CN101489581A - 用交联血红蛋白血液代用品治疗急性失血性贫血的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用血液代用品治疗急性失血的新方法和包含血液代用品的新的药物组合物。本发明的方法所用的血液代用品可以(1)如在常氧条件下的细胞培养中试验所示，所述血液代用品能够诱导促红细胞生成素的表达，和/或(2)在常氧条件下，如通过(a)个体红细胞压积或血红蛋白的倍增时间减少来检测，和/或通过(b)个体促红细胞生成素循环水平增加来检测所示，所述血液代用品能够诱导红细胞生成。本发明的药物组合物所用的血液代用品可以(1)稳定HIF－1α的表达，和/或(2)下调NF－κB。优选地，所述血液代用品为交联血红蛋白血液代用品，或者更优选地，交联血红蛋白包含与高碘酸－氧化的ATP5分子内交联、与高碘酸－氧化的腺苷分子间交联并且与还原型谷胱甘肽偶联的血红蛋白。

Description

用交联血红蛋白血液代用品治疗急性失血性贫血的方法

1.引言

本发明涉及的新方法用于治疗或预防急性失血，优选急性失血性贫血，或者更优选由下述原因引起的贫血：(i)疾病引起的急性失血、(ii)外科手术期间发生的急性失血、或(iii)创伤引起的急性失血。本发明的方法包括向有需要的个体施用有效量的血液代用品，以提高血容量和对抗与急性失血相关的缺氧以及在常氧条件下诱导红细胞生成。特别地，本发明的方法所用的血液代用品能够(1)如在常氧条件下的细胞培养试验所示，所述血液代用品能够诱导促红细胞生成素的表达，和/或(2)在常氧条件下，如通过(a)个体红细胞压积或血红蛋白的倍增时间减少来检测，和/或通过(b)个体促红细胞生成素循环水平增加来检测所示，所述血液代用品能够诱导红细胞生成。

本发明还涉及新的药物组合物，其包含在药学可接受的载体中的治疗或预防有效量或有效体积的交联血红蛋白血液代用品，其中在常氧条件下的细胞培养中检测时，所述交联血红蛋白血液代用品诱导促红细胞生成素的表达。本发明进一步涉及新的药物组合物，其包含在药学可接受的载体中的治疗或预防有效量或有效体积的交联血红蛋白，其中所述交联血红蛋白包含的血红蛋白：与高碘酸氧化的ATP分子内交联、与高碘酸氧化的腺苷分子间交联和与还原型谷胱甘肽偶联。在细胞培养中试验时，本发明的药物组合物中所用的交联血红蛋白血液代用品和交联血红蛋白能够(1)稳定HIF-1α的表达，和/或(2)下调NF-κB。

2.发明背景

虽然自从19世纪末以来就认为可以使用不含细胞的血红蛋白(人和牛)作为红细胞的替代品，但仅仅在最近几十年集中尝试进行了血液代用品的研究。近年来这种尝试背后的主要推动力是对血源性传染源的潜在传播和世界范围内血液供者不足的考虑(Sellards等人(1916)J Med Res 34：469；AmbersonWR(1934)J Cell Compar Physiol 5：359-382；Amberson WR(1937)Biol Rev12：48-86；Winslow RM(2002)Curr Opin Hematol 9(2)：146-151；WinslowRM(2003)J Intern Med 253：508-517)。

在美国，实施灵敏筛选实验降低了输血引起的传染病传播的风险，乙型肝炎传播降低到1:63,000，HIV传播降低到1:493,000，丙型肝炎和人T细胞白血病病毒的传播降低到介于前二者之间(Schreiber等人(1996)N Engl JMed 334(26)：1685-1690)。虽然血液是否传播克-雅病(Creutzfeldt-Jacob’sdisease)或其牛类变种的问题还不明确，在发达国家中血液安全性仍显著地需要改善(Hoots等人(2001)Transfus Med Rev 15(2Suppl 1)：45-59)。

另一方面，世界卫生组织和国际科学团体应该迫切关注不发达国家中血液供应缺乏安全性的问题。在感染人群很大的发展中国家，估计6百万单位的供血没有检测HIV、肝炎和梅毒(World Health Organization Web Page(2005)www.who.int，Wake等人(1998)TroD Doct 28(1)：4-8)。

世界卫生组织估计每年全世界需要1亿单位的血液；每3.75秒就有一个美国公民需要输血。同时，供血者的比例下降。因为供血比例很低，血库经常不能满足需要。美国已经从欧洲进口血液。在美国，每年使用约1.2千万单位，预期到2030年每年有3-4百万单位的不足。该预期的供血不足没有考虑在自然灾害、恐怖袭击和战争中对血液的更多严重需要。当血液的需要以每年1％的速率增长时，美国的供血以1％的年速率降低(Surgenor等人(1990)NEngl J Med 322(23)：1646-1651；Hawkins D .(1999)US News World Rep126(3)：34；National Blood Data Resource Center Web Page(2005)www.nbdrc.org：North Central Blood Services Web Page(2005)www.vourbloodcenter.org)。

血液获得和检测的成本显著地逐步升高。目前，采集、检测和输送一单位血液的成本为约$1,000，这没有计算接受经筛选，却存在污染的血液的人员的诉讼费用因素(Blumberg等人(1996)Am J Surg 171：324-330)。

使用红细胞输血的另一个缺点是必须使它们保持冷冻，即使是封装的细胞也仅仅具有42天的保存期限。而且，用红细胞进行输血需要检定血型和交叉配型，这些都不能在事故现场或战场上进行(Williams等人(1977)Preservation and Clinical Use of Blood and Blood Components.Hematology.McGraw-Hill Book Company，New York)。

2.1.血液代用品

由于输血医学中存在的这些和其它问题，需要寻找新的血液代用品。有效的血液代用品将消除输血传播疾病的风险，并且改变管理世界范围内血液供应的选择。无病原体、普遍相容且不需要交叉配型的血液代用品将开启重要的民用和军用全球市场。携带活性氧的溶液具有广泛含义，包括潜在的不含任何病原体的无限量血液代用品。通用的血液代用品可以改变出血性休克的患者的紧急治疗操作；用于择期外科手术期间围手术期的血液稀释；延长移植用捐赠器官的存活时间；改善血液的携氧能力以治疗生命受威胁的疾病例如心肌梗死和中风；用于肿瘤辐射致敏；和治疗贫血及其它血液学疾病(Winslow RM.(2002)Curr Opin Hematol 9(2)：146-151)。

在不到十年中，血液代用品的研究从科幻小说领域进入到现实中。然而，可用的血液代用品的商业化开发受到一定限制，还没有成功。尽管研究了许多不同的基于游离血红蛋白的血液代用品，但是由于存在不良副作用，在有限的人安全试验中它们并不令人满意。这些产品的主要问题是它们的血管收缩活性。其它被报道的问题是加重氧化应激和放大全身性炎症反应(Workshopon Criteria for Safety and Efficacy Evaluation of Oxygen Therapeutics as Red CellSubstitutes(1999)NIH，Bethesda MD；Winslow RM.(2000)Vox Sang 79(1)：1-20)。

实际上，HEMASSIST^TM，Baxter Healthcare Round Lake，IL(授予Walder的美国专利4,598,064和4,600,531；授予Estep的美国专利4,831,012和5,281,579)的商业化开发已经停止；同时，HEMOLINK^TM，一种棉子糖聚合的人血红蛋白溶液，Hemosol，Mississauga，Canada(授予Hsia的美国专利4,857,636)，的开发已经暂停，因为其导致人的死亡率增高或心肌梗死增多。更早的，OPTRO^TM，一种重组血红蛋白，Somatogen，Boulder，CO(授予Hoffman等人的美国专利5,028,588、5,563,254和5,661,124；授予Rosenthal等人的美国专利5,631,219)的商业开发被取消，因为在受试病人中观察到严重的全身性炎症反应。

，牛的戊二醛聚合血红蛋白溶液，Biopure Inc.，Cambridge，MA(授予Rausch等人的美国专利5,084,558、5,296,465和5,753,616；授予Light等人的美国专利5,895,810)因其“安全考虑”而临床试验暂缓进行。在2002年，Northfield Laboratories，Evanston，IL(授予Sehgal等人的美国专利4,826,811、5,194,590、5,464,814、6,133,425、6,323,320和6,914,127)的

没有得到美国管理部门的批准，是戊二醛聚合的人血红蛋白溶液，用于择期外科手术患者。现在，在同情使用(compassionateuse)的基础上，

被临床实验用于治疗汽车事故受害者的重度出血(Workshop on Criteria for Safety and Efficacy Evaluation of Oxygen Therapeuticsas Red Cell Substitutes.September 27-29，1999.NIH，Bethesda，MD；SimoniJ.(2005)In：Artificial Oxygen Carrier.Its Front Line.K.Kobayashi等人(编辑).Springer-Verlag，Tokyo 2005，第75-126页；Moore E.(2003)J Am Coll Surgeons196：1-17)。

要成为有效的载氧血浆扩容剂，血液代用品必须满足一系列必要条件。除了是不含病原体、无毒、非免疫原性和非致热性及具有延长的贮存期限之外，这些产品还应当具有接近于全血的令人满意的携氧能力，足够进行有效的组织氧化和使循环保留时间为至少24小时。所述血液代用品产品的胶体渗透压和粘度不应当超过血浆(Workshop on Criteria for Safety and EfficacyEvaluation of Oxygen Therapeutics as Red Cell Substitutes(1999)NIH，Bethesda，MD；Guidance for Industry.Criteria for Safety and Efficacy Evaluation of OxygenTherapeutics as Red Cell Substitutes(2004)U.S.Department of Health andHuman Services，Food and Drug Administration，Center for Biologies Evaluationand Research，Rockville，MD)。

所述有效的血液代用品除了能立即使血流(血管舒张)和组织/器官灌注(氧化)达到最大外，这些产品也应当能刺激红细胞生成。由于血液代用品的循环保留时间短(半衰期小于24小时)以及亚铁血红素自氧化速率高(每天超过30％)，这些产品的红细胞生成活性是失血性贫血治疗中的一个主要组成。氧化的亚铁血红素丧失了其转运氧的能力，因此，刺激红细胞生成成为用血液代用品治疗的一种极为重要的因素。用内源性红细胞对失血进行迅速补给似乎是血液代用品最有吸引力的前景。换句话说，在治疗急性贫血中，血液代用品应当充当临时的“氧”过渡，直到身体能够产生足够的红细胞以维持适当的组织氧化(Workshop on Criteria for Safety and Efficacy Evaluation of OxygenTherapeutics as Red Cell Substitutes(1999)NIH，Bethesda，MD)。

红细胞生成，造血的一个组成部分，是多能干细胞通过细胞分裂和分化的几个步骤向红细胞发展。多能干细胞产生骨髓干细胞(CFU-GEMM)，后者变成爆发形成单位类红细胞(BFU-E)，然后，变成集落形成单位类红细胞(CFU-E)和原红细胞。当原红细胞开始产生血红蛋白时，其变成早幼红细胞和中幼红细胞。然后，当所述细胞质更进一步变得嗜伊红时，其变成正染性成红细胞。在挤压其核后，该细胞作为网织红细胞进入循环，并且在几天内，在丧失其多核糖体后变成成熟的红细胞。在正常条件下，整个红细胞生成过程将需要不超过5天。成熟红细胞的寿命为约90-120天，它们需要连续的补给(Hillman RS，Finch CA：Red Cell Manual.第7版，Philadelphia：F.A.Davis，c1996，viii，第190页)。

红细胞生成的调节是由高敏感度的反馈系统控制的复杂过程，该系统基于氧张力(浓度)和细胞的氧化还原状态，该状态涉及氧和氧化还原调节的转录因子及许多生长因子(促红细胞生成素-EPO、IL-3、IL-9、SCF、GM-CSF)和矿物质，特别是铁(Adamson JW(1991)Biotechnology 19：351-361；Sasaki R(2003)Int Med 42(2)：142-149；Lacombe C等人(1998)Haematologica 83(8：724-732)。

虽然EPO不是负责红细胞生成的唯一生长因子，但其是定向祖细胞增殖的最重要调节剂和抗细胞凋亡的保护剂。通过EPO受体(EpoR)实现的EPO的主要功能是保护定向红系祖细胞不凋亡。EPO-依赖性的抗细胞凋亡蛋白BcI-(L)的上调允许细胞凋亡-保护的定向成红细胞的“默认”终末分化，而与任何外源性信号无关(Socolovsky等人(1999)Cell 98(2)：181-91；Dolznig等人(2002)Curr Biol 12(13)：1076-1085)。

红细胞生成事件和因子的示意包括：CFU-GEMM→(EPO，SCF，IL-9)→BFU-E→(EPO，SCF，GM-CST，IL-3)→CFU-E→(EPO，GM-CSF)→ERYTHROBLAST(EPO)→RETICULOCYTE→RBC。

贫血定义为血液载氧能力的病理性不足，导致缺氧。贫血的主要原因是急性失血、顽固性贫血继发的慢性疾病、癌症、血管内溶血和红细胞扣留增加或红细胞生成减少。缺氧的固有应答是红细胞生成反应增加(CampbellK.(2004)Nurs Times 100(47)：40-43)。

缺氧刺激肾脏(皮质)的小管周间质细胞生成EPO。EPO也在肝脏和脑星形细胞中合成，其对抗缺氧期间神经元的细胞凋亡和破坏。氧调节的转录因子；缺氧诱导的因子-1α(HIF-1α)和缺氧诱导的因子-1β(HIF-1β)调节在人的7号染色体上的单个基因控制下的该过程。特异性结合EPO编码基因3′增强子的HIF-1也是其它对缺氧适应重要的基因中的启动子(Semenza等人(1992)MoI Cell Biol 12；5447-5454；Brines等人(2005)Nat Rev Neurosci6(6)：484-494)。

Semenza和Wang鉴定的HIF-1是由两个碱性螺旋环-螺旋/PAS蛋白(HIF-1α)和芳香烃核转位HIF-1β组成的异源二聚体。HIF-1β不太受氧的影响，而HIF-1α仅在低氧条件下存在。在含氧量正常下，HIF-1α的降解取决于pyrol-4-羟化酶对其脯氨酸残基的氧介导的羟基化。HIF-1α的羟基化引发vonHippel-Lindau肿瘤抑制蛋白对其快速降解，所述von Hippel-Lindau肿瘤抑制蛋白结合羟基化域而不结合非羟基化域。所述von Hippel-Lindau肿瘤抑制蛋白是将HIF-1α连接至泛素途径的泛素连接酶的一部分(Wang等人(1995)JBiol Chem 270；1230-1237；Wang等人(1993)J Biol Chem 268；21513-21518；Kallio等人(1999)J Biol Chem 274(10)：6519-6525。

然而，在低氧条件下，氧的缺乏抑制HIF-1α的降解，HIF-1α从细胞质快速易位至细胞核，并作为数十个氧-调节靶基因的主要调节剂起作用，这些靶基因参与：

1)氧转运：红细胞生成(EPO)；铁转运(转铁蛋白)；铁摄取(转铁蛋白受体)，

2)血管调节：血管生成(VEGF、EG-VEGF、PAI-1)；血管紧张度的控制(iNOS、α1B-肾上腺素能受体、ET-1)；血管重构(HO-1)，

3)无氧供能：葡萄糖摄取(葡萄糖运载体1)；糖酵解的调节(PFKFB3)；糖酵解(磷酸果糖激酶1、醛醇酶、GAPDH、磷酸甘油酸激酶1、烯醇酶1、乳酸脱氢酶A(Wenger RH(2002)FASEB J 16；1151-1162；Gleadle等人(1997)Blood89(2)：503-509；Gleadle等人(1998)MoI Med Today 4(3)：122-129)。

HIF-1α在含氧量正常下也可以是稳定的。例如，在氧化应激下，通过改变激活NF-κB和诱导炎症基因(即TNF-α、IL-1β、IL-6)的细胞氧化还原平衡产生的活性氧分子(ROS)可以稳定HIF-1α。然而，这些炎症细胞因子也可以抑制HIF-1α结合EPO基因，同时促进VEGF基因诱导，从而抑制红细胞生成和加速血管生成。在癌症患者中，由于有效的血管生成，该现象可导致重度贫血和肿瘤过度生长。类似地，已知在常氧条件下其能稳定HIF-1α的其它炎症介质TGF-β，能够阻止红系祖细胞的分化，同时降低EPO的红细胞生成活性(Hellwing-Burgel等人(1999)Am Soc Hematol 94：1561-1567；Linch DC(1989)Schweiz Med Wochenschr 119(39)：1327-1328)。

在晚期肾病的患者中，炎症也受到EPO抗性的发病机理影响。现在认为TNF-α、IL-1β和IL-6能抑制尿毒症中的红细胞生成。在动物模型和人中，施用IL-6可通过直接抑制红系祖细胞而导致造血障碍性贫血(Trey等人(1995)Crit Rev Oncol Hematol 21：1-8；Yuen等人(2005)ASAIO J 51(3)：236-241)。

已知在常氧条件下稳定HIF-1α的其它因子包括NO、PDGF和oxLDL。在含氧量正常条件下控制HIF-1α调节的分子途径受ROS、PI3K、TOR和MAP激酶，特别是ERK1/2的介导(Haddad等人(2000)J Biol Chem 275(28)：21130-21139；Haddad等人(2001)FEBS Lett 505(2)：269-274；Lando等人(2000)J Biol Chem 275(7)：4618-4627；Richard等人(1999)J Biol Chem 274(46)：32631-32637)。

