 세포사멸을 발생시키는 것으로 발견되었다 (TUNEL 분석) (문헌 [Mohara et al. (2005) ASAIO J 51(3):288-295]).
골수 세포와 직접 접촉하는 친-아폽토시스 포텐셜을 갖는 임의의 제제가 항-적혈구생성 활성을 갖는다는 것은 명백하게 되었다. 그러한 제제는 적혈구생성을 불가능하게 만들면서 EPO의 항-아폽토시스 효과와 경쟁할 것이다. 실제로, 헤모글로빈 기반 혈액 대용품은 골수 세포에 의해 부분적으로 제거되고, 이에 따라 이들은 적혈구모세포와의 직접 접촉 상태에 있다 (문헌 [Shum et al. (1996) Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol 24(6):655-683]).
헤모글로빈이 친-아폽토시스 포텐셜을 갖고, 골수와 직접 접촉할 수 있다는 것을 자각하면서, 친-아폽토시스 활성을 갖는 임의의 혈액 대용품 제품이 상대적으로 고농도로 주어질 때 적혈구생성을 억제할 것이라는 것을 제안하는 것이 가능하다.
과학 및 특허 문헌에서, 헤모글로빈-기반 혈액 대용품의 적혈구생성 효능에 대한 정보는 제한되어 있다. 1997년에, 로젠탈(Rosenthal) 등은 적혈구 전구세포를 비롯한 전구 모세포의 성장 또는 분화를 증진시키는 것을 통해 재조합 헤모글로빈 (rHb1.1)을 갖는 포유동물에서의 조혈 자극 방법을 청구하였다 (미국 특허 제5,631,219호). 미국 특허 제5,028,588호, 제5,563,254호 및 제5,661,124호 (Hoffman 등)는 재조합 헤모글로빈 rHb1.1 (상표명 옵트로™)을 보호한다.
미국 특허 제5,631,219호에서, 마우스에 1주일 당 3시간 0.5 또는 1.0 mg/kg 체중의 용량으로 정맥내로 투여된 rHb1.1은 골수에서의 적혈구의 초기 전구체인 BFU-E의 증가를 유도한다. 미국 특허 제5,631,219호에서, 로젠탈 등은 정상 마우스 (BDF-1)를 rHb1.1로 처치 후에 적혈구용적률이 증가했다고 보고하였다. rHb1.1이 수임 적혈구 전구체 이외의 수준에서 작용하는지 평가하기 위해, 로젠탈은 매우 초기의 비-수임 전구세포, 콜로니 형성 단위-비장 (CFU-S) 상에서의 rHb1.1의 영향을 평가하였다.
미국 특허 제5,631,219호에 따라, 로젠탈은 0.5 mg/kg 체중의 농도의 rHb.1.1이 CFU-S의 수를 증가시킨다는 것을 발견하였다. 미국 특허 제5,631,219호에서, 저용량 수준의 헤모글로빈 0.5 mg/kg 체중이 고용량의 rHb1.1 (5 및 10 mg/kg) 보다 더 잘 작용하는 것으로 보이며, 예상외로 낮은 용량에서 최대 효과를 시사한다.
어떠한 이론적 설명도 제공하지 않고, 로젠탈 등은 저용량 (0.5 mg/kg 체중)의 rHb1.1이 전구세포 상에서 직접 작용하거나, 또는 조혈을 간접적으로 증진시키고 적혈구생성 인자로서 작용한다고 결론지었다.
로젠탈 등에 의해 사용된 rHb1.1의 농도 (0.5 내지 10 mg/kg 체중)는 산소 수송에 대해 임상적으로 관련이 없고, 이에 따라 급성 혈액 손실의 치료에도 관련이 없다. 치료적으로 유효하기 위하여, 헤모글로빈-기반 혈액 대용품은 밀리그램 단위가 아니라 그램 단위로 수혈되어야 한다. 따라서, 미국 특허 제5,631,219호는 급성 혈액 손실 빈혈의 치료에 적용될 수 없다.
게다가, 미국 특허 제5,631,219호의 특허된 청구항은 제공된 실시예와 불일치한다. 로젠탈은 0.001 내지 10,000 mg/kg 체중인 치료상 유효 수준의 헤모글로빈을 청구하였다. 이들 청구항은 오직 0.5 mg/kg 체중의 농도의 rHb1.1이 조혈 효과를 갖는다는 로젠탈의 실시예에 의해 지지되지 않는다. 아마도, 로젠탈은 대략 1.75 g (1,750 mg)/kg 체중의 용량의 화학적으로 변형된 소 헤모글로빈 용액이 인간에서 유효한 적혈구생성 반응을 나타낸다는 본 발명자들의 공개된 문헌에 영향받았을 것이다. 미국 특허 제5,631,219호는 문헌 [Feola et al. (1992) Surg Gynecol Obstet 174(5):379-386]에 의존한다.
1997년에, 모카타쉬(Moqattash) 등은 정상 및 AIDS 마우스에서의 AZT의 억제 효과로부터 조혈 활성을 구조하기 위한 주입된 rHb1.1 및 EPO의 능력을 비교하였다. 그 결과는 사용된 보다 높은 농도의 rHb1.1 (10 내지 15 mg/kg 체중)이 대부분 혈액 지수의 보다 상당한 증가를 유도하지 않는다는 것을 나타내었다. 게다가, rHb1.1 5 mg/kg 체중 + 2 U EPO/마우스/일의 조합 치료가 rHb1.1 5 mg/kg 체중 단독보다 더 잘 작용하는 것으로 나타났다 (문헌 [Moqattash et al. (1997) Acta Haematol 98(2):76-82]).
2년 후에, 루톤(Lutton) 등은 로젠탈의 연구에 성공적으로 반론을 제기하였다. 토끼에서 임상적 해당량의 가교된 및 비-가교된 헤모글로빈의 조혈 효과를 분석함으로써, 그는 둘 모두의 고농도의 헤모글로빈 용액이 BFU-E 및 CFU-S 생성의 상당한 변화를 제공하지 않고, 따라서 이들은 어떠한 조혈 활성도 나타내지 않는다 고 결론지었다 (문헌 [Lutton et al. (1999) Pharmacology 58:319-324]).
재조합 (즉, rHb1.1), 가교된 사량체 (즉, 헤마시스트™), 및 중합된 (즉, 헤모퓨어®, 폴리헴®) 헤모글로빈들은 다양한 전임상 및 임상 연구에서 광범위하게 시험되어 왔다. 시험된 모든 헤모글로빈 용액은 독성인 것으로 나타났다 (문헌 [Workshop on Criteria for Safety and Efficacy Evaluation of Oxygen Therapeutics as Red Cell Substitutes (1999) NIH, Bethesda, MD]).
48명의 건강한 남성 자원자가 15 내지 320 mg/kg 체중의 5％ rHb1.1을 투여받도록 무작위로 지정된, rHb1.1로의 인간 임상 시험은 심각한 부작용, 예컨대 위장연동 이상항진, 발열, 오한, 두통 및 요통과 관련되었다 (문헌 [Viele et al. (1997) Anesthesiology 86(4):848-858]). 수술을 받고 67 내지 365 mg/kg 체중의 rHb1.1을 투여받은 환자에서의 또다른 임상 연구에서는, 어떠한 심각한 유해 사건도 발생하지 않았다. 그러나, 환자들은 고혈압증, 염증성 증상 및 췌장 효소의 증가로 고통받았다. 상기 임상 시험들에서, rHb1.1의 적혈구생성 효과 또한 보고되지 않았다 (문헌 [Hayes et al. (2001 Cardiothorac Vase Anesth 15(5):593-602]).
rHb1.1를 사용한 매우 불만족스러운 임상 시험은 상기 재조합 혈액 대용품 제품의 상업적 개발을 종료시켰다. 1990년대 후반에, 소마토겐/벡스터는 임상적으로 성공적이지 못한 rHb1.1을 대체하기 위해 신규한 2차-생성 재조합 제품 (rHb2.0; 미국 특허 제6,022,849호 (Olson 등))에 집중하였다. 신규한 제품은 산화질소와의 보다 낮은 반응 속도를 갖도록 설계되었다. 그러나, 전임상 시험 2년 후에, rHb2.0의 상업적 개발 또한 중단되었다.
rHb1.1을 사용한 임상 실험은 미국 특허 제5,631,219호에서 왜 저용량 수준 (헤모글로빈 0.5 mg/kg 체중)에서 고용량 (5 및 10 mg/kg)에서보다 더 잘 작용하는 것 같이 보였는지 이해하는데 도움을 줄 수 있다. 아마도, 고용량의 rHb.1.1의 강력한 친-염증성 및 친-아폽토시스 포텐셜이 EPO 유전자의 유도를 억제하여 적혈구생성을 불가능하게 만들었을 것이다. 따라서, 수 mg/kg 체중보다 높은 농도의 rHb1.1이 조혈-염증성 사건의 일부로서 친-염증성 식세포의 생성을 촉진하면서 적혈구생성의 억제를 제공할 것이라고 제안하는 것이 가능하다.
다른 헤모글로빈 기반 혈액 대용품 제품 또한 임상 시험 후기에서 성공적이지 못했다.
헤마시스트™를 사용한 III 상 연구는 비극적으로 끝났다. 헤마시스트™로 처치된 환자는 대조군보다 상당히 높은 사망률을 나타냈다. 1998년 6월에, FDA의 추천에 따라, 헤마시스트™의 개발 프로그램은 안전성 우려로 인해 중단되었다. 헤마시스트™ 임상 시험에서, 적혈구생성 또는 조혈 효과는 보고되지 않았다 (문헌 [Sloan et al. (1999) JAMA 282:1857-1864]).
헤모퓨어®의 임상적 개발 (미국 특허 제5,084,558호, 제5,296,465호 및 제5,753,616호 (Rausch 등); 제5,895,810호 (Light 등))은 "안전성 우려"로 인해 임상 중지가 내려졌다. 상기 제품의 강력한 혈관수축성, 전-산화성, 친-염증성 및 친-아폽토시스성 포텐셜로 인해, 상기 제품의 혈액 대용품으로서의 실용성이 필연적으로 제한될 수 있다 (문헌 [Kasper et al. (1996) Cardiovasc Anesth 83(5):921-927]; [Kasper et al. (1998) Anesth Anal 87(2):284-291]).
헤모퓨어® 단독의 적혈구생성 효과는 전혀 실증되지 않았다 (문헌 [Gawryl MS (2003) Artif Blood 11(1):46]). 그러나, 헤모퓨어® (+ EPO)는 여호와의 증인(Jehovah's Witness)에서 위장 출혈 후 중증 빈혈을 치료하는데 실험적으로 사용되었다. 3.5 g/dL의 초기 헤모글로빈을 갖는 50세의 남성에게 헤모퓨어® (7 단위) 및 고용량의 재조합 EPO (500 U/kg/일)가 주사되었다. 헤모글로빈 수준이 초기에는 유지되었고, 이후에 서서히 rEPO 요법 24일차에 최대 7.6 g/dL까지 증가되었다. 이 실험은 헤모퓨어® (24시간 미만의 반감기를 가짐)가 골수 적혈구 생성에 대한 재조합 EPO의 최대 효과를 기다리는 동안 초기 요법으로서 수행될 수 있다는 것을 입증하였다. 상기 임상 연구는 헤모퓨어® 단독으로는 적혈구생성 포텐셜을 갖지 않는다는 것을 나타내었다 (문헌 [Gannon et al. (2002) Crit Care Med 30(8):1893-1895]).
2002년에, 폴리헴® (미국 특허 제4,826,811호, 제5,194,590호, 제5,464,814호, 제6,133,425호, 제6,323,320호 및 제6,914,127호 (Sehgal 등))은 선택 수술 환자에 사용하기 위한 미국 규제 승인을 획득하는데 실패하였다. 현재, 폴리헴®은 교통사고 피해자의 중증 출혈을 치료하기 위한 동정적 사용 기준으로 임상 시험되고 있다.
과거에는, 폴리헴®은 지속적 결장 출혈을 앓고 헤모글로빈 2.9 g/dL인 위독한 빈혈 여성을 치료하기 위해 사용되었다. 이 임상 연구에서, 폴리헴®은 적혈구생성 반응을 자극하는데 필요한 고용량의 재조합 EPO와 함께 사용되었다. 따라서, 헤모퓨어®와 유사하게 폴리헴®은 단독으로는 어떠한 적혈구생성 활성도 갖지 않 는다는 것이 거의 확실하다 (문헌 [Allison et al. (2004) Southern Med J 97(12): 1257-1258]).
헤모링크™의 임상적 개발 (미국 특허 제4,857,636호 (Hsia))은 인간에서 (염증-기반) 심근 경색증 비율의 증가 때문에 중지되었다. 헤모링크™는 천연 헤모글로빈과 비교하여 자가산화, 산화적 변형, 및 헴 기의 보전성에 있어서 덜 안정적인 것으로 밝혀졌다. 높은 혈관수축성, 전-산화성 및 친-염증성 특성을 나타내는 헤모링크™는 단독으로 적혈구생성을 자극하는 제품으로서 전혀 특징규명되지 않았다 (문헌 [Alayash Al (2004) Nature 3:152-159]; [Riess JG (2001) Chem Rev 101(9):2797-2919]).
과거에, 다른 혈액 대용품 제품 (헤모퓨어®, 폴리헴®)과 유사하게, 헤모링크™가 중증 빈혈 및 헤모글로빈 3.2 g/dL를 갖는 53세 여성 여호와의 증인의 동정적 치료에 시험되었다. 또한 상기 시험에서, 헤모링크™는 고용량의 재조합 EPO 및 황산제1철과 함께 투여되었다. 14일 후에, 환자의 헤모글로빈 수준은 단지 6.5 g/dL로 증가하였다 (적혈구용적률 23％). 이 시험은 독성 헤모글로빈 기반 혈액 대용품이 단독으로 적혈구생성 사건을 자극할 수 없다는 것에 대해 더욱 명백하다는 것을 보여준다 (문헌 [Lanzinger et al. (2005) Can J Anaesth 52(4):369-373]).
헤모글로빈의 적혈구생성 활성에 대한 기본 연구는 또한 매우 제한적이다. 최근에, 저산소성 조건 하에 헤모글로빈이 HIF-1 알파의 발현을 증가시킨다는 것이 보고되었다. HIF-1 알파의 검출을 위한 소 대동맥 내피 세포 모델 및 웨스턴 블롯 방법을 이용하여, HIF-1 알파의 보다 높은 발현은 모든 비변형 헤모글로빈 용액에서 제1철-Hb의 손실 및 제2철-Hb의 축적 (헴의 산화)과 연결되어 있다는 것이 제안되었다. 이 연구에서, 연구자들은 헤마시스트™의 헤모글로빈과 유사한 디아스피린 가교된 헤모글로빈을 사용하였다 (문헌 [Yeh et al. (2004) Antioxid Redox Signal 6:944-953]).
이 실험은, 제1철- (산소화된) 헤모글로빈이 아닌 제2철- (산화된) 헤모글로빈에 대한 내피 세포의 연장된 노출이 HO-1 및 페리틴의 생성의 증가를 통해 이들 세포를 2차적 산화 공격에 대해 현저히 내성을 갖게 만든다는 초기 제안에 대해 분자적 상세 정보를 더 제공하면서, 추가로 또한 이 현상이 이제는 HIF-1 알파를 조절하는 것으로 공지된다는 것을 제안한다 (문헌 [Balla et al. (1995) Am J Physiol 268(2 Pt l):L321-327]).
효능있는 헤모글로빈-기반 산소 운반체는 혈액 손실 빈혈과 관련된 저산소성 조건을 완화시킬 수 있어야하기 때문에, 상기 발견들은 저산소증을 악화시키고 따라서 HIF-1 알파를 유도하는 상기 제품에만 적용할 수 있다. 실제로, 현재 임상적 개발중인 혈액 대용품 제품은 잘 실증된 혈관수축성 포텐셜 및 높은 자가산화율을 갖는다. 그러나, 예(Yeh)의 연구에서, 헤모글로빈과 적혈구생성 간의 어떠한 연결점도 발견되지 않았다.
현재 개발중인 혈액 대용품의 적혈구생성 활성의 명백한 결여는 미국 메릴랜드주 베테스다에 위치한 국립보건원 산하 워렌 지. 매그너슨 임상 센터 수혈의학부의 하베이 쥐. 클라인(Harvey G. Klein) 박사의 언급에 의해 요약될 수 있다. "혈 액 대용품: 어떻게 용액에 근접할 수 있을까?"란 제목의 그의 2005년 리뷰 논문에서, 그는 "...인간, 소 및 재조합 공급원으로부터의 헤모글로빈-유래 적혈구 대용품은 III 상 시험에서 모두 수 시간 이내의 반감기를 갖고, 수혈, 또는 만성 빈혈에 대해 적혈구생성을 자극하는 약물을 대체하지 못할 것이나, 이들은 (1) 즉시 이용가능한 어떠한 상용가능한 혈액도 없을 경우에 수혈에 대한 브릿지로서, (2) 수술의 자가혈액희석법 관리에 대한 보조약으로서, 또는 심지어 (3) 방사선 요법에서 또는 암의 관리에서의 역할을 수행할 수 있다..."고 언급하였다 (문헌 [Klein HG (2005) Dev Biol (Basel) 120:45-52]).
상기 분석은 이상적인 혈액 대용품은 아직 개발되지 않았다는 것을 설명한다. 완벽한 혈액 대용품은 출혈이 제어될 수 있을 때까지 환자를 유지시켜야 한다. 비-세포 혈액 대용품이 짧은 순환 반감기를 갖기 때문에, 이들은 혈액 손실을 보상하기 위해 적혈구생성을 자극하는 능력을 가져야 한다. 환자를 유지시키기 위해, 혈액 대용품은 혈류 및 조직 관류, 이에 따른 산소화를 최대화시켜야 한다. 적혈구생성을 자극하기 위해, 혈액 대용품은 저산소 및 정상산소 조건 하에 전-산화성 및 친-염증성 반응을 제어함으로써 HIF-1 알파를 안정화시켜야 하고, EPO-유전자에 결합하는 HIF-1 알파를 촉진하여야 한다. 또한, 혈액 대용품은 EPO의 주요 기능이 아폽토시스로부터 수임 적혈구 전구세포를 구조하는 것이기 때문에, 어떠한 친-아폽토시스 활성에도 관여하면 안된다. 상기 사건들은 내생 적혈구로 혈액 손실을 시시각각 차례차례 보상할 효과적인 적혈구생성을 개시하기 위해 필요하다.
허혈성 장기로의 산소의 적당한 전달은 혈액 대용품으로서의 헤모글로빈 용 액의 규제 승인에 주요 필요조건이다. 따라서, 혈관수축을 유도하고 강력한 전-산화성, 친-염증성 및 친-아폽토시스 포텐셜을 갖는 혈액 대용품은 환자에게 유해할 수 있고, 임상적으로 허용되지 않는다.
현재 임상 시험중인 제품들은 혈액 대용품의 제1 세대를 나타내고, 이제 모든 헤모글로빈 내인성 독성 문제점을 대처하는 혈액 대용품의 "신규한 세대"를 향해 나아가는데 노력하고 있다. 제2 세대 제품이 급성 혈액 손실 빈혈 및 외상의 치료를 비롯한 모든 임상적 증세에 사용될 수 있다고 여겨진다.
현재 시험된 혈액 대용품은 적혈구생성 활성이 결핍되었기 때문에, 조직 관류 및 산소화를 최대화하고 적혈구생성을 자극하여, 손실 혈액을 내생 적혈구로 대체하는 능력을 가질 개선된 산소 운반 용액에 대한 요구가 여전히 존재한다. 상기 혈액 대용품에 의한 적혈구생성의 자극은 저산소 및 정상산소 조건에서 일어나야 한다. 삶을 위협하는 빈혈의 경우에, 상기 혈액 대용품은 조직 산소화, 및 HIF-1 알파의 안정화 및 EPO 생성을 통해 환자의 적혈구생성 반응의 자극을 통한 적혈구용적률을 정상화시키기 위한 2차적 요법을 유지하는 초기 요법으로서 기능해야 한다. 이 요법은 고가의 재조합 EPO 약물에 대한 요구를 제거해야 한다.
특허 문헌에 HIF-1 알파의 안정화가 저산소증 관련 조직 손상의 치료에 치료적 이점을 제공할 수 있다는 일부 내용들이 존재한다. 미국 특허 제6,562,799호 (Semenza)는 대상체에게 치료 유효량의 안정한 HIF-1 알파 단백질을 투여함으로써 저산소증- 또는 허혈-관련 조직 손상을 치료하는 방법을 제공한다. 미국 특허 제6,432,927호 (Gregory 등)는 전사 활성화가 가능한 저산소증 유발가능 인자 단백질 의 DNA 결합 도메인을 이용하여 허혈성 조직 손상을 감소시키는 방법을 제공한다. 미국 특허 제6,849,718호 (Kaelin 등)는 HIF-1 알파 뮤테인을 함유하는 제약 조성물 및 저산소증 및 허혈성 관련 조직 손상을 치료하기 위해 상기 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 미국 특허 제6,838,430호 (Arbeit)는 상처 치유를 가속화하기 위한 안정한 HIF-1 알파 변이체의 용도를 제공한다.
그러나, 상기 특허 방법들은 HIF-1 알파 의존성 EPO 유도, 이에 따른 적혈구생성을 촉진하는데 있어서의 헤모글로빈 기반 혈액 대용품의 용도에는 관심이 없다.
허혈성 조직 및 장기로의 산소 전달 및 적혈구생성 반응의 효과적인 자극을 최적화하는 것은 혈액 대용품으로서의 이들 제제의 규제 승인에 있어서 가장 중요한 인자이다. 본 발명의 혈액 대용품은 상기 논의된 문제점들에 대처한다.
2.2. 급성 혈액 손실 요법
현재 미국에서 규제 승인된 혈액 대용품은 없다. 따라서, 혈액 수혈은 급성 혈액 손실을 갖는 대상체에서 혈액 부피를 신속하게 회복하는 유일하게 신뢰성있는 수단이다. 그러나, 혈액 수혈과 관련된 수많은 위험들이 존재한다. 첫째로, 공여자 혈액은 수혈에 대한 그의 적합여부 및 수용자에 대한 상용가능성을 결정하기 위해 시험될 필요가 있다. 상용가능성 시험은 일반적으로 (1) 상용가능하지 않은 적혈구 (RBC)의 수혈을 예방하기 위한 공여자 및 수용자 혈액의 ABO 형검사; 및 (2) Rh 인자 RhO(D)가 RBC 상에 존재하는지 (Rh-양성) 또는 존재하지 않는지 (Rh-음성) 결정하기 위한 Rh 형검사를 포함한다. 기증된 혈액 또한, 예를 들면 직접 항글로 불린 시험 (직접 쿰스 시험(Coombs' test)) 및 간접 항글로불린 시험 (간접 쿰스 시험)을 이용하여 용혈성 질환 또는 심각한 수혈 반응을 유발할 수 있는 예상치 못한 항-RBC 항체를 동정하기 위해 스크리닝될 필요가 있다.
공여자 혈액이 수용자에 대해 매칭된다 하더라도, 다수의 합병증이 여전히 혈액 수혈에 기인하여 생길 수 있다. 예를 들면, 수혈 도중 또는 수혈 후의 공여자 또는 수용자 RBC (일반적으로 공여자 RBC)의 용혈은 ABO/Rh 부적합, 상용가능하지 않은 혈장, 용혈된 또는 무른 RBC (예를 들면, 저장된 혈액을 과보온하거나 또는 부적합한 IV 용액과의 접촉에 의해), 또는 비-등장성 용액의 주사에 기인할 수 있다. 상기 반응은, 상용가능하지 않은 공여자 RBC가 수용자의 혈장 중 항체에 의해 용혈되는 경우 가장 심각하고, 호흡곤란, 발열 및 오한, 안면홍조증, 중증 동통 (특히 요추 영역에서), 및 혈압 강하, 구역 및 구토를 유발하는 쇼크를 가져올 수 있다. 공여자 혈액의 알려지지 않은 성분에 대한 알레르기성 반응 또한 일반적이며, 보통 공여자 혈장의 알레르기 항원에 기인하거나, 또는 가끔 알레르기성 공여자로부터의 항체에 기인한다. 이들 반응은, 아나필락시스(anaphylaxis)가 일부 드문 경우에 발생할 수는 있지만, 일반적으로 수혈 도중 또는 직후에 경증의 두드러기, 부종, 간헐적 현기증 및 두통을 수반한다. 가끔이지만, 또다른 합병증은 폐 내에서 수용자 백혈구(WBC)를 응집시키고 탈과립화하는 공여자 혈장의 항-WBC 항체에 의해 유발되는 수혈-관련 급성 폐 손상이다. 다량의 공기가 정맥으로 수혈되는 것 또한 결과적으로 무력한 펌핑과 함께 심장에서의 혈액의 기포화를 유발하여 심장 부전증을 초래할 수 있다. 수혈된 혈액 또는 혈액 성분 내 소수의 생존가능한 림프구에 의해서조차 유발될 수 있는 이식편-대-숙주 질환 또한 혈액 수혈로부터 생길 수 있다. 또한, 수집 동안 불충분한 무균 기술에 기인하거나 일시적 무증후성 공여자에 의해 발생할 수 있는 박테리아 오염의 우려도 존재한다. 최종적으로, 그리고 가장 중요하게, 혈액 수혈의 수용자는 간염, HIV, 거대세포바이러스(CMV), 및 인간 T-세포 림프영양성 바이러스 유형 I (HTLV-I) 감염을 포함하지만 이에 한정되지 않는 바이러스성 질환 전파의 위험을 항상 가질 것이다.
3. 발명의 요약
본 발명은 급성 혈액 손실 빈혈, 즉 (i) 질병으로 인한 급성 혈액 손실, (ii) 수술 중 발생하는 급성 혈액 손실, 또는 (iii) 외상에 의한 급성 혈액 손실에 의해 유발되는 빈혈의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에서, 상기 치료 또는 예방을 위한 특정 혈액 대용품의 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 혈액 부피를 회복하고 저산소증을 완화하는 것과 정상산소 조건 하에 적혈구생성을 유도하는 것 둘 다를 수행하는 혈액 대용품의 사용을 포함한다. 현재 대상체에서의 혈액 손실을 빠르게 회복시키는 유일한 신뢰할 수 있는 수단인 혈액 수혈은 혈액 부피를 회복시키고 저산소증을 완화하는 데에 유효하다. 그러나, 급성 혈액 손실에 의해 야기되는 위급상황 동안에는 공여자와 수여자 혈액 사이의 적합성을 시험할 시간이 없으며 공여자 혈액에 존재하는 면역학적 성분과 관련된 다수의 합병증 (예를 들면, RBC의 용혈, 알레르기성 반응, 수혈-관련 급성 폐 손상, 이식편 대 숙주 질환, 박테리아 오염, 바이러스성 질환 전파 등)을 촉발시킬 위험이 언제나 존재하기 때문에, 혈액 수혈을 이용하는 것은 바람직하지 않다. 게다가, 정상산소 조건을 일 시적으로 회복시키는 혈액 수혈은 신체 자체의 적혈구 세포를 재공급하려는 신체의 능력을 손상시킨다. 특히, 적혈구생성을 담당하는 체내 에리쓰로포이에틴의 생성 증가는 저산소 조건에 의해 유도된다. 따라서, 저산소증에 대한 "임시변통(quick fix)"인 혈액 수혈은 궁극적으로 적혈구생성을 늦춰서, 순환계에 내생 적혈구 세포를 재공급하려는 체내의 능력을 늦추게 된다. 현재 인간 사용을 위해 시험되고 있는 혈액 대용품은 유사한 이유로 문제가 있다. 특히, 많은 혈액 대용품의 순환 체류 시간이 짧고 (반감기가 24 시간 미만), 헴 자가산화율이 높아서 (1일 당 30％ 초과), 체순환계에 내생 적혈구 세포를 재공급하는 필수적인 적혈구생성 활성을 갖지 않는다. 본 발명의 방법에 사용되는 혈액 대용품은 정상산소 조건 하에조차 적혈구생성을 유도할 수 있기 때문에, 본 발명은 이 문제를 경감시킨다.
특정 실시양태에서, 혈액 손실은 질병, 예컨대 출혈성 질환, 궤양, 또는 혈관 파열 또는 동맥류와 연관된다. 특정 다른 실시양태에서, 혈액 손실은 수술, 예컨대 선택 수술 (예를 들면, 정형외과 수술) 중 발생한다. 특정 다른 실시양태에서, 혈액 손실은 외상, 예컨대 화상 손상, 총상 상처 또는 자상 상처로 유발된다. 특정 실시양태에서, 혈액 손실은 대상체의 혈액 손실이 33％ 초과인 중증(severe)이다. 특정 다른 실시양태에서, 혈액 손실은 대상체의 혈액 손실이 약 20％ 내지 33％인 중등도(moderate)이다. 특정 다른 실시양태에서, 혈액 손실은 대상체의 혈액 손실이 20％ 미만인 경증(mild)이다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다. 유리하게는, 7 g/dL 미만의 헤모글로빈을 갖는 인간 대상체를 본 발명의 방법을 사용하여 치료할 수 있다.
본 발명의 방법은 혈액 대용품을 혈액 부피를 증가시키고 급성 혈액 손실과 연관된 저산소증을 완화하기에 유효한 양으로 이것이 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법에 유용한 혈액 대용품은 (1) 정상산소 조건 하에 세포 배양물에서 시험시 에리쓰로포이에틴의 발현을 유도하고/거나, (2) (a) 대상체의 적혈구용적률 또는 헤모글로빈의 배가 시간의 감소, 또는 (b) 대상체의 순환 에리쓰로포이에틴 수준의 증가에 의해 측정시 정상산소 조건 하에 적혈구생성을 유도할 수 있다. 임의로, 혈액 대용품은 또한 세포 배양물에서 시험시 HIF-1 알파 발현을 안정화하고/거나, 세포 배양물에서 시험시 NF-카파 B 발현을 하향조절하는 것으로 나타날 수 있다.
이러한 특성을 발휘하는 모든 혈액 대용품을 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 예를 들면, 혈액 대용품은 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품, 또는 보다 구체적으로는, 퍼요오데이트-산화된 ATP와 분자내 가교되고, 퍼요오데이트-산화된 아데노신과 분자간 가교되고, 환원된 글루타티온과 접합된 헤모글로빈을 포함하는 가교된 헤모글로빈일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 가교된 헤모글로빈은 헤모글로빈 및 퍼요오데이트-산화된 ATP를 1:1 내지 1:3의 몰비로; 헤모글로빈 및 퍼요오데이트-산화된 아데노신을 1:1 내지 1:10의 몰비로; 및/또는 헤모글로빈 및 환원된 글루타티온을 1:1 내지 1:20의 몰비로 포함한다. 상기 제품에 대한 상표명은 헤모테크(HEMOTECH)™이며, 이는 o-아데노신 5'-트리포스페이트 (o-ATP), o-아데노신 및 환원된 글루타티온 (GSH)과 가교된 순수한 소(bovine) Hb를 포함하는 가교된 헤모글로빈이다. 가교된 헤모글로빈에 대한 보 다 상세한 내용은 페올라(Feola) 등의 미국 특허 제5,439,882호에서 발견할 수 있으며, 이는 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 또는 다른 요법에 사용될 수 있는, 특정 농도 또는 부피의 혈액 대용품을 포함하는 신규한 제약 조성물에 관한 것이다. 예를 들면, 상기 신규한 조성물은 제약상 허용되는 담체 내에 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품의 (1) (a) 7 g 내지 122.5 g 미만 또는 (b) 122.5 g 초과 내지 700 g의 치료 유효량, 또는 (2) 0.6 리터 미만의 치료 유효 부피를 포함할 수 있으며, 여기서 정상산소 조건 하에 세포 배양물에서 시험시 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품은 에리쓰로포이에틴의 발현을 유도한다.
다른 신규한 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체 내에 가교된 헤모글로빈의 (1) (a) 7 g 내지 122.5 g 미만 또는 (b) 122.5 g 초과 내지 700 g의 치료 유효량, 또는 (2) 0.6 리터 미만의 치료 유효 부피를 포함하며, 여기서 가교된 헤모글로빈은 퍼요오데이트-산화된 ATP와 분자내 가교되고, 퍼요오데이트-산화된 아데노신과 분자간 가교되고, 환원된 글루타티온과 접합된 헤모글로빈이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 사용되는 가교된 헤모글로빈은 비전해질 수용액 중에 용해된다. 상기 제약 조성물은 만니톨 및/또는 전해질을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 신규한 제약 조성물은 본 발명의 방법 뿐만 아니라 (예를 들면 만성 혈액 손실 빈혈 또는 장기간의 혈액 손실에 의해 유발되는 빈혈을 치료하는) 임의의 다른 방법에 사용할 수 있다.
본 발명의 방법은 동물 대상체에서의 급성 혈액 손실 치료를 위해 가교된 헤모글로빈을 사용하는 것으로 예시된다.
3.1. 정의
본원에 사용된 용어 "약"은 표준 실험 오차 (예를 들면, 표준 편차)를 포함하는 것으로 의도된다. 표준 편차의 정의, 계산 및 해석에 관한 더 많은 정보는 통계 교과서, 예컨대 이들로 한정되지는 않지만, 문헌 [Statistics, W. W. Norton & Company; 3rd edition (September 1, 1997)]; 및 [The Basic Principles of Statistics, W.H. Freeman & Company; 3rd Bk&Cdr edition (June 1, 2003)]에서 발견할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유효량" 및 "유효 부피"는 각각 본 발명의 하나 이상의 혈액 대용품 및/또는 제약 조성물을 투여받은 대상체에서 혈액 부피의 증가, 혈류의 회복, 조직 산소화 수준의 회복, 혈류역학 파라미터의 회복, 급성 혈액 손실과 연관된 저산소증의 완화, 순환 EPO 또는 EPO 합성의 증가, 적혈구용적률 수준의 회복, 헤모글로빈 수준의 회복, HIF-1 알파의 안정화, NF-카파 B의 하향조절, 전-적혈구모세포의 아폽토시스 사건 감소, 및/또는 항-적혈구생성 염증성 사이토킨의 생성 감소에 충분한 양 및 부피를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "저산소" 및 "저산소증"은 감소된 수준의 산소의 상태를 의미한다. 저산소증은 산소 분압 감소, 부적절한 산소 수송, 및/또는 조직의 산소 사용 불능에 의해 유발될 수 있고, 신체 기능의 장애를 유발할 수 있다. 예를 들 면 습한 가변성 호기성 작업장에서 저산소 조건 (1.5％ O2, 93.5％ N2, 및 5％ CO2)이 달성될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "질병"은 용어 "질환"과 구분없이 사용된다. 급성 혈액 손실을 유발하는 질병은 모든 종류의 세포 (예를 들면, 체세포, 생식세포, 배아세포, 줄기세포), 조직 (예를 들면, 골, 근육, 결합 조직, 혈액), 및/또는 기관 (예를 들면, 뇌, 신장, 폐, 심장, 췌장, 전립선, 난소, 자궁, 위장관)과 관련될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "정상산소의" 및 "정상산소"는 정상 수준의 산소의 상태를 의미한다. 전형적으로는, 정상산소 조건은 흡입 기체 중 산소 분압이 해수면에서의 산소 분압인 약 150 mm Hg과 동일한 상황을 의미한다. 정상산소 조건은 95％ 공기 및 5％ CO2이다.
급성 혈액 손실과 관련하여 본원에 사용된 용어 "예방하다", "예방하는" 및 "예방" (또는 문법적으로 동등한 용어)은 급성 혈액 손실 또는 급성 혈액 손실과 연관된 증상 또는 조직병증을 지연시키거나 막는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "예방적 유효량" 및 "예방적 유효 부피"는 각각 대상체가 급성 혈액 손실이 되는 것을 지연시키거나 막기에 충분한 양 또는 부피를 의미한다. 예를 들면, 예방적 유효량 또는 예방적 유효 부피는 각각 혈액 대용품 및/또는 제약 조성물을 투여받은 대상체에서 혈액 부피의 증가, 혈류의 회복, 조직 산소화 수준의 회복, 혈류역학 파라미터의 회복, 급성 혈액 손실과 연관된 저산소증 의 완화, 순환 EPO 또는 EPO 합성의 증가, 적혈구용적률 수준의 회복, 헤모글로빈 수준의 회복, HIF-1 알파의 안정화, NF-카파 B의 하향조절, 전-적혈구모세포의 아폽토시스 사건 감소, 및/또는 항-적혈구생성 염증성 사이토킨의 생성 감소에 충분한 본 발명의 혈액 대용품 또는 제약 조성물의 양 및 부피를 의미할 수 있다. 예방적 유효량 또는 예방적 유효 부피는 또한 급성 혈액 손실과 연관된 증상 또는 조직병증의 치료 또는 관리시에 예방적 이점을 제공하는 본 발명의 혈액 대용품 또는 제약 조성물의 양 또는 부피를 의미할 수 있다. 추가로, 본 발명의 혈액 대용품 또는 제약 조성물에 대한 예방적 유효량 또는 예방적 유효 부피는 급성 혈액 손실 또는 급성 혈액 손실과 연관된 증상 또는 조직병증의 치료, 관리 또는 개선에 예방적 이점을 제공하는, 상기 혈액 대용품 또는 제약 조성물 단독, 또는 다른 요법과 조합된 상기 혈액 대용품 또는 제약 조성물의 양 또는 부피를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "대상체" 및 "환자"는 구분없이 사용된다. 대상체는 동물일 수 있다. 특히 대상체는 포유동물, 예컨대 비-영장류 (예를 들면, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 및 마우스) 또는 영장류 (예를 들면, 원숭이, 예컨대 사이노몰거스 원숭이, 침팬지 및 인간)일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "수술"은 용어 "시술"과 구분없이 사용된다. 급성 혈액 손실을 유발하는 수술은 모든 종류의 세포 (예를 들면, 체세포, 생식세포, 배아세포, 줄기세포), 조직 (예를 들면, 골, 근육, 결합 조직, 혈액), 및/또는 기관 (예를 들면, 뇌, 신장, 폐, 심장, 췌장, 전립선, 난소, 자궁, 위장관)과 관련될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료 유효량" 및 "치료 유효 부피"는 각각 급성 혈액 손실이 있는 대상체에게 몇몇 개선 또는 이점을 제공하기에 충분한 양 및 부피를 의미한다. 예를 들면, 치료 유효량 또는 치료 유효 부피는 각각 혈액 대용품 및/또는 제약 조성물을 투여받은 대상체에서 혈액 부피의 증가, 혈류의 회복, 조직 산소화 수준의 회복, 혈류역학 파라미터의 회복, 급성 혈액 손실과 연관된 저산소증의 완화, 순환 EPO 또는 EPO 합성의 증가, 적혈구용적률 수준의 회복, 헤모글로빈 수준의 회복, HIF-1 알파의 안정화, NF-카파 B의 하향조절, 전-적혈구모세포의 아폽토시스 사건 감소, 및/또는 항-적혈구생성 염증성 사이토킨의 생성 감소에 충분한 본 발명의 혈액 대용품 또는 제약 조성물의 양 및 부피를 의미할 수 있다. 치료 유효량 또는 치료 유효 부피는 또한 급성 혈액 손실과 연관된 증상 또는 조직병증의 치료 또는 관리시에 치료적 이점을 제공하는 본 발명의 혈액 대용품 또는 제약 조성물의 양 또는 부피를 의미할 수 있다. 추가로, 본 발명의 혈액 대용품 또는 제약 조성물에 대한 치료 유효량 또는 치료 유효 부피는 급성 혈액 손실 또는 급성 혈액 손실과 연관된 증상 또는 조직병증의 치료, 관리 또는 개선에 치료적 이점을 제공하는, 상기 혈액 대용품 또는 제약 조성물 단독, 또는 다른 요법과 조합된 상기 혈액 대용품 또는 제약 조성물의 양 또는 부피를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "외상"은 용어 "손상"과 구분없이 사용된다. 급성 혈액 손실을 유발하는 외상은 모든 종류의 세포 (예를 들면, 체세포, 생식세포, 배아세포, 줄기세포), 조직 (예를 들면, 골, 근육, 결합 조직, 혈액), 및/또는 기관 (예를 들면, 뇌, 신장, 폐, 심장, 췌장, 전립선, 난소, 자궁, 위장관)과 관련될 수 있 다.
급성 혈액 손실과 관련하여 본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료" (또는 문법적으로 동등한 용어)는 급성 혈액 손실 또는 급성 혈액 손실과 연관된 증상 또는 조직병증을 감소시키거나 제거하는 것을 의미한다.
4. 도면의 간단한 설명
도 1은 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품 및 동족의 혈장으로 처리된, 총 혈액의 33 및 66％ 손실을 겪는 코에버스(Coebus) 원숭이의 적혈구용적률 (％ 단위)을 나타낸다.
도 2는 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품으로 처리되거나 또는 처리되지 않은, 총 혈액의 66％ 손실을 겪는 토끼의 적혈구용적률 (％ 단위)을 나타낸다.
도 3은 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품으로 처리된, 총 혈액의 40％ 손실을 겪는 래트의 혈압 및 조직 산소화 (pO2)의 그래프 표시이다.
도 4는 체중 kg 당 대략 1.75 g의 투여량 (계산된 총 혈액 부피의 25％)으로 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품으로 처리된 겸상적혈구성 빈혈 환자로부터 얻은 총 헤모글로빈 (g/dL 단위), 혈장 헤모글로빈 (gm/dL 단위) 및 망상적혈구 계수 (％ 단위)를 비롯한 요약 데이타를 나타낸다.
도 5는 체중 kg 당 대략 1.75 g의 투여량 (계산된 총 혈액 부피의 25％)으로 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품으로 처리된 겸상적혈구성 빈혈 환자에서의 EPO의 혈액 수준을 나타낸다.
도 6은 저산소 및 정상산소 조건하에 인간 별아교세포에 의한 (A) HIF-1 알파 안정성 및 (B) EPO 생성에 대한, 0.1, 1.0 및 1.75 g/dL의 농도인 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품 및 비변형된 헤모글로빈 용액의 효과를 나타낸다.
도 7은 저산소 및 정상산소 조건하에 인간 별아교세포에서 항-적혈구생성 NF-카파 B의 활성화에 대한, 0.1, 1.0 및 1.75 g/dL의 농도인 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품 및 비변형된 헤모글로빈 용액의 효과를 나타낸다.
5. 발명의 상세한 설명
본 발명은 급성 혈액 손실, 바람직하게는 급성 혈액 손실 빈혈, 또는 보다 바람직하게는 (i) 질병으로 인한 급성 혈액 손실, (ii) 수술 중 발생하는 급성 혈액 손실, 또는 (iii) 외상에 의한 급성 혈액 손실에 의해 유발되는 빈혈을 치료 또는 예방하는 신규한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 정상산소 조건 하에 적혈구생성을 유도하는 혈액 대용품을 혈액 부피를 증가시키고 급성 혈액 손실과 연관된 저산소증을 완화하기에 유효한 양으로 이것이 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 보다 특히, 본 발명의 방법에 유용한 혈액 대용품은 (1) 정상산소 조건 하에 세포 배양물에서 시험시 에리쓰로포이에틴의 발현을 유도하고/거나, (2) (a) 대상체의 적혈구용적률 또는 헤모글로빈의 배가 시간의 감소, 또는 (b) 대상체의 순환 에리쓰로포이에틴 수준의 증가에 의해 측정시 정상산소 조건 하에 적혈구생성을 유도할 수 있다.
본 발명은 또한 제약상 허용되는 담체 내에 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품의 치료 또는 예방적 유효량 또는 유효 부피를 포함하며, 정상산소 조건 하에 세포 배양물에서 시험시 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품이 에리쓰로포이에틴의 발현을 유도하는 것인 제약 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 제약상 허용되는 담체 내에 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품의 치료 또는 예방적 유효량 또는 유효 부피를 포함하며, 가교된 헤모글로빈이 퍼요오데이트-산화된 ATP와 분자내 가교되고, 퍼요오데이트-산화된 아데노신과 분자간 가교되고, 환원된 글루타티온과 접합된 헤모글로빈을 포함하는 것인, 신규한 제약 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 제약 조성물에 유용한 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품 및 가교된 헤모글로빈은 세포 배양물에서 시험시 (1) HIF-1 알파 발현을 안정화시키고/거나, (2) NF-카파 B를 하향조절할 수 있다. 상기 제품에 대한 상표명은 헤모테크™이며, 이는 o-아데노신 5'-트리포스페이트 (o-ATP), o-아데노신 및 환원된 글루타티온 (GSH)과 가교된 순수한 소 Hb를 포함하는 가교된 헤모글로빈이다. 가교된 헤모글로빈에 대한 보다 상세한 내용은 페올라(Feola) 등의 미국 특허 제5,439,882호에서 발견할 수 있으며, 이는 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 급성 혈액 손실 요법이 필요한 대상체에게 유용한 방법, 제약 조성물 및 키트에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 급성 혈액 손실 빈혈이 있는 대상체에게 유용한 방법, 제약 조성물 및 키트에 관한 것이다. 하기 하위단락에서는 (a) 본 발명에 따라 치료할 수 있는 환자군 (단락 5.1 및 그의 하위단락); (b) 본 발명에 포함되는 급성 혈액 손실 요법에 대한 신규한 프로토콜 (단락 5.2); 및 (c) 본 요법 및 다른 요법에 사용할 수 있는 신규한 제약 조성물 (단락 5.4)을 보다 상세히 기재한다.