1949年由Amberson首次观察到游离血红蛋白可能参与红细胞生成反应，他观察到在给予天然血红蛋白溶液后人红细胞生成指标(网织红细胞计数和红细胞压积)增加。该试验以患者由于肾衰竭死亡而悲剧性地结束(Amberson等人(1949)J Appl Physiol 1：469-489)。30年后，Savitsky进行了向正常人志愿者灌注无红细胞架构的血红蛋白溶液的实验，该临床试验导致类似的悲剧性结果。采用这种血红蛋白治疗的所有个体均显示出系统性高血压和肾衰竭，其中一人死亡(Savitsky等人(1978)Clin Pharmacol Ther 23：73-80)。

这些早期的临床试验证实未交联的血红蛋白是致命的，且不适于输血。当时，那些作者们还不能解释这些病理性事件的机理。运用目前的知识，有理由认为在Amberson和Savitsky的临床试验中观察到的病理性反应，特别是血压的快速升高是血红蛋白的内在毒性的结果。现在，已经了解基于血红蛋白的血液代用品通过清除一氧化氮和影响其它血管紧张度控制机制，可以造成血压严重升高，血压的升高与心输出量降低和总的血管外周阻力增加相关(Simoni J.(2005)In：Artificial Oxygen Carrier.Its Front Line.K.Kobayashi等人(编辑).Springer-Verlag，Tokyo，2005第75-126页)。

血红蛋白是一种升压剂，并且目前所用的化学或重组体修饰技术不能解决这一问题。所有检测的血液代用品产品，包括HEMASSIST^TM、OPTRO^TM-rHb1.1、

和HEMOLINK^TM，都会引起血管收缩，这种副作用已成为血液代用品开发商面临的主要困难。在注射这些血液代用品之后观察到的血压升高是由血管收缩引起的外周血管阻力增加引起的(Winslow RM(1994)Transf Clin Biol 1(1)；9-14；Hess等人(1994)ArtifCells Blood Substit Immobil Biotechnol 22(3)：361-372；Kasper等人(1996)Cardiovasc Anesth 83(5)：921-927；Kasper等人(1998)Anesth Anal 87(2)：284-291；Winslow RM(2003)J Intern Med 253：508-517)。也有报道一些产品具有闭合毛细管流的倾向，这会降低组织/器官灌注率，并导致缺氧(Cheung等人(2001)Anesth Anal 93(4)：832-838)。

因为低氧环境稳定HIF-1α，理论上，促进血管收缩和产生缺氧的血液代用品有可能会诱导HIF-1α调节基因。然而，该机制与向迫切需要空气的组织递送足够量的氧的血液代用品的主要作用相矛盾。向缺血器官适当地供氧是管理部门批准血红蛋白溶液作为血液代用品的基本要求。因此，这样的“红细胞生成作用”应当被认为是病理性的。无毒和有效的血液代用品产品应当使血流和组织灌注最大化，从而使氧合最大化(Workshop on Criteria for Safety andEfficacy Evaluation of Oxygen Therapeutics as Red Cell Substitutes(1999)NIH，Bethesda，MD；Guidance for Industry.Criteria for Safety and Efficacy Evaluationof Oxygen Therapeutics as Red Cell Substitutes(2004)U.S.Department of Healthand Human Services，Food and Drug Administration，Center for BiologiesEvaluation and Research，Rockville，MD)。

理论上，当大剂量使用这样的血液代用品时，其可以触发炎症反应，所述炎症反应可抑制其初始的、含氧量低-驱动的红细胞生成反应。

在20世纪90年代，Simoni等人发现血红蛋白是一种氧化还原调节的转录因子NF-κB的有效诱导物，NF-κB参与调节涉及炎症的基因。他发现内皮NF-κB的活化可能取决于血红蛋白的促氧化潜能和血红蛋白-介导的细胞氧化应激的程度，所述血红蛋白-介导的细胞氧化应激使GSH/GSSG变化成氧化平衡。在该研究中，戊二醛聚合的牛血红蛋白似乎是比未修饰的血红蛋白更有效的NF-κB诱导物。Simoni等人认为该作用与戊二醛聚合的血红蛋白产生最高的内皮脂质过氧化作用和最大的细胞内GSH消耗的现象有关。基于这些研究，Simoni等人提出NF-κB的活化可以被认为是血红蛋白-诱导的氧化应激和血红蛋白-介导的炎症反应之间的“过渡”。此外，他的发现奠定了认为血红蛋白是一种信号分子的基础(Simoni等人(1997)Artif Cells Blood Substit ImmobilBiotechnol 25(1-2)：193-210；Simoni等人(1997)Artif Cells Blood SubstitImmobil Biotechnol 25(1-2)：211-225；Simoni等人(1998)ASAIO J 44(5)：M356-367；Simoni等人(1994)Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol22(3)：525-534；Simoni等人(2000)ASAIO J 46(6)：679-692；Simoni等人(1994)Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol 22(3)：777-787；PahlHL(1999)Oncogene 18：6853-6866；Gilmore TD(2005))。

Simoni随后的研究揭示触发NF-κB的血红蛋白溶液可抑制HIF-1α调节基因，特别是EPO的证据(Simoni等人(2003)Artificial Blood 11(1)：69；Simoni等人(2003)ASAIO J 49(2)：181；Simoni J.(2005)In：Artificial Oxygen Carrier.ItsFront Line.K.Kobayashi等人(Eds.).Springer-Verlag，Tokyo，2005，第75-126页)。

也有报道在最初红系祖细胞中的高活性NF-κB途径参与红细胞系特异性基因的抑制(Liu等人(2003)J Biol Chem 278(21)：19534-19540)。

普遍认为炎症有助于EPO抗性的发病，特别在贫血和癌症中(Yuen等人(2005)ASAIO J 51(3)：236-241；Hellwig-Burgel等人(1999)94(5)：1561-1567)。

因此，理论上，即使在含氧量正常的环境中，改变细胞的氧化还原态的血液代用品可能会触发NF-κB调节基因(即细胞因子)和稳定HIF-1α。然而，在这样的条件下，HIF-1α与EPO基因的有效结合受炎症细胞因子的抑制。因为血红蛋白与炎症细胞因子的生成相关，而且炎症细胞因子是强的抗红细胞生成剂，有理由认为具有强促炎症反应潜能的血液代用品可抑制红细胞生成反应。

实际上，有报道一些目前正在检测的血液代用品不仅调节血管收缩事件，而且它们也能诱导炎症反应。在剂量逐步增加的研究中(临床试验的后期)，那些反应更加明显，并且已经通过Baxter的HEMASSIST^TM、Biopure的

、Somatogen的rHb1.1-OPTRO^TM和Northfield的

观察到那些反应。血管收缩和缺血/炎症反应被认为是更改、停止或中止这些血液代用品的临床开发的主要原因(Simoni J.(2005)In：Artificial Oxygen Carrier.Its Front Line.K.Kobayashi等人(编辑).Springer-Verlag，Tokyo，2005第75-126页)。

不利于目前检测的血液代用品的可能的红细胞生成活性的另一科学原理是血红蛋白具有天然的促细胞凋亡潜能。这一观察结果非常重要，因为EPO作为促红细胞生成剂的主要功能是保护定向成红细胞不发生细胞凋亡，从而使得红细胞生成能够发生(Socolovsky等人(1999)Cell 98(2)：181-91；Dolznig等人(2002)Curre Biol 12(13)：1076-1085)。

有报道未修饰的血红蛋白对于人内皮细胞具有促细胞凋亡潜能，半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9控制这一作用，其可通过消耗细胞内GSH来促进(Meguro等人(2001)J Neurochem 77(4)：1128-1135；Simoni等人(2002)ASAIO J48(2)：193)。琥珀酰水杨酸修饰的血红蛋白(HEMASSIST^TM)及其戊二醛-聚合的变型也诱导形态变化、G2/M阻滞和DNA片段化，其标志着凋亡性细胞死亡(Goldman等人(1998)Am J Physiol 275(3 Pt2)：Hl 046-53)；D′Agnillo等人(2001)Blood 98(12)：3315-3323)。已经发现Oxyglobin，一种在体外心脏灌流模型中所用的(Biopure)的变型，可导致凋亡性内皮细胞死亡(TUNEL测定)，其与冠状动脉阻力的显著增加有关(Mohara等人(2005)ASAIOJ 51(3)：288-295)。

事实证明与骨髓细胞直接接触的具有促细胞凋亡潜能的任何试剂都具有抗红细胞生成活性。这样的试剂将与EPO的抗细胞凋亡作用相竞争，阻止红细胞生成。实际上，基于血红蛋白的血液代用品部分地被骨髓细胞清除，因此，它们与成红细胞直接接触(Shum等人(1996)Artif Cells Blood SubstitImmobil Biotechnol 24(6)：655-683)。

认识到血红蛋白具有促细胞凋亡潜能并可与骨髓直接接触，有理由认为当以较高的浓度给予时，具有促细胞凋亡活性的任何血液代用品产物将抑制红细胞生成。

在科学文献和专利文献中，关于基于血红蛋白的血液代用品的红细胞生成潜能的信息非常有限。1997年，Rosenthal等人(美国专利5,631,219)要求保护用重组血红蛋白(rHb1.1)通过增加包括红系祖细胞的祖细胞/干细胞的生长或分化来刺激哺乳动物造血的方法。授予Hoffman等人的美国专利5,028,588、5,563,254和5,661,124要求保护重组血红蛋白rHb1.1(商品名为OPTRO^TM)。

在美国专利5,631,219中，向小鼠静脉内给予剂量为0.5或1.0mg/kg体重的rHb1.1，每周三次，将引起骨髓中红系细胞的早期前体—BFU-E的增加。在Rosenthal等人的美国专利5,631,219中报道了用rHb1.1治疗正常小鼠(BDF-1)后红细胞压积增加。为了评价rHb1.1是否以不同于定向红细胞系前体的水平起作用，Rosenthal评价了rHb1.1对非常早期、非定向祖细胞、脾集落生成单位(CFU-S)的影响。

根据美国专利5,631,219，Rosenthal发现rHb.1.1以0.5mg/kg体重的浓度可增加CFU-S的量。在美国专利5,631,219中，0.5mg的血红蛋白/kg体重的较低剂量水平似乎比较高剂量的rHb1.1(5和10mg/kg)的效果更好，这表明以低剂量出人意料地获得最大的效果。

没有提供任何理论性说明，Rosenthal等人得出低剂量(0.5mg/kg体重)的rHb1.1以直接作用于祖细胞或间接增加血细胞生成的方式作用，并起到促红细胞生成因子的作用。

Rosenthal等人所用的rHb1.1的浓度(0.5-10mg/kg体重)在临床上与氧转运无关，因此不能治疗急性失血。为了获得治疗性效果，基于血红蛋白的血液代用品应当以克而不是以毫克输注。因此，美国专利5,631,219不能用于治疗急性失血性贫血。

此外，美国专利5,631,219的专利权利要求与提供的实施例不一致。Rosenthal要求保护血红蛋白的治疗有效的水平为0.001至10,000mg/kg体重。这些权利要求不能得到Rosenthal专利的实施例支持，所述实施例显示出浓度仅为0.5mg/kg体重的rHb1.1具有造血作用。也许，Rosenthal受到我们发表的文章的影响，该文章中公开剂量为约1.75g(1,750mg)/kg体重的化学修饰的牛血红蛋白溶液在人中显示出有效的红细胞生成反应。美国专利5,631,219依赖于该文献(Feola等人(1992)Surg Gynecol Obstet 174(5)：379-386)。

1997年，Moqattash等人比较了灌注的rHb1.1和EPO在正常小鼠和AIDS小鼠中从AZT的抑制作用下拯救造血活性的能力。结果表明使用更高浓度的rHb1.1(10-15mg/kg体重)不会引起大多数血液指数的更显著增加。而且，5-mgrHb1.1/kg体重联合2U EPO/小鼠/天的治疗显示出比单独的5-mg/kg-体重的rHb1.1作用更好(Moqattash等人(1997)Acta Haematol 98(2)：76-82)。

两年后，Lutton等人成功地挑战了Rosenthal的研究。通过分析临床相关剂量的交联血红蛋白和非交联血红蛋白在兔子中的造血效应，他得出结论：两种血红蛋白溶液在高浓度下不会产生BFU-E和CFU-S生成的显著变化，因此，它们不表现出任何造血活性(Lutton等人(1999)Pharmacology 58：319-324)。

在多个临床前和临床研究中，已经广泛检测了重组血红蛋白(即rHb1.1)、交联的四聚体血红蛋白(即HEMASSIST^TM)和聚合血红蛋白(即

)。所有被检测的血红蛋白溶液都被证实是有毒性的(Workshop on Criteria for Safety and Efficacy Evaluation of OxygenTherapeutics as Red Cell Substitutes(1999)NIH5 Bethesda，MD)。

在rHb1.1的人临床试验中，48名健康男性志愿者随机分配接受15-320mg/kg体重的5％ rhb1.1，其产生了严重的副作用，比如胃肠不适、发热、寒战、头痛和背痛(Viele等人(1997)Anesthesiology 86(4)：848-858)。在另一个临床研究中，患者接受手术并接受67-365mg/kg体重的rHb1.1，没有出现严重的不良事件。然而，患者患有高血压、炎症症状和胰酶升高。在这些临床试验中，也没有报道rhb1.1的红细胞生成作用(Hayes等人(2001 CardiothoracVase Anesth 15(5)：593-602)。

rHb1.1的高度不令人满意的临床经验终止了该重组血液代用品的商业化开发。在90年代后期，Somatogen/Baxter集中开发新的第二代重组产品(rHb2.0；授予Olson等人的美国专利6,022,849)来代替临床不成功的rHb1.1。新产品被设计成具有与一氧化氮更低的反应速率。然而，在2年的临床前试验后，rHb2.0的商业化开发也停止了。

rHb1.1的临床经验可帮助理解为什么在美国专利5,631,219中较低剂量水平(0.5mg的血红蛋白/kg体重)似乎比较高剂量(5和10mg/kg)的作用更好。也许，较高剂量的rHb.1.1的强促炎症反应和促细胞凋亡潜能抑制了EPO基因的诱导，使红细胞生成不能发生。因此，有理由认为比几mg/kg体重更高浓度的rHb1.1将抑制红细胞生成，却能促进促炎症反应吞噬细胞生成作为造血的-炎症事件的一部分。

其它基于血红蛋白的血液代用品产品在临床试验后期也没有成功。

HEMASSIST^TM的III期研究悲剧性地终止了。施用HEMASSIST^TM的患者的死亡率显著高于对照组患者。1998年6月，在FDA的建议下，由于安全问题，HEMASSIST^TM的开发计划被暂缓。在HEMASSIST^TM临床试验中，没有报道红细胞生成作用或造血作用(Sloan等人(1999)JAMA 282：1857-1864)。

的临床开发(授予Rausch等人的美国专利5,084,558、5,296,465和5,753,616；授予Light等人的美国专利5,895,810)由于“安全问题”而被归入临床限制。该产品的强血管收缩、促氧化、促炎症反应和促细胞凋亡潜能不可避免地限制了其作为血液代用品的实用性(Kasper等人(1996)Cardiovasc Anesth 83(5)：921-927；Kasper等人(1998)Anesth Anal 87(2)：284-291)。

单独的红细胞生成作用从来没有被证实(Gawryl MS(2003)Artif Blood 11(1)：46)。然而，试验性地使用

(联合EPO)治疗Jehovah′s Witness胃肠出血后的重度贫血。给具有初始血红蛋白为3.5g/dL的50岁的人注射

(7单位)和高剂量的重组EPO(500U/kg/天)。在rEPO治疗的24天中，血红蛋白水平最初保持不变，然后慢慢地增加到7.6g/dL的最大值。该实例证实在等待重组EPO对骨髓红细胞生成产生最大作用时，

(半衰期小于24小时)可以起到初始治疗的作用。该临床研究表明单独的

不具有红细胞生成潜能(Gannon等人(2002)Crit CareMed 30(8)：1893-1895)。

在2002年，

(授予Sehgal等人的美国专利4,826,811、5,194,590、5,464,814、6,133,425、6,323,320和6,914,127)未能获得美国管理部门批准用于择期外科手术患者。现在，在同情使用的基础上，

被临床实验用于治疗汽车事故受害者的重度出血。

过去，被用于治疗患有持续性结肠出血且血红蛋白为2.9g/dL的危重贫血妇女。在该临床研究中，

与刺激红细胞生成反应所需的高剂量的重组EPO一起使用。因此，很可能类似于

其单独的不具有任何红细胞生成活性(Allison等人(2004)Southern Med J 97(12)：1257-1258)。

因为受试患者的心肌梗死(基于炎症)比例增加，HEMOLINK^TM的临床开发(授予Hsia的美国专利4,857,636)被停止。与天然血红蛋白相比，HEMOLINK^TM显示出在自氧化、氧化修饰和血红素基团的完整性方面，稳定性更低。表现出高血管收缩、促氧化和促炎症反应性质的HEMOLINK^TM从来没有被表征为单独刺激红细胞生成的产品(Alayash Al(2004)Nature 3：152-159；Riess JG(2001)Chem Rev 101(9)：2797-2919)。

过去，与其它血液代用品产品(

)类似，在患有重度贫血、血红蛋白为3.2g/dL的53岁女性Jehovah’s Witness的同情治疗中试检HEMOLINK^TM。也在该试验中，HEMOLINK^TM与高剂量的重组EPO和硫酸亚铁一起施用。在14天后，患者的血红蛋白水平仅增加至6.5g/dL，红细胞压积为23％。该试验提供了进一步的证据，证明有毒的基于血红蛋白的血液代用品单独的不会刺激红细胞生成(Lanzinger等人(2005)Can J Anaesth52(4)：369-373)。