5.1. 급성 혈액 손실 요법이 필요한 대상체
빈혈은 적혈구의 개수 또는 헤모글로빈의 양이 적은 상태이다. 임상적으로, 중증 빈혈은 7 g/dL 미만의 헤모글로빈 수준을 갖는 것으로 정의된다 (문헌 [The Merck Manual of Diagnosis and Therapy. Section 11: Hematology and Oncology. Chapter 127: Anemias, pages 849-850. John Wiley ＆ Sons; 17th edition (March 1, 1999)]). 급성 혈액 손실 빈혈 (급성 출혈후 빈혈로도 알려져 있음)은 급속 대량 출혈 (급성 혈액 손실)에 의해 유발된 빈혈이다. 골수 비축량이 제한되어 있기 때문에, 자발성 또는 외상성 발진 또는 대형 혈관 (예를 들면, 동맥류)의 절개와 연관된 대량 출혈, 병변 (예를 들면, 소화성 궤양, 신생물)에 의한 동맥 미란, 또는 정상 지혈 부전이 빈혈을 유발할 수 있다. 급성 혈액 손실 빈혈의 즉시적 효과는 출혈의 기간 및 부피에 따라 달라진다.
급성 혈액 손실 빈혈은, 장기간의 중등도 혈액 손실로 인한 소구성 빈혈인 만성 혈액 손실 빈혈과는 다르다. 예를 들면, 만성 빈혈은 만성 출혈 위장관 병변 (예를 들면, 소화성 궤양, 치질) 또는 비뇨기과 또는 부인과 부위로부터 발생할 수 있다. 만성 혈액 손실 빈혈이 결손성 또는 결핍성 적혈구생성에 의해 유발되고, 이로써 순환 적혈구의 평균 크기가 보통 크기보다 작은 소구성 적혈구 집단이 생성될 수 있다. 결손성 또는 결핍성 적혈구생성은 철 결핍, 철-수송 결핍, 및/또는 부적절하거나 비정상적인 철 사용으로 인한 결과일 수 있다. 또한, 만성 혈액 손실 빈혈은 비타민 B12, 엽산 또는 비타민 C의 결핍에 의해 유발될 수 있다. 또한, 만성 혈액 손실 빈혈은 세망내피세포 과다활성, 면역 이상, 적혈구 막의 변화, 적혈구 대사의 장애, 또는 결손성 헤모글로빈 합성 (예를 들면, 겸상적혈구성 빈혈)으로 인한 과도한 용혈에 의해 유발될 수 있다. 급성 및 만성 혈액 손실 빈혈간의 차이점에 대한 추가적인 논의는 문헌 [The Merck Manual of Diagnosis and Therapy. Section 11: Hematology and Oncology. Chapter 127: Anemias, pages 849-850. John Wiley ＆ Sons; 17th edition (March 1, 1999)]에서 찾아볼 수 있으며, 이는 전문이 본원에 참고로 포함된다.
급성 혈액 손실 빈혈의 원인은 다양하다. 예를 들면, 질병, 수술 또는 외상으로 인해 급성 혈액 손실 빈혈이 발생할 수 있다. 따라서, 대상체는 하기 단락 5.1.1에 논의된 바와 같은 질병으로 인한 급성 혈액 손실, 하기 단락 5.1.2에 논의된 바와 같은 수술 중 발생하는 급성 혈액 손실, 또는 하기 단락 5.1.3에 논의된 바와 같은 외상에 의한 급성 혈액 손실을 앓는 자일 수 있다.
특정 실시양태에서, 대상체는 실신, 현기증, 갈증, 발한, 약하고 빠른 맥박 및 빠른 호흡 (이들로 한정되지는 않음)을 비롯한 급성 혈액 손실과 연관된 증상을 나타낼 수 있다. 또다른 특정 실시양태에서, 대상체는 급성 혈액 손실과 연관된 증상이 임상적으로 없는 것으로 보일 수 있다.
특정 실시양태에서, 대상체는 저산소증 및 조직 괴사 (이들로 한정되지는 않음)를 비롯한 급성 혈액 손실과 연관된 조직병증을 나타낼 수 있다. 또다른 특정 실시양태에서, 대상체는 급성 혈액 손실과 연관된 조직병증이 임상적으로 없는 것으로 보일 수 있다.
특정 실시양태에서, 대상체에게 혈액 수혈, 식염수 또는 덱스트로스 주입, 에리쓰로포이에틴 주사 (이들로 한정되지는 않음)를 비롯한, 급성 혈액 손실에 대한 하나 이상의 유형의 요법이 적용되는 중일 수 있거나 이미 적용되었다.
특정 실시양태에서, 대상체는 중증 혈액 손실, 또는 혈액 부피의 33％ (또는 1/3) 초과의 혈액 손실을 앓는다. 또다른 특정 실시양태에서, 대상체는 중등도 혈액 손실, 또는 혈액 부피의 20％ 내지 33％의 혈액 손실을 앓는다. 또다른 특정 실시양태에서, 대상체는 경증 혈액 손실, 또는 혈액 부피의 20％ 미만의 혈액 손실을 앓는다. 정상 혈액 부피는 인간 대상체의 경우에 체중의 약 8％ (또는 약 5 리터)이다.
특정 실시양태에서, 대상체는 10 g/dL, 9 g/dL, 8 g/dL, 7 g/dL, 5 g/dL, 4 g/dL, 3 g/dL, 2 g/dL 또는 그 미만의 헤모글로빈을 갖는다. 일 실시양태에서, 대상체는 7 g/dL 미만의 헤모글로빈을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "대상체" 및 "환자"는 구분없이 사용된다. 대상체는 동물일 수 있다. 구체적으로, 대상체는 포유동물, 예컨대 비-영장류 (예를 들면, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 및 마우스) 또는 영장류 (예를 들면, 원숭이, 예컨대 사이노몰거스 원숭이, 침팬지 및 인간)일 수 있다.
바람직하게는, 대상체는 인간이다. 일 실시양태에서, 대상체는 인간 유아 또는 조산된 인간 유아이다. 또다른 실시양태에서, 대상체는 인간 아동이다. 또다른 실시양태에서, 대상체는 성인이다. 또다른 실시양태에서, 대상체는 노인이다. 본원에 사용된 용어 "인간 유아"는 생후 24개월 미만, 바람직하게는 16개월 미만, 6개월 미만, 3개월 미만, 2개월 미만 또는 1개월 미만의 인간을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "인간 아동"은 24개월 내지 18년 연령의 인간을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "성인"은 18년 이상 연령의 인간을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "노인"은 55년 이상 연령의 인간을 의미한다.
특정 경우에서, 대상체는 면역손상 또는 면역억제 상태이다. 예를 들면, 대상체는 HIV-양성 또는 AIDS 환자일 수 있다.
5.1.1 질병으로 인한 급성 혈액 손실
대상체는 질병으로 인한 급성 혈액 손실을 앓는 자일 수 있다. 일 실시양태에서, 대상체는 급성 혈액 손실을 유발하는 질병을 앓고 있거나 이러한 질병이 진단될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 대상체는 유전 인자 (예를 들면, 가족력) 및/또는 환경 인자 (예를 들면, 식단)로 인해 급성 혈액 손실을 유발하는 질병에 걸리기 쉽거나 이러한 질병이 발생할 위험이 있다.
본원에 사용된 용어 "질병"은 용어 "질환"과 구분없이 사용된다. 급성 혈액 손실을 유발하는 질병은 모든 종류의 세포 (예를 들면, 체세포, 생식세포, 배아세포, 줄기세포), 조직 (예를 들면, 골, 근육, 결합 조직, 혈액) 및/또는 기관 (예를 들면, 뇌, 신장, 폐, 심장, 췌장, 전립선, 난소, 자궁, 위장관)과 관련될 수 있다. 급성 혈액 손실을 유발할 수 있는 질병의 예로는 출혈성 질환, 궤양, 병변, 혈관 파열 및 동맥류 파열이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
특정 출혈성 질환은 출생시에 존재하고, 희귀 유전 장애에 의해 유발된다. 예를 들면, 대상체는 혈액 응고 단백질 인자 VIII (혈우병 A) 또는 인자 IX (혈우병 B)가 결핍됨에 따라 불량한 혈액 응고 및/또는 연속적인 제어불가능한 출혈을 앓는 혈우병 환자일 수 있다. 대상체는, 각 월경 동안 제어불가능하게 월경 및 출혈을 시작하는 여성 혈우병 환자일 수 있다 (예를 들면, 문헌 [Quick et al. Hemophilic condition in a girl. AMA Am J Dis Child. 1953 Jun;85(6):698-705] 참조). 또한, 출혈성 질환은 특정 질병 (예를 들면, 비타민 K 결핍, 중증 간 질환, 폰 빌레브란트 질환(von Willebrand's disease), 백혈병, 골수 문제, 파종성 혈관내 응고, 임신-관련 자간증, 뱀독에의 노출) 또는 치료 (예를 들면, 항응고 약물, 예컨대 아스피린, 헤파린 또는 워파린의 사용, 또는 항생제의 장기간 사용) 동안 발생할 수 있다. 대상체는 비타민 K 결핍을 앓는 신생아일 수 있다 (문헌 [The Merck Manual of Diagnosis and Therapy. Secon 1: Nutritional Disorders. Chapter 3: Vitamin Deficiency, Dependency, And Toxicity, page 42. John Wiley ＆ Sons; 17th edition (March 1, 1999)]).
대상체에게 질병 이전, 동안 및/또는 이후에 본 발명의 혈액 대용품 및 제약 조성물이 투여될 수 있다. 숙련된 실무자는, 예를 들면 대상체에서의 혈액 손실 정도를 고려하는 통상적인 기술을 이용하여, 투여할 혈액 대용품 및 제약 조성물의 타이밍 및 양/부피를 선택할 수 있다.
5.1.2. 수술 중 발생하는 급성 혈액 손실
대상체는 수술 중 발생하는 급성 혈액 손실을 앓는 자일 수 있다. 일 실시양태에서, 대상체는 급성 혈액 손실을 유발할 수 있는 수술을 받는 중일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 대상체는 급성 혈액 손실을 유발할 수 있는 수술을 받을 예정일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 대상체는 유전 인자 (예를 들면, 가족력) 및/또는 환경 인자 (예를 들면, 식단)로 인해 급성 혈액 손실을 유발할 수 있는 수술이 요구되기 쉽거나 이러한 수술이 요구될 위험이 크다.
본원에 사용된 용어 "수술"은 용어 "시술"과 구분없이 사용된다. 급성 혈액 손실을 유발하는 수술은 모든 종류의 세포 (예를 들면, 체세포, 생식세포, 배아세포, 줄기세포), 조직 (예를 들면, 골, 근육, 결합 조직, 혈액) 및/또는 기관 (예를 들면, 뇌, 신장, 폐, 심장, 췌장, 전립선, 난소, 자궁, 위장관)과 관련될 수 있다. 급성 혈액 손실을 유발할 수 있는 수술의 예로는 선택 수술이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
임의 또는 선택 수술, 필수 수술, 및 긴급 또는 응급 수술 (이들로 한정되지는 않음)을 비롯한, 수많은 여러 유형의 수술이 존재한다. 임의 또는 선택 수술은 선택될 수 있는 시술이며, 이는 우수한 삶의 질을 영위하기 위해 반드시 필수적인 것은 아니다. 그 예는, 근골격계의 급성, 만성, 외상성 및 재발성 손상 및 여타 장애와 관련된 수술인 정형외과 수술이다. 또다른 예는 흉한 모반 또는 사마귀를 제거하는 것이다. 필수 수술은 미래의 삶의 질을 보장하기 위해 행해져야 할 필요가 있는 시술이다. 필수 수술은 응급 수술과 달리, 반드시 바로 행해져야 할 필요가 없다. 그 예는 신장 결석의 제거 (다른 형태의 약물치료 및 처치가 유효하지 않은 경우임)이다. 긴급 또는 응급 수술은 긴급한 의학적 상태 (예컨대, 급성 충수염)에 응하여 수행된다.
수많은 외과 시술은 출혈 또는 혈액 손실의 높은 위험성과 연관된 것으로 보고되었다. 예를 들면, 뇌성 아밀로이드 혈관병증 (예를 들면, 문헌 [Matkovic et al. Surgical risk of hemorrhage in cerebral amyloid angiopathy. Stroke. 1991 Apr;22(4):456-61] 참조); 뇌 동맥류의 회복 (예를 들면, 문헌 [Mayberg et al. Guidelines for the management of aneurysmal subarachnoid hemorrhage. A statement for healthcare professionals from a special writing group of the Stroke Council, American Heart Association. Stroke. 1994 Nov;25(11):2315-28]; [Tsutsumi et al. Risk of subarachnoid hemorrhage after surgical treatment of unruptured cerebral aneurysms. Stroke. 1999 Jun;30(6):1181-4]; 및 [Wirth FP. Surgical treatment of incidental arteriovenous malformations. Clin Neurosurg. 1986;33:125-35] 참조); 동정맥 기형의 방사선수술 (예를 들면, 문헌 [Friedman et al. The risk of hemorrhage after radiosurgery for arteriovenous malformations. J Neurosurg. 1996 Jun;84(6):912-9]; [Hunt et al. Surgical risk as related to time of intervention in the repair of intracranial aneurysms. J Neurosurg. 1968 Jan; 28(1):14-20] 참조); 후순환 동맥류의 혈관내 치료 (예를 들면, 문헌 [Guglielmi et al. Endovascualar treatment of posterior circulation aneurysms by electrothrombosis using electrically detachable coils. J Neurosurg. 1992 Oct;77(4):515-24] 참조); 증식성 유리체망막증 (예를 들면, 문헌 [Bonnet et al. Surgical risk factors for severe postoperative proliferative vitreoretinopathy (PVR) in retinal detachment with grade B PVR. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 1995 Dec;233(12):789-91] 참조); 지방종 절제 (예를 들면, 문헌 [Rodriguez et al. Colonic lipoma as a source of massive hemorrhage. Report of a case. Dis Colon Rectum. 1990 Nov;33(11):977-9); 및 부비동 수술 (예를 들면, 문헌 [Schnipper et al. Management of intracranial complications of sinus surgery. Otolaryngol Clin North Am. 2004 Apr;37(2):453-72, ix] 참조)이다. 따라서, 대상체는 뇌성 아밀로이드 혈관병증; 뇌 동맥류의 회복; 동정맥 기형의 방사선수술; 후순환 동맥류의 혈관내 치료; 증식성 유리체망막증; 지방종 절제; 또는 부비동 수술을 겪고 있거나, 겪을 예정이거나, 겪었던 자일 수 있다.
대상체에게 수술 이전, 동안 및/또는 이후에 본 발명의 혈액 대용품 및 제약 조성물이 투여될 수 있다. 숙련된 실무자는, 예를 들면 대상체에서의 혈액 손실 정도를 고려하는 통상적인 기술을 이용하여, 투여할 혈액 대용품 및 제약 조성물의 타이밍 및 양/부피를 선택할 수 있다.
5.1.3. 외상에 의한 급성 혈액 손실
대상체는 외상에 의한 급성 혈액 손실을 앓는 자일 수 있다. 일 실시양태에서, 대상체는 급성 혈액 손실을 유발할 수 있는 외상을 앓거나 이러한 외상이 진단된다. 또다른 실시양태에서, 대상체는 유전 인자 (예를 들면, XXX 증후군) 및/또는 환경 인자 (예를 들면, 범죄율이 높은 환경 하의 거주)로 인해 급성 혈액 손실을 유발하는 외상을 앓게 되기 쉽거나 이러한 외상을 앓게 될 위험이 있다.
본원에 사용된 용어 "외상"은 용어 "손상"과 구분없이 사용된다. 급성 혈액 손실을 유발하는 외상은 모든 종류의 세포 (예를 들면, 체세포, 생식세포, 배아세포, 줄기세포), 조직 (예를 들면, 골, 근육, 결합 조직, 혈액) 및/또는 기관 (예를 들면, 뇌, 신장, 폐, 심장, 췌장, 전립선, 난소, 자궁, 위장관)과 관련될 수 있다. 급성 혈액 손실을 유발할 수 있는 외상의 예로는 화상, 총상 및 자상이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
사고 손상 및 또는 범죄 손상을 비롯한, 수많은 여러 유형의 외상이 존재한다. 사고 손상은 임의 유형의 사고로 인한 손상 (예를 들면, 사고사, 자동차 사고 손상, 편타손상, 익사, 추락, 스포츠 손상, 화상, 기계 사고, 질식, 자연 사고, 사고 안구 손상, 직업 손상, 장난감-관련 손상)이다. 범죄 손상은 범죄 활동 (예를 들면, 아동 학대, 살인, 폭행)에 의해 유발된 손상, 특히 총상 및 자상이다.
대상체에게 외상 이전, 동안 및/또는 이후에 본 발명의 혈액 대용품 및 제약 조성물이 투여될 수 있다. 숙련된 실무자는, 예를 들면 대상체에서의 혈액 손실 정도를 고려하는 통상적인 기술을 이용하여, 투여할 혈액 대용품 및 제약 조성물의 타이밍 및 양/부피를 선택할 수 있다.
5.2. 급성 혈액 손실 요법
본 발명의 방법은, 혈액 부피를 증가시키고 급성 혈액 손실과 연관된 저산소증을 완화하기에 유효한 양 또는 부피의 하나 이상의 혈액 대용품 및/또는 제약 조성물을 이것이 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 사용되는 혈액 대용품은, 세포 배양물에서 정상산소 조건 하에 에리쓰로포이에틴의 발현을 유도할 수 있는 능력에 기초하여 선택될 수 있다. 혈액 대용품이 대상체에서 사용되는 경우, 혈액 대용품은 (a) 대상체의 적혈구용적률 또는 헤모글로빈의 배가 시간의 감소 또는 (b) 대상체의 순환 에리쓰로포이에틴 수준의 증가에 의해 측정시, 정상산소 조건 하에 적혈구생성을 증가시키는 것으로 나타날 수 있다. 특히, 본 발명의 방법은, 대상체에게 치료 또는 예방적 유효량 또는 유효 부피의 하나 이상의 하기 단락 5.3 (및 그의 소단락) 및 5.4에 각각 논의된 혈액 대용품 및/또는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 급성 혈액 손실 빈혈의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 질병으로 인한 급성 혈액 손실 (상기 단락 5.2.1 참조), 또는 수술 중 발생하는 급성 혈액 손실 (상기 단락 5.1.2 참조), 또는 외상에 의한 급성 혈액 손실 (상기 단락 5.1.3 참조)의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명의 혈액 대용품은 수많은 이유에서 급성 혈액 손실 요법에 특히 유용하다. 첫번째, 가장 중요하게는, 본 발명의 혈액 대용품은 환자에서 혈액 부피를 증가시켜, 급성 혈액 손실 동안에 쇼크를 유발할 수 있는 체액 손실을 보충하고 저산소증을 완화할 뿐만 아니라, 정상산소 조건 하에 적혈구생성을 자극한다. 이는 급성 혈액 손실 환자의 치료시에 매우 유리하며, 그 이유는 이러한 대상체의 경우에 혈액 손실 사건 동안 및 이후에 손실된 혈액을 대체하고 적혈구용적률 수준을 개선하고/거나 유지하기 위한 다중 혈액 수혈이 때때로 요구되기 때문이다. 본 발명의 혈액 대용품은 다른 혈액 대용품 및 기증자 혈액의 경우보다 빠르고 높은 수준으로 적혈구생성을 유도하고, 이로써 투여 횟수를 감소시킬 수 있다.
두번째, 본 발명의 혈액 대용품은, 수혈에 적합하고 수용자에게 적합한지 여부를 결정하기 위해 시험할 필요가 없기 때문에, 급성 혈액 손실 요법에서 사용하기에 적합하고 용이하다. 또한, 본 발명의 혈액 대용품은 기증자 혈액에 존재하는 면역 성분과 연관된 수많은 합병증 (예를 들면, RBC의 용혈, 알레르기성 반응, 수혈-관련 급성 폐 손상, 이식편 대 숙주 질환, 박테리아 오염, 바이러스성 질환 감염 등)을 촉발하지 않을 것이다.
본 발명의 치료 및 예방 방법은 대상체에서 혈류역학의 수많은 측면 또는 혈액 순환의 물리적 측면을 개선한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 방법에 사용되는 혈액 대용품 및 제약 조성물의 물리적 실재는 대상체의 혈류역학을 개선시킬 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 치료 및 예방 방법은 대상체의 혈액 부피를 증가시킨다. 구체적인 실시양태에서, 혈액 부피는 5％, 10％, 20％, 50％, 100％, 200％, 500％ 또는 그 이상 증가된다. 구체적인 실시양태에서, 혈액 부피는 0.1 리터, 0.5 리터, 1.0 리터, 1.5 리터, 2.0 리터 또는 그 이상 증가된다. 혈액 부피는 당업자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 1회용 저부피 혈압 변환기가 연결된 카테터 (오메다, 피티이, 엘티디(Ohmeda, Pte, Ltd; 싱가포르))를 이용하여 혈액 부피를 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 치료 및 예방 방법은 대상체에서 혈류를 회복시킬 수 있다. 인간의 경우, 정상 혈류는 250 내지 300 ml/분이다. 구체적인 실시양태에서, 혈류의 5％, 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 100％가 회복된다. 혈류는 당업자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 1회용 저부피 혈압 변환기가 연결된 카테터 (오메다, 피티이, 엘티디; 싱가포르)를 이용하여 혈류를 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 치료 및 예방 방법은 대상체에서 조직 산소화 수준을 회복시킬 수 있다. 조직 산소화 수준은 전신에 걸쳐 균일하지 않다. 조직 산소화 수준은 조직/기관 관류를 최대화시킴으로써 개선될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 조직 산소화 수준의 5％, 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 100％가 회복된다. 조직 산소화 수준은 당업자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, DO-166 프로브의 인터페이스를 마이크로컴퓨터 (pH-버전 6071, 라자르 리서치 래버러토리즈(Lazar Research Laboratories)) 및 카디오맥스(Cardiomax) 순환계 컴퓨터의 차트 기록기와 연결시킴으로써 조직 산소화 수준이 연속적으로 기록될 수 있다.