对血红蛋白的红细胞生成活性的基础研究也非常有限。最近，有报道血红蛋白在低氧条件下增加HIF-1α的表达。使用牛主动脉内皮细胞模型，用蛋白质印迹法检测HIF-1α，结果表明在全部未修饰的血红蛋白溶液中，HIF-1α的高表达与亚铁-Hb的损失和三价铁-Hb的累积(血红素的氧化)有关。在该研究中，作者使用类似于HEMASSIST^TM的琥珀酰水杨酸交联血红蛋白(Yeh等人(2004)Antioxid Redox Signal 6：944-953)。

该试验除了对之前提出的长期暴露于三价铁-(氧化的)血红蛋白而不是亚铁-(氧合的)血红蛋白中的内皮细胞会经由HO-1和铁蛋白的生成增加而导致这些细胞显著地对抗继发的氧化损伤提供更多分子机制外，还提示现在已知该现象是受HIF-1α调节的(Balla等人(1995)Am J Physiol 268(2 Pt 1)：L321-327)。

因为有效的基于血红蛋白的载氧体必须能对抗与失血性贫血相关的低氧条件，上述发现仅可以应用于加重缺氧的那些产品，从而诱导HIF-1α。实际上，目前临床开发中的血液代用品产品具有良好的经证实的血管收缩潜能和高自氧化速率。然而，在Yeh的研究中，得出血红蛋白和红细胞生成之间没有联系。

一种目前开发中的血液代用品明显缺少红细胞生成活性，这可由来自theDepartment of Transfusion Medicine，Warren G.Magnuson Clinical Center，National Institute of Health，Bethesda，MD的Dr.Harvey G.Klein的声明中得出。在他的2005年标题为：＂Blood substitutes：how close to a solution？＂评论性文章中，他指出：“...人、牛和重组来源的血红蛋白-衍生的红细胞代用品在III期试验中都具有按小时计的半衰期，不可能代替刺激红细胞生成的输血或药物用于慢性贫血，但是他们可起以下作用：(1)当没有立即可用的相容性血液时，作为输血的过渡，(2)作为外科手术的自体血液稀释治疗的辅助物，或者甚至(3)用于放射治疗或控制癌症”(Klein HG(2005)Dev Biol(Basel)120：45-52)。

上述分析阐述了还没有被开发出的理想的血液代用品。最佳血液代用品应当维持患者直到出血被控制。因为无细胞的血液代用品循环半衰期短，它们应具有刺激红细胞生成的能力以补偿失血。为了维持患者，血液代用品将使血流和组织灌注最大化，从而使氧合作用最大化。为了刺激红细胞生成，血液代用品应当在低氧和常氧条件下稳定HIF-1α，通过控制促氧化和促炎症反应，该血液代用品应促进HIF-1α结合EPO-基因。所述血液代用品也应当不具有任何促细胞凋亡活性，因为EPO的主要功能是从凋亡中抢救定向的红系祖细胞。这些事件是引发有效的红细胞生成所必需的，所述红细胞生成将用内源性红细胞不停地补偿损失的血液。

向缺血器官适当地供氧是管理部门批准血红蛋白溶液作为血液代用品的基本要求。因此，诱导血管收缩和具有强的促氧化、促炎症反应和促细胞凋亡潜能的血液代用品可能对患者有害，是临床不可接受的。

目前在临床试验下的产品代表了第一代血液代用品，现在的研究致力于解决所有血红蛋白内在毒性问题的“新一代”血液代用品。相信第二代产品可用于所有临床适应症，包括治疗急性失血性贫血和创伤。

因为目前试验的血液代用品不具有红细胞生成活性，仍存在对改善的载氧溶液的需要，所述载氧溶液应当具有如下能力：使组织灌注和氧合作用最大化和刺激红细胞生成，从而用内源性红细胞代替损失的血液。这样的血液代用品刺激红细胞生成应当出现在低氧和常氧条件下。在生命受威胁的贫血情况下，这样的血液代用品应通过稳定HIF-1α和EPO生成来刺激患者的红细胞生成反应，作为最初的治疗以保持组织氧合作用，并作为继续性治疗以使红细胞压积正常化。该治疗应不再需要昂贵的重组EPO药物。

在专利文献中，提示稳定HIF-1α可以在治疗缺氧相关的组织损伤中提供治疗益处。授予Semenza的美国专利6,562,799提供了通过给个体施用治疗有效量的稳定的HIF-1α蛋白来治疗缺氧-或局部缺血-相关的组织损伤的方法。授予Gregory等人的美国专利6,432,927提供了用能够转录活化的缺氧诱导蛋白因子的DNA结合域来减少局部缺血性组织损伤的方法。授予Kaelin等人的美国专利6,849,718提供了包含HIF-1α突变体的药物组合物和使用所述组合物治疗缺氧和局部缺血相关的组织损伤的方法。授予Arbeit的美国专利6,838,430提供了稳定的HIF-1α变体促进伤口愈合的用途。

然而，这些专利方法没有涉及使用基于血红蛋白的血液代用品促进HIF-1α依赖性EPO诱导，从而促进红细胞生成。

使氧递送至局部缺血的组织和器官最佳化和有效刺激红细胞生成反应是管理部门批准这些试剂作为血液代用品的最重要因素。本发明的血液代用品解决了上述讨论的问题。

2.2.急性失血的治疗

在美国，目前没有管理部门批准的血液代用品。因而，输血是快速恢复急性失血个体的血容量的唯一可靠方法。然而，存在大量与输血有关的风险。首先，需要检测供体血液以确定其适于输血并与接受者相容。相容性检测通常包括(1)供体和接受者血液的ABO类型，以防止输入不相容的红细胞(RBC)；和(2)Rh类型，以确定在是否在RBC中存在Rh因子RhO(D)(Rh-阳性)或不存在Rh因子(Rh-阴性)。所供血液也需要使用例如直接抗球蛋白试验(直接Coombs试验)和间接抗球蛋白试验(直接Coombs试验)来筛选，以鉴定不可预期的抗-RBC抗体，其可引起溶血性疾病或严重的输血反应。

假定供体血与接受者匹配，输血仍可导致许多并发症。例如，在输血期间或输血之后供体或接受者RBC(通常是前者)的溶血可能由ABO/Rh不相容性、血浆不相容、发生溶血的RBC或脆弱的RBC(例如过度加热贮藏的血液或与不适当的IV溶液接触)、或注射非等渗的溶液引起。当不相容的供体RBC被接受者血浆中的抗体溶血时，反应是最严重的，可引起呼吸困难、发热和寒战、脸部发红、极度疼痛(特别是在腰部)以及导致血压下降、恶心和呕吐的休克。对供体血液未知成分的过敏性反应也很常见，通常是由供体血浆中的变应原或较少情况下由来自过敏性供体的抗体引起。在输血期间或输血刚结束时，这些反应通常是轻度的，伴有荨麻疹、水肿、临时性头昏和头痛，但是在少见情况下可出现过敏反应。更不常见的另一种并发症是输血相关的急性肺损伤，其由供体血浆中的抗白细胞(WBC)抗体使接受者肺内的WBC聚集和脱颗粒引起。将大量空气输入静脉也可引起心脏中的血液起泡沫，随后泵送效率低，导致心力衰竭。移植物抗宿主疾病，其甚至可以由输注血液中的少量活性淋巴细胞或输注的血液成分引起，也可以由输血引起。还存在细菌污染的问题，其可能由于采集期间无菌操作不当或暂时未出现症状的供体而导致。最后和最重要地，输血的接受者总是有病毒性疾病的传染危险，包括但不限于肝炎、HIV、巨细胞病毒(CMV)和I型人T细胞亲淋巴病毒(HTLV-I)传染。

3.发明概述

本发明涉及使用某些血液代用品来治疗或预防有需要的个体的急性失血性贫血的方法，所述急性失血性贫血是由下述原因引起的贫血：(i)疾病引起的急性失血，(ii)外科手术期间出现的急性失血，或(iii)由创伤引起的急性失血。本发明的方法涉及使用在既能恢复血容量和对抗缺氧，又能在常氧条件下诱导红细胞生成的血液代用品。输血是目前快速恢复个体失血的唯一可靠的方法，能有效地恢复血容量和对抗缺氧。然而，在急性失血引起的急症期间输血是不理想的，因为没有时间检测供体和接受者血液之间的相容性，而且总会存在触发与存在于供体血液中的免疫成分相关的许多并发症(例如RBC的溶血、过敏性反应、输血相关的急性肺损伤、移植物抗宿主疾病、细菌污染、病毒性疾病的传染等)的风险。而且，输血暂时恢复了常氧条件，但损害了身体再补充自身红细胞的能力。特别地，引起红细胞生成的体内促红细胞生成素的生成增加是由低氧条件诱导的。因此，输血虽然是缺氧的“快速修复”，但最终减慢了红细胞生成，和因而减慢了将内源性红细胞再补充到循环中的机体能力。目前试验用于人使用的血液代用品也有类似的原因。特别地，许多血液代用品的循环保留时间很短(半衰期小于24小时)，亚铁血红素自氧化速率很高(每天超过30％)，因此不具有用内源性红细胞补充体循环所需的红细胞生成活性。本发明解决了这一问题，因为本发明方法所用的血液代用品能够在常氧条件下诱导红细胞生成。

在一些实施方案中，所述失血与疾病例如出血性疾病、溃疡或血管破裂或动脉瘤等相关。在某些其它的实施方案，所述失血在外科手术比如择期外科手术(例如矫形外科手术)期间出现。在某些其它的实施方案，所述失血是由创伤比如烧伤、枪伤或刺伤引起。在一些实施方案中，所述失血为重度的，个体的失血超过33％。在某些其它的实施方案，所述失血为中度的，个体的失血为约20％至33％。在某些其它的实施方案，所述失血为轻度的，个体的失血为小于20％。优选地，所述个体为人。可以有利地使用本发明的方法治疗血红蛋白低于7g/dL的人个体。

本发明的方法包括向有需要的个体施用一定量的血液代用品，所述量能有效地提高血容量和对抗与急性失血相关的缺氧。本发明的方法所用的血液代用品能够(1)如在常氧条件下的细胞培养中试验所示，所述血液代用品能够诱导促红细胞生成素的表达，和/或(2)在常氧条件下，如通过(a)个体红细胞压积或血红蛋白的倍增时间减少来检测，和/或通过(b)个体促红细胞生成素循环水平增加来检测所示，所述血液代用品能够诱导红细胞生成。任选地，所述血液代用品也显示在细胞培养中试验时可以稳定HIF-1α的表达，和/或在细胞培养中试验时下调NF-κB的表达。

显示出这些特征的任何血液代用品可以被用于本发明方法。例如，所述血液代用品可以是交联血红蛋白血液代用品，或者更具体地，交联血红蛋白包含的血红蛋白与高碘酸-氧化的ATP分子内交联、与高碘酸-氧化的腺苷分子间交联并且与还原型谷胱甘肽偶联。在优选的实施方案，本发明方法所用的交联血红蛋白所包含的血红蛋白与高碘酸-氧化的ATP的摩尔比为1:1至1:3；血红蛋白与高碘酸-氧化的腺苷的摩尔比为1:1至1:10；和/或血红蛋白与还原型谷胱甘肽的摩尔比为1:1至1:20。该产品的商标为HEMOTECH^TM，其为一种包含与邻-腺苷5’-三磷酸盐(o-ATP)、邻-腺苷和还原型谷胱甘肽(GSH)交联的纯牛Hb的交联血红蛋白。关于交联血红蛋白的更详细描述可以在Feola等人的美国专利5,439,882中找到，将其全部内容引入本发明作为参考。

本发明还涉及新的药物组合物，其包含一定浓度或体积的可用于本发明方法或用于其它治疗的血液代用品。例如，这样的新的组合物可以包含在药学可接受载体中的(1)治疗有效量的(a)7g至小于122.5g，或(b)大于122.5g至700g的交联血红蛋白血液代用品，或(2)小于0.6升的治疗有效体积的交联血红蛋白血液代用品，其中当在常氧条件下的细胞培养中试验时，所述交联血红蛋白血液代用品诱导促红细胞生成素的表达。

其它新的药物组合物包含在药学可接受的载体中的(1)治疗有效量的(a)7g至小于122.5g，或(b)大于122.5g至700g的交联血红蛋白血液代用品，或(2)小于0.6升的治疗有效体积的交联血红蛋白，其中所述交联血红蛋白为与高碘酸-氧化的ATP分子内交联、与高碘酸-氧化的腺苷分子间交联和与还原型谷胱甘肽偶联的血红蛋白。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物所用的交联血红蛋白溶于非电解水溶液中。所述药物组合物可以进一步包含甘露醇和/或电解质。

本发明的新的药物组合物可用于本发明方法及任何其它方法中(例如治疗慢性失血性贫血或由长期失血引起的贫血)。

本发明的方法采用交联血红蛋白治疗动物个体急性失血来阐述。

3.1.定义

如本发明中使用的术语“约”意味着包括标准实验误差(例如标准偏差)。关于标准偏差的定义、计算和说明的更多信息可以在统计学教科书中找到，所述统计学教科书例如，但不限于Statistics，W.W.Norton & Company；第3版(1997年9月1日)和The Basic Principles of Statistics，W.H.Freeman & Company；Bk&Cdr第3版(2003年6月1日)。

如本发明中使用的术语“有效量”和“有效体积”分别指在施用一种或多种本发明的血液代用品和/或药物组合物的个体中，足够提高血容量、恢复血流、恢复组织的氧合水平、恢复血液动力学参数、对抗与急性失血相关的缺氧、增加循环EPO或EPO的合成、恢复红细胞压积水平、恢复血红蛋白水平、稳定HIF-1α、下调NF-κB、减少原成红细胞的细胞凋亡事件和/或减少抗红细胞生成的炎症细胞因子的生成的量和体积。

如本发明中使用的术语“低氧”和“缺氧”指氧水平降低的状态。缺氧可由氧分压降低、氧转运不足和/或组织使用氧的能力不足引起，其可引起身体功能损伤。例如，可以在湿润的可变需氧的工作站获得低氧条件(1.5％的O₂、93.5％的N₂和5％的CO₂)。

如本发明中使用的术语“病症”与术语“疾病”可互换地使用。引起急性失血的疾病可涉及任何类型的细胞(例如体细胞、生殖细胞、胚细胞、干细胞)、组织(例如骨骼、肌肉、结缔组织、血液)、和/或器官(例如脑、肾、肺、心脏、胰腺、前列腺、卵巢、子宫、胃肠道)。

如本发明中使用的术语“含氧量正常”和“常氧”指氧水平正常的状态。典型地，常氧条件指其中吸入气体中氧分压等于海平面上空气中的氧分压的情况，约150mm Hg。常氧条件为95％的空气和5％的CO₂。

如本发明中对于急性失血所使用的术语“预防”(或语法上等同的术语)指延迟或防止急性失血或与急性失血相关的症状或组织病理变化。

如本发明中使用的术语“预防有效量”和“预防有效体积”分别指足够延迟或预防个体发生急性失血的量或体积。例如，预防有效量或预防有效体积可以指向个体施用的本发明血液代用品或药物组合物的量或体积足够提高血容量、恢复血流、恢复组织的氧合水平、恢复血液动力学参数、对抗与急性失血相关的缺氧、增加循环EPO或EPO的合成、恢复红细胞压积水平、恢复血红蛋白水平、稳定HIF-1α、下调NF-κB、减少原红细胞的细胞凋亡事件和/或减少抗红细胞生成的炎症细胞因子的生成。所述预防有效量或预防有效体积还可以指在治疗或控制与急性失血相关的症状或组织病理变化中提供预防益处的本发明的血液代用品或药物组合物的量或体积。进一步，本发明的血液代用品或药物组合物的预防有效量或预防有效体积指单独的所述血液代用品或药物组合物或者与其它治疗联合的量或体积，其在治疗、控制或改善急性失血或与急性失血相关的症状或组织病理变化中提供预防益处。

如本发明中使用的术语“个体”和“患者”可互换地使用。所述个体可以是动物，特别地，所述个体可以是哺乳动物，比如非灵长类例如母牛、猪、马、猫、狗、大鼠和小鼠)或灵长类(例如猴子比如短尾猴、黑猩猩和人)。

如本发明中使用的术语“外科手术”与术语“手术”可互换地使用。引起急性失血的外科手术可涉及任何类型的细胞(例如体细胞、生殖细胞、胚细胞、干细胞)、组织(例如骨骼、肌肉、结缔组织、血液)、和/或器官(例如脑、肾、肺、心脏、胰腺、前列腺、卵巢、子宫、胃肠道)。

如本发明中使用的术语“治疗有效量”和“治疗有效体积”分别指足够向患有急性失血的个体提供一些改善或益处的量或体积。例如，治疗有效量或治疗有效体积可以指向个体施用的本发明血液代用品或药物组合物的量或体积足以提高其血容量、恢复血流、恢复组织的氧合水平、恢复血液动力学参数、对抗与急性失血相关的缺氧、增加循环EPO或EPO的合成、恢复红细胞压积水平、恢复血红蛋白水平、稳定HIF-1α、下调NF-κB、减少原红细胞的细胞凋亡事件和/或减少抗红细胞生成的炎症细胞因子的生成。所述治疗有效量或治疗有效体积也可以指在治疗或控制与急性失血相关的症状或组织病理变化中提供治疗治疗益处的本发明的血液代用品或药物组合物的量或体积。进一步，本发明的血液代用品或药物组合物的治疗有效量或治疗有效体积指单独的所述血液代用品或药物组合物或者与其它治疗联合的量或体积，在治疗、控制或改善急性失血或与急性失血相关的症状或组织病理变化中提供治疗益处。