또한, 본 발명의 치료 및 예방 방법은 대상체에서 혈류역학 파라미터를 회복시킬 수 있다. 혈류역학 파라미터로는 심박출량 (CO; ml/분; 심계수 (CI): ml/분/100 g 체중), 1회 박출량 (SV; ml/박동/100 g 체중), 평균 동맥압 (MAP; mmHg), 맥박압 (PP; mmHg), 심박동수 (HR; 박동/분), 총 말초 저항 (TPR; (dyn/sec/cm-5) × 103) 및 혈액 온도가 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다. 인간의 경우, 정상 심박출량은 5 내지 6 리터/분이고, 정상 심계수는 2.5 내지 4 리터/분이고, 정상 1회 박출량은 60 내지 130 ml/박동이고, 정상 평균 동맥압은 70 내지 90 mmHg이고, 정상 맥박압은 20 내지 60 mmHg이고, 정상 심박동수는 60 내지 100 박동/분이고, 정상 총 말초 저항은 770 내지 1500 dyn/sec/cm-5이고, 정상 혈액 온도는 37 ℃이다. 구체적인 실시양태에서, 하나 이상의 혈류역학 파라미터의 5％, 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 100％가 회복된다. 혈류역학 파라미터는 당업자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 완전 자동화 카디오맥스 순환계 컴퓨터 (콜럼버스 인스트루먼츠(Columbus Instruments; 미국 오하이오주 콜럼버스))를 이용하여 혈류역학 파라미터를 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 치료 및 예방 방법은 대상체에서 급성 혈액 손실과 연관된 저산소증을 완화한다. 구체적인 실시양태에서, 저산소증은 5％, 10％, 20％, 50％, 100％, 200％, 500％, 1000％ 또는 그 이상 감소된다. 저산소증은 당업자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 대체값으로서 조직 산소화 수준을 이용하여 저산소증을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 치료 및 예방 방법은 대상체에서 출혈성 쇼크를 역전시킬 수 있다. 출혈성 쇼크는 심계수의 대략 66％ 하락, 평균 동맥압의 대략 67％ 하락과 함께 TPR의 유의한 증가, 및 조직 산소화 수준의 대략 78％ 감소를 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 치료 및 예방 방법은 대상체에서 에리쓰로포이에틴 (적혈구생성 (즉, 적혈구의 생산)을 담당함)의 내인성 생성을 개선시킬 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 치료 및 예방 방법은 대상체에서 EPO 또는 EPO 합성을 증가시킬 수 있다. 에리쓰로포이에틴 (EPO)은, 골수에서 적혈구 생성을 조절하는 신장의 특수화 세포에 의해 생성되는 글리코단백질 (46 kD) 호르몬이다. 구체적인 실시양태에서, 순환 EPO 또는 EPO 합성은 5％, 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 100％, 200％, 500％, 1000％ 또는 그 이상 증가된다. 구체적인 실시양태에서, 순환 EPO 수준은 5 mU/ml, 10 mU/ml, 20 mU/ml, 50 mU/ml, 100 mU/ml, 150 mU/ml, 200 mU/ml 또는 그 이상 증가된다. 순환 EPO 수준 및 EPO 합성은 당업자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 고특이성의 퀀티카인(Quantikine) 시험관내 진단용 인간 에리쓰로포이에틴 ELISA (알앤디 시스템즈 인크.(R＆D Systems Inc.; 미국 미네소타주 미네아폴리스)) 또는 EPO-Trac 125I RIA 키트 (인크스타 코퍼레이션(INCSTAR Corp.) (현재, 디아 소린 에스.피.에이.(Dia Sorin S.p.A.)); 이탈리아 살루기)를 이용하여 세포 배양물 상층액에서 순환 EPO 수준 및 EPO 합성을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 치료 및 예방 방법은 대상체에서 적혈구용적률 수준을 회복시킬 수 있다. 적혈구용적률 (전혈 부피에 대한 적혈구 부피의 비율; 백분율로 표시됨)은 무-혈장 헤모글로빈을 함유하는 혈액 샘플에서의 적혈구생성에 대한 강력한 지시자이다. 정상 적혈구용적률은 성인 남성의 경우에 47 ± 5％이고, 성인 여성의 경우에 42 ± 5％이다 (문헌 [The Merck Manual of Diagnosis and Therapy. Section 11: Hematology and Oncology. Chapter 127: Anemias, page 854. John Wiley ＆ Sons; 17th edition (March 1, 1999)]). 구체적인 실시양태에서, 적혈구용적률 수준의 5％, 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 100％가 회복된다. 적혈구용적률은 당업자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 헤파린이 첨가된 마이크로-헤마토크릿(micro-hematocrit) 모세관 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific; 미국 텍사스주 휴스턴)) 및 마이크로-헤마토크릿 원심분리기 (다몬 아이스 디비젼(Damon ICE Division; 미국 매사추세츠주 니담)를 이용하여 적혈구용적률을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 치료 및 예방 방법은 대상체에서 헤모글로빈 수준을 회복시킬 수 있다. 헤모글로빈은 적혈구 (RBC)에서의 철-함유 산소-수송 금속단백질이다. 정상 헤모글로빈은 성인 남성의 경우에 16 ± 2 g/dL이고, 성인 여성의 경우에 14 ± 2 g/dL이다 (문헌 [The Merck Manual of Diagnosis and Therapy. Section 11: Hematology and Oncology. Chapter 127: Anemias, page 854. John Wiley ＆ Sons; 17th edition (March 1, 1999)]). 구체적인 실시양태에서, 헤모글로빈 수준의 5％, 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 100％가 회복된다. 헤모글로빈 수준은 당업자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 헤모큐(HemoCue) B-헤모글로빈 광도계 (헤모큐 코퍼레이션; 스웨덴 엔젤홀름)를 이용하여 헤모글로빈 수준을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 치료 및 예방 방법은 대상체에서 HIF-1 알파 발현을 안정화시킬 수 있다. 구체적인 실시양태에서, HIF-1 알파의 5％, 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 100％가 안정화된다. HIF-1 알파 안정화 수준은 당업자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 측정될 수 있다. 고처리량 트랜스에이엠(TransAM) ELISA-기반 분석법 (액티브 모티프(Active Motif; 미국 캘리포니아주 칼스배드))을 이용하여 HIF-1 알파 안정화 수준을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 치료 및 예방 방법은 대상체에서 NF-카파 B 발현을 하향조절할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, NF-카파 B 발현의 5％, 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 100％가 하향조절된다. NF-카파 B 활성화 수준은 당업자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 트랜스에이엠™ NF-카파 B p65 전사 인자 분석 키트 (액티브 모티프, 미국 캘리포니아주 카를스배드)를 이용하여 NF-카파 B 활성화 수준을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 치료 및 예방 방법은 대상체에서 전-적혈구모세포의 아폽토시스를 감소시킬 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 전-적혈구모세포의 아폽토시스는 5％, 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 100％ 감소된다. 아폽토시스성 사건 수준은 당업자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 아넥신(Annexin) V-FITC 및 프로피듐 요오다이드 형광 프로브 (시그마 케미칼(Sigma Chemical))를 이용하여 초기 및 후기의 아폽토시스성 사건 수준을 각각 평가할 수 있다.
또한, 본 발명의 치료 및 예방 방법은 대상체에서 항-적혈구생성 염증성 사이토킨의 생성을 감소시킬 수 있다. 항-적혈구생성 염증성 사이토킨으로는 TNF-알파, TGF-베타 1, IL-I, IL-6 등이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다. 구체적인 실시양태에서, 하나 이상의 항-적혈구생성 염증성 사이토킨의 생성은 5％, 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 100％ 감소된다. 항-적혈구생성 염증성 사이토킨 생성 수준은 당업자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, TNF-알파 인간 EIA 키트 (케이만 케미칼(Cayman Chemical; 미국 미시간주 앤 아버))를 이용하여 TNF-알파 수준을 측정할 수 있고, 인간 TGF-베타 1 퀀티카인 면역분석법 (알앤디 시스템즈)을 이용하여 TGF-베타 1 수준을 측정할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유효량" 및 "유효 부피"는 각각 본 발명의 하나 이상의 혈액 대용품 및/또는 제약 조성물을 투여받은 대상체에서 혈액 부피의 증가, 혈류의 회복, 조직 산소화 수준의 회복, 혈류역학 파라미터의 회복, 급성 혈액 손실과 연관된 저산소증의 완화, 순환 EPO 또는 EPO 합성의 증가, 적혈구용적률 수준의 회복, 헤모글로빈 수준의 회복, HIF-1 알파의 안정화, NF-카파 B의 하향조절, 전-적혈구모세포의 아폽토시스 사건 감소 및/또는 항-적혈구생성 염증성 사이토킨의 생성 감소에 충분한 양 및 부피를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "치료 유효량" 및 "치료 유효 부피"는 각각 급성 혈액 손실이 있는 대상체에게 몇몇 개선 또는 이점을 제공하기에 충분한 양 및 부피를 의미한다. 예를 들면, 치료 유효량 또는 치료 유효 부피는 본 발명의 혈액 대용품 또는 제약 조성물을 투여받은 대상체에서 혈액 부피의 증가, 혈류의 회복, 조직 산소화 수준의 회복, 혈류역학 파라미터의 회복, 급성 혈액 손실과 연관된 저산소증의 완화, 순환 EPO 또는 EPO 합성의 증가, 적혈구용적률 수준의 회복, 헤모글로빈 수준의 회복, HIF-1 알파의 안정화, NF-카파 B의 하향조절, 전-적혈구모세포의 아폽토시스 사건 감소 및/또는 항-적혈구생성 염증성 사이토킨의 생성 감소에 충분한 양 또는 부피의 상기 혈액 대용품 또는 제약 조성물을 의미할 수 있다. 또한, 치료 유효량 또는 치료 유효 부피는 급성 혈액 손실과 연관된 증상 또는 조직병증의 치료 또는 관리시에 치료적 이점을 제공하는 본 발명의 혈액 대용품 또는 제약 조성물의 양 또는 부피를 의미할 수 있다. 또한, 본 발명의 혈액 대용품 또는 제약 조성물과 관련하여, 치료 유효량 또는 치료 유효 부피는 급성 혈액 손실, 또는 급성 혈액 손실과 연관된 증상 또는 조직병증의 치료, 관리 또는 개선에 치료적 이점을 제공하는 상기 혈액 대용품 또는 제약 조성물 단독, 또는 다른 요법과 조합된 상기 혈액 대용품 또는 제약 조성물의 양 또는 부피를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "예방적 유효량" 및 "예방적 유효 부피"는 각각 각각 대상체가 급성 혈액 손실이 되는 것을 지연시키거나 막기에 충분한 양 또는 부피를 의미한다. 예를 들면, 예방적 유효량 또는 예방적 유효 부피는 본 발명의 혈액 대용품 또는 제약 조성물을 투여받은 대상체에서 혈액 부피의 증가, 혈류의 회복, 조직 산소화 수준의 회복, 혈류역학 파라미터의 회복, 급성 혈액 손실과 연관된 저산소증의 완화, 순환 EPO 또는 EPO 합성의 증가, 적혈구용적률 수준의 회복, 헤모글로빈 수준의 회복, HIF-1 알파의 안정화, NF-카파 B의 하향조절, 전-적혈구모세포의 아폽토시스 사건 감소 및/또는 항-적혈구생성 염증성 사이토킨의 생성 감소에 충분한 양 또는 부피의 상기 혈액 대용품 또는 제약 조성물을 의미할 수 있다. 또한, 예방적 유효량 또는 예방적 유효 부피는 급성 혈액 손실과 연관된 증상 또는 조직병증의 치료 또는 관리시에 예방적 이점을 제공하는 본 발명의 혈액 대용품 또는 제약 조성물의 양 또는 부피를 의미할 수 있다. 또한, 본 발명의 혈액 대용품 또는 제약 조성물과 관련하여, 예방적 유효량 또는 예방적 유효 부피는 급성 혈액 손실, 또는 급성 혈액 손실과 연관된 증상 또는 조직병증의 치료, 관리 또는 개선에 예방적 이점을 제공하는 상기 혈액 대용품 또는 제약 조성물 단독, 또는 다른 요법과 조합된 상기 혈액 대용품 또는 제약 조성물의 양 또는 부피를 의미한다.
급성 혈액 손실과 관련하여 본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료" (또는 문법적으로 동등한 용어)는 급성 혈액 손실, 또는 급성 혈액 손실과 연관된 증상 또는 조직병증을 감소시키거나 제거하는 것을 의미한다.
급성 혈액 손실과 관련하여 본원에 사용된 용어 "예방하다", "예방하는" 및 "예방" (또는 문법적으로 동등한 용어)은 급성 혈액 손실, 또는 급성 혈액 손실과 연관된 증상 또는 조직병증을 지연시키거나 막는 것을 의미한다.
치료 또는 예방적 유효량 또는 유효 부피, 및 투여 빈도는 급성 혈액 손실, 또는 급성 혈액 손실과 연관된 증상 또는 조직병증의 유형 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 또한, 치료 또는 예방적 유효량 또는 유효 부피, 및 투여 빈도는 치료할 대상체에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 치료 또는 예방적 유효량 또는 유효 부피, 및 투여 빈도는 대상체의 연령, 성별, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다.
구체적인 실시양태에서, 급성 혈액 손실이 있는 대상체에게 투여되는 본 발명의 혈액 대용품 또는 제약 조성물의 총 일일 양은 1 g, 2 g, 3 g, 4 g, 5 g, 6 g, 7 g, 8 g, 9 g, 10 g, 20 g, 50 g, 100 g, 200 g, 500 g, 1000 g 또는 그 이상이다. 바람직한 실시양태에서, 급성 혈액 손실이 있는 대상체에게 투여되는 본 발명의 혈액 대용품 또는 제약 조성물의 총 일일 양은 단일 또는 분할 용량으로 투여시에 7 g 내지 700 g, 바람직하게는 7 g 내지 122.5 g 미만, 또는 122.5 g 초과 내지 700 g의 범위이다.
구체적인 실시양태에서, 급성 혈액 손실이 있는 대상체에게 투여되는 본 발명의 혈액 대용품 또는 제약 조성물의 총 일일 부피는 0.01 리터, 0.05 리터, 0.1 리터, 0.2 리터, 0.5 리터, 1.0 리터, 1.5 리터, 2.0 리터 또는 그 이상이다. 바람직한 실시양태에서, 급성 혈액 손실이 있는 대상체에게 투여되는 본 발명의 혈액 대용품 또는 제약 조성물의 총 일일 양은 단일 또는 분할 용량으로 투여시에 0.1 리터 내지 1 리터, 바람직하게는 0.6 리터의 범위이다.
특정 경우에는 상기 수치 및 범위가 아닌 양 및 부피를 사용할 필요가 있을 수 있으며, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
치료 과정을 위한 기간은 적어도 6 시간, 적어도 12 시간, 적어도 24 시간, 적어도 1 일, 적어도 2 일, 적어도 3 일, 적어도 4 일, 적어도 5 일, 적어도 6 일, 적어도 1 주, 적어도 2 주, 적어도 3 주, 적어도 4 주, 적어도 5 주, 적어도 7 주, 적어도 10 주, 적어도 13 주, 적어도 15 주, 적어도 20 주, 적어도 6개월 또는 적어도 1 년일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 혈액 대용품 또는 제약 조성물은 급성 혈액 손실이 소멸되거나 제어될 때까지 소정 기간 동안 투여되거나, 급성 혈액 손실의 증상이 부분적으로 또는 완전히 퇴행할 때 투여될 수 있다.
본 발명의 혈액 대용품 및 제약 조성물은 6개월 기간까지, 또는 미국의 식이 보충제 및 건강 교육법 (Dietary Supplement Health and Education Act; DSHEA) 또는 여타 미국 정부 또는 기업의 지침에 따른 권장 기간에 따라 식이 보충제로서 투여될 수 있다. 또한, 영양학자, 영양사, 임상의 또는 치료 전문의는 개별 환자 반응에 따라 본 발명의 혈액 대용품 및 제약 조성물을 의약 또는 식이 보충제로서 사용하는 것을 언제 어떻게 중단, 조정 또는 종결하는지 알 것이라는 점을 주목한다.
본 발명의 혈액 대용품 및 제약 조성물은 임의의 통상적인 치료 기법, 예컨대 혈액 수혈, 식염수 또는 덱스트로스 주입, 에리쓰로포이에틴 주사 (이들로 한정되지는 않음)와 함께 보조적으로 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 본 발명의 혈액 대용품 및/또는 제약 조성물은 순차적으로 투여된다. 또다른 특정 실시양태에서, 하나 이상의 본 발명의 혈액 대용품 및/또는 제약 조성물은 동시에 투여된다.
본 발명의 방법의 치료적 및 예방적 효과는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 통상적으로 기초하여 모니터링할 수 있다. 예를 들면, 혈액 부피, 급성 혈액 손실과 연관된 저산소증, 적혈구용적률 수준, 헤모글로빈 수준, 혈류역학 파라미터, 혈류, 조직 산소화 수준, 순환 EPO 수준, EPO 합성, HIF-1 알파 발현, NF-카파 B 발현, 전-적혈구모세포의 아폽토시스성 사건, 항-적혈구생성 염증성 사이토킨 수준, 및/또는 치료 후 대상체의 생활 건강, 신체적 건강 및/또는 정서적 건강을, 치료후 1 주, 2 주, 3 주 또는 4 주까지 측정할 수 있다. 치료 과정 이전, 동안 및/또는 이후에, 매일, 매주, 격주, 매달 또는 매년 기준으로 의사의 방문이 수행될 수 있다.
5.3. 혈액 대용품
본 발명의 혈액 대용품은 바람직하게는 무병원체, 비독성, 비-면역원성 및 비-발열원성이며 연장된 저장 수명을 갖는다.
특히, 본 발명의 방법 및 제약 조성물에 유용한 혈액 대용품은, (1) 정상산소 조건 하에 세포 배양물에서 시험시에 에리쓰로포이에틴의 발현을 유도할 수 있고/거나 (2) (a) 대상체의 적혈구용적률 또는 헤모글로빈의 배가 시간의 감소 정도 또는 (b) 대상체의 순환 에리쓰로포이에틴 수준의 증가 정도의 측정시, 정상산소 조건 하에 적혈구생성을 유도할 수 있다. 이러한 특성을 나타내는 모든 혈액 대용품이 본 발명의 방법 및 제약 조성물에서 사용될 수 있다.
상기 언급된 특성들을 나타내는 임의의 혈액 대용품 (현재 공지되어 있고/거나 시판중인 혈액 대용품 포함)이 본 발명의 방법 및 제약 조성물에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서 사용하기 위한 우수한 혈액 대용품은 o-아데노신 5 '-트리포스페이트 (o-ATP), o-아데노신 및 환원 글루타티온 (GSH)과 가교된 순수한 소 Hb를 포함하는 가교 헤모글로빈 (예를 들면, 헤모테크™)이고, 이는 혈액 부피를 증가시키고 급성 혈액 손실과 연관된 저산소증을 완화할 수 있으며, (1) 정상산소 조건 하에 세포 배양물에서 시험시에 에리쓰로포이에틴의 발현을 유도할 수 있고/거나 (2) (a) 대상체의 적혈구용적률 또는 헤모글로빈의 배가 시간의 감소 정도 또는 (b) 대상체의 순환 에리쓰로포이에틴 수준의 증가 정도의 측정시, 정상산소 조건 하에 적혈구생성을 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 여타 혈액 대용품, 예컨대 헤마시스트™ (벡스터 헬스케어; 미국 일리노이주 라운드 레이크), 헤모링크 ™ (헤모솔 인크.; 캐나다 토론토), 옵트로™ (소마토겐; 미국 콜로라도주 볼더), 헤모퓨어® (바이오퓨어 인크.; 미국 메사추세츠주 캠브리지), 폴리헴® (노쓰필드 래버러토리즈 인크.(Northfield Laboratories Inc.; 미국 일리노이주 에반스톤)) (앞서 언급됨) 및 헤모스판(HEMOSPAN)® (산가르트, 인크.(Sangart, Inc.; 미국 캘리포니아주 샌 디에고)) [유리 헤모글로빈의 독성을 제거하기 위해 오래된(outdated) 인간 혈액으로부터 수확되어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 조합됨], 및 헤모자임(HEMOZYME)® (신자임 테크놀로지스, 엘엘씨(SynZyme Technologies, LLC; 미국 캘리포니아주 어바인)) [헤모글로빈 담체 및 CNO 복합체로 이루어짐]은 정상산소 조건 하에 적혈구생성을 유도할 수 있는 것으로 알려지지는 않았다. 그러나, 이들은 대상체에서의 적혈구생성을 자극하기 위해 내생 에리쓰로포이에틴의 생성을 유도하도록 적합화될 수 있는 것으로 판단된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 제약 조성물에 유용한 혈액 대용품은 정상산소 조건 하에 세포 배양물에서 시험시 에리쓰로포이에틴의 발현을 유도할 수 있다. 특정 실시양태에서, 에리쓰로포이에틴의 발현은 기저 수준의 5％ 이하, 10％, 20％, 50％, 100％, 200％, 500％ 또는 그 이상 유도된다. 에리쓰로포이에틴의 발현은 당업자에게 널리 알려진 임의의 방법으로 측정할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 제약 조성물에 유용한 혈액 대용품은 대상체의 적혈구용적률의 배가 시간의 감소에 의해 측정시 정상산소 조건 하에 적혈구생성을 유도할 수 있다. 특정 실시양태에서, 대상체의 적혈구용적률의 배가 시간은 5％ 이하, 10％, 20％, 50％, 100％, 200％, 500％ 또는 그 이상 감소된다. 특정 실시양태에서, 대상체의 적혈구용적률의 배가 시간은 6시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 20일 또는 그 이상 감소된다. 특정 실시양태에서, 대상체의 적혈구용적률의 배가 시간은 30일, 20일, 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일, 1일, 12시간 또는 6시간 미만이다. 바람직한 실시양태에서, 대상체의 적혈구용적률의 배가 시간은 3일 미만이다. 대상체의 적혈구용적률의 배가 시간은 당업자에게 널리 알려진 임의의 방법으로 측정할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 제약 조성물에 유용한 혈액 대용품은 대상체의 헤모글로빈의 배가 시간의 감소에 의해 측정시 정상산소 조건하에서 적혈구생성을 유도할 수 있다. 특정 실시양태에서, 대상체의 헤모글로빈의 배가 시간은 5％ 이하, 10％, 20％, 50％, 100％, 200％, 500％ 또는 그 이상 감소된다. 특정 실시양태에서, 대상체의 헤모글로빈의 배가 시간은 6시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 20일 또는 그 이상 감소된다. 특정 실시양태에서, 대상체의 헤모글로빈의 배가 시간은 30일, 20일, 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일, 1일, 12시간 또는 6시간 미만이다. 바람직한 실시양태에서, 대상체의 헤모글로빈의 배가 시간은 7일이다. 대상체의 헤모글로빈의 배가 시간은 당업자에게 널리 알려진 임의의 방법으로 측정할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 제약 조성물에 유용한 혈액 대용품은 대상체의 순환 에리쓰로포이에틴 수준의 증가에 의해 측정시 정상산소 조건 하에 적혈구생성을 유도할 수 있다. 특정 실시양태에서, 대상체의 순환 에리쓰로포이에틴 수준은 5％ 이하, 10％, 20％, 50％, 100％, 200％, 500％ 또는 그 이상 증가된다. 특정 실시양태에서, 대상체의 순환 에리쓰로포이에틴 수준은 5 mU/ml, 10 mU/ml, 20 mU/ml 또는 그 이상 증가된다. 특정 실시양태에서, 대상체의 순환 에리쓰로포이에틴 수준은 20 mU/ml, 50 mU/ml, 100 mU/ml, 200 mU/ml, 500 mU/ml, 1000 mU/ml 또는 그 이상이다. 바람직한 실시양태에서, 대상체의 순환 에리쓰로포이에틴 수준은 15 ± 5 mU/ml이다. 대상체의 순환 에리쓰로포이에틴 수준은 당업자에게 널리 알려진 임의의 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 혈액 대용품은 아래 단락 5.3.1에서 논의하는 가교된 헤모글로빈이거나, 또는 하기 단락 5.4에서 논의하는 신규한 조성물이다.
5.3.1. 가교된 헤모글로빈
본 발명의 가교된 헤모글로빈에는 페올라 등의 미국 특허 제5,439,882호 (이는 전문이 본원에 참고로 포함된)에 기재된 것들이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 특히, 본 발명의 가교된 헤모글로빈에는 헤모테크™가 포함된다.
가교된 헤모글로빈은 퍼요오데이트-산화된 ATP (o-ATP)와 분자내 가교되고 퍼요오데이트-산화된 아데노신 (o-아데노신)과 분자간 가교되어 폴리헤모글로빈을 형성하는 헤모글로빈을 포함한다.
본 발명의 가교된 헤모글로빈 중의 헤모글로빈 및 퍼요오데이트-산화된 ATP의 몰비는 1:1 내지 1:3, 또는 그 사이의 임의의 범위일 수 있다.
본 발명의 가교된 헤모글로빈 중의 헤모글로빈 및 퍼요오데이트-산화된 아데노신의 몰비는 1:1 내지 1:10, 또는 그 사이의 임의의 범위일 수 있다.
본 발명의 가교된 헤모글로빈 중의 헤모글로빈 및 퍼요오데이트-산화된 ATP의 몰비는 1:1 내지 1:3, 또는 그 사이의 임의의 범위일 수 있고, 본 발명의 가교된 헤모글로빈 중의 헤모글로빈 및 퍼요오데이트-산화된 아데노신의 몰비는 1:1 내지 1:10, 또는 그 사이의 임의의 범위일 수 있다.
본 발명의 가교된 헤모글로빈 중의 헤모글로빈은 추가로 환원된 글루타티온과 접합된다. 환원된 글루타티온의 부가는 헤모글로빈과 퍼요오데이트-산화된 아데노신의 가교 반응을 정지시킨다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 가교된 헤모글로빈 중의 헤모글로빈 및 환원된 글루타티온의 몰비는 1:1 내지 1:20, 또는 그 사이의 임의의 범위일 수 있다.
퍼요오데이트-산화된 ATP, 퍼요오데이트-산화된 아데노신, 및 환원된 글루타티온은 당업자 공지의 임의의 방법으로 헤모글로빈과 가교시킬 수 있다 (예를 들면, 페올라 등의 미국 특허 제5,439,882호 참조).
바람직한 헤모글로빈은 소 헤모글로빈이다. 그러나, 그 밖의 헤모글로빈 원료도 본원에서 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 가교된 헤모글로빈은 메트-헤모글로빈을 약 50％, 30％, 20％, 10％, 5％, 1％ 미만으로 포함하거나, 또는 포함하지 않는다.
본 발명의 가교된 헤모글로빈의 분자량은 바람직하게는 약 130 내지 390 킬로달톤이고, 보다 바람직하게는 약 190 내지 260 킬로달톤이며, 최대로는 1000 킬로달톤을 초과한다.
헤모글로빈, 퍼요오데이트-산화된 ATP, 퍼요오데이트-산화된 아데노신, 및 환원된 글루타티온은 시중에서 구입할 수 있거나 (시그마 케미칼 캄파니; 미국 미주리주 세인트 루이스), 또는 전문이 본원에 참고로 포함되는 페올라 등의 미국 특허 제5,439,882호에 기재되어 있는 방법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 가교된 헤모글로빈은 비전해질 수용액 중에 용해될 수 있다. 본 발명의 가교된 헤모글로빈의 수용액에 첨가될 수 있는 비전해질의 일례는 인간 알부민, 상이한 혈장 분획물, 및 혈장이다. 그러나, 제약상 허용되고 본 발명의 가교된 헤모글로빈의 산소-운반 기능을 훼손하지 않는 임의의 비전해질로서 덱스트란 및 히드록시에틸 전분을 사용할 수도 있다.
본 발명의 가교된 헤모글로빈은 전문이 본원에 참고로 포함되는 페올라 등의 미국 특허 제5,439,882호에 기재되어 있는 방법을 포함해서, 이들로 한정되지 않는 방법들로 제조할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 가교된 헤모글로빈은 다음과 같은 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다:
(a) 전혈을 백혈구-적혈구 혼합물, 혈소판 및 혈장으로 분리시키고, 수득한 혼합물을 수용액 중에 현탁시키는 단계;
(b) 백혈구-적혈구 혼합물을 포함하는 수용액을 냉각시켜 백혈구들을 응집시키고, 이 백혈구 응집체를 제거하여 실질적으로 백혈구가 없는 용액을 수득하는 단계;
(c) 실질적으로 백혈구가 없는 용액을 저장 용액으로 투석하여 실질적으로 백혈구가 없는 용액 중의 적혈구로부터 헤모글로빈을 추출하고, 증가된 정수압 하에서 한외여과하여 상기 실질적으로 백혈구가 없는 용액 중의 추출된 헤모글로빈으로부터 적혈구를 분리시켜 추출된 헤모글로빈 용액을 수득하는 단계;
(d) 상기 추출된 헤모글로빈 용액 중의 추출된 헤모글로빈을 카르복시-헤모글로빈으로 전환시켜 카르복시-헤모글로빈 용액을 수득하는 단계;
(e) 상기 카르복시-헤모글로빈 용액을 저온 살균하여 비-헴 단백질로 변성 및 침전시키는 단계;
(f) 상기 카르복시-헤모글로빈 용액으로부터 인지질 및 침전된 비-헴 단백질을 제거하는 단계;
(g) 친화성 크로마토그래피로 상기 카르복시-헤모글로빈 용액으로부터 내독소를 제거하는 단계;
(h) 상기 카르복시-헤모글로빈 용액 중의 카르복시-헤모글로빈을 약 10 g/dL의 농도로 농축시켜 농축된 카르복시-헤모글로빈 용액을 수득하는 단계;
(i) 상기 농축된 카르복시-헤모글로빈 용액 중의 카르복시-헤모글로빈을 o-ATP와 반응시켜 카르복시-헤모글로빈의 분자내 가교가 우세하게 일어나게 하여, 분자내 가교된 카르복시-헤모글로빈 용액을 수득하는 단계;
(j) 상기 o-ATP 카르복시-헤모글로빈을 카르복시-헤모글로빈의 분자간 가교가 우세하게 일어나는데 유효한 양의 o-아데노신과 반응시켜, 분자간 및 분자내 가교된 카르복시-헤모글로빈 용액을 수득하고, 상기 분자간 및 분자내 가교된 카르복시-헤모글로빈 용액에 글루타티온을 첨가하여 o-아데노신 가교 반응을 켄칭시키는 단계; 및
(k) 상기 분자간 및 분자내 가교된 카르복시-헤모글로빈 용액 중의 가교된 카르복시-헤모글로빈을 가교된 옥시-헤모글로빈으로 전환시키는 단계.
특정 실시양태에서는, 단계 (a)에서 전혈을 원심분리하여 혈소판 및 혈장으로부터 백혈구-적혈구 혼합물을 분리시킨다. 다른 특정 실시양태에서는, 단계 (b)에서 백혈구 응집체를 여과하여 제거한다. 또다른 특정 실시양태에서는, 단계 (f)에서 인지질 및 침전된 비-헴 단백질을 카르복시-헤모글로빈 용액으로부터 용매 추출하여 제거한다. 또다른 특정 실시양태에서는, 단계 (h)에서 농축된 카르복시-헤모글로빈 용액을 대략 등장의 용액(normotonic solution)으로 투석하여 농축시킨다.
5.4. 제약 조성물 및 키트
또한 본 발명은 본 발명의 방법 또는 기타 치료 방법에서 사용할 수 있는 특정 농도 또는 부피의 혈액 대용품을 포함하는 신규한 제약 조성물에 관한 것이다. 예를 들면, 그러한 신규 조성물은 제약상 허용되는 담체 내에 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품의 7 g 내지 122.5 g 미만의 치료 유효량을 포함할 수 있고, 상기 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품은 정상산소 조건 하에 세포 배양물에서 시험시 에리쓰로포이에틴의 발현을 유도한다. 이와 달리, 상기 조성물은 제약상 허용되는 담체 내에 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품의 122.5 g 초과 내지 700 g의 치료 유효량을 포함할 수 있고, 상기 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품은 정상산소 조건 하에 세포 배양물에서 시험시 에리쓰로포이에틴의 발현을 유도한다. 한편, 상기 조성물은 제약상 허용되는 담체 내에 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품의 0.6 리터 미만의 치료 유효량을 포함할 수 있고, 상기 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품은 정상산소 조건 하에 세포 배양물에서 시험시 에리쓰로포이에틴의 발현을 유도한다.
기타의 신규한 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체 내에 가교된 헤모글로빈의 7 g 내지 122.5 g 미만의 치료 유효량을 포함하고, 상기 가교된 헤모글로빈은 퍼요오데이트-산화된 ATP와 분자내 가교되고, 퍼요오데이트-산화된 아데노신과 분자간 가교되고, 환원된 글루타티온과 접합된 헤모글로빈이다. 이와 달리, 상기 조성물은 제약상 허용되는 담체 내에 가교된 헤모글로빈의 122.5 g 초과 내지 700 g의 치료 유효량을 포함할 수 있고, 상기 가교된 헤모글로빈은 퍼요오데이트-산화된 ATP와 분자내 가교되고, 퍼요오데이트-산화된 아데노신과 분자간 가교되고, 환원된 글루타티온과 접합된 헤모글로빈이다. 또다른 실시양태에서, 상기 조성물은 제약상 허용되는 담체 내에 가교된 헤모글로빈의 0.6 리터 미만의 치료 유효량을 포함할 수 있고, 상기 가교된 헤모글로빈은 퍼요오데이트-산화된 ATP와 분자내 가교되고, 퍼요오데이트-산화된 아데노신과 분자간 가교되고, 환원된 글루타티온과 접합된 헤모글로빈이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 사용되는 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품 및 가교된 헤모글로빈은 세포 배양물에서 시험시 HIF-1 알파의 발현을 안정화시킨다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 사용되는 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품 및 가교된 헤모글로빈은 세포 배양물에서 시험시 HIF-1 알파의 발현을 5％, 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 또는 100％ 안정화시킨다.
특정한 다른 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 사용되는 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품 및 가교된 헤모글로빈은 세포 배양물에서 시험시 NF-카파 B의 발현을 하향조절한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 사용되는 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품 및 가교된 헤모글로빈은 세포 배양물에서 시험시 NF-카파 B의 발현을 5％, 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 또는 100％ 하향조절한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 사용되는 가교된 헤모글로빈은 헤모글로빈 및 퍼요오데이트-산화된 ATP를 1:1 내지 1:3의 몰비로 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 사용되는 가교된 헤모글로빈은 헤모글로빈 및 퍼요오데이트-산화된 아데노신을 1:1 내지 1:10의 몰비로 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 사용되는 가교된 헤모글로빈은 헤모글로빈 및 환원된 글루타티온을 1:1 내지 1:20의 몰비로 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 사용되는 가교된 헤모글로빈은 헤모글로빈 및 퍼요오데이트-산화된 ATP를 1:1 내지 1:3의 몰비로; 헤모글로빈 및 퍼요오데이트-산화된 아데노신을 1:1 내지 1:10의 몰비로; 그리고 헤모글로빈 및 환원된 글루타티온을 1:1 내지 1:20의 몰비로 포함한다.
아래 단락 5.3에서 기재하는, 이러한 특징을 나타내는 임의의 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품 및 가교된 헤모글로빈을 본 발명의 제약 조성물에 사용할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 사용되는 가교된 헤모글로빈을 비전해질 수용액 중에 용해시킨다.
상기 제약 조성물은 추가로 만니톨 및/또는 전해질을 포함할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물에 사용할 수 있는 전해질에는 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘 양이온, 및 염화물, 중탄산염, 글루콘산염 및 황산염 음이온이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 혈액 대용품을 약 1 g 이하, 5 g, 10 g, 15 g, 20 g, 25 g, 30 g, 40 g, 50 g, 60 g, 70 g, 80 g, 90 g, 100 g, 150 g, 200 g, 300 g, 50O g, 1000 g, 2000 g 또는 그 이상 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 혈액 대용품을 약 7 g 내지 약 122.5 g 미만 포함한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 혈액 대용품을 약 122.5 g 내지 약 700 g 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 혈액 대용품을 약 0.1 리터 이하, 0.2 리터, 0.3 리터, 0.4 리터, 0.5 리터, 0.6 리터, 0.7 리터, 0.8 리터, 0.9 리터, 1.0 리터, 2.0 리터, 5.0 리터, 10.0 리터 또는 그 이상 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 혈액 대용품을 약 0.6 리터 미만 포함한다.
본 발명의 제약 조성물은 본 발명의 방법 외에도 만성 혈액 손실 빈혈 (예를 들면, 겸상 적혈구 빈혈증) 치료를 비롯해서 이것으로 한정되지 않는 임의의 다른 방법에도 사용할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 당업자 공지의 임의의 방법으로 투여할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물을 투여하는 방법에는 비경구 (예를 들면, 피하, 근육내, 안와내, 관절낭내, 척수강내, 흉골내, 정맥내, 피내, 복강내, 문맥내) 투여, 경막외 투여, 및 점막 (예를 들면, 비강내) 투여가 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
특정 실시양태에서는, 제약 조성물을 비경구적으로 투여한다. 제약 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우, 사용 전에 성분들을 혼합할 수 있도록 멸균수 또는 멸균염수의 앰풀이 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서는, 본 발명의 제약 조성물을 주입에 의해 투여한다. 또다른 특정 실시양태에서는, 본 발명의 제약 조성물을 주사에 의해, 바람직하게는 정맥내 주사에 의해 투여한다.
본 발명의 제약 조성물은 고형, 캡슐, 정제, 겔 등을 비롯해서 이들로 한정되지 않는 단위 투여형으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 또한 앰풀이나 사쉐와 같은 밀폐된 밀봉 용기 내의 동결 건조된 분말 또는 무수 농축제로 제형화될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 하나 이상의 용기를 포함하는 키트로 공급될 수 있다. 각 용기는 동일하거나 상이한 제약 조성물을 포함할 수 있다.
상기 키트는 추가로 제약 조성물을 주사하기 위한, 바람직하게는 멸균형으로 포장된, 바늘이나 주사기 및/또는 포장된 알코올 패드를 포함할 수 있다. 임의로, 임상의나 환자가 본 발명의 혈액 대용품 및 제약 조성물을 투여하도록 지시사항이 포함될 수 있다.
상기의 설명 및 도면은 단지 본 발명의 원리를 설명하기 위한 것일 뿐이고, 여기에 다양한 부가, 변형 및 치환이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 특히, 본 발명이 본 발명의 개념 또는 본질적인 특징과 동떨어짐 없이 다른 특정 형태, 구조, 배열, 비율로, 그리고 다른 요소, 재료 및 성분들에 의해 구체화될 수 있음은 당업자에게 분명할 것이다. 또한, 본원에서 기재한 특성들은 그 단독으로 또는 다른 특성들과 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 여기서 개시하는 실시양태들은 모두 설명적인 측면일 뿐이며, 첨부된 특허청구범위에 의해 나타내어지는 본 발명의 범위를 제한하지 않고, 상기의 상세한 설명을 제한하지 않는 것으로 간주되어야 한다.
6. 실시예
이하의 실시예는 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하지 않으면서 본 발명의 특정 실시양태를 설명하는 방식으로 제공된다.
6.1. 실시예 1 - 생명을 위협하는 빈혈 환자를 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품으로 처리하는 것에 의한 생체내 적혈구용적률의 증가
6.1.1. 방법
이전의 과학 문헌 (페올라 등 (1988)의 문헌 [Circulatory Shock 25:275-290])에서 보고된 방법에 따라 순환 혈액 부피의 1/3 (33％) 및 2/3 (66％)로 혈액을 제거한 후, dL 당 10 g으로 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 혈액 대용품을 동일한 부피로 주입한 코에버스 원숭이의 각각 여섯 마리씩 네 그룹에 대해 실험을 수행하였다.
본 실험에서는, 혈액 대용품 대신 동족의 혈장을 사용한 것을 대조군으로 하였다. 체중 4 내지 5 kg의 건강한 수컷 원숭이의 근육내로 케타민 HCl 12.5 mg/kg 을 사용하여 이들을 진정시켰다. 멸균 16-게이지 테플론 카테터를 대퇴 동맥 및 하나의 대퇴 정맥에 경피적으로 삽입하였다. 헤파린은 투여하지 않았다. 동물들이 자발적으로 실내 공기로 호흡하도록 하였다. 표본들이 안정을 되찾은 후, 원숭이들을 다음과 같은 처리 그룹 중의 하나로 나누었다: (I) 대퇴 동맥으로부터 순환 전체 혈액 부피의 1/3 (33％)을 제거하고, 정맥선을 통해 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품을 동일한 부피로 주입 (체중 kg 당 대략 2.3 g)하여 대체시킨 것; (II) 대퇴 동맥으로부터 순환 전체 혈액 부피의 2/3 (66％)를 제거하고, 정맥선을 통해 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품을 동일한 부피로 주입 (체중 kg 당 대략 4.6 g)하여 대체시킨 것; (III) 대퇴 동맥으로부터 순환 전체 혈액 부피의 1/3 (33％)을 제거하고, 정맥선을 통해 동족의 혈장을 동일한 부피로 주입하여 대체시킨 것; 및 (IV) 대퇴 동맥으로부터 순환 전체 혈액 부피의 2/3 (66％)를 제거하고, 정맥선을 통해 동족의 혈장을 동일한 부피로 주입하여 대체시킨 것.
혈액 샘플을 기저에서, 혈액을 제거한 후, 및 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품 및 동족의 혈장을 주입한 후 1, 2, 4, 5, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20, 22 및 24일 째에 채취하고, 혈장없이 헤모글로빈을 함유하는 혈액 샘플에서 적혈구생성의 가장 강력한 지표인 적혈구용적률을 시험하였다. 적혈구용적률은 전혈의 부피에 대한 농축 적혈구 부피의 비율로, 퍼센트로 표현된다. 적혈구용적률은 헤파린처리된 미세-적혈구용적률 모세관 튜브 (피셔 사이언티픽; 미국 텍사스주 휴스턴) 및 미세-적혈구용적률 원심분리기 (다몬 아이스 디비젼; 미국 메사추세츠주 니담)를 이용하여 측정하였다.
6.1.2. 결과
그룹 I, II 및 III에 속한 모든 동물들은 처리 후 살아남았지만, 그룹 IV의 동물 중 한 마리 (16％)는 24시간 내에 사망하였다.
도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 순환 전체 혈액 부피의 1/3 및 2/3을 제거한 이후에 적혈구용적률은 각각 대략 30％ (Hb는 dL 당 대략 9 g임) 및 13％ (헤모글로빈은 dL 당 대략 4.5 g임)로 떨어졌다. 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품의 투여는 적혈구용적률을 순환 전체 혈액 부피의 1/3을 대체한 후에는 (그룹 I) 대략 3.5일, 순환 전체 혈액 부피의 2/3을 대체한 후에는 (그룹 II) 대략 8.5일 후에 기저 수준으로 회복시켰다. 대조적으로, 동족의 혈장으로 처리한 동물은 적혈구용적률이 신속하게 정상화되지 못하였다. 혈장으로 33％ 대체 수혈된 그룹 III에서, 적혈구용적률은 대략 10일 후에 정상으로 되돌아왔고, 66％ 대체 수혈된 그룹 IV에서는 적혈구용적률이 대략 24일 후에 기저 수준에 이르렀다.
66％ 대체 요법을 행한 혈액 대용품 그룹 (II)에서는 적혈구용적률이 3일 이내에 배가된 반면, 동족의 혈장으로 처리한 그룹 IV에서는 살아남은 동물에서 적혈구용적률이 대략 10일 만에 배가되었다.