如本发明中使用的术语“创伤”与术语“损伤”可互换地使用。引起急性失血的创伤可涉及任何类型的细胞(例如体细胞、生殖细胞、胚细胞、干细胞)、组织(例如骨骼、肌肉、结缔组织、血液)、和/或器官(例如脑、肾、肺、心脏、胰腺、前列腺、卵巢、子宫、胃肠道)。

如本发明中与急性失血一起使用的术语“治疗”指减少或消除急性失血或与急性失血相关的症状或组织病理变化。

4.附图说明

图1显示了用基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品和同源血浆治疗的具有33和66％总失血的Coebus猴的红细胞压积(％)。

图2显示了用基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品治疗的或没有治疗的具有66％总失血的兔子的红细胞压积(％)。

图3为用基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品治疗的具有40％总失血的大鼠的血压和组织氧合(pO₂)的图示。

图4显示了用基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品以约1.75g/kg体重(计算的总血容量的25％)治疗镰状细胞贫血患者所获得的汇总数据，包括总血红蛋白(g/dL)、血浆血红蛋白(g/dL)和网织红细胞计数(％)。

图5显示了用基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品以约1.75g/kg体重(计算的总血容量的25％)治疗的镰状贫血患者中EPO的血液水平。

图6显示了在低氧和常氧条件下，浓度为0.1、1.0和1.75g/dL基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品和未修饰的血红蛋白溶液对(A)HIF-1α稳定性和(B)人星形细胞生成的EPO的影响。

图7显示了在低氧和常氧条件下，浓度为0.1、1.0和1.75g/dL的基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品和未修饰的血红蛋白溶液对人星形细胞中抗红细胞生成NF-κB的影响。

5.发明详述

本发明涉及用于治疗或预防急性失血的新方法，所述急性失血优选急性失血性贫血，或更优选由下述原因引起的贫血：(i)由疾病引起的急性失血，(ii)外科手术期间出现的急性失血，或(iii)由创伤引起的急性失血。本发明的方法包括向有需要的个体施用一定量的血液代用品，所述量能有效地提高血容量和对抗与急性失血相关的缺氧，其中所述血液代用品在常氧条件下诱导红细胞生成。更具体地，本发明的方法所用的血液代用品能够(1)如在常氧条件下的细胞培养中试验所示，所述血液代用品能够诱导促红细胞生成素的表达，和/或(2)在常氧条件下，如通过(a)个体红细胞压积或血红蛋白的倍增时间减少来检测，和/或通过(b)个体促红细胞生成素循环水平增加来检测所示，所述血液代用品能够诱导红细胞生成。

本发明还涉及新的药物组合物，其包含在药学可接受的载体中的治疗或预防有效量或有效体积的交联血红蛋白血液代用品，其中在常氧条件下细胞培养中测定时，所述交联血红蛋白血液代用品诱导促红细胞生成素的表达。本发明进一步涉及新的药物组合物，其包含在药学可接受的载体中的治疗或预防有效量或体积的交联血红蛋白，其中所述交联血红蛋白包含与高碘酸-氧化的ATP分子内交联、与高碘酸-氧化的腺苷分子间交联并且与还原型谷胱甘肽偶联的血红蛋白。在细胞培养中试验时，本发明的药物组合物所用的交联血红蛋白血液代用品和交联血红蛋白能够(1)稳定HIF-1α的表达，和/或(2)下调NF-κB。该产品的商标为HEMOTECH^TM，其为包含与邻-腺苷5’-三磷酸盐(o-ATP)、邻-腺苷和还原型谷胱甘肽(GSH)交联的纯牛Hb的交联血红蛋白。关于交联血红蛋白的更详细描述可以在授予Feola等人的美国专利5,439,882中找到，将其全部内容引入作为参考。

本发明涉及用于需要治疗急性失血的个体的方法、药物组合物和试剂盒。特别地，本发明涉及用于患有急性失血性贫血的个体的方法、药物组合物和试剂盒。下面部分更详细地描述(a)可以根据本发明治疗的患者人群(5.1节及其内小节)；(b)本发明所包括的用于急性失血治疗的新方案(5.2节)；和(c)可以在这些及其它治疗中使用的新的药物组合物(5.4节)。

5.1.需要治疗急性失血的个体

贫血为红细胞的数量或血红蛋白的含量低的病症。重度贫血在临床上定义为血红蛋白水平低于7g/dL(The Merck Manual of Diagnosis and Therapy.Section 11：Hematology and Oncology.Chapter 127：Anemias，第849-850页，JohnWiley & Sons；第17版(1999年3月1日))。急性失血性贫血也称为急性出血后贫血，是由快速大出血(急性失血)引起的贫血。因为骨髓的储备有限，大血管的自发性或外伤性破裂或切口(例如主动脉瘤)相关的大出血、损害(例如消化性溃疡、新生物)引起的动脉糜烂或正常止血的失败可以引起贫血。急性失血性贫血的即时效应取决于出血的持续时间和量。

急性失血性贫血与慢性失血性贫血不同，慢性失血性贫血为由长期中度失血引起的小红细胞性贫血。例如，慢性贫血可由胃肠道损伤(例如消化性溃疡、痔疮)或泌尿外科或妇科部位的慢性出血引起。慢性失血性贫血可由红细胞生成缺陷或不足导致小红细胞群，其中循环红血球的平均粒径小于正常值。红细胞生成缺陷或不足可能是缺铁症、铁转运不足和/或铁利用不当或异常的结果。慢性失血性贫血也可以由维生素B₁₂、叶酸盐或维生素C不足引起。慢性失血性贫血还可以由溶血过度引起，溶血过度可以是网状内皮组织的活性过强、免疫学异常、红细胞膜改变、红细胞代谢紊乱、或者血红蛋白合成缺陷(例如镰状细胞贫血)引起。关于急性和慢性失血性贫血的差异的更多讨论可以在The Merck Manual of Diagnosis and Therapy.Section 11：Hematology andOncology.Chapter 127：Anemias，第849-850页，JohnWiley & Sons；第17版(1999年3月1日)中找到，将其全部内容引入本发明作为参考。

急性失血性贫血有许多原因。例如，急性失血性贫血可以由疾病、外科手术或创伤引起。因而，所述个体的急性失血可以：由于如本发明在下述5.1.1节中讨论的疾病引起；如本发明在下述5.1.2节讨论的在外科手术期间出现；或由于如本发明在下述5.1.3节讨论的创伤引起。

在一些实施方案中，所述个体可表现出与急性失血相关的症状，包括但不限于衰弱、头晕、口渴、出汗、虚弱和脉搏加快，以及快速呼吸。在某些其它的实施方案中，所述个体可以表现为似乎没有与急性失血相关的临床症状。

在一些实施方案中，所述个体可表现出与急性失血相关的组织病理变化，包括但不限于缺氧和组织坏死。在某些其它的实施方案中，所述个体可以表现为似乎没有与急性失血相关的临床组织病理变化。

在一些实施方案中，所述个体可将要接受或已经接受一种或多种类型的抗急性失血治疗，其包括，但不限于输血、输注生理盐水或葡萄糖、注射促红细胞生成素。

在一些实施方案中，所述个体患有重度失血或者失血超过33％血容量或血容量的三分之一。在某些其它的实施方案中，所述个体患有中度失血或者失血量为20％至33％的血容量。在某些其它的实施方案中，所述个体患有轻度失血或者失血量低于20％血容量。对于人个体，正常血容量为体重的约8％或约5升。

在一些实施方案中，所述个体的血红蛋白低于10g/dL、9g/dL、8g/dL、7g/dL、5g/dL、4g/dL、3g/dL、2g/dL或更少。在一实施方案中，所述个体的血红蛋白低于7g/dL。

如本发明中使用的术语“个体”和“患者”可互换地使用。所述个体可以是动物。特别地，所述个体可以是哺乳动物，比如非灵长类例如母牛、猪、马、猫、狗、大鼠和小鼠)或灵长类(例如猴子比如短尾猴、黑猩猩和人)。

优选地，所述个体是人。在一实施方案中，所述个体是人类婴儿或早产的人类婴儿。在另一个实施方案中，所述个体是人类儿童。在另一个实施方案中，所述个体是成年人。在另一个实施方案中，所述个体是老年人。如本发明中使用的术语“人类婴儿”指年龄小于24个月、优选小于16个月、小于6个月、小于3个月、小于2个月或小于1个月的人。如本发明中使用的术语“人类儿童”指年龄为24个月至18岁的人。如本发明中使用的术语“成年人”指年龄为18岁或更年长的人。如本发明中使用的术语“老年人”指年龄为55岁或更年长的人。

在某些情况下，所述个体具有免疫缺陷或免疫抑制。例如，所述个体可以是HIV-阳性或AIDS患者。

5.1.1由疾病引起的急性失血

所述个体可以是患有由疾病引起的急性失血。在一实施方案中，所述个体可以患有或诊断患有引起急性失血的疾病。在另一个实施方案中，所述个体可以易感染或具有发展成为下述疾病的危险：由遗传因素(例如家族史)和/或环境因素(例如饮食)导致的可引起急性失血的疾病。

如本发明中使用的术语“病症”与术语“疾病”可互换地使用。引起急性失血的疾病可涉及任何类型的细胞(例如体细胞、生殖细胞、胚细胞、干细胞)、组织(例如骨骼、肌肉、结缔组织、血液)、和/或器官(例如脑、肾、肺、心脏、胰腺、前列腺、卵巢、子宫、胃肠道)。可引起急性失血的疾病实例包括但不限于出血性疾病、溃疡、损伤、血管破裂和动脉瘤破裂。

一些出血性疾病在出生时就存在，由罕见的遗传疾病引起。例如，所述个体可以是缺少凝血蛋白因子VIII(血友病A)或因子IX(血友病B)的血友病患者，因而血液凝固差和/或连续的、不可控制的出血。所述个体可以是已经具有月经并在每次月经期间出血不可控制的女性血友病人(参见，例如Quick等人，Hemophilic condition in a girl.AMA Am J Dis Child.1953Jun；85(6)：698-705)。出血性疾病也可以在某些疾病(例如维生素K不足、严重的肝病、von Willebrand疾病、白血病、骨髓病症、弥漫性血管内凝血、妊娠-伴有子痫、暴露于蛇毒)或治疗(例如，使用抗凝血药比如阿司匹林、肝素或华法林或长期使用抗生素)期间形成。所述个体可以是维生素K不足的新生儿(The Merck Manual of Diagnosis and Therapy.Section 1：Nutritional Disorders.第3章：Vitamin Deficiency，Dependency，And Toxicity，第42页.John Wiley &Sons；第17版(March 1，1999)。

可以在患病之前、期间和/或之后向所述个体施用本发明的血液代用品和药物组合物。可以由有经验的医师使用常规技术根据例如个体失血的程度选择施用血液代用品和药物组合物的时间和量/体积。

5.1.2.外科手术期间出现的急性失血

所述个体可以是在外科手术期间出现急性失血。在一实施方案中，所述个体可能正在进行可引起急性失血的外科手术。在另一个实施方案中，所述个体可计划要进行可引起急性失血的外科手术。在另一个实施方案中，由于遗传因素(例如家族史)和/或环境因素(例如饮食)，所述个体可能容易需要进行可引起急性失血的外科手术或处于需要进行可引起急性失血的外科手术的高风险中。

如本发明中使用的术语“外科手术”与术语“手术”可互换地使用。引起急性失血的外科手术可涉及任何类型的细胞(例如体细胞、生殖细胞、胚细胞、干细胞)、组织(例如骨骼、肌肉、结缔组织、血液)、和/或器官(例如脑、肾、肺、心脏、胰腺、前列腺、卵巢、子宫、胃肠道)。可引起急性失血的外科手术的实例包括但不限于择期外科手术。

存在许多不同类型的外科手术，包括但不限于任选的或择期外科手术、必需的外科手术和紧急或急救外科手术。任选的或择期外科手术是一种选择性进行的操作，其对于继续良好的生活质量可以是非必需的。一种实例是矫形外科手术，该手术涉及肌肉骨胳系统的急性、慢性、外伤性和复发性损伤及肌肉骨胳系统疾病的其它损伤。另一个实例是要除去难看的痣或疣。必需的外科手术是需要进行以保证未来的生活质量的操作。与急救外科手术不同，必需的外科手术未必是必须立即进行的。一个实例是当其它形式的药物和治疗不能起效时通过手术除去肾结石。紧急的或急救外科手术是针对紧急的医学病症比如急性阑尾炎反应而进行的操作。已经有报道，许多外科手术操作都伴有出血或失血的高风险。例如，脑淀粉样血管病(参见，例如Matkovic等人，Surgical risk of hemorrhage in cerebral amyloid angiopathy.Stroke.1991 Apr；22(4)：456-61)；脑动脉瘤的修复(参见，例如Mayberg等人，Guidelines forthe management of aneurysmal subarachnoid hemorrhage.A statement forhealthcare professionals from a special writing group of the Stroke Council，American Heart Association.Stroke.1994 Nov；25(11)：2315-28；Tsutsumi等人，Risk of subarachnoid hemorrhage after surgical treatment of unruptured cerebralaneurysms.Stroke.1999 Jun；30(6)：1 181-4；和Wirth FP.Surgical treatment ofincidental intracranial aneurysms.Clin Neurosurg.1986；33：125-35)；用于动静脉畸形的放射外科手术(参见，例如Friedman等人，The risk of hemorrhage afterradiosurgery for arteriovenous malformations.J Neurosurg.1996 Jun；84(6)：912-9；Hunt等人，Surgical risk as related to time of intervention in the repair ofintracranial aneurysms.J Neurosurg.1968 Jan；28(1)：14-20)；用于后循环动脉瘤的血管内治疗(参见，例如Guglielmi等人，Endovascular treatment of posteriorcirculation aneurysms by electrothrombosis using electrically detachable coils.JNeurosurg.1992 Oct；77(4)：515-24)；增殖性玻璃体视网膜病变(参见，例如Bonnet等人，Surgical risk factors for severe postoperative proliferativevitreoretinopathy(PVR)in retinal detachment with grade B PVR.Graefes ArchClin Exp Ophthalmol.1995 Dec；233(12)：789-91)；脂肪瘤切除(参见，例如Rodriguez等人，Colonic lipoma as a source of massive hemorrhage.Report of acase.Dis Colon Rectum.1990 Nov；33(11)：977-9)；和窦手术(参见，例如Schnipper等人，Management of intracranial complications of sinus surgery.Otolaryngol Clin North Am.2004 Apr；37(2)：453-72，ix)。因而，所述个体可以是正在进行、计划要进行或已经进行脑淀粉样血管病手术；脑动脉瘤修复；治疗动静脉畸形的放射外科手术；后循环动脉瘤的血管内治疗；增殖性玻璃体视网膜病变手术；脂肪瘤切除；或窦外科手术。

可以在外科手术之前、期间和/或之后向个体施用本发明的血液代用品和药物组合物。可以由有经验的医师使用常规技术根据例如个体失血的程度来选择施用所述血液代用品和药物组合物的时间和量/体积。

5.1.3.由创伤引起的急性失血

所述个体可以由创伤引起急性失血。在一实施方案中，所述个体患有或诊断患有可引起急性失血的创伤。在另一个实施方案中，由遗传因素(例如三X染色体综合征)和/或环境因素(例如生活在高犯罪附近地区)，所述个体可能容易遭受引起急性失血的创伤或处于遭受该创伤的高风险中。

如本发明中使用的术语“创伤”与术语“损伤”可互换地使用。引起急性失血的创伤可涉及任何类型的细胞(例如体细胞、生殖细胞、胚细胞、干细胞)、组织(例如骨骼、肌肉、结缔组织、血液)、和/或器官(例如脑、肾、肺、心脏、胰腺、前列腺、卵巢、子宫、胃肠道)。可引起急性失血的创伤的实例包括但不限于烧伤、枪伤和刺伤。

存在许多不同类型的创伤，包括但不限于意外伤害和/或犯罪性损伤。意外伤害是在任何类型的事故中承受的损伤(例如意外死亡、车祸损伤、颈部扭伤、溺水、跌倒、运动损伤、烧伤、机械事故、窒息、自然事故、意外的眼损伤、工伤、玩具相关的损伤)。犯罪性损伤是由犯罪活动(例如虐待孩子、杀人、袭击)引起的损伤。特别是枪伤和刺伤。可以在创伤之前、期间和/或之后向个体施用本发明的血液代用品和药物组合物。可以由有经验的医师使用常规技术根据例如个体失血的程度选择施用血液代用品和药物组合物的时间和量/体积。

5.2.急性失血的治疗

本发明的方法包括向有需要的个体施用一种或多种一定量的血液代用品和/或药物组合物，所述量能有效地提高血容量并对抗与急性失血相关的缺氧。可以根据常氧条件下在细胞培养中诱导促红细胞生成素表达的能力来选择所用的血液代用品。当用于个体时，当通过(a)个体的红细胞压积或血红蛋白的倍增时间减少，或(b)个体的促红细胞生成素循环水平增加来测定时，所述血液代用品在常氧条件下可以显示出增加红细胞生成。特别地，本发明的方法包括给有需要的个体施用治疗或预防有效量或体积的一种或多种分别在下文5.3节(及内小节)和5.4节中讨论的血液代用品和/或药物组合物。本发明提供用于治疗或预防急性失血性贫血的方法。例如，本发明提供用于治疗或预防由于疾病引起的(参见上文5.2.1)或外科手术期间出现的(参见上文5.1.2)或由创伤引起的(参见上文5.1.3)急性失血的方法。

本发明的血液代用品特别地可用于多种原因的急性失血的治疗。首先和最重要的，本发明的血液代用品不仅提高患者的血容量以补偿急性失血期间可引起休克的液体丢失和对抗缺氧，而且在常氧条件下刺激红细胞生成。这对于治疗急性失血的患者非常有利，因为这样的个体有时需要多次输血以补充失血事件期间或之后损失的血液以及改善和/或保持红细胞压积水平。本发明的血液代用品可以以比其它血液代用品和供体血液以更快和更高的速率诱导红细胞生成，因而减少了施用次数。

第二，本发明的血液代用品适于和易于进行急性失血的治疗，因为它不需要测试是否适合输入和接受者的相容性。而且，本发明的血液代用品不会触发与供体血液中存在的免疫组分相关的许多并发症(例如RBC的溶血、过敏性反应、输血相关的急性肺损伤、移植物抗宿主疾病、细菌污染、病毒性疾病的传染等)。

本发明的治疗和预防方法改善了个体血液循环的血液动力学或物理性质的许多方面。更特别地，本发明的方法所用的血液代用品和药物组合物的物理存在可改善个体的血液动力学。例如，本发明的治疗和预防方法提高了个体的血容量。在具体的实施方案中，血容量提高了5％、10％、20％、50％、100％、200％、500％或更多。在具体的实施方案中，血容量提高了0.1升、0.5升、1.0升、1.5升、2.0升或更多。可以使用本领域技术人员公知的方法来测定血容量。例如，可以使用与一次性、小体积血压传感器(Ohmeda，Pte，Ltd，Singapore)相连的导管来测定血容量。

本发明的治疗和预防方法也可以恢复个体的血流量。对于人而言，正常血流量为250至300ml/分钟。在具体的实施方案中，血流量的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％被恢复。可以使用本领域技术人员公知的方法来测定血流量。例如，可以使用与一次性、小体积血压传感器(Ohmeda，Pte，Ltd，Singapore)相连的导管来测定血流量。

本发明的治疗和预防方法也可以恢复个体的组织氧合水平。组织的氧合水平在整个体内是不均匀的。可以通过使组织/器官灌注最大化来改善组织的氧合水平。在具体的实施方案中，组织氧合水平的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％被恢复。可以使用本领域技术人员公知的方法来测定组织的氧合水平。例如，可以通过将DO-166探针的界面与微型计算机(pH-版本6071，Lazar Research Laboratories)和图表记录器(Cardiomax Circulatory System Computer)连接来连续纪录组织的氧合水平。本发明的治疗和预防方法也可以恢复个体的血液动力学参数。血液动力学参数包括，但不限于心输出量(CO；ml/min)；心脏指数(CI，ml/min/100g体重)、心搏量(SV；ml/搏动/100g体重)、平均动脉压(MAP；mmHg)、脉压(PP；mrnHg)、心率(HR；搏动/分钟)、总外周围阻力(TPR；(dyn/min/cm^-5)×10³)和血液温度。对于人而言，正常心输出量为每分钟5至6升；正常心脏指数为2.5至4升/分种；正常心搏量为60至130ml/搏动；正常平均动脉压为70至90mm Hg；正常脉压为20至60mm Hg；正常心率为60至100次搏动/分钟；正常总外周围阻力为770至1500dyn/min/cm^-5；和正常血液温度为37℃。在具体的实施方案中，一种或多种血液动力学参数的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％被恢复。可以使用本领域技术人员公知的方法来测定血液动力学参数。例如，使用全自动的Cardiomax Circulatory SystemComputer(Columbus Instruments，Columbus，OH)来测定血液动力学参数。本发明的治疗和预防方法也对抗个体的与急性失血相关的缺氧。在具体的实施方案中，缺氧被减少了5％、10％、20％、50％、100％、200％、500％、1000％或更多。可以使用本领域技术人员公知的方法来测定缺氧。例如，可以使用组织氧合水平作为指标来测定缺氧。

本发明的治疗和预防方法也可以逆转个体的出血性休克。出血性休克的特征在于心脏指数降低66％、平均动脉压降低约67％、TPR显著性增加、和组织的氧合作用减少78％。

本发明的治疗和预防方法也可以改善个体促红细胞生成素的内源性生成，所述促红细胞生成素负责个体红细胞生成(即红细胞产生)。例如，本发明的治疗和预防方法可以增加个体的EPO或EPO的合成。促红细胞生成素(EPO)是一种由肾脏中的特定细胞生成的糖蛋白(46kD)激素，其调节骨髓中红细胞的生成。在具体的实施方案中，循环EPO或EPO的合成增加了5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、500％、1000％或更多。在具体的实施方案中，所述循环EPO水平增加了5mU/ml、10mU/ml、20mU/ml、50mU/ml、100mU/ml、150mU/ml、200mU/ml或更多。可以使用本领域技术人员公知的方法测定循环EPO水平和EPO的合成。例如，可以使用高度特异性Quantikine In Vitro Diagnostic Human Erythropoietin ELISA(R& P Systems Inc.，Minneapolis，MN)或EPO-Trac ¹²⁵I RIA试剂盒(INCSTARCorp.now Dia Sorin S.p.A.，Sallugi，Italy)在细胞培养上清液中测定循环EPO水平和EPO的合成。

本发明的治疗和预防方法也可以恢复个体的红细胞压积水平。红细胞压积为以百分数表示的红细胞体积与全血体积的比例，其对包含血浆游离血红蛋白的血液样品中红细胞生成是有效指征。对于成年男性，正常红细胞压积为47±5％，对于成年女性，其为42±5％(The Merck Manual of Diagnosis andTherapy.Section 11：Hematology and Oncology.Chapter 127：Anemias，第854页.John Wiley & Sons；第17版(March 1，1999))。在具体的实施方案中，红细胞压积水平的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％被恢复。可以使用本领域技术人员公知的方法来测定红细胞压积。例如，可以使用肝素化的微红细胞压积毛细管(Fisher Scientific，Houston，TX)和微红细胞压积离心机(Damon ICE Division，Needham，MA)来测定红细胞压积。

本发明的治疗和预防方法也可以恢复个体的血红蛋白水平。血红蛋白为红细胞(RBC)中含铁的氧转运金属蛋白。对成年男性，正常血红蛋白为16±2g/dL，对于成年女性，其为14±2g/dL(The Merck Manual of Diagnosis andTherapy.Section 11：Hematology and Oncology.Chapter 127：Anemias，第854页.John Wiley & Sons；第17版(March 1，1999))。在具体的实施方案中，血红蛋白水平的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％被恢复。可以使用本领域技术人员公知的方法来测定血红蛋白。例如，可以使用HemoCue B-Hemoglobin Photometer(HemoCue Corp.，Angelholm，Sweden)来测定血红蛋白。

本发明的治疗和预防方法也可以稳定个体的HIF-1α的表达。在具体的实施方案中，HIF-1α的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％被稳定。可以使用本领域技术人员公知的方法来测定HIF-1α的稳定。可以使用基于高通量TransAM ELISA的检测(Active Motif，Carlsbad，CA)来测定HIF-1α的稳定。

本发明的治疗和预防方法也可以下调个体的NF-κB的表达。在具体的实施方案中，NF-KB表达的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％被下调。可以使用本领域技术人员公知的方法来测定NF-κB的活化。例如，可以使用TransAM^TM NF-κBp65转录因子分析试剂盒(ActiveMotif，Carlsbad，CA)来测定NF-κB的活化。

本发明的治疗和预防方法也可以减少个体的原成红细胞的细胞凋亡。在具体的实施方案中，原红细胞的细胞凋亡减少了5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。可以使用本领域技术人员公知的方法来测定细胞凋亡事件。例如，可以分别使用Annexin V-FITC和碘化丙啶荧光探针(Sigma Chemical)来评价早期和晚期的凋亡事件。

本发明的治疗和预防方法也可以减少个体的抗红细胞生成的炎症细胞因子的生成。抗红细胞生成的炎症细胞因子包括但不限于TNF-α、TGF-β1、IL-1、IL-6等。在具体的实施方案中，一种或多种抗红细胞生成的炎症细胞因子的生成减少了5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。可以使用本领域技术人员公知的方法来测定抗红细胞生成的炎症细胞因子的生成。例如，可以使用TNF-α人EIA试剂盒(Cayman Chemical，Ann Arbor，MI)来测定TNF-α，可以使用人TGF-β1 Quantikine Immunoassay(R & DSystems)来测定TGF-β1。

如本发明中使用的术语“有效量”和“有效体积”分别指在对于施用一种或多种本发明的血液代用品和/或药物组合物的个体而言，所述量或体积足够提高血容量、恢复血流、恢复组织的氧合水平、恢复血液动力学参数、对抗与急性失血相关的缺氧、增加循环EPO或EPO的合成、恢复红细胞压积水平、恢复血红蛋白水平、稳定HIF-1α、下调NF-κB、减少原成红细胞的细胞凋亡事件和/或减少抗红细胞生成的炎症细胞因子的生成。

如本发明中使用的术语“治疗有效量”和“治疗有效体积”分别指能够给患有急性失血的个体提供一些改善或益处的量和体积。例如，治疗有效量或治疗有效体积可以指对于施用一种或多种本发明的血液代用品和/或药物组合物的个体而言，所述本发明的血液代用品和/或药物组合物的量和体积足够提高血容量、恢复血流、恢复组织的氧合水平、恢复血液动力学参数、对抗与急性失血相关的缺氧、增加循环EPO或EPO的合成、恢复红细胞压积水平、恢复血红蛋白水平、稳定HIF-1α、下调NF-κB、减少原成红细胞的细胞凋亡事件和/或减少抗红细胞生成的炎症细胞因子的生成。所述治疗有效量或治疗有效体积也可以指在治疗或控制与急性失血相关的症状或组织病理变化中能够提供治疗益处的本发明的血液代用品或药物组合物的量或体积。进一步，本发明的血液代用品或药物组合物的治疗有效量或治疗有效体积指在治疗、控制或改善急性失血或与急性失血相关的症状或组织病理变化中提供治疗益处的单独的或与其它治疗联合的所述血液代用品或药物组合物的量或体积。

如本发明中使用的术语“预防有效量”和“预防有效体积”分别指有效延迟或防止个体出现急性失血的量和体积。例如，预防有效量或预防有效体积可以指对于施用本发明的血液代用品或药物组合物的个体而言，所述量或体积足够提高血容量、恢复血流、恢复组织的氧合水平、恢复血液动力学参数、对抗与急性失血相关的缺氧、增加循环EPO或EPO的合成、恢复红细胞压积水平、恢复血红蛋白水平、稳定HIF-1α、下调NF-κB、减少原成红细胞的细胞凋亡事件和/或减少抗红细胞生成的炎症细胞因子的生成。所述预防有效量或预防有效体积也可以指在预防或处理与急性失血相关的症状或组织病理变化中提供预防益处的本发明的血液代用品或药物组合物的量或体积。进一步，本发明的血液代用品或药物组合物的预防有效量或预防有效体积指在治疗、控制或改善急性失血或与急性失血相关的症状或组织病理变化中提供预防益处的单独的或与其它治疗联合的所述血液代用品或药物组合物的量或体积。

如本发明对于急性失血所使用的术语“治疗”(或语法上等同的术语)指减少或消除急性失血或与急性失血相关的症状或组织病理变化。

如本发明对于急性失血所使用的术语“预防”(或语法上等同的术语)指延迟或预防急性失血或与急性失血相关的症状或组织病理变化。

治疗或预防有效量或体积以及给药频率将随急性失血的类型和严重性或与急性失血相关的症状或组织病理变化而改变。所述治疗或预防有效量或体积及给药频率也将随要治疗的个体而改变。例如，所述治疗或预防有效量或体积及给药频率将根据个体的年龄、性别、体重和反应而改变。

在具体的实施方案中，向患有急性失血的个体施用的本发明血液代用品或药物组合物的总日用量为1g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g、20g、50g、100g、200g、500g、1000g或更多。在一个优选的实施方案中，向患有急性失血的个体施用的本发明血液代用品或药物组合物的总日用量为7g至700g，优选7g至低于122.5g，或大于122.5g至700g，以单剂量或分剂量给药。

在具体的实施方案中，向患有急性失血的个体施用的本发明血液代用品或药物组合物的总日用体积为0.01升、0.05升、0.1升、0.2升、0.5升、1.0升1.5升、2.0升或更多。在一个优选的实施方案中，向患有急性失血的个体施用的本发明血液代用品或药物组合物的总日用量为0.1升至1升，优选0.6升，以单剂量或分剂量给药。

将对本领域技术人员显而易见的是，在一些情况中使用这些数字或范围之外的量和体积可能是必需的。

治疗过程的持续时间可以是至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少7周、至少10周、至少13周、至少15周、至少20周、至少6个月或至少1年。在一些实施方案中，本发明的血液代用品或药物组合物可以施用一段时期直到急性失血停止或被控制或者当急性失血的症状部分或完全消失。

本发明的血液代用品和药物组合物可以作为食品补充剂施用6个月或者按照Dietary Supplement Health and Education Act(DSHEA)或其它政府或工业规定推荐的使用期。进一步，人们注意到营养学家、饮食学专家、临床医师或治疗医师将懂得如何和何时结合个体患者的反应中断、调节或停止使用本发明的血液代用品和药物组合物作为药物或食品补充剂。

本发明的血液代用品和药物组合物可以与任何其它常规治疗模式一起使用，所述治疗模式比如但不限于输血、输注生理盐水或葡萄糖、注射促红细胞生成素。

在一些实施方案中，顺序施用一种或多种本发明的血液代用品和/或药物组合物。在某些其它的实施方案中，同时施用一种或多种本发明的血液代用品和/或药物组合物。

可以通过本领域技术人员公知的任何方法定期监测本发明方法的治疗和预防效果。例如，可以在治疗后1周、2周、3周或4周测定治疗后个体的血容量、与急性失血相关的缺氧、红细胞压积水平、血红蛋白水平、血液动力学参数、血流量、组织氧合水平、循环EPO水平、EPO的合成、HIF-1α的表达、NF-κB的表达、原红细胞的细胞凋亡事件、抗红细胞生成的炎症细胞因子水平和/或一般性的健康、身体健康和/或情感健康。可以在治疗过程之前、期间和/或之后，每天、每周、每两周、每月或每年进行医生随访。

5.3.血液代用品

本发明的血液代用品优选无病原体、无毒性、非免疫原性、非致热的和具有长期的贮存期限。

特别地，本发明的方法和药物组合物所用的血液代用品能够(1)如在常氧条件下的细胞培养中试验所示，所述血液代用品能够诱导促红细胞生成素的表达，和/或(2)在常氧条件下，如通过(a)个体红细胞压积或血红蛋白的倍增时间减少来检测，和/或通过(b)个体促红细胞生成素循环水平增加来检测所示，所述血液代用品能够诱导红细胞生成。显示出这些特征的任何血液代用品都可以用于本发明的方法和药物组合物。

显示出上述特征的任何血液代用品，包括已知的和/或市售获得的血液代用品都可以用于本发明的方法和药物组合物。例如，发现本发明所用的良好的血液代用品为交联血红蛋白，其包含与邻-腺苷5’-三磷酸盐(o-ATP)、邻-腺苷和还原型谷胱甘肽(GSH)交联的纯牛Hb(例如HEMOTECHT^M，其可提高血容量和对抗与急性失血相关的缺氧，以及(1)在常氧条件下在细胞培养中试验，诱导促红细胞生成素的表达，和/或(2)通过(a)个体的红细胞压积或血红蛋白的倍增时间减少，或(b)个体的促红细胞生成素循环水平增加来测定，在常氧条件下诱导红细胞生成。已知其它的血液代用品，比如如上讨论的HEMASSIST^TM(Baxter Healthcare，Round Lake，IL)，HEMOLINK^TM(Hemosol，Inc.，Toronto，Canada)，OPTRO^TM(Somatogen，Boulder，CO)，

(Biopure Inc.，Cambridge，MA)，

(NorthfieldLaboratories Inc.，Evanston，IL)和

(Sangart，Inc.，San Diego，CA)(其从过期的人血液中采集，并与聚乙二醇(PEG)结合以除去游离血红蛋白的毒性)和

(SynZyme Technologies，LLC，Irvine，CA)(其由血红蛋白载体和CNO复合物组成)在常氧条件下不能诱导红细胞生成。然而，预期它们适于诱导生成内源性促红细胞生成素，促红细胞生成素在个体中刺激红细胞生成。在一些实施方案中，在常氧条件下在细胞培养中测定，本发明的方法和药物组合物所用的血液代用品能够诱导促红细胞生成素的表达。在具体的实施方案中，促红细胞生成素被诱导表达其基准水平的5％或更少、10％、20％、50％、100％、200％、500％或更多。可以通过本领域技术人员众所周知的任何方法来测定促红细胞生成素的表达。

在一些实施方案中，通过个体的红细胞压积的倍增时间减少测定，本发明的方法和药物组合物所用的血液代用品能够在常氧条件下诱导红细胞生成。在具体的实施方案中，个体的红细胞压积的倍增时间被减少了5％或更少、10％、20％、50％、100％、200％、500％或更多。在具体的实施方案中，个体的红细胞压积的倍增时间减少了6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、20天或更长。在具体的实施方案中，个体的红细胞压积的倍增时间少于30天、20天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、1天、12小时或6小时。在一个优选的实施方案中，个体的红细胞压积的倍增时间少于3天。可以通过本领域技术人员众所周知的任何方法来测定个体的红细胞压积的倍增时间。