6.1.3. 결론
헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품을 투여한 결과, 생명을 위협하는 정도의 혈액 손실 (66％) 이후에도 적혈구 질량이 매우 신속하게 정상 수준으로 회복되었다. 이 혈액 대용품은 급성 혈액 손실 빈혈에 대한 자연적인 적혈구생성 반응을 2배 더 촉진시킨다. 이 혈액 대용품의 순환상 반감기는 대략 24시간으로 추정되므로, 본 제품은 초기 소생 시기에서 단순히 산소 운반체로서 뿐만 아니라, 적혈구생성 반응의 효과적인 자극제로서도 작용한다.
다른 혈액 대용품으로 실험상 처리한 생명을 위협하는 빈혈 환자에게서 보고되는 적혈구용적률 배가 시간은 대량의 재조합 EPO와 동시처리한 이후에도 10일 내지 24일이었다 (문헌 [Lanzinger et al. (2005) Can J Anaesth 52(4):369-373]; [Gannon et al. (2002) 30(8):1893-1895]; [Allison et al. (2004) 97(12):1257-1258]).
정상 상태에서 적혈구생성 (다능성 줄기세포로부터 RBC)은 5일 이내에 일어나야 하기 때문에, 최근에 시험된 혈액 대용 제품 (EPO 보충)으로 얻은 결과는 임상적으로 허용되지 않고, 이는 골수 세포 상의 헤모글로빈에 대해 직접 독성 효과를 나타낸다.
대조적으로, 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품을 단독으로 처리했을 때 적혈구용적률의 배가 시간이 3일 미만이라는 것은 본 혈액 대용 제품이 유일하고 직접적인 적혈구생성 포텐셜을 가짐을 보여준다.
6.2. 실시예 2 - 생명 위협 빈혈 하의 토끼에서의 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품으로의 처리로 인한 생체내 적혈구용적률의 증가
6.2.1. 방법
문헌에 종래에 보고되어 있는 방법에 따라, 1％ 리도카인으로의 국소 마취 하에서 체중이 4.0 kg인 12 마리의 뉴질랜드 토끼의 한쪽 귀의 중심 동맥 및 다른쪽 귀의 가장자리 정맥에 멸균 캐뉼러를 삽입하였다 (문헌 [Feola et al. (1988) Surg Gynecol Obstet 166: 211-222; Simoni et al. (1990) Biomat Art Cells Art Org 18(2): 189-202] 참조).
장치한 후, 토끼에서 산출 총 혈액 부피의 ⅓ (33％)을 제거하고, 이어서 15분 후에 또다른 ⅓ (33％)을 제거하였다. 실험용 토끼 (6 마리)에게 총 혈액 손실 부피와 동일한 부피 (kg 체중 당 대략 4.6 g)의 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품을 주입하였다. 출혈 후의 또다른 6 마리의 동물은 처리하지 않았다. 이들 동물은 모두 1시간 내에 폐사하였다. 혈액 대용품이 주입된 동물 실험군은 모두 생존하였다.
출혈 후에, 그리고 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품을 주입한 후 1일, 2일, 4일, 7일, 9일 및 14일 후에 혈액 샘플을 기저에서 채취하였다. 혈액 샘플을 실시예 1에서와 같이 적혈구용적률에 대해 시험하였다.
6.2.2. 결과-결론
도 2에 나타낸 바와 같이, 산출 총 혈액 부피의 ⅔를 제거함에 따라, 적혈구용적률이 대략 9.5％로 하락하였다 (헤모글로빈이 dL 당 대략 4.0 g였음). 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품의 투여는 대략 8.5일에 기저 적혈구용적률을 재편성하였다. 또한, 토끼에서, 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품을 투여한 결과, 심지어 생명 위협 (66％) 혈액 손실 후에도 적혈구 질량이 정상 수치로 매우 빠르게 회복되었다. 적혈구용적률 배가 시간은 대략 3일이었다. 또한, 토끼에서, 이러한 혈액 대용 제품은 단순하게 최초 소생 단계에서 산소 담체로서 작용할 뿐만 아니라, 또한 적혈구생성의 효과적인 자극제로서 작용하였다.
6.3. 실시예 3 - 생명 위협 빈혈이 있는 정상혈압 래트의 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품을 사용하여 소생한 후의 혈류역학 및 조직 산소화도
6.3.1. 방법
문헌에 종래에 보고되어 있는 방법에 따라 나트륨 펜토바르비탈을 주사하고 무균 미세수술 과정으로 처리하여, 체중이 350 내지 450 g인 10 마리의 수컷 정상혈압 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트 (찰스 리버; 미국 뉴욕주 킹스톤)를 30 mg/kg 체중의 나트륨 펜토바르비탈로 복막내 마취하고, 무균 미세수술 과정으로 처리하였다 (문헌 [Simoni et al. (1996) ASAIO J 42(5): M773-782] 참조).
혈류역학 값을 평가하고 참조 샘플을 수집하기 위해, 우 및 좌 대퇴 동맥, 좌 대퇴 정맥 및 외부 경정맥을 수술로 노출시키고, 폴리에틸렌 카테터 (모델 PE-50, 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니(Becton Dickinson and Co.; 미국 뉴저지주 파르시파니))로 캐뉼러 처리하였다. 동맥 혈압은, 우 대퇴 동맥에 위치하고 1회용 소 부피 혈압 변환기 (오메다, 피티이, 엘티디(Ohmeda, Pte, Ltd; 싱가포르))에 연결된 카테터를 통해 연속 측정하였다. 심장 박출량 (CO)을 측정하기 위해, 실온에서 외부 경정맥에 위치한 카테터를 통해 우심방에 식염수 용액 100 μL를 주사하면서 서모스탯(thermostat) 마이크로프로브 (모델 IF, ⅓ mm O.D.; 콜롬버스 인스트루먼츠; 미국 오하이오주 콜롬버스)를 경동맥을 통해 상행 대동맥으로 진행하게 하였다. 조직 산소화도 (tpO2)를 측정하기 위해, DO-166 산소 마이크로프로브 (라자르 리서치 레버러토리즈 인코포레이티드; 미국 캘리포니아주 로스앤젤러스)를 대퇴이두근 근육 (오른쪽 다리)에 수술로 삽입하였다. 가열 패드를 사용하여 전체 실험 동안 혈액 온도를 37±0.1℃로 유지하였다. 모든 동물은 자발 호흡하게 하였다.
심장 박출량 (CO; ml/분; ml/분/100 g 체중 단위의 심장 지수 (CI)), 박동 부피 (SV; ml/박동/100 g 체중), 평균 동맥 압력 (MAP; mmHg), 맥압 (PP; mmHg), 심박수 (HR; 박동/분), 총 말초 저항 (TPR; (dyn/초/cm-5)×103) 및 혈액 온도를 비롯한 혈류역학 파라미터는, 완전 자동 카르디오맥스 순환 시스템 컴퓨터 (콜롬버스 인스트루먼트사; 미국 오하이오주 콜롬버스)를 사용하여 기록하였다. 조직 산소화도는, DO-166 프로브의 인터페이스와 마이크로컴퓨터 (pH 버젼 6071, 라자르 리서치 레버러토리즈) 및 카르디오맥스 순환 시스템 컴퓨터의 차트 기록기를 연결하여 연속 기록하였다.
동맥 혈액 산소 함량 (혈액 100 mL 중 ml O2)은, 헤모글로빈의 양 (g)과 공지된 산소 포화도 및 1.36 (완전 포화된 1 g의 헤모글로빈이 운반하는 산소의 양)을 곱하여 산출하였다. 혈액 산소 운반 (ml 02/분)은, CO (L/분)와 동맥 혈액 산소 운반량 (혈액 100 mL 당 ml)을 곱하고 10의 인수로 조정하여 산출하였다.
카르디오맥스 시스템의 수술 처치 및 보정을 완료한 후, 혈류역학 및 조직 산소 함량 파라미터의 안정화를 위해 30분을 두었다. 총 혈액 부피의 40％에 상응하는 부피 (각각의 래트에 대해 kg 체중의 7％와 같도록 산출됨) 또는 kg 체중 당 2.8 g의 동맥 혈액을 배출시켜, 출혈성 쇼크를 유발하였다. 혈액의 배출은 5분 내에 완료하였다. 출혈성 쇼크를 30분 동안 지속시켰다. 그 후, 래트를 총 혈액 손 실 부피와 동일한 부피의 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품으로 처리하였다. 처리는 대략 10분 내에 완료하였다. 이어서, 모든 래트를 처리 후 90분의 동안 연구하였다. 실험 종료시, 나트륨 펜토바르비탈을 정맥내 투여하여 래트를 죽였다.
6.3.2. 결과
하기 (표 1) 및 도 3에 요약된 결과는 혈액 제거 후 TPR가 증가하고, CI, MAP 및 조직 pO2가 감소하고, 이어서 TPR가 정상으로 즉시 감소하여, CI, MAP 및 조직 pO2가 빠르게 정상화됨을 나타내었다. 게다가, 처리 후 전체 기간 동안 혈관확장이 나타나고, 조직 산소화도가 더 양호했다.
Figure 112008086410450-PCT00001
6.3.3. 결론
본 실험은 TPR가 현저하게 증가하면서 심장 지수가 대략 66％ 하락하고 평균 동맥 압력이 대략 67％ 하락하고 조직 산소화가 대략 78％ 감소하는 것을 특징으로 하는 출혈성 쇼크가 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품으로 성공적으로 치료될 수 있음을 나타내었다. 혈관확장 활성, 및 출혈로 이어지는 혈관수축의 감소는, 1차적으로 혈관확장성 및 항-염증성을 갖고 본 기술분야에서 분자간 가교 시약 및 헤모글로빈 표면 변형제로서 사용되는 아데노신과 관련될 수 있다 (페올라(Feola), 시모니(Simoni) 및 카니짜로(Canizaro)의 미국 특허 제5,439,882호 참조). 또한, 본 실험은 치료제 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품이 조직/기관 관류를 최대화하여 조직 산소화를 개선함을 증명하였다.
허혈성 기관으로의 적합한 산소 운반은 혈액 대용품으로서의 상기 작용제의 규제 승인의 주요 인자이다. 도 1, 도 2, 도 3, 도 4, 도 5, 및 도 6A 및 6B에 나타낸 바와 같이, 허혈성 조직 및 기관으로의 생체내 산소 운반의 최대화는 적혈구생성 반응을 차단하지 않았다.
6.4. 실시예 4 - 겸상적혈구성 빈혈 환자의 치료에 사용되는 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품의 적혈구생성 효과
6.4.1. 방법
문헌에 종래에 보고되어 있는 바와 같이, 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품을 인간에게 시험하였다 (문헌 [Feola et al. (1992) Surg Gynecol Obstet 174(5): 379-386] 참조). 9명의 환자군을 킨샤사 소재의 겸상적혈구성 빈혈 센터에서 치료하였다. 4세 내지 13세의 남아 5명 및 여아 4명이 있었다. 5명의 아동은 혈액 헤모글로빈 수준이 dL 당 5 g 이하로 중증의 빈혈이었다. 4명의 아동은 헤모글로빈 수준이 dL 당 대략 8 g으로 빈혈의 정도가 보다 경증이었으나, "겸상적혈구성 발증"을 앓았다. 즉, 손 및 발 (2명의 환자), 왼쪽 폐 (1명의 환자), 및 비장 (1명의 환자)에서의 급성 모세혈관 폐쇄를 앓았다. 환자에게는 동통, 열, 전신 권태 및 허약 증상이 있었다.
kg 체중 당 대략 1.75 g인 총 혈액 부피의 25％에 상응하는 부피 (각각의 환자에 대해 kg 체중 당 7％로 산출됨)의 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품을 정맥내로 주사하였다. 최초 헤모글로빈이 dL 당 3.5 g인 중증의 빈혈이 있는 1명의 환자는 연속 2일 동안 2번의 수혈을 받았다.
활력 징후, 온도, 맥박, 호흡 및 혈압은, 혈액 대용품 투여 동안 15분마다 그리고 혈액 대용품 투여 후 2시간 동안 측정하였다. 소변 배출량은, 혈액 대용품 투여 2시간 전 및 2시간 후 동안 측정하였다. 소변을 헤모글로빈의 존재에 대해 시험하였다.
혈액 샘플을 혈액 대용품 투여 전, 직후, 2시간 후, 그리고 5일 동안 매일 채취하였다. 환자 혈액을 혈장 유리 헤모글로빈, 총 헤모글로빈 및 망상적혈구에 대해 시험하였다.
적은 부피의 EDTA 혈장을 -20℃에서 저장한 후, 에리쓰로포이에틴 수준을 측정하였다. EPO-트랙 125I RIA 키트 (인크스타 코퍼레이션 (현재, 디아 소린 에스.피.에이.); 이탈리아 살루기)를 사용하여 EPO를 검출하였다. 인크스타 EPO-트랙 125I RIA 방법은 추적자 및 표준물 둘 다에 대해 재조합 인간 에리쓰로포이에틴을 사용하는 경쟁 결합 방사선면역분석법이었다. 상기 분석법을 사용하여 검출가능한 EPO의 최소 농도는 5.5 mU/mL였다. 상기 회사에 의해 수행된 방해 연구는 중증의 용혈 (헤모글로빈이 dL 당 대략 4 g임)이 EPO-트랙 RIA를 방해하지 않음을 나타내었다. 결과를 mU/mL 혈장으로 나타내었다.
6.4.2. 결과
환자는 알레르기성 반응이 발생하지 않고, 모두 건강하고, 일반적으로 개선되었다. 열이 내리고, 맥박이 덜 빠르게 되고, 맥압이 증가하면서 혈압이 안정하게 유지되었는데, 이는 혈관확장의 지표이다 (표 2).
Figure 112008086410450-PCT00002
도 4에 나타낸 바와 같이, 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품은 총 헤모글로빈을 5일 동안 dL 당 대략 6.3±2.0의 전체 그룹에 대한 평균값에서 dL 당 대략 10.9±1.3 g으로 혁신적으로 개선하였으며 (p<0.001), 배가 시간은 대략 7일이었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 총 헤모글로빈의 증가는 망상적혈구가 대략 3.7±3.1％에서 대략 44.2±7.2％ (p<0.001)로 현저하게 증가하는 것과 관련되어 있었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품으로의 처리는 순환 EPO 수준을 현저하게 증가시켰다. 1일 후의 EPO 수준은 대략 1.6배 상승하고, 3일차에 대략 210 mU/mL의 최대 농도에 도달하였다. 5일차에, EPO의 수준은 여전히 기저보다 약간 높았다.
헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품으로 치료한 결과, 총 헤모글로빈이 정상 수치로 극적으로 회복되었다. 이러한 혈액 대용품은 EPO의 합성을 촉진하여, 망상적혈구가 대규모로 생성되었다.
상기는 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품이 RBC의 즉각적인 대용품을 제공할 뿐만 아니라, 또한 EPO의 합성을 자극하여 신규한 RBC의 생성을 촉진함을 나타낸다. 단, 이러한 자극은 5일 동안 기록되었다.
6.4.3. 결론
결론적으로, 생명 위협 빈혈을 앓는 인간에게 상당한 부피의 헤모글로빈-ATP-아데노신-글루타티온 계 혈액 대용품을 투여하는 것은 독성 또는 알레르기성 반응을 발생시키지 않으며, 일반 조건 및 자극된 환자의 적혈구생성 반응을 개선하였다.
6.5. 실시예 5 - 인간 별아교세포를 모델로서 사용한, 정상산소 및 저산소에서의 친-적혈구생성 인자인 HIF-1 알파 안정화 및 EPO의 생성에 대한 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품의 효과
6.5.1. 방법
헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품이 EPO 유전자의 유도인자로 공지되어 있는 HIF-1 알파의 안정화제로서 작용하는지 평가하기 위해, 본 발명자들은 EPO를 생성할 수 있는 인간 별아교세포에서의 이러한 혈액 대용품의 효과를 평가하였다.
특징적으로, EPO는 적혈구생성의 주요한 자극제이며, 태아의 간 및 성인의 신장에 의해 생성된다. 최근에는, 신규한 EPO 생성 부위로서 중추신경계가 발견되었다. 중추신경계에서, 별아교세포는 저산소증/허혈에 대한 반응에서 EPO의 주요 생성자이다 (문헌 [Siren AL, Knerlich F, Poser W, Gleiter CH, Bruck W, Ehrenreich H: Erythropoietin and erythropoietin receptor in human ischematic/hypoxic brain. Acta Neuropathol (Berl) 101 (3): 271-276, 2001; Sasaki R: Pleiotropic functions of erythropoietin. Int Med 42(2): 142-149, 2003] 참조).
별아교세포에서, HIF-1 알파는 EPO 발현을 조절한다. EPO는 저산소성/허혈성 스트레스로부터 뉴론을 보호하는 신경보호 역할을 하는 것으로 알려져 있다. EPO 유도 신경보호는 친-아폽토시스성 벨(Bel) 부류의 구성원인 배드(Bad)의 인산화를 기초로 한다. EPO 수용체는 뉴론에서 발현되기 때문에, 뉴론 EPO 수용체의 활성화에 의해 EPO는 뉴론에서 저산소증 유도 아폽토시스를 나타낼 수 있다 (문헌 [Variano M, Dello Russo C, Pozzoli G, Battagia A, Scambia G, Tringali G, Aloe-Spiriti MA, Preziosi P, Navarra P: Erythropoietin exerts anti-apoptotic effects on rat microglial cells in vitro. Eur J Neurosci 16(4): 684-692, 2002] 참조).
적혈구생성시 EPO의 주요 기능은 아폽토시스로부터 에리쓰로이드 전구체를 구조하는 것이기 때문에 (문헌 [Socolovsky et al. (1999) Cell 98(2): 181-91; Dolznig et al., (2002) Curr Biol 12(13): 1076-1085] 참조), 본 발명자들은 별아교세포 모델이 HIF-1 알파의 진로 및 EPO 합성에 대한 혈액 대용품의 효과를 연구하기에 가장 양호한 인간 세포계일 것으로 생각하였다.
정상산소
클로네틱스(Clonetics) (바이오-위타커(Bio-Wittaker), 어 캄브렉스 캄파니(A Cambrex Co; 미국 캘리포니아주 샌디에고))에서 제2 계대배양의 정상 인간 별아교세포의 최초 배양물을 입수하였다. 세포를, AGM 불릿키트(BulletKit) 배지 (클로네틱스)가 있는 75 ㎠ 조직 배양 플라스크 (코닝 글래스 웍스(Corning Glass Works; 미국 뉴욕주 코닝))에서 세포가 전면성장될 때 (대략 50,000 세포수/㎠)까지 5％ CO2의 다습한 분위기 및 37℃의 온도에서 배양하였다. 이어서, 별아교세포를 6개의 웰이 있는 세포 배양 플레이트 (코닝) 및 유리 커버슬립에서 2차 배양하였다. 트립신 시약 팩 (클로네틱스)을 사용하여 세포 계대배양을 수행하였다. 전달하는 동안, 별아교세포는 5분 미만 동안 트립신 처리되었다. 제4 내지 제6 세포 계대배양을 이용하여 모든 실험을 수행하였다. 별아교세포는 HIV, 간염, 미코플라즈마, 박테리아, 효모 및 진균에 대해 음성이고, GFAP에 대해 양성이고, CD68 및 CNPase에 대해 염색 음성임이 미리 시험되었다 (클로네틱스 인증 분석).
이어서, 전면성장 별아교세포를 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품이 dL 당 0.1, 1.0 및 1.75 g의 최종 농도로 함유된 배지와 함께 대략 18시간 동안 인큐베이션하였다. 양성 대조군 별아교세포는 비변형 헤모글로빈이 dL 당 0.1, 1.0 및 1.75 g의 최종 농도로 함유된 배지와 함께 인큐베이션하였다. 음성 대조군 별아교세포는 헤모글로빈 용액의 부재하에 (FBS로 대체됨) 배양하였다.
모든 실험은 정상산소 조건을 나타내는 공기 95％의 분위기에서 수행하였다. 처리 후, 세포를 여러 생화학적 및 분자생물학적 방법으로 평가하였다.
정상산소 조건에서의 HIF-1 알파 안정화 및 인간 EPO 유전자를 유도하는 그의 능력에 대한 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품의 영향은, 고처리량 트랜스에이엠 ELISA-기반 분석법 (액티브 모티프; 미국 캘리포니아주 칼스배드)을 사용하여 세포 핵 추출물에서 측정하였다. 상기 분석법에서, 96개의 웰이 있는 플레이트에 인간 EPO 유전자로부터의 저산소 반응성 요소 함유 올리고뉴클레오티드 (5'-TACGTGCT-3')를 고정화시켰다. 노니덴트(Nonident) P-40, 및 DTT 및 프로테아제 억제제 칵테일이 함유된 용해 완충제 (액티브 모티프)를 사용하여, 살아있는 별아교세포로부터 핵 추출물을 수득하였다. 핵 추출물을 HIF-1 알파에 대해 검출하였다. 핵 추출물에 존재하는 HIF-1 알파는 인간 EPO 유전자에 결합하여, 1차 항체에 접근할 수 있었다. 이어서, 1차 항체는 민감한 비색 판독치를 제공하는 2차 HRP-접합 항체에 의해 인식된다. 반응물을, 3550-UV 마이크로플레이트 판독기 (바이오래드)를 사용하여 450 nm에서 판독하였다. 결과를 핵 추출물 2.5 ㎍ 당 450 nm에서의 OD로 나타내었다. HIF-1 알파 활성화 및 EPO 유전자에의 결합에 대한 양성 대조군으로서, 제조자에 의해 제공되는 COS-7 핵 추출물을 사용하였다.
EPO 합성에 대한 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품의 영향은, 고특이적 퀀티킨 시험관내 진단학적 인간 에리쓰로포이에틴 ELISA (알앤드디 시스템즈 인크.; 미국 미네소타주 미네아폴리스)를 사용하여 세포 배양 상층액에서 측정하였다. 상기 분석법은 이중 항체 샌드위치 방법에 기초한 것이다. 인간 EPO에 대해 특이적인 모노클로날 항체로 미리 코팅된 마이크로플레이트 웰을 세포 배양 상층액 또는 인간 EPO 표준물과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션하고 세척한 후, 웰을 HRP와 접합된 항-EPO 폴리클로날 항체와 함께 인큐베이션하였다. 2차 인큐베이션하는 동안, 항체-효소 접합체는 고정화된 EPO에 결합되었다. 세척한 후, 색원체(chromogen)를 첨가하여, 청색의 복합체가 형성되었다. 발생된 색의 양은 샘플 또는 표준물 중 EPO의 양에 정비례하였다. 결과를 mU/mL로 나타내었다. 상기 분석법으로 검출가능한 최소 EPO 용량은 0.6 mU/mL 미만이었다.