在一些实施方案中，通过个体的血红蛋白的倍增时间减少测定，本发明的方法和药物组合物所用的血液代用品能够在常氧条件下诱导红细胞生成。在具体的实施方案中，个体的血红蛋白的倍增时间减少了5％或更少、10％、20％、50％、100％、200％、500％或更多。在具体的实施方案中，个体的血红蛋白的倍增时间减少了6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、20天或更长。在具体的实施方案中，个体的血红蛋白的倍增时间为少于30天、20天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、1天、12小时或6小时。在一个优选的实施方案中，个体的血红蛋白的倍增时间为7天。可以通过本领域技术人员众所周知的任何方法来测定个体的血红蛋白的倍增时间。

在一些实施方案中，通过个体的促红细胞生成素循环水平的增加来测定，本发明的方法和药物组合物所用的血液代用品能够在常氧条件下诱导红细胞生成。在具体的实施方案中，个体的促红细胞生成素循环水平增加了5％或更少、10％、20％、50％、100％、200％、500％或更多。在具体的实施方案中，个体的促红细胞生成素循环水平增加了5mU/ml、10mU/ml、20mU/ml或更多。在具体的实施方案中，个体的促红细胞生成素循环水平为20mU/ml、50mU/ml、100mU/ml、200mU/ml、500mU/ml、1000mU/ml或更多。在一个优选的实施方案中，个体的促红细胞生成素循环水平为15+5mU/ml。可以通过本领域技术人员众所周知的任何方法来测定个体的促红细胞生成素循环水平。

根据本发明的一个方面，所述血液代用品为在下述5.3.1节中讨论的交联血红蛋白或在下述5.4节中讨论的新的组合物。

5.3.1.交联血红蛋白

本发明的交联血红蛋白包括，但不限于在授予Feola等人的美国专利5,439,882中描述的那些，将其全部内容引入本发明作为参考。特别地，本发明的交联血红蛋白包括HEMOTECH^TM。

所述交联血红蛋白包含与高碘酸氧化的ATP(o-ATP)分子内交联和与高碘酸氧化的腺苷(邻-腺苷)分子间交联形成多聚血红蛋白的血红蛋白。

在本发明的交联血红蛋白中的血红蛋白和高碘酸氧化的ATP的摩尔比可以为1:1至1:3，或其中的任何范围。

在本发明的交联血红蛋白中的血红蛋白和高碘酸氧化的腺苷的摩尔比可以为1:11至1:10，或其中的任何范围。

在本发明的交联血红蛋白中的血红蛋白和高碘酸氧化的ATP的摩尔比可以为1:1至1:3，或其中的任何范围，并且血红蛋白和高碘酸氧化的腺苷的摩尔比为1:1至1:10，或其中的任何范围。

在本发明的交联血红蛋白中的血红蛋白进一步与还原型谷胱甘肽偶联。加入还原型谷胱甘肽终止了血红蛋白与高碘酸-氧化的腺苷的交联反应。

在具体的实施方案中，在本发明的交联血红蛋白中的血红蛋白和还原型谷胱甘肽的摩尔比为1:1至1:20，或其中的任何范围。

可以通过本领域技术人员公知的任何方法(参见，例如授予Feola等人的美国专利5,439,882)将高碘酸-氧化的ATP、高碘酸-氧化的腺苷交联到血红蛋白上。

优选地，所述血红蛋白为牛血红蛋白。然而，在本发明中也可以使用其它来源的血红蛋白。优选地，本发明的交联血红蛋白包括少于约50％、30％、20％、10％、5％、1％或更少或不包括高铁血红蛋白。

本发明的交联血红蛋白优选地具有约130至390千道尔顿的分子量，更优选约190至260千道尔顿的分子量，最大超过1000千道尔顿的分子量。

所述血红蛋白、高碘酸-氧化的ATP、高碘酸-氧化的腺苷和还原型谷胱甘肽可以从商业来源(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)获得，或者根据在授予Feola等人的美国专利5,439,882中描述的方法制备，将其全部内容引入本发明作为参考。

本发明的交联血红蛋白可以溶于非电解的水溶液中。可以加入到本发明交联血红蛋白的水溶液中的非电解质的实例为人白蛋白、不同的血浆部分和血浆。然而，也可以使用药学可接受的且不会干扰本发明交联血红蛋白的载氧功能的任何非电解质，比如葡聚糖和羟乙基淀粉。

本发明的交联血红蛋白可以通过包括但不限于在授予Feola等人的美国专利5,439,882中描述的那些方法来制备，将其全部内容引入本发明作为参考。

例如，通过包括下述步骤的方法制备本发明的交联血红蛋白：

(a)将全血分离成白细胞-红细胞混合物、血小板和血浆，将如此获得的混合物悬浮在水溶液中；(b)冷却包含白细胞-红细胞混合物的水溶液以凝聚白细胞和除去白细胞聚集体，获得基本上不含白细胞的溶液；

(c)用低渗溶液透析基本上不含白细胞的溶液以从基本上不含白细胞的溶液中的红细胞提取血红蛋白，在流体静力压增加下超滤，从基本上不含白细胞溶液中的萃取血红蛋白中分离红细胞，获得提萃取的血红蛋白溶液；

(d)将提取的血红蛋白溶液中的提取血红蛋白转化成羧基-血红蛋白，得到羧基-血红蛋白溶液；

(e)对该羧基-血红蛋白溶液进行巴氏杀菌，使非血红素蛋白变性并沉淀出来；

(f)从羧基-血红蛋白溶液中除去磷脂和沉淀的非血红素蛋白；

(g)通过亲合层析从羧基-血红蛋白溶液中除去内毒素；

(h)浓缩在羧基-血红蛋白溶液中的羧基-血红蛋白至浓度为约10g/dL，得到浓缩的羧基-血红蛋白溶液；

(i)使浓缩的羧基-血红蛋白溶液中的羧基-血红蛋白与o-ATP反应，主要形成羧基-血红蛋白分子内交联，从而获得分子内交联的羧基-血红蛋白溶液；

(j)使o-ATP羧基-血红蛋白与一定量的邻-腺苷反应，所述量有效地引起羧基-血红蛋白分子间交联，从而获得分子间和分子内交联的羧基-血红蛋白溶液，向该分子间和分子内交联的羧基-血红蛋白溶液中加入谷胱甘肽以终止邻-腺苷交联反应；和

(k)将分子间和分子内交联的羧基-血红蛋白溶液中的交联的羧基-血红蛋白转化成交联的氧-血红蛋白。

在一个具体的实施方案中，在步骤(a)中，通过离心全血从血小板和血浆中分离出白细胞-红细胞混合物。在另一个具体的实施方案中，在步骤(b)中，通过过滤除去白细胞的聚集。在另一个具体的实施方案中，在步骤(f)中，通过溶剂萃取从羧基-血红蛋白溶液中除去磷脂和沉淀的非血红素蛋白。在另一个具体的实施方案中，在步骤(h)中，通过用大致张力正常的溶液透析来浓缩浓的羧基-血红蛋白溶液。

5.4.药物组合物和试剂盒

本发明还涉及新的药物组合物，其包含一定浓度或体积的可在本发明的方法中或其它治疗方法中使用的血液代用品。例如，这样的新的组合物可以包含在药学可接受的载体中的7g至低于122.5g的治疗有效量的交联血红蛋白血液代用品，其中在常氧条件下在细胞培养中测定，所述交联血红蛋白血液代用品诱导促红细胞生成素的表达。可选地，所述组合物可以包含在药学可接受的载体中的治疗有效量的交联血红蛋白血液代用品，所述治疗有效量为从大于122.5g至700g，其中在常氧条件下在细胞培养中测定，所述交联血红蛋白血液代用品诱导促红细胞生成素的表达。另一方面，所述组合物可以包含在药学可接受的载体中的治疗有效体积的交联血红蛋白血液代用品，所述治疗有效体积为少于0.6升，其中在常氧条件下在细胞培养中试验，所述交联血红蛋白血液代用品诱导促红细胞生成素的表达。

其它新的药物组合物包含在药学可接受的载体中的治疗有效量的交联血红蛋白，所述治疗有效量为7g至低于122.5g，其中所述交联血红蛋白为与高碘酸-氧化的ATP分子内交联、与高碘酸-氧化的腺苷分子间交联和与还原型谷胱甘肽偶联的血红蛋白。可选地，所述组合物可以包含在药学可接受的载体中的治疗有效量的交联血红蛋白，其中所述治疗有效量为大于122.5g至700g，其中所述交联血红蛋白为与高碘酸-氧化的ATP分子内交联、与高碘酸-氧化的腺苷分子间交联和与还原型谷胱甘肽偶联的血红蛋白。在另一个实施方案中，所述组合物可包含在药学可接受的载体中的治疗有效体积的交联血红蛋白，所述治疗有效体积为少于0.6升，其中所述交联血红蛋白为与高碘酸-氧化的ATP分子内交联、与高碘酸-氧化的腺苷分子间交联和与还原型谷胱甘肽偶联的血红蛋白。

在一些实施方案中，当在细胞培养中测定时，本发明的药物组合物中所用的交联血红蛋白血液代用品和交联血红蛋白稳定了HIF-1α的表达。在具体的实施方案中，当在细胞培养中测定时，本发明的药物组合物中所用的交联血红蛋白血液代用品和交联血红蛋白稳定5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的HIF-1α的表达。

在某些其它的实施方案中，当在细胞培养中试验时，本发明的药物组合物中所用的交联血红蛋白血液代用品和交联血红蛋白下调NF-κB的表达。在具体的实施方案中，当在细胞培养中测定时，本发明的药物组合物中所用的交联血红蛋白血液代用品和交联血红蛋白下调5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的NF-κB表达。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物中所用的交联血红蛋白包含摩尔比为1:1至1:3的血红蛋白和高碘酸氧化的ATP。在一些实施方案中，本发明的药物组合物中所用的交联血红蛋白包含摩尔比为1:1至1:10的血红蛋白和高碘酸氧化的腺苷。在一些实施方案中，本发明的药物组合物中所用的交联血红蛋白包含摩尔比为1:1至1:20的血红蛋白和还原型谷胱甘肽。在一些实施方案中，本发明的药物组合物中所用的交联血红蛋白包含摩尔比为1:1至1:3的血红蛋白和高碘酸氧化的ATP；摩尔比为1:1至1:10的血红蛋白和高碘酸-氧化的腺苷；和摩尔比为1:1至1:20的血红蛋白和还原型谷胱甘肽。

本发明的药物组合物中可以使用表现出这些特征的上述5.3节中的任何交联血红蛋白血液代用品和交联血红蛋白。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物中所用的交联血红蛋白溶于非电解的水溶液中。

所述药物组合物可以进一步包含甘露醇和/或电解质。本发明的药物组合物中可使用的电解质包含但不限于钠、钾、钙和镁阳离子、和氯酸根、碳酸氢根、葡糖酸根和硫酸根阴离子。

在具体的实施方案中，本发明的药物组合物包含约1g或更少、5g、10g、15g、20g、25g、30g、40g、50g、60g、70g、80g、90g、100g、150g、200g、300g、500g、1000g、2000g或更多的血液代用品。在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含约7g至低于约122.5g的血液代用品。在另一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含约122.5g至约700g的血液代用品。

在具体的实施方案中，本发明的药物组合物包含约0.1升或更少、0.2升、0.3升、0.4升、0.5升、0.6升、0.7升、0.8升、0.9升、1.0升、2.0升、5.0升、10.0升或更多的血液代用品。在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含约少于0.6升的血液代用品。

本发明的药物组合物可被用于本发明的方法以及任何其它的方法中，所述其它的方法包括但不限于治疗慢性失血性贫血(例如镰状细胞贫血)。

可以通过本领域技术人员众所周知的任何方法来施用本发明的药物组合物。施用本发明的药物组合物的方法包括但不限于胃肠外(例如皮下、肌内、眶内、囊内、脊柱内、胸骨内、静脉内、真皮内、腹膜内、门静脉内)、硬膜外和粘膜(例如鼻内)给药。

在一些实施方案中，肠胃外施用所述药物组合物。当肠胃外施用药物组合物时，可以提供无菌水或生理盐水的安瓿剂以便施用前可以混合各成分。在具体的实施方案中，本发明的药物组合物通过输注施用。在另一个具体的实施方案中，本发明的药物组合物通过注射、优选通过静脉注射施用。

本发明的药物组合物可以被配制成单元剂型，包括但不限于固体剂、胶囊剂、片剂、凝胶剂等。本发明的药物组合物也可以被配制成在密闭容器比如安瓿或小袋(sachette)中的无水冻干粉剂或无水浓缩物。

本发明的药物组合物可以在包括一个或多个容器的试剂盒中提供。每个容器可以包含相同的或不同的药物组合物。

所述试剂盒可以进一步包括用于注射药物组合物的针或注射器，优选以无菌形式包装，和/或包装的酒精垫。任选地包括用于临床医师或患者给药本发明的恶血液代用品和药物组合物的说明。

虽然前述说明书和附图仅仅阐述了本发明的原理，应当理解可以对其进行多种添加、修饰和取代。特别地，对本领域技术人员明然的是，在不背离本发明的精神或基本特征下，本发明可以表现为其它的具体形式、结构、方案、比例和含有其它的元素、原料和组分。另外，本发明描述的特征可以单独或与其它的特征组合使用。因此，本发明公开的实施方案被认为在各方面都是说明性而非限制性的，本发明的范围通过附加的权利要求来表明而不限于前述说明书。

6.实施例

提供下述实施例以描述本发明的具体实施方案，并不意味着以任何方式限制本发明的范围。

6.1.实施例1-用基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品治疗处于生命受威胁的贫血中的灵长类，增加了其体内的红细胞压积

6.1.1.方法

根据以前在科学文献(Feo1a等人(1988)Circulatory Shock 25：275-290)中报道的方法，在四组Coebus猴(每组六只)中进行试验，每只猴被抽出等于计算血容量的三分之一(33％)和三分之二(66％)的血液，接着输注同容量的10g/dL血红蛋白-ATP-腺苷-GSH血液代用品。

在该试验中，使用同源的血浆代替血液代用品作为对照。肌内注射12.5mg/kg的盐酸氯胺酮使重量为4至5kg的健康雄性猴子镇静。将无菌16-gauge聚四氟乙烯导管皮下插入股动脉和一个股静脉。没有施用肝素。允许动物自然呼吸室内空气。在制剂稳定后，将猴子分配到下述处理组之一：(I)从股动脉抽出三分之一(33％)的理论总血容量，通过静脉管灌注来用等体积的基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH血液代用品(约2.3g/kg体重)代替；(II)从股动脉抽出三分之二(66％)的理论总血容量，通过静脉管灌注用等体积的基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH血液代用品(约4.6g/kg体重)代替；(III)从股动脉抽出三分之一(33％)的理论总血容量，并通过静脉管灌注用等体积的同源血浆代替；和(IV)从股动脉抽出三分之二的(66％)的理论总血容量，并通过静脉管灌注用等体积的同源血浆代替。

在基线、除去血液后和在输注基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品和同源血浆后1、2、4、5、7、9、11、14、16、18、20、22和24天采集血样，检测红细胞压积，其为包含血浆游离血红蛋白的血样中红细胞生成的最有效的指征。红细胞压积为压缩红细胞的体积与全血体积之比，以百分数表示。使用肝素化的微红细胞压积毛细管(Fisher Scientific，Houston，TX)和微红细胞压积离心机(Damon ICE Division，Needham，MA)来测定红细胞压积。

6.1.2.结果

组I、II和III的所有动物都从处理中存活下来，而组IV中一只动物在24小时内死亡。

如图1所示，在抽出三分之一和三分之二的理论总血容量后，红细胞压积分别下降至约30％(Hb为约9g/dL)和13％(血红蛋白为约4.5g/dL)。在补充三分之一的理论总血容量(组I)后约3.5天和补充三分之二的理论总血容量(组II)后约8.5天，施用基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品使红细胞压积回到基准值。相反，用同源血浆处理的动物不能快速使红细胞压积正常化。在接受33％的补充输注血浆的组III中，红细胞压积在约10天后回到正常值，在接受66％的补给输血的组IV中，红细胞压积在约24天后达到基准值。

然而在接受66％替代治疗的血液代用品组(II)中，红细胞压积在不到3天就翻倍，在用同源血浆处理的组IV中，存活的动物的红细胞压积在约10天翻倍。

6.1.3.结论

甚至在生命受威胁的失血(66％)情况下，施用基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品也使红细胞量非常快地恢复至正常值。该血液代用品使对急性失血性贫血的自然的红细胞生成反应加快超过两倍。假定该血液代用品的循环半衰期为约24小时，该产品不仅在初始复苏期作为载氧体，而且也是红细胞生成反应的有效激活剂。

用其它血液代用品试验性处理患有生命受威胁性贫血的住院病人的报道中，甚至在用大剂量的重组体EPO同时治疗的情况下，红细胞压积的倍增时间为10至24天(Lanzinger等人(2005)Can J Anaesth 52(4)：69-373；Gannon等人(2002)30(8)：1893-1895；Allison等人(2004)97(12)：1257-1258)。