저산소
다습한 변동성 호기성 워크스테이션에서 저산소 조건 (O2 1.5％, N2 93.5％ 및 CO2 5％)을 만들었다. 실험하기 전에, 배지를 1.5％의 산소 수준으로 밤새 미리 평형화시켰다.
상기와 같이 배양된 전면성장 별아교세포를 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품이 dL 당 0.1, 1.0 및 1.75 g의 최종 농도로 함유된, 미리 평형화된 배지의 존재하에 저산소 (O2 1.5％)에 대략 18시간 동안 노출시켰다. 양성 대조군 별아교세포는 비변형 헤모글로빈이 dL 당 0.1, 1.0 및 1.75 g의 최종 농도로 함유된, 미리 평형화된 배지와 함께 인큐베이션하였다. 음성 대조군 별아교세포는 헤모글로빈 용액의 부재하에 (FBS로 대체됨) 배양하였다.
모든 과정은 저산소 조건을 나타내는 O2 1.5％, N2 95.5％ 및 CO2 5％의 분위기에서 암조건에서 수행하였다. 노출 후, 세포를 하기에 대해 평가하였다.
1) 상기한 트랜스에이엠 ELISA 방법에 의해 수행되는, HIF-1 알파 안정화 및 인간 EPO 유전자를 유도하는 그의 능력에 대한 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품의 효과, 및
2) 상기한 퀀티킨 IVD 인간 EPO ELISA를 사용하여 측정되는 저산소에서의 EPO 합성에 대한 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품의 영향.
6.5.2. 결과
친-적혈구생성 인자인 HIF-1 알파 및 EPO에 대한 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품 및 비변형 헤모글로빈 용액의 효과를 하기 표 3 및 4, 및 도 6 및 7에 나타내었다.
표 3은 저산소 및 정상산소 조건 하에서의 HIF-1 알파 안정성 및 EPO 유전자에의 그의 결합에 대한 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품 및 비변형 헤모글로빈 용액의 효과를 나타내었다.
Figure 112008086410450-PCT00003
표 4는 저산소 및 정상산소 조건 하에서의 EPO 생성에 대한 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품 및 비변형 헤모글로빈 용액의 효과를 나타내었다.
Figure 112008086410450-PCT00004
6.5.3. 결론
본 연구는 저산소 및 정상산소 조건 하의 별아교세포의 핵 추출물에서 HIF-1 알파가 발견될 수 있음을 나타내었다. 게다가, 본 연구는 시험 헤모글로빈 용액이 HIF-1 알파 안정화, 핵 전위 및 EPO 유전자의 결합에 대한 효과가 저산소 및 정상산소 환경에서 상이함을 나타내었다.
도 6A 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 비변형 헤모글로빈 용액은, 특히 저산소에서, HIF-1 알파의 세포질 분해를 증가시키고, (보다 많은 투여량에서는) EPO 유전자에 대한 그의 결합 활성을 현저하게 감소시켰다. 비변형 헤모글로빈 용액은 정상산소 또는 저산소 조건 하에서 HIF-1 알파를 안정화시키지 않았다.
반면에, 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품은 두 산소 조건 모두에서 HIF-1 알파의 유도를 증가시켰다. 이러한 혈액 대용품은 투여량 의존 방식으로 HIF-1 알파를 안정화시키고, EPO 유전자에의 그의 결합을 증가시켰다. 이러한 혈액 대용품은 임의의 시험 농도에서 정상산소 및 저산소 하에서 HIF-1 알파를 안정화시킬 수 있었다. 제품은 dL 당 1.0 g 내지 1.75 g의 투여량에서 가장 효과적이었다. 이러한 전사 효과는 적혈구생성 반응의 촉진을 시사한다.
사실상, 도 6B 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 이러한 혈액 대용품은 정상산소 및 저산소 조건 하에서의 EPO의 생성을 효과적으로 증가시켰다. 적혈구생성 효과는 임의의 시험 농도에서 나타났다. 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품은 효과적인 친-적혈구생성 인자로서 작용하였다.
비변형 헤모글로빈은 EPO의 합성을 차단하여, 적혈구생성을 억제하였다. 이러한 효과는 보다 높은 헤모글로빈 농도에서 보다 효과적인 것으로 나타났다.
6.6. 실시예 6 - 인간 별아교세포를 모델로서 사용한, 정상산소 및 저산소에서의 항-적혈구생성 인자인 NF-카파 B, TNF-알파 및 TGF-베타 1, 및 아폽토시스에 대한 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품의 효과
6.6.1. 방법
인간 별아교세포는 항-적혈구생성제로서 작용하는 염증성 사이토킨, 예컨대 TNF, IL-1, IL-6, TGF-베타 1을 생성하는 것으로 공지되어 있기 때문에 (문헌 [Hellwing-Burgel et al. (1999) Am Soc Hematol 94: 1561-1567; Linch DC (1989) Schweiz Med Wochenschr 119(39): 1327-1328; Trey et al. (1995) Crit Rev Oncol Hematol 21: 1-8; Yuen et al. (2005) ASAIO J 51(3): 236-241] 참조), 본 발명자들은 혈액 대용품의 항-염증성 역가 및 HIF-1 알파 안정성 및 EPO 유도에 대한 그의 영향을 연구하기 위해 이러한 인간 세포 모델을 선택하였다 (문헌 [Van Wagoner et al. (1999) J Neurosci 19(13): 5236-5244; Oh et al. (1999) J Neurovirol 5(1): 82-94; Flanders et al. (1998) Prog Neurobiol 54(1): 71-85] 참조).
상기 배경기술 부분에 나타낸 바와 같이, 비변형 및 변형 헤모글로빈 용액은 강한 친-아폽토시스 효과를 갖는다 (문헌 [Meguro et al. (2001) J Neurochem 77(4): 1128-1135; Simoni et al. (2002) ASAIO J 48(2): 193; Goldman et al. (1998) Am J Physiol 275(3 Pt2): H 1046-53); D'Agnillo et al. (2001) Blood 98(12): 3315-3323; Mohara et al. (2005) ASAIO J 51(3): 288-295] 참조).
EPO의 주요 기능은 아폽토시스로부터 전-적혈구모세포를 보호하는 것이기 때문에 (문헌 [Socolovsky et al. (1999) Cell 98(2): 181-91; Dolzniget al. (2002) Curre Biol 12(13): 1076-1085] 참조), 수혈된 헤모글로빈이 골수세포 적혈구모세포와 직접 접촉함이 보고되어 (문헌 [Shum et al. (1996) Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol 24(6): 655-683] 참조), 본 발명자들은 혈액 대용품의 친-아폽토시스 및 항-적혈구생성 효과를 평가하는 것이 또한 중요한 것으로 생각하였다.
정상산소
실시예 5에 기재된 인간 별아교세포 모델을 사용하여, 본 실험을 수행하였다. 모든 실험은 정상산소 조건을 나타내는 공기 95％ 및 CO2 5％의 분위기에서 수행하였다. 요약하면, 전면성장 별아교세포는 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품이 dL 당 0.1, 1.0 및 1.75 g의 최종 농도로 함유된 배지에서 대략 18시간 동안 인큐베이션하였다. 양성 대조군 별아교세포는 비변형 헤모글로빈이 dL 당 0.1, 1.0 및 1.75 g의 최종 농도로 함유된 배지와 함께 인큐베이션하였다. 음성 대조군 별아교세포는 헤모글로빈 용액의 부재하에 (FBS로 대체됨) 배양하였다.
처리 후, 세포를 다양한 생화학적 및 분자생물학적 방법으로 평가하였다.
NF-카파 B의 핵 활성화 및 DNA 결합의 측정값은, 트랜스에이엠™ NF-카파 B p65 전사 인자 분석 키트 (액티브 모티프; 미국 캘리포니아주 칼스배드)를 사용하여 핵 세포 추출물에서 분석하였다. 상기 방법은, NF-카파 B 컨센서스 부위 함유 올리고뉴클레오티드 (5'-GGGACTTTCC-3')가 고정화된 96개의 웰이 있는 플레이트를 포함하는, NF-카파 B 활성화를 검출 및 정량하기 위한 최초의 ELISA-기반 방법이었다. 본 연구에서, 핵 추출물에 존재하는 p65 헤테로이량체인 NF-카파 B의 활성형을 상기 올리고뉴클레오티드와 함께 인큐베이션하였다. 제조자에 의해 제공되는 DTT 및 프로테아제 억제제 칵테일이 함유된 완전 용해 완충제를 사용하여, 살아있는 세포로부터 핵 추출물을 수득하였다. 완전 결합 완충제는 DTT 및 청어 정자 DNA를 함유하였다. 인큐베이션 후, 형성된 DNA-단백질 복합체는 1차 항체에 접근성이어서, p65 상의 에피토프가 인식되었다. DNA-단백질 복합체는 NF-카파 B가 활성화되고 DNA에 결합되어 있는 경우에만 1차 항체에 접근할 수 있었다. 이어서, 상기 반응물은 p65에 대한 2차 HRP-접합 항체를 사용하여 인식되고, 벤지딘 유도체 및 과산화수소를 사용하여 발색되었다. 반응물을, 바이오래드 모델 3550-UV인 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 판독하였다. 결과를 전세포 추출물 2.5 ㎍ 당 450 nm에서의 OD로 나타내었다. NF-카파 B 활성화 및 DNA 결합에 대한 양성 대조군으로서 제조자에 의해 제공되는 HeLa 전세포 추출물을 사용하였다.
항-적혈구생성 활성을 갖는 친-염증성 사이토킨 (TNF-알파 및 TGF-베타 1)의 생성의 측정값은 시판 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다.
TNF-알파는 TNF-알파 인간 EIA 키트 (케이만 케미칼; 미국 미시건주 앤아버)를 사용하여 분석하였다. 상기 분석은 인간 TNF-알파의 모노클로날 항체를 사용하는 이중 항체 '샌드위치' 기술을 기초로 하였다. 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅된 상기 항체를 웰에 도입된 임의의 인간 TNF-알파에 결합시켰다. 이어서, 웰에 인간 TNF-알파 분자의 에피토프에 선택적으로 결합하는 아세틸콜린에스테라제 (AchE):Fab의 접합체를 첨가하였다. '샌드위치'를 플레이트 상에 고정화시키고, 잉여량의 시약을 세척 제거하였다. 분석물의 농도를 엘맨(Ellman) 시약을 사용하여 AchE의 효소 활성을 측정함으로써 결정하고, 마이크로플레이트 판독기 (바이오래드 모델 3550-UV)를 사용하여 분광학적으로 측정하였다. 결과를 mL 당 pg으로 나타내었다.
TGF-베타 1은 세포 배양 상층액, 혈청 및 혈장 중 활성화된 인간 TGF-베타 1의 농도를 결정하기 위한 인간 TGF-베타 1 퀀티킨 면역분석법 (알앤드디 시스템)을 사용하여 측정하였다. 상기 연구에서, 세포 배양 상층액 중 잠재적 TGF-베타 1을 산 활성화 및 중화에 의해 면역반응성 형태로 전환시켰다. 이어서, TGF-베타 1를 TGF-베타 가용성 수용체가 고정화된 마이크로플레이트를 사용하여 분석하였다. 인큐베이션하고 세척한 후, 2차 항체-효소 시약을 첨가하여, 기질과 함께 최초 단계에서 결합된 TGF-베타 1의 양에 비례하게 발색시켰다. TGF-베타 1의 농도를 mL 당 pg으로 나타내었다.
아폽토시스. 상기 연구에서, 커버슬립 상에서 성장시키고 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품에 노출시킨 별아교세포를, 각각 아넥신 V-FITC 및 요오드화프로피듐 형광 프로브 (시그마 케미칼)를 사용하여 초기 및 후기 아폽토시스 현상에 대해 평가하였다. 아넥신 V-FITC는 포스파티딜세린에 결합하여 녹색 형광으로서 검출하는 프로브였다. 요오드화프로피듐은 세포 DNA에 결합하여 적색 형광을 생성하였다. 아폽토시스의 초기 단계에서, 인지질의 비대칭 손실은 일반적으로 막의 내부에서 발견되는 포스파티딜세린을 막의 외부로 전위시킨다. 이에 따라, 포스파티딜세린이 막의 외부에 있을 수 있어, 아넥신이 이에 결합하여, 아폽토시스 과정의 시작이 식별된다. 반면에, 세포 DNA가 단편화되는 아폽토시스의 진행은 요오드화프로피듐을 사용하여 검출하였다. 결과를 형광 현미경을 사용하여 평가하였다.
저산소
실시예 6에서도, 다습한 변동성 호기성 워크스테이션에서 저산소 조건 (O2 1.5％, N2 93.5％ 및 CO2 5％)을 만들었다.
상기와 같이 배양된 전면성장 별아교세포를 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품이 dL 당 0.1, 1.0, 및 1.75 g의 최종 농도로 포함된, 미리 평형화된 배지의 존재하에 저산소 (O2 1.5％)에 대략 18시간 동안 노출시켰다. 양성 대조군 별아교세포는 비변형 헤모글로빈이 dL 당 0.1, 1.0 및 1.75 g의 최종 농도로 포함된, 미리 평형화된 배지와 함께 인큐베이션하였다. 음성 대조군 별아교세포는 헤모글로빈 용액의 부재하에 (FBS로 대체됨) 배양하였다.
상기한 바와 같이, 모든 과정은 저산소 조건을 나타내는 O2 1.5％, N2 95.5％ 및 CO2 5％의 분위기에서 암조건에서 수행하였다. 노출 후, 세포를 하기에 대해 평가하였다.
1) 상기한 트랜스에이엠™ NF-카파 B p65 전사 인자 분석 키트 (액티브 모티프)를 사용하여 핵 세포 추출물에서 분석되는 NF-카파 B의 핵 활성화 및 DNA 결합,
2) 상기한 시판 ELISA 키트를 사용하여 측정되는 항-적혈구생성 활성을 갖는 친-염증성 사이토킨 (TNF-알파 및 TGF-베타 1)의 생성, 및
3) 상기한 초기 및 후기 아폽토시스.
6.6.2. 항-염증성 효과 - 결과/결론
Figure 112008086410450-PCT00005
Figure 112008086410450-PCT00006
도 7에 나타낸 바와 같이, 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품은 모든 시험 농도 및 산소 수준에서 NF-카파 B 활성화를 억제하였다. 반면에, 비변형 헤모글로빈은 투여량 의존 방식으로 NF-카파 B 유도를 활성화하였다. 상기 효과는 정상산소 조건에서 더욱 발휘되기 쉬웠다.
표 5 및 6에 나타낸 바와 같이, 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품은 두 시험 산소 조건에서 모두 투여량 의존 방식으로 TGF-베타 1의 형성을 억제하고 TNF-알파의 생성을 증가시키지 않아, 가장 강력한 항-적혈구생성제였다. 상기 효과는 상기 혈액 대용품이 NF-카파 B를 유도할 수 없음과 관련될 수 있다.
그러나, 비변형 헤모글로빈 용액은, 특히 보다 높은 농도 (dL 당 1 및 1.75 g)로 제공되는 경우, TGF-베타 1 및 TNF-알파인 두 항-적혈구생성제 모두의 생성을 증가시켰다.
실시예 6에 기재된 실험은 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품이 항-염증성 포텐셜을 갖는 반면 비변형 헤모글로빈이 친-염증성 특성을 가짐을 나타내었다.
NF-카파 B 경로의 높은 활성은 에리쓰로이드 특이적 유전자의 억제와 관련되어 있는 반면, TGF-베타 1은 에리쓰로이드 전구체의 분화를 차단하고, TNF-알파는 EPO 유전자에의 HIF-1 알파의 결합을 억제하기 때문에, 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품의 항-염증성 특성이 적혈구생성 인자로서 작용할 수 있음이 타당하다.
6.6.3. 항-아폽토시스 효과 - 결과/결론
정상산소 조건 하의 대조군 별아교세포는 어떠한 친-아폽토시스 반응도 나타내지 않았다. 형광 분석 결과, 아넥신의 표면 결합 및 요오드화프로피듐의 핵 축적이 부족하며, 이는 초기 및 후기 아폽토시스 현상의 부재로서 해석될 수 있었다. 저산소는 별아교세포의 표면 상에 아넥신 V-FITC을 축적시켰다. 상기 효과는 초기 아폽토시스에서 발생되는 포스파티딜세린의 막의 외부로의 전위를 나타낸다.
비변형 헤모글로빈으로의 별아교세포의 처리에 의해 정상산소 조건에서 초기 아폽토시스가 발생하고, 저산소 조건에서 아폽토시스가 진행하였다. 비변형 헤모글로빈 용액에 노출시킨 저산소 별아교세포에서의 요오드화프로피듐의 축적은 손상된 원형질막 및 DNA의 단편화의 결과였다. 보다 높은 농도의 비변형 헤모글로빈은 보다 많은 파괴 효과를 제공하였다.
헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품은 어떠한 시험 농도 또는 산소 함량에서도 아폽토시스 반응을 유도하지 않았다.
친-적혈구생성제로서의 EPO의 주요 기능은 아폽토시스로부터 전-적혈구모세포를 보호하는 것이기 때문에, EPO의 HIF-1 알파 매개 생성을 촉진하는 헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품은 EPO 기능을 방해하지 않을 것이다. 반면에, 친-아폽토시스 포텐셜이 높은 비변형 헤모글로빈 용액은, 특히 보다 높은 농도에서, 항-적혈구생성제로서 작용할 수 있다.
6.6.4. 일반 결론
미국 특허 제5,439,882호에 기재되어 있는 ATP, 아데노신 및 GSH를 사용한 헤모글로빈의 화학적/약리학적 변형은, 혈관확장 활성 및 양호한 조직 산소화 능력, 및 HIF-1 알파 안정화 및 차후의 EPO 유도를 통한 적혈구생성 활성을 갖는 개선된 혈액 대용 제품을 제공하였다. 상기 혈액 대용품 생성물의 항-염증성 및 항-아폽토시스 포텐셜은 적혈구생성 반응을 촉진한다.
상기 혈액 대용품 생성물은 높은 농도 (g/kg 체중)에서 친-적혈구생성 포텐셜이 발현되어, 조직 산소화도를 유지하기 위한 1차적 요법, 및 환자의 적혈구생성 반응을 자극하여 적혈구용적률을 정상화시키기 위한 2차적 요법으로서 작용할 수 있다.
헤모글로빈-ATP-아데노신-GSH 계 혈액 대용품 요법에서는 고가의 재조합 EPO 지지체가 필요 없다.
6.7. (예상) 실시예 7 - 대상체에서의 급성 혈액 손실의 치료
6.7.1. 실험 고안 1
급성 혈액 손실 빈혈로 진단된 인간 대상체를 동일한 인원의 남성과 여성, 성인과 아동을 포함하는 A 및 B 그룹으로 나눈다.
A 그룹의 대상체는 일정 기간 동안 본 발명의 혈액 대용품으로 처리하고, B 그룹의 대상체는 동일한 기간 동안 플라시보 혈액 대용품으로 처리한다.
처리 기간 동안 그리고 처리 후, 대상체의 적혈구용적률 수준, 헤모글로빈 수준, 순환 에리쓰로포이에틴 수준 및 혈류역학 파라미터를 측정 및 비교한다.
6.7.2. 실험 고안 2
수술 동안 혈액 부피의 33％를 초과하는 혈액의 손실을 겪는 인간 대상체의 제1 그룹에게 본 발명의 혈액 대용품을 제공한다. 수술 동안 혈액 부피의 33％를 초과하는 혈액의 손실을 겪는 인간 대상체의 제2 그룹에게 통상의 혈액 수혈을 제공한다. 두 그룹의 남성과 여성, 성인과 아동의 인원은 동일하다.
수술 동안 그리고 수술 후, 대상체의 적혈구용적률 수준, 헤모글로빈 수준, 순환 에리쓰로포이에틴 수준 및 혈류역학 파라미터를 측정 및 비교한다.
6.7.3. 실험 고안 3
외상 (예를 들면, 총상, 교통 사고)으로 인해 혈액 부피의 33％를 초과하는 혈액의 손실을 겪는 인간 대상체의 제1 그룹에게 본 발명의 혈액 대용품을 제공한다. 동일한 유형의 외상으로 인해 혈액 부피의 33％를 초과하는 혈액의 손실을 겪는 인간 대상체의 제2 그룹에게 통상의 혈액 수혈을 제공한다. 두 그룹의 남성과 여성, 성인과 아동의 인원은 동일하다.
그 후, 대상체의 적혈구용적률 수준, 헤모글로빈 수준, 순환 에리쓰로포이에틴 수준 및 혈류역학 파라미터를 측정 및 비교한다.
본 발명의 범위는 본원에 기재된 특정 실시양태에 의해 한정되지 않는다. 또한, 당업자는 상기 상세한 설명 및 첨부 도면으로부터 본 발명이 기재된 것 이외로 다양하게 변형될 수 있음을 알 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 포함된다.
본원에는 여러 문헌이 인용되어 있으며, 이들은 전문이 본원에 참고로 포함된다.

Claims (121)

  1. 대상체에서 혈액 부피를 증가시키고 급성 혈액 손실 빈혈과 연관된 저산소증을 완화하기에 유효한 양의 혈액 대용품을 급성 혈액 손실 빈혈의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 정상산소 조건 하에 세포 배양물에서 시험시 상기 혈액 대용품은 에리쓰로포이에틴(erythropoietin)의 발현을 유도하는 것인, 상기 대상체에서 급성 혈액 손실 빈혈의 치료 방법.
  2. 대상체에서 혈액 부피를 증가시키고 급성 혈액 손실 빈혈과 연관된 저산소증을 완화하기에 유효한 양의 혈액 대용품을 급성 혈액 손실 빈혈의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 대상체의 적혈구용적률 또는 헤모글로빈의 배가 시간의 감소에 의해 측정시 상기 혈액 대용품은 정상산소 조건 하에 적혈구생성(erythropoiesis)을 유도하는 것인, 상기 대상체에서 급성 혈액 손실 빈혈의 치료 방법.