因为在正常情况下，红细胞生成(从多能干细胞到RBC)在5天内发生，用目前检测的血液代用品产品(由EPO支持)得到的结果是临床上不可接受的，表明这些血红蛋白对骨髓细胞有直接毒性作用。

相反，单独用基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品处理后，红细胞压积的倍增时间少于3天，表明该血液代用品产品具有真实、唯一和直接的红细胞生成潜能。

6.2.实施例2-用基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品治疗处于生命受威胁的贫血的兔子，增加了其体内的红细胞压积

6.2.1.方法

根据以前在科学文献(Feola等人(1988)Surg Gynecol Obstet 166：211-222；Simoni等人(1990)Biomat Art Cells Art Org 18(2)189-202)中报道的方法，在用1％的利多卡因的局部麻醉下，将无菌插管插入十二只4.0kg体重的新西兰兔子的一只耳朵的中央动脉和另一只耳朵的marglobal静脉中。

在固定后，抽出兔子的三分之一(33％)理论总血容量，15分钟后，接着再抽出三分之一(33％)。所述试验兔子(n＝6)接受输注与总失血(约4.6g/kg体重)相同体积的基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品。另6只动物在出血后没有接受处理，一小时内，所有的这些动物都死亡。所有接受输注血液代用品的实验组动物都存活下来。

在基线、抽血后和输注基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品1、2、4、7、9和14天后采集血样。如实施例1检测血样。

6.2.2.结果-结论

如图2所示，在抽出三分之二的理论总血容量后，红细胞压积降至约9.5％(血红蛋白为约4.0g/dL)。施用基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品在约8.5天恢复了其基准红细胞压积。在兔子中，甚至在生命受威胁(66％)的失血后，施用基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品还使红细胞量非常快地恢复至正常值。红细胞压积的倍增时间为约3天。在兔子中，这些血液代用品产品不仅仅在初始复苏期充当载氧体，还是红细胞生成的有效激活剂。

6.3.实施例3-用基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品使患有生命受威胁的贫血的正常血压的大鼠复苏后，大鼠血液动力学和组织氧合

6.3.1.方法

根据以前文献Simoni等人(1996)ASAIO J 42(5)：M773-782)中报道的注射戊巴比妥钠和进行无菌显微手术操作的方法，将350-450gm重的十只雄性正常血压的Sprague-Dawley大鼠(Charles River，Kingston，NY)腹膜内施用30mg/kg体重的戊巴比妥钠麻醉，并进行无菌显微手术操作。

为了获取血液动力学值和采集参照样本，外科手术暴露左和右股动脉、左股静脉和外颈静脉，并插入聚乙烯导管(模型PE-50，Becton Dickinson andCo.，Parsippany，NJ)。通过位于右股动脉且与一次性、小体积血压传感器(Ohmeda，Pte，Ltd，Singapore)相连的的导管进行动脉血压的连续测定。为了测定心输出量(CO)，将thermostat microprobe(模型IF，O.D.为1/3mm；ColumbusInstruments，Columbus，OH)推进穿过颈动脉进入升主动脉，同时在室温下，经由置于外颈静脉中的导管将100μl的盐溶液注射到右心房。为了测定组织氧合(tpO₂)，通过外科手术将DO-166氧显微探针(Lazar Research Laboratories，LosAngeles，CA)插入股二头肌(biceps femori muscle)(右腿)中。在整个试验中，用加热板使血液温度维持在37±0.1℃下。所有的动物自然的呼吸。

通过使用全自动的Cardiomax Circulatory System Computer(ColumbusInstruments，Columbus，OH)记录血液动力学参数，包括心输出量(CO；ml/min)；心脏指数(CI；ml/min/100g体重)、心搏量(SV；ml/搏动/100g体重)、平均动脉压(MAP；mmHg)、脉压(PP；mmHg)、心率(HR；搏动/分钟)、总外周阻力(TPR；(dyn/sec/cm^-5)×10³)和血液温度。通过将DO-166探针的界面与Microcomputer(pH-版6071，Lazar Research Laboratories)和CardiomaxCirculatory System Computer的图表记录器连接获得组织氧合的连续记录。

用血红蛋白的量(克)乘以已知的氧饱和度和1.36(一克完全饱和的血红蛋白的载氧量)计算动脉血的氧含量(在100ml血液中的O₂(ml))。用CO(L/min)乘以动脉血的氧转运(ml/100ml血液)和校正因子10来计算血液的氧转运(ml02/min)。

在完成外科手术准备和校准Cardiomax系统后，指定30分钟用于稳定血液动力学和组织氧含量参数。按体积相当于40％总血容量(经计算，对每只大鼠而言等于按千克计体重的7％)或2.8g/kg体重抽出动脉血诱导出血性休克。在5分钟内完成血液的抽出。出血性休克持续30分钟。然后，用与总失血相同体积的基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品处理这些大鼠。在约10分钟内完成处理。然后，在处理后90分钟期间研究所有的大鼠。在试验结束时，通过静脉内给予戊巴比妥钠杀死大鼠。

6.3.2.结果

总结在下面(表1)和图3中的结果显示出在抽血后，TPR增加，CI、MAP和组织pO₂降低，然后TPR立即还原成正常值，CI、MAP和组织pO₂快速正常化。而且，在整个处理后期间可观察到血管舒张和较好的组织氧合。

表1

6.3.3.结论

该试验表明可以用基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品成功地治疗特征为心脏指数降低约66％、平均动脉压降低约67％、TPR显著性增加、和组织氧合降低约78％的出血性休克。出血后血管扩张活性和血管收缩的降低主要与腺苷相关，其具有血管扩张和抗炎性质，在我们的技术(授予Feola、Simoni和Canizaro的美国专利5,439,882)中用作分子间交联剂和血红蛋白表面修饰剂。该试验也证实用基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品治疗，通过使组织/器官灌注最大化而改善了组织氧合。

向局部缺血的器官递送适当的氧是管理部门批准这些试剂作为血液代用品的主要原因。在体内向局部缺血的组织和器官递送氧最大化不会阻断红细胞生成反应，如在图1、图2、图3、图4、图5和图6A & B中所示。

6.4.实施例四-用基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品处理镰状细胞贫血患者的红细胞生成作用

6.4.1.方法

如以前在科学文献(Feola等人(1992)Surg Gynecol Obstet 174(5)：379-386)中报道的，在人中检测基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品。在Kinshasa的Center for Sickle Cell Anemia治疗一组九名患者。5名男性和4名女性，4-13岁。五名孩子存在重度贫血，血液的血红蛋白水平为5g/dL或更少。四名孩子具有较轻程度的贫血，血红蛋白水平为约8g/dL，但具有“镰状细胞危象”，即手部和足部(2名患者)、左肺(1名患者)和脾(1名患者)存在急性微血管堵塞。所述患者存在疼痛、发热和全身不适及虚弱。

静脉注射体积相当于总血容量25％(经计算对每名患者而言为以千克计体重的7％)、约1.75g/kg体重的基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品。一名患有重度贫血和初始血红蛋白为3.5g/dL的患者在连续两天接受两次输注。

在施用血液代用品期间和之后2小时，每15分钟测定生命特征、温度、脉搏、呼吸和血压。在施用血液代用品两小时前和两小后的期间测定尿排出量。检测尿中存在的血红蛋白。

在施用血液代用品之前、之后立即、施用后两小时和施用后5天中的每天采集血样。检测患者血液中的血浆游离血红蛋白、总血红蛋白和网织红细胞。

将小体积的EDTA血浆保存在-20℃下，之后进行促红细胞生成素水平的测定。用EPO-Trac ¹²⁵I RIA试剂盒(INCSTAR Corp.now Dia Sorin S.p.A.，Sallugi，Italy)检测EPO。所述INCSTAR EPO-Trac ¹²⁵I RIA过程是竞争性结合放射免疫分析，其利用重组体人促红细胞生成素作为示踪剂和标准品。在该分析中，EPO的最小可检测浓度为5.5mU/mL。由Company进行的干扰研究证实严重的溶血(血红蛋白为约4g/dL)似乎不受EPO-Trac-RIA的干扰。结果用血浆的mU/ml表示。

6.4.2.结果

没有一个患者出现过敏性反应，所有患者的健康都得到改善。发热减弱、脉搏变快、血压保持稳定和脉压增加，表现出血管舒张(表2)。

表2

 

血压(mmHg)	处理前	处理后	显著性
				收缩压	108±10	107±8	N.S
舒张压	65±6	58±6	P<0.02

如图4所示，基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品在5天期间逐渐将总血红蛋白从全组平均值约6.3±2.0提高至约10.9±1.3g/dL(p<0.001)，倍增时间为约7天。

如图4所示，总血红蛋白的增加与网织红细胞从约3.7±3.1显著增加至44.2±7.2％(p<0.001)相关。

如图5所示，用基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH血液代用品进行治疗显著地增加了EPO循环水平。在1天后，EPO水平上升约1.6倍，在第3天，达到最大浓度约210mU/ml。在第5天，EPO的水平仍稍高于基线值。

用基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品进行治疗使得总血红蛋白最终恢复正常值。该血液代用品加速了EPO的合成，导致网织红细胞的大量生成。

这表明基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品不仅提供了对RBC的即刻补充，而且刺激EPO的合成，加速了新的RBC的生成。该刺激仅被记录了5天。

6.4.3.结论

总之，向患有生命受威胁的贫血的人施用显著体积的血红蛋白-ATP-腺苷-谷胱甘肽-基血液代用品不产生毒性或过敏性反应，改善了其一般状态和刺激患者的红细胞生成反应。

6.5.实施例5-使用人星形细胞作为模型，在常氧和缺氧下，基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品对促进红细胞生成的因子、HIF-1α稳定和EPO的生成的影响

6.5.1.方法

为了评价基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品是否具有HIF-1α(已知其为EPO基因的诱导物)稳定剂的作用，我们评价了该血液代用品对能够生成EPO的人星形细胞的作用。

特征性地，EPO，一种红细胞生成的主要激活剂是由胎儿的肝和成年人肾产生的。最近，已经发现了新的产生EPO的部位：中枢神经系统。在中枢神经系统中，星形细胞是应答缺氧/局部缺血的EPO的主要产生者(Siren AL，Knerlich F，Poser W，Gleiter CH，Bruck W，Ehrenreich H：Erythropoietin anderythropoietin receptor in human ischemic/hypoxic brain.ActaNeuropathol(Berl)101(3)：271-276，2001；Sasaki R：Pleiotropic functions oferythropoietin.Int Med 42(2)：142-149，2003)。

在星形细胞中，HIF-1α调节EPO的表达。EPO似乎起保护神经元免受低氧/局部缺血应激的神经保护作用。EPO诱导的神经保护是基于促凋亡(proapoptotic)Bel家族成员Bad的磷酸化作用。因为EPO受体在神经元中表达，EPO通过激活神经元的EPO受体可抑制神经元中缺氧-诱导的细胞凋亡(Variano M，Dello Russo C，Pozzoli G，Battagia A，Scambia G，Tringali G，Aloe-Spiriti MA，Preziosi P，Navarra P：Erythropoietin exerts anti-apoptotic effectson rat microglial cells in vitro.Eur J Neurosci 16(4)：684-692，2002)。

因为EPO在红细胞生成中的主要功能是拯救红细胞的祖细胞避免细胞凋亡(Socolovsky等人(1999)Cell 98(2)：181-91；Dolznig等人(2002)Curr Biol12(13)：1076-1085)，我们认为星形细胞模型是研究血液代用品对HIF-1α命运和EPO合成的影响的最好的人细胞体系。

常氧

第2代正常人星形细胞的初始培养物从Clonetics(Bio-Wittaker，A CambrexCo，San Diego，CA)获得。在湿润的5％ CO₂的气氛和37℃的温度下，将细胞培养在75cm²的装有BulletKit培养基(Clonetics)的组织培养瓶(Corning GlassWorks，Corning，NY)中，直到它们发生融合(约50,000细胞/cm²)。然后，将星形细胞传代培养在6孔细胞培养板(Corning)和盖玻片中。使用胰蛋白酶试剂包(Clonetics)进行细胞传代。在转移过程中，星形细胞受胰蛋白酶作用不超过5分钟。使用第四至第六代细胞进行所有的试验。所述星形细胞之前已被检测HIV、肝炎、支原体、细菌、酵母菌、真菌阴性；和检测GFAP阳性以及CD68和CNPase染色阴性(Clonetics Certificate of Analysis)。

然后，用培养基孵育融合的星形细胞约18小时，所述培养基添加有最终浓度为0.1、1.0和1.75g/dL的基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品。用培养基培养阳性对照星形细胞，所述培养基添加有最终浓度为0.1、1.0和1.75g/dL的未修饰的血红蛋白。在不存在血红蛋白溶液下，用FBS代替其培养阴性对照星形细胞。

所有试验都在95％空气的气氛(代表常氧条件)下进行。处理后，用多种生化和分子生物学方法进行细胞的评价。

使用高通量基于TransAM ELISA的分析(Active Motif，Carlsbad，CA)，在细胞核提取物中测定在常氧条件下基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品对HIF-1α稳定的影响及其诱导人EPO基因的能力。在该试验中，用包含来自人EPO基因的缺氧效应元件(5’-TACGTGCT-3’)的寡核苷酸孵育96-孔板。使用Nonident P-40和补充有DTT和蛋白酶抑制剂混合物(Active Motif)的细胞溶解缓冲液从活的星形细胞获得核提取物。进行核提取物中HIF-1α的检测。HIF-1α存在于结合人EPO基因的核提取物中，并且可以结合第一抗体。然后，HRP-结合的第二抗体识别第一抗体，提供灵敏的比色分析读数。使用3550-UV微板读数器(BioRad)在450nm读取反应。用每2.5μg的核提取物在450nm的OD表示结果。使用制造商提供的COS-7核提取物作为HIF-1α活化和结合EPO基因的阳性对照。

使用高特异性QuantikineIn Vitro Diagnostic Human ErythropoietinELISA(RScD Systems Inc.，Minneapolis，MN)在细胞培养上清液中评价所述血红蛋白-ATP-腺苷-GSH-基-血液代用品对EPO合成的影响。该试验是基于双-抗体夹层法。用对人EPO特异性的单克隆抗体预包被微板孔，然后用细胞培养上清液或人EPO标准品孵育。在孵育和洗涤后，用HRP连接的抗-EPO多克隆抗体孵育各小孔。在第二次孵育期间，所述抗体-酶连接物结合已固定的EPO。在洗涤后，加入色素原形成蓝色络合物。产生的颜色的量与样品或标准品中EPO的含量成正比。结果用mU/mL表示。该检测方法的最低可检测的EPO剂量可低于0.6mU/ml。

缺氧

在湿润可变的有氧工作站获得低氧条件(1.5％的O₂、93.5％的N₂和5％的CO₂)。在试验前，在1.5％的氧水平预平衡培养基过夜。

在预平衡的培养基存在下，将如上培养的融合的星形细胞暴露于缺氧(1.5％的O₂)下约18小时，其中所述培养基补充有最终浓度为0.1、1.0和1.75g/dL的基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品。用预平衡的培养基培养阳性对照星形细胞，其中所述培养基补充有最终浓度为0.1、1.0和1.75g/dL的未修饰的血红蛋白。在不存在血红蛋白溶液下，用FBS代替培养阴性对照星形细胞。

所有的步骤都在1.5％的O₂、95.5％的N₂和5％的CO₂的气氛(代表低氧条件)下于黑暗中进行。在暴露后，如下评价细胞：

1)如上所述，用Trans AM ELISA方法，评价基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品对HIF-1α稳定的作用及其诱导人EPO基因的能力，和

2)如上所述，用Quantikine IVD human EPO ELISA评价在缺氧下所述基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品对EPO合成的影响。

6.5.2.结果

基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品和未修饰的血红蛋白溶液对促进红细胞生成的因子、HIF-1α和EPO的作用显示在表3和4及图6和7中。

表3给出了在低氧和常氧条件下，所述血红蛋白-ATP-腺苷-GSH-基-血液代用品和未修饰的血红蛋白溶液对HIF-1α的稳定性及其结合EPO基因的影响。

表3

表4给出了在低氧和常氧条件下，所述血红蛋白-ATP-腺苷-GSH-基-血液代用品和未修饰的血红蛋白溶液对EPO生成的影响。

表4

6.5.3.结论

该研究表明HIF-1α可以在低氧和常氧条件下的星形细胞的核提取物中找到。而且，该研究表明在低氧和常氧的环境中，检测的血红蛋白溶液对HIF-1α的稳定、核转运和结合EPO基因具有不同的影响。

如在图6A和表3中所示，未修饰的血红蛋白溶液增加了HIF-1α的细胞质的降解，并显著地降低了(在较高的剂量)其结合EPO基因的活性，特别是在低氧下。在含氧量正常的或低氧条件下，未修饰的血红蛋白溶液没有稳定HIF-1α。

相反，在两种氧气的条件下，所述基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品增加了HIF-1α的诱导。该血液代用品以剂量依赖性方式稳定HIF-1α和加速其结合EPO基因。在常氧和低氧下，任何试验浓度的该血液代用品都能稳定HIF-1α。该产品在1.0-1.75g/dL的剂量下最有效。这样的转录作用表明加速了红细胞生成反应。

实际上，如图6B和表4所示，在常氧的和低氧条件下，该血液代用品有效地增加了EPO的生成。所述红细胞生成作用可在任何试验浓度下观察到。所述基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品作为有效的促红细胞生成因子起作用。