  3. 대상체에서 혈액 부피를 증가시키고 급성 혈액 손실 빈혈과 연관된 저산소증을 완화하기에 유효한 양의 혈액 대용품을 급성 혈액 손실 빈혈의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 대상체의 순환 에리쓰로포이에틴 수준의 증가에 의해 측정시 상기 혈액 대용품은 정상산소 조건 하에 적혈구생성을 유도하는 것인, 상기 대상체에서 급성 혈액 손실 빈혈의 치료 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 혈액 손실이 중증(severe)인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 33％ 초과인 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 혈액 손실이 중등도(moderate)인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 20％ 내지 33％인 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 혈액 손실이 경증(mild)인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 20％ 미만인 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 대상체가 7 g/dL 미만의 헤모글로빈을 갖는 것인 방법.
  12. 대상체에서 혈액 부피를 증가시키고 급성 혈액 손실 빈혈과 연관된 저산소증을 완화하기에 유효한 양의 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품을 급성 혈액 손실 빈혈의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 정상산소 조건 하에 세포 배양물에서 시험시 상기 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품은 에리쓰로포이에틴의 발현을 유도하는 것인, 상기 대상체에서 급성 혈액 손실 빈혈의 치료 방법.
  13. 대상체에서 혈액 부피를 증가시키고 급성 혈액 손실 빈혈과 연관된 저산소증을 완화하기에 유효한 양의 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품을 급성 혈액 손실 빈혈의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 대상체의 적혈구용적률 또는 헤모글로빈의 배가 시간의 감소에 의해 측정시 상기 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품은 정상산소 조건 하에 적혈구생성을 유도하는 것인, 상기 대상체에서 급성 혈액 손실 빈혈의 치료 방법.
  14. 대상체에서 혈액 부피를 증가시키고 급성 혈액 손실 빈혈과 연관된 저산소증을 완화하기에 유효한 양의 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품을 급성 혈액 손실 빈혈의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 대상체의 순환 에리쓰로포이에틴 수준의 증가에 의해 측정시 상기 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품은 정상산소 조건 하에 적혈구생성을 유도하는 것인, 상기 대상체에서 급성 혈액 손실 빈혈의 치료 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 혈액 손실이 중증인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 33％ 초과인 방법.
  17. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 혈액 손실이 중등도인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 20％ 내지 33％인 방법.
  19. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 혈액 손실이 경증인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 20％ 미만인 방법.
  21. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 대상체가 7 g/dL 미만의 헤모글로빈을 갖는 것인 방법.
  23. (a) 퍼요오데이트-산화된 ATP와 분자내 가교되고;
    (b) 퍼요오데이트-산화된 아데노신과 분자간 가교되고;
    (c) 환원된 글루타티온과 접합된
    헤모글로빈을 포함하는 가교된 헤모글로빈의 치료 유효량을 급성 혈액 손실 빈혈의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 급성 혈액 손실 빈혈의 치료 방법.
  24. 제23항에 있어서, 급성 혈액 손실이 중증인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 33％ 초과인 방법.
  26. 제23항 있어서, 급성 혈액 손실이 중등도인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 20％ 내지 33％인 방법.
  28. 제23항에 있어서, 급성 혈액 손실이 경증인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 20％ 미만인 방법.
  30. 제23항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 대상체가 7 g/dL 미만의 헤모글로빈을 갖는 것인 방법.
  32. 제23항에 있어서, 가교된 헤모글로빈 중 헤모글로빈 및 퍼요오데이트-산화된 ATP가 1:1 내지 1:3의 몰비로 존재하는 것인 방법.
  33. 제23항에 있어서, 가교된 헤모글로빈 중 헤모글로빈 및 퍼요오데이트-산화된 아데노신이 1:1 내지 1:10의 몰비로 존재하는 것인 방법.
  34. 제23항에 있어서, 가교된 헤모글로빈 중 헤모글로빈 및 환원된 글루타티온이 1:1 내지 1:20의 몰비로 존재하는 것인 방법.
  35. 대상체에서 혈액 부피를 증가시키고 혈액 손실과 연관된 저산소증을 완화하기에 유효한 양의 혈액 대용품을 수술 중 발생하는 혈액 손실의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 정상산소 조건 하에 세포 배양물에서 시험시 상기 혈액 대용품은 에리쓰로포이에틴의 발현을 유도하는 것인, 상기 대상체에서 수술 중 발생하는 혈액 손실의 치료 방법.
  36. 대상체에서 혈액 부피를 증가시키고 혈액 손실과 연관된 저산소증을 완화하기에 유효한 양의 혈액 대용품을 수술 중 발생하는 혈액 손실의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 대상체의 적혈구용적률 또는 헤모글로빈의 배가 시간의 감소에 의해 측정시 상기 혈액 대용품은 정상산소 조건 하에 적혈구생성을 유도하는 것인, 상기 대상체에서 수술 중 발생하는 혈액 손실의 치료 방법.
  37. 대상체에서 혈액 부피를 증가시키고 혈액 손실과 연관된 저산소증을 완화하기에 유효한 양의 혈액 대용품을 수술 중 발생하는 혈액 손실의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 대상체의 순환 에리쓰로포이에틴 수준의 증가에 의해 측정시 상기 혈액 대용품은 정상산소 조건 하에 적혈구생성을 유도하는 것인, 상기 대상체에서 수술 중 발생하는 혈액 손실의 치료 방법.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 혈액 손실이 중증인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 33％ 초과인 방법.
  40. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 혈액 손실이 중등도인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 20％ 내지 33％인 방법.
  42. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 혈액 손실이 경증인 방 법.
  43. 제42항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 20％ 미만인 방법.
  44. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 대상체가 7 g/dL 미만의 헤모글로빈을 갖는 것인 방법.
  46. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수술이 선택(elective) 수술인 방법.
  47. 대상체에서 혈액 부피를 증가시키고 혈액 손실과 연관된 저산소증을 완화하기에 유효한 양의 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품을 수술 중 발생하는 혈액 손실의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 정상산소 조건 하에 세포 배양물에서 시험시 상기 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품은 에리쓰로포이에틴의 발현을 유도하는 것인, 상기 대상체에서 수술 중 발생하는 혈액 손실의 치료 방법.
  48. 대상체에서 혈액 부피를 증가시키고 혈액 손실과 연관된 저산소증을 완화하기에 유효한 양의 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품을 수술 중 발생하는 혈액 손실의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 대상체의 적혈구용적률 또는 헤모글로빈의 배가 시간의 감소에 의해 측정시 상기 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품은 정상산소 조건 하에 적혈구생성을 유도하는 것인, 상기 대상체에서 수술 중 발생하는 혈액 손실의 치료 방법.
  49. 대상체에서 혈액 부피를 증가시키고 혈액 손실과 연관된 저산소증을 완화하기에 유효한 양의 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품을 수술 중 발생하는 혈액 손실의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 대상체의 순환 에리쓰로포이에틴 수준의 증가에 의해 측정시 상기 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품은 정상산소 조건 하에 적혈구생성을 유도하는 것인, 상기 대상체에서 수술 중 발생하는 혈액 손실의 치료 방법.
  50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 혈액 손실이 중증인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 33％ 초과인 방법.
  52. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 혈액 손실이 중등도인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 20％ 내지 33％인 방법.
  54. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 혈액 손실이 경증인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 20％ 미만인 방법.
  56. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 대상체가 7 g/dL 미만의 헤모글로빈을 갖는 것인 방법.
  58. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수술이 선택 수술인 방법.
  59. (a) 퍼요오데이트-산화된 ATP와 분자내 가교되고;
    (b) 퍼요오데이트-산화된 아데노신과 분자간 가교되고;
    (c) 환원된 글루타티온과 접합된
    헤모글로빈을 포함하는 가교된 헤모글로빈의 치료 유효량을 수술 중 발생하는 혈액 손실의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 수술 중 발생하는 혈액 손실의 치료 방법.
  60. 제59항에 있어서, 급성 혈액 손실이 중증인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 33％ 초과인 방법.
  62. 제59항에 있어서, 급성 혈액 손실이 중등도인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 20％ 내지 33％인 방법.
  64. 제59항에 있어서, 급성 혈액 손실이 경증인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 20％ 미만인 방법.
  66. 제59항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 대상체가 7 g/dL 미만의 헤모글로빈을 갖는 것인 방법.
  68. 제59항에 있어서, 가교된 헤모글로빈 중 헤모글로빈 및 퍼요오데이트-산화된 ATP가 1:1 내지 1:3의 몰비로 존재하는 것인 방법.
  69. 제59항에 있어서, 가교된 헤모글로빈 중 헤모글로빈 및 퍼요오데이트-산화된 아데노신이 1:1 내지 1:10의 몰비로 존재하는 것인 방법.
  70. 제59항에 있어서, 가교된 헤모글로빈 중 헤모글로빈 및 환원된 글루타티온이 1:1 내지 1:20의 몰비로 존재하는 것인 방법.
  71. 제59항에 있어서, 상기 수술이 선택 수술인 방법.
  72. 대상체에서 혈액 부피를 증가시키고 혈액 손실과 연관된 저산소증을 완화하기에 유효한 양의 혈액 대용품을 외상에 의한 혈액 손실의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 정상산소 조건 하에 세포 배양물에서 시험시 상기 혈액 대용품은 에리쓰로포이에틴의 발현을 유도하는 것인, 상기 대상체에서 외상에 의한 혈액 손실의 치료 방법.
  73. 대상체에서 혈액 부피를 증가시키고 혈액 손실과 연관된 저산소증을 완화하기에 유효한 양의 혈액 대용품을 외상에 의한 혈액 손실의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 대상체의 적혈구용적률 또는 헤모글로빈의 배가 시간의 감소에 의해 측정시 상기 혈액 대용품은 정상산소 조건 하에 적혈구생성을 유도하는 것인, 상기 대상체에서 외상에 의한 혈액 손실의 치료 방법.
  74. 대상체에서 혈액 부피를 증가시키고 혈액 손실과 연관된 저산소증을 완화하 기에 유효한 양의 혈액 대용품을 외상에 의한 혈액 손실의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 대상체의 순환 에리쓰로포이에틴 수준의 증가에 의해 측정시 상기 혈액 대용품은 정상산소 조건 하에 적혈구생성을 유도하는 것인, 상기 대상체에서 외상에 의한 혈액 손실의 치료 방법.
  75. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 혈액 손실이 중증인 방법.
  76. 제75항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 33％ 초과인 방법.
  77. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 혈액 손실이 중등도인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 20％ 내지 33％인 방법.
  79. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 혈액 손실이 경증인 방법.
  80. 제79항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 20％ 미만인 방법.
  81. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  82. 제81항에 있어서, 대상체가 7 g/dL 미만의 헤모글로빈을 갖는 것인 방법.
  83. 대상체에서 혈액 부피를 증가시키고 혈액 손실과 연관된 저산소증을 완화하기에 유효한 양의 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품을 외상에 의한 혈액 손실의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 정상산소 조건 하에 세포 배양물에서 시험시 상기 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품은 에리쓰로포이에틴의 발현을 유도하는 것인, 상기 대상체에서 외상에 의한 혈액 손실의 치료 방법.
  84. 대상체에서 혈액 부피를 증가시키고 혈액 손실과 연관된 저산소증을 완화하기에 유효한 양의 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품을 외상에 의한 혈액 손실의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 대상체의 적혈구용적률 또는 헤모글로빈의 배가 시간의 감소에 의해 측정시 상기 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품은 정상산소 조건 하에 적혈구생성을 유도하는 것인, 상기 대상체에서 외상에 의한 혈액 손실의 치료 방법.
  85. 대상체에서 혈액 부피를 증가시키고 혈액 손실과 연관된 저산소증을 완화하기에 유효한 양의 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품을 외상에 의한 혈액 손실의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 대상체의 순환 에리쓰로포이에틴 수준의 증가에 의해 측정시 상기 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품은 정상산소 조건 하에 적혈구생성을 유도하는 것인, 상기 대상체에서 외상에 의한 혈액 손실의 치료 방법.
  86. 제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 혈액 손실이 중증인 방법.
  87. 제86항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 33％ 초과인 방법.
  88. 제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 혈액 손실이 중등도인 방법.
  89. 제88항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 20％ 내지 33％인 방법.
  90. 제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 혈액 손실이 경증인 방법.
  91. 제90항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 20％ 미만인 방법.
  92. 제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  93. 제92항에 있어서, 대상체가 7 g/dL 미만의 헤모글로빈을 갖는 것인 방법.
  94. (a) 퍼요오데이트-산화된 ATP와 분자내 가교되고;
    (b) 퍼요오데이트-산화된 아데노신과 분자간 가교되고;
    (c) 환원된 글루타티온과 접합된
    헤모글로빈을 포함하는 가교된 헤모글로빈의 치료 유효량을 외상에 의한 혈액 손실의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 외상에 의한 혈액 손실의 치료 방법.
  95. 제94항에 있어서, 급성 혈액 손실이 중증인 방법.
  96. 제95항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 33％ 초과인 방법.
  97. 제94항 있어서, 급성 혈액 손실이 중등도인 방법.
  98. 제97항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 20％ 내지 33％인 방법.
  99. 제94항에 있어서, 급성 혈액 손실이 경증인 방법.
  100. 제99항에 있어서, 대상체의 혈액 손실이 20％ 미만인 방법.
  101. 제94항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  102. 제101항에 있어서, 대상체가 7 g/dL 미만의 헤모글로빈을 갖는 것인 방법.
  103. 제94항에 있어서, 가교된 헤모글로빈 중 헤모글로빈 및 퍼요오데이트-산화된 ATP가 1:1 내지 1:3의 몰비로 존재하는 것인 방법.
  104. 제94항에 있어서, 가교된 헤모글로빈 중 헤모글로빈 및 퍼요오데이트-산화된 아데노신이 1:1 내지 1:10의 몰비로 존재하는 것인 방법.
  105. 제94항에 있어서, 가교된 헤모글로빈 중 헤모글로빈 및 환원된 글루타티온이 1:1 내지 1:20의 몰비로 존재하는 것인 방법.
  106. 제약상 허용되는 담체 내에 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품의 치료 유효량을 포함하며, 상기 치료 유효량이 7 g 내지 122.5 g 미만이고, 정상산소 조건 하에 세포 배양물에서 시험시 상기 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품이 에리쓰로포이에틴의 발현을 유도하는 것인 제약 조성물.
  107. 제약상 허용되는 담체 내에 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품의 치료 유효량을 포함하며, 상기 치료 유효량이 122.5 g 초과 내지 700 g이고, 정상산소 조건 하에 세포 배양물에서 시험시 상기 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품이 에리쓰로포이에틴의 발현을 유도하는 것인 제약 조성물.
  108. 제약상 허용되는 담체 내에 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품의 치료 유효 부피를 포함하며, 상기 치료 유효 부피가 0.6 리터 미만이고, 정상산소 조건 하에 세포 배양물에서 시험시 상기 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품이 에리쓰로포이에틴의 발현을 유도하는 것인 제약 조성물.
  109. 제106항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양물에서 시험시 상기 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품이 HIF-1 알파 발현을 안정화시키는 것인 제약 조성물.
  110. 제106항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양물에서 시험시 상기 가교된 헤모글로빈 혈액 대용품이 NF-카파 B를 하향조절하는 것인 제약 조성물.
  111. 제약상 허용되는 담체 내에 가교된 헤모글로빈의 치료 유효량을 포함하며, 상기 치료 유효량은 7 g 내지 122.5 g 미만이고, 상기 가교된 헤모글로빈은
    (a) 퍼요오데이트-산화된 ATP와 분자내 가교되고;
    (b) 퍼요오데이트-산화된 아데노신과 분자간 가교되고;
    (c) 환원된 글루타티온과 접합된
    헤모글로빈을 포함하는 것인 제약 조성물.
  112. 제약상 허용되는 담체 내에 가교된 헤모글로빈의 치료 유효량을 포함하며, 상기 치료 유효량은 122.5 g 초과 내지 700 g이고, 상기 가교된 헤모글로빈은
    (a) 퍼요오데이트-산화된 ATP와 분자내 가교되고;
    (b) 퍼요오데이트-산화된 아데노신과 분자간 가교되고;
    (c) 환원된 글루타티온과 접합된
    헤모글로빈을 포함하는 것인 제약 조성물.
  113. 제약상 허용되는 담체 내에 가교된 헤모글로빈의 치료 유효 부피를 포함하며, 상기 치료 유효 부피는 0.6 리터 미만이고, 상기 가교된 헤모글로빈은
    (a) 퍼요오데이트-산화된 ATP와 분자내 가교되고;
    (b) 퍼요오데이트-산화된 아데노신과 분자간 가교되고;
    (c) 환원된 글루타티온과 접합된
    헤모글로빈을 포함하는 것인 제약 조성물.
  114. 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양물에서 시험시 상기 가교된 헤모글로빈이 HIF-1 알파 발현을 안정화시키는 것인 제약 조성물.
  115. 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양물에서 시험시 상기 가교된 헤모글로빈이 NF-카파 B를 하향조절하는 것인 제약 조성물.
  116. 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 가교된 헤모글로빈 중 헤모글로빈 및 퍼요오데이트-산화된 ATP가 1:1 내지 1:3의 몰비로 존재하는 것인 제약 조성물.
  117. 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 가교된 헤모글로빈 중 헤모글로빈 및 퍼요오데이트-산화된 아데노신이 1:1 내지 1:10의 몰비로 존재하는 것인 제약 조성물.
  118. 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 가교된 헤모글로빈 중 헤모글로빈 및 환원된 글루타티온이 1:1 내지 1:20의 몰비로 존재하는 것인 제약 조성물.
  119. 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 가교된 헤모글로빈이 비전해질 수용액에 용해된 것인 제약 조성물.
  120. 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 만니톨을 더 포함하는 제약 조성물.
  121. 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 전해질을 더 포함하는 제약 조성물.
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WO (1) WO2007136641A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190039156A (ko) * 2016-07-26 2019-04-10 라라 올러 두케 등장성 결정질 수용액

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10172949B2 (en) 2009-06-09 2019-01-08 Prolong Pharmaceuticals, LLC Hemoglobin compositions
AU2010258752B2 (en) * 2009-06-09 2015-07-09 Prolong Pharmaceuticals, LLC Hemoglobin compositions
US10172950B2 (en) 2009-06-09 2019-01-08 Prolong Pharmaceuticals, LLC Hemoglobin compositions
US7989593B1 (en) 2010-05-27 2011-08-02 Bing Lou Wong Method for the preparation of a high-temperature stable oxygen-carrier-containing pharmaceutical composition and the use thereof
US7932356B1 (en) 2010-06-23 2011-04-26 Bing Lou Wong Method for the preparation of a heat stable oxygen carrier-containing pharmaceutical composition
US8048856B1 (en) 2010-06-23 2011-11-01 Billion King, Ltd. Treatment methods using a heat stable oxygen carrier-containing pharmaceutical composition
US8084581B1 (en) 2011-04-29 2011-12-27 Bing Lou Wong Method for removing unmodified hemoglobin from cross-linked hemoglobin solutions including polymeric hemoglobin with a high temperature short time heat treatment apparatus
US20130052232A1 (en) 2011-08-31 2013-02-28 Bing Lou Wong Method for the preparation of a heat stable oxygen carrier-containing composition facilating beta-beta cross-linking
CN106620663B (zh) * 2017-02-05 2020-05-19 中国医学科学院生物医学工程研究所 糖-血红蛋白纳米粒子的制备方法及用途
US11504417B2 (en) 2017-07-18 2022-11-22 VirTech Bio, Inc. Blood substitutes comprising hemoglobin and methods of making

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5281579A (en) 1984-03-23 1994-01-25 Baxter International Inc. Purified virus-free hemoglobin solutions and method for making same
US4831012A (en) 1984-03-23 1989-05-16 Baxter International Inc. Purified hemoglobin solutions and method for making same
US4598064A (en) 1984-06-27 1986-07-01 University Of Iowa Research Foundation Alpha-alpha cross-linked hemoglobins
US4600531A (en) 1984-06-27 1986-07-15 University Of Iowa Research Foundation Production of alpha-alpha cross-linked hemoglobins in high yield
US5464814A (en) 1986-06-20 1995-11-07 Northfield Laboratories, Inc. Acellular red blood cell substitute
US4826811A (en) 1986-06-20 1989-05-02 Northfield Laboratories, Inc. Acellular red blood cell substitute
US5194590A (en) 1986-06-20 1993-03-16 Northfield Laboratories, Inc. Acellular red blood cell substitute
US5084558A (en) 1987-10-13 1992-01-28 Biopure Corporation Extra pure semi-synthetic blood substitute
US5753616A (en) 1986-11-10 1998-05-19 Biopure Corporation Method for producing a stable polymerized hemoglobin blood-substitute
CA1312009C (en) 1986-11-10 1992-12-29 Carl W. Rausch Extra pure semi-synthetic blood substitute
GB8710598D0 (en) 1987-05-05 1987-06-10 Star Medical Diagnostics Ltd Hemoglobin based blood substitute
US5449759A (en) 1987-05-16 1995-09-12 Somatogen, Inc. Hemoglobins with intersubunit desulfide bonds
GB8711614D0 (en) 1987-05-16 1987-06-24 Medical Res Council Proteins
US6022849A (en) 1987-05-16 2000-02-08 Baxter Biotech Technology Saarl Mutant recombinant hemoglobins containing heme pocket mutations
US5439882A (en) 1989-12-29 1995-08-08 Texas Tech University Health Sciences Center Blood substitute
US5631219A (en) 1994-03-08 1997-05-20 Somatogen, Inc. Method of stimulating hematopoiesis with hemoglobin
US5895810A (en) 1995-03-23 1999-04-20 Biopure Corporation Stable polymerized hemoglobin and use thereof
DE69727241D1 (de) 1996-08-27 2004-02-19 Hemosol Inc Gesteigerte stimulation der erythropoesis
EP1034267A1 (en) 1997-12-04 2000-09-13 Genzyme Corporation Compositions and methods for inducing gene expression
US6124131A (en) 1998-08-25 2000-09-26 The Johns Hopkins University School Of Medicine Mutant hypoxia inducible factor-1 HIF-1
US6894150B1 (en) 1999-10-01 2005-05-17 Ross Walden Tye Non-pyrogenic, endotoxin-free, stroma-free tetrameric hemoglobin
US6849718B2 (en) 2001-03-20 2005-02-01 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Muteins of hypoxia inducible factor alpha and methods of use thereof
US6838430B2 (en) 2001-09-28 2005-01-04 The Regents Of The University Of California Use of HIF-1a variants to accelerate wound healing

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190039156A (ko) * 2016-07-26 2019-04-10 라라 올러 두케 등장성 결정질 수용액

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