所述未修饰的血红蛋白阻断EPO的合成，表明抑制红细胞生成。可观察到该作用在较高的血红蛋白浓度下更有效。

6.6.实施例6-使用人星形细胞作为模型，在常氧和缺氧下，基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品对抗-促红细胞生成的因子、NF-κB、TNF-α和TGF-β1及细胞凋亡的作用

6.6.1.方法

因为已知人星形细胞可生成炎症细胞因子，比如TNF、IL-1、IL-6、TGF-β1，它们起抗-红细胞生成剂的作用(Hellwing-Burgel等人(1999)Am Soc Hematol94：1561-1567；Linch DC(1989)Schweiz Med Wochenschr 119(39)：1327-1328；Trey等人(1995)Crit Rev Oncol Hematol 21：1-8；Yuen等人(2005)ASAIO J51(3)：236-241)，所以我们选择人细胞模型来研究血液代用品的抗炎功效及其对HIF-1α的稳定性和EPO诱导的影响(Van Wagoner等人(1999)J Neurosci19(13)：5236-5244；Oh等人(1999)J Neurovirol 5(1)：82-94；Flanders等人(1998)Prog Neurobiol 54(1)：71-85)。

如背景技术部分所述，未修饰的和修饰的血红蛋白溶液具有强的促细胞凋亡作用(Meguro等人(2001)J Neurochem 77(4)：1128-1135；Simoni等人(2002)ASAIO J 48(2)：193；Goldman等人(1998)Am J Physiol 275(3 Pt2)：H1046-53)；D′Agnillo等人(2001)Blood 98(12)：3315-3323；Mohara等人(2005)ASAIO J 51(3)：288-295)。

由于EPO的主要功能是保护原成红细胞免于细胞凋亡(Socolovsky等人(1999)Cell 98(2)：181-91；Dolznig等人(2002)Curre Biol 12(13)：1076-1085)，已有记录输注的血红蛋白直接接触骨髓细胞成红细胞(Shum等人(1996)ArtifCells Blood Substit Immobil Biotechnol 24(6)：655-683)，因此，我们认为重要的是评价血液代用品的促细胞凋亡和抗-红细胞生成作用。

常氧

如实施例5所述，使用人星形细胞模型进行这些试验。所有试验都在代表常氧条件的95％空气和5％ CO₂的气氛下进行。简单地说，在培养基中孵育融合的星形细胞约18小时，所述培养基添加有最终浓度为0.1、1.0和1.75g/dL的基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品。用培养基培养阳性对照星形细胞，所述培养基添加有最终浓度为0.1、1.0和1.75g/dL的未修饰的血红蛋白。在不存在血红蛋白溶液下，用FBS代替其培养阴性对照星形细胞。

处理后，用多种生化和分子生物学方法进行细胞评价。

使用TransAM^TMNF-κB p65 transcription Factor Assay试剂盒(Active Motif，Carlsbad，CA)在细胞核提取物中检测NF-κB的核活化和NF-κB的DNA结合。该方式是检测和定量NF-κB活化的第一种基于ELIS的方法，其包含96-孔板，在其上存在含有NF-κB共有位点(5′-GGGACTTTCC-3’)的固定的寡核苷酸。在该研究中，用该寡核苷酸与存在于核提取物中的NF-κB的活化形式，一种p65异源二聚体，一起培养。使用制造商提供的全溶解缓冲液从活细胞获得核提取物，所述全溶解缓冲液包含DTT和蛋白酶抑制剂混合物。向该完全结合缓冲液中补充DTT和鲱鱼精液DNA。在培养后，形成的DNA-蛋白质复合物结合第一抗体，该抗体识别p65上的表位。仅仅当NF-κB被激活和结合DNA时，所述DNA-蛋白质复合物才能结合该第一抗体。然后，用抗p65的HRP-结合的第二抗体识别该反应，并使用联苯胺衍生物和过氧化氢进行显色。使用微板读数器，Bio-Rad Model 3550-UV在450nm读取该反应。结果以每2.5μg的全细胞提取物在450nm的OD表示。将制造商提供的HeLa全细胞提取物作为NF-κB活化和DNA结合的阳性对照。

用市售获得的ELISA试剂盒检测具有抗-红细胞生成活性的促炎细胞因子(TNF-α和TGF-β1)的生成。

使用TNF-α人EIA试剂盒(Cayman Chemical，Ann Arbor，MI)检测TNF-α。该检测是基于使用人TNF-α的单克隆抗体的双-抗体“夹心”技术。用该抗体包被微滴定孔，抗体与加入孔中的任何人TNF-α结合。然后，将乙酰胆碱酯酶(AchE)：Fab’连接物加入到所述孔中，所述孔选择性结合人TNF-α分子的表位。将所述“夹心”固定在板上，洗除过量的试剂。通过用Ellman′s试剂测定AchE的酶活性和用微板读数器(Bio-Rad Model 3550-UV)进行分光光度测量来确定分析物的浓度。结果用pg/mL表示。

用Human TGF-β1 Quantikine Immunoassay测定TGF-β1以确定活化的人TGF-β1在细胞培养的上清液、血清和血浆中的浓度(R&D Systems)。在该研究中，通过酸活化和中和，将在细胞培养上清液中无活性的TGF-β1转变成免疫活性形式。然后，使用具有固定的TGF-β可溶性受体的微板分析TGF-β1。在培养和洗涤后，加入第二抗体-酶试剂，其与底物产生颜色，该颜色与最初步骤中结合的TGF-β1的量成正比。TGF-β1的浓度用pg/mL表示。

细胞凋亡。在该研究中，星形细胞生长在盖玻片上并暴露于所述基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品中，分别使用Annexin V-FITC和碘化丙啶荧光探针(Sigma Chemical)评价星形细胞初期和晚期的细胞凋亡事件。Annexin V-FITC是一种结合磷脂酰丝氨酸的探针，作为绿色荧光被检测。碘化丙啶结合细胞的DNA，并产生红色荧光。在细胞凋亡的初期阶段，磷脂不对称损失导致通常在膜内部才能发现的磷脂酰丝氨酸易位至膜的外部。因此，如果在膜外可获得磷脂酰丝氨酸，则Annexin与之结合，标志细胞凋亡过程开始。相反，用碘化丙啶检测导致细胞DNA片段化的细胞凋亡的进展。用荧光显微镜评价结果。

低氧

在实施例6中，在湿润可变的需氧工作站获得低氧条件(1.5％的O₂、93.5％的N₂和5％的CO₂)。

在添加有最终浓度为0.1、1.0和1.75g/dL基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品的预平衡的培养基的存在下，将如上培养的融合的星形细胞暴露于低氧(1.5％的O₂)下约18小时。用添加有最终浓度为0.1、1.0和1.75g/dL的未修饰的血红蛋白的预平衡的培养基，培养阳性对照星形细胞。在不存在血红蛋白溶液中，用FBS代替其培养阴性对照星形细胞。

如上，所有的步骤都在1.5％的O₂、93.5％的N₂和5％的CO₂的气氛(表示低氧条件)下于黑暗中进行。在暴露后，如上所述对细胞进行评价：

1)如上所述，使用Trans AM^TM NF-κBp65转录因子分析试剂盒(ActiveMotif)，在核细胞提取物中分析NF-κB的核的活化和DNA结合，

2)如上所述，使用市售获得的ELISA试剂盒分析具有抗红细胞生成活性的促炎细胞因子(TNF-α和TGF-β1)的生成，和

3)如上所述，分析初期和晚期的细胞凋亡。

6.6.2.抗炎作用-结果/结论

表5

表6

如图7所示，在所有试验浓度和氧含量下，所述基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品都抑制了NF-κB的活化。相反，未修饰的血红蛋白以剂量依赖性方式活化NF-κB诱导。在常氧条件下更趋向于该效果。

如表5和6所示，在两种检测的氧气条件下，所述基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品以剂量依赖性方式抑制TGF-β1的形成，并且不会增加TNF-α的生成，TNF-α是最强的抗红细胞生成剂。这一作用可能与该血液代用品不诱导NF-κB相关。

然而，所述未修饰的血红蛋白溶液，特别是当以较高的浓度(1和1.75g/dL)给予时，增加了两种抗红细胞生成剂TGF-β1和TNF-α的生成。

实施例6中描述的试验表明所述基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品具有抗炎潜能，而未修饰的血红蛋白具有促炎症反应的性质。

因为高活性的NF-κB途径参与抑制红系细胞-特异的基因，TGF-β1阻断红系祖细胞的分化，TNF-α抑制HIF-1α结合EPO基因，有理由认为所述基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品的抗炎性质起到促红细胞生成因子的作用。

6.6.3.抗细胞凋亡作用-结果/结论

在常氧条件下的对照星形细胞没有显示出任何促细胞凋亡反应。荧光分析显示出没有Annexin的表面结合，也没有碘化丙啶的核聚积，这可以解释为不存在初期和晚期的细胞凋亡事件。缺氧导致Annexin V-FITC在星形细胞的表面上累积。该结果是磷脂酰丝氨酸易位至膜的外部的指标，其出现在细胞凋亡的初期。

用未修饰的血红蛋白处理星形细胞，在常氧条件下导致初期细胞凋亡，而在缺氧条件下导致进展的细胞凋亡。在暴露于未修饰的血红蛋白溶液的低氧星形细胞中的碘化丙啶累积是质膜受损和DNA片段化的结果。较高浓度的未修饰的血红蛋白引起更严重的毁坏性作用。

所述基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品在任何试验浓度或氧含量下都没有诱导细胞凋亡反应。

由于EPO作为促红细胞生成剂的主要功能是保护原红细胞不发生细胞凋亡，基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品加快HIF-1α介导的EPO生成，所以该血液代用品不会干扰EPO的功能。相反，具有高促细胞凋亡潜能的未修饰的血红蛋白溶液，特别是在较大的浓度下，可以起到抗红细胞生成剂的作用。

6.6.4.结论

如在美国专利5,439,882中描述的，用ATP、腺苷和GSH化学/药理学修饰血红蛋白得到改进的血液代用品产品，其通过稳定HIF-1α和随后的EPO诱导而具有血管扩张活性和良好的组织氧合能力及红细胞生成活性。该血液代用品产品的抗炎和抗细胞凋亡潜能加速了红细胞生成反应。

这一在高浓度(克/kg体重)下表现出促红细胞生成潜能的血液代用品产品可以作为初始治疗以保持组织氧合，并作为再治疗通过刺激患者的红细胞生成反应使红细胞压积正常化。

基于血红蛋白-ATP-腺苷-GSH的血液代用品治疗不需要昂贵的重组EPO的支持。

6.7.(预言性)实施例7-治疗个体的急性失血

6.7.1.试验设计1

将诊断患有急性失血性贫血的人个体分成A组和B组，各组的男性和女性、成年人和儿童的数量相等。

在一定时期内用本发明的血液代用品处理A组的个体，在相同的时期内给予B组的个体安慰剂血液代用品。

在治疗期间和治疗后，测定并比较个体的红细胞压积水平、血红蛋白水平、促红细胞生成素循环水平和血液动力学参数。

6.7.2.试验设计2

给予在外科手术期间失血超过33％血容量的第一组人个体本发明的血液代用品。给予在外科手术期间失血超过33％血容量的第二组人个体常规输血。两组具有相等数量的男性和女性，成年人和儿童。

在外科手术期间和外科手术后，测定并比较个体的红细胞压积水平、血红蛋白水平、促红细胞生成素循环水平和血液动力学参数。

6.7.3.试验设计3

给予由于创伤(例如枪伤、车祸)引起失血超过33％血容量的第一组人个体本发明的血液代用品。给予由于相同类型的创伤导致失血超过33％血容量的第二组人个体常规输血。两组具有相等数量的男性和女性，成年人和儿童。

随后，测定并比较个体的红细胞压积水平、血红蛋白水平、促红细胞生成素循环水平和血液动力学参数。

本发明的范围不受本发明描述的具体实施方案的限制。事实上，根据上述说明和附图，除了本发明中描述的之外，本发明的多种改变对本领域技术人员是显而易见的。这样的改变应被认为落入所附权利要求的范围内。

本发明引用了多种出版物，将其公开的全部内容引入本发明作为参考。

Claims (121)

1.用于治疗个体急性失血性贫血的方法，包括给有需要的个体施用有效量的血液代用品，以提高所述个体的血容量和对抗与急性失血性贫血相关的缺氧，其中在常氧条件下的细胞培养中试验时，所述血液代用品诱导促红细胞生成素的表达。

2.用于治疗个体急性失血性贫血的方法，包括给有需要的个体施用有效量的血液代用品，以提高所述个体的血容量和对抗与急性失血性贫血相关的缺氧，其中通过所述个体的红细胞压积或血红蛋白的倍增时间减少来检测，所述血液代用品在常氧条件下诱导红细胞生成。

3.用于治疗个体急性失血性贫血的方法，包括给有需要的个体施用有效量的血液代用品，以提高所述个体的血容量和对抗与急性失血性贫血相关的缺氧，其中通过所述个体的促红细胞生成素循环水平的增加来检测，所述血液代用品在常氧条件下诱导红细胞生成。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述急性失血为重度。

5.权利要求4的方法，其中所述个体的失血超过33％。

6.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述急性失血为中度。

7.权利要求6的方法，其中所述个体的失血为20％至33％。

8.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述急性失血为轻度。

9.权利要求8的方法，其中所述个体的失血少于20％。

10.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述个体为人。

11.权利要求10的方法，其中所述个体的血红蛋白低于7g/dL。

12.用于治疗个体中急性失血性贫血的方法，包括给有需要的个体施用有效量的交联血红蛋白血液代用品，以提高所述个体的血容量和对抗与急性失血性贫血相关的缺氧，其中在常氧条件下的细胞培养中试验时，所述交联血红蛋白血液代用品诱导促红细胞生成素的表达。

13.用于治疗个体的急性失血性贫血的方法，包括给有需要的个体施用有效量的交联血红蛋白血液代用品，以提高个体的血容量和对抗与急性失血性贫血相关的缺氧，其中通过所述个体的红细胞压积或血红蛋白的倍增时间减少来检测，所述交联血红蛋白血液代用品在常氧条件下诱导红细胞生成。

14.用于治疗个体的急性失血性贫血的方法，包括给有需要的个体施用有效量的交联血红蛋白血液代用品，以提高所述个体的血容量和对抗与急性失血性贫血相关的缺氧，其中通过所述个体的促红细胞生成素循环水平增加来检测，所述交联血红蛋白血液代用品在常氧条件下诱导红细胞生成。

15.权利要求12-14中任一项的方法，其中所述急性失血为重度。

16.权利要求15的方法，其中所述个体的失血超过33％。

17.权利要求12-14中任一项的方法，其中所述急性失血为中度。

18.权利要求17的方法，其中所述个体的失血为20％至33％。

19.权利要求12-14中任一项的方法，其中所述急性失血为轻度。

20.权利要求19的方法，其中所述个体的失血少于20％。

21.权利要求12-14中任一项的方法，其中所述个体为人。

22.权利要求21的方法，其中所述个体的血红蛋白低于7g/dL。

23.用于治疗个体急性失血性贫血的方法，包括给有需要的个体施用治疗有效量的交联血红蛋白，其中所述交联血红蛋白包含的血红蛋白：

(a)与高碘酸氧化的ATP分子内交联；

(b)与高碘酸氧化的腺苷分子间交联；和

(c)与还原型谷胱甘肽偶联。

24.权利要求23的方法，其中所述急性失血为重度。

25.权利要求24的方法，其中所述个体的失血超过33％。

26.权利要求23的方法，其中所述急性失血为中度。

27.权利要求26的方法，其中所述个体的失血为20％至33％。

28.权利要求23的方法，其中所述急性失血为轻度。

29.权利要求28的方法，其中所述个体的失血少于20％。

30.权利要求23的方法，其中所述个体为人。

31.权利要求30的方法，其中所述个体的血红蛋白低于7g/dL。

32.权利要求23的方法，其中所述交联血红蛋白中血红蛋白和高碘酸氧化的ATP的摩尔比为1:1至1:3。

33.权利要求23的方法，其中在所述交联血红蛋白中血红蛋白和高碘酸氧化的腺苷的摩尔比为1:1至1:10。

34.权利要求23的方法，其中在所述交联血红蛋白中血红蛋白和还原型谷胱甘肽的摩尔比为1:1至1:20。

35.用于治疗个体在外科手术期间发生的失血的方法，该方法包括给有需要的个体施用有效量的血液代用品，以提高所述个体的血容量和对抗与急性失血性贫血相关的缺氧，其中在常氧条件下的细胞培养中试验时，所述血液代用品诱导促红细胞生成素的表达。

36.用于治疗个体在外科手术期间发生的失血的方法，该方法包括给有需要的个体施用有效量的血液代用品，以提高所述个体的血容量和对抗与急性失血性贫血相关的缺氧，其中通过所述个体的红细胞压积或血红蛋白的倍增时间减少来检测，所述血液代用品在常氧条件下诱导红细胞生成。

37.用于治疗个体在外科手术期间发生的失血的方法，该方法包括给有需要的个体施用有效量的血液代用品，以提高所述个体的血容量和对抗与急性失血性贫血相关的缺氧，其中通过所述个体的促红细胞生成素循环水平增加来检测，所述血液代用品在常氧条件下诱导红细胞生成。

38.权利要求35-37中任一项的方法，其中所述急性失血为重度的。

39.权利要求38的方法，其中所述个体的失血超过33％。

40.权利要求35-37中任一项的方法，其中所述急性失血为中度。

41.权利要求40的方法，其中所述个体的失血为20％至33％。

42.权利要求35-37中任一项的方法，其中所述急性失血为轻度。

43.权利要求42的方法，其中所述个体的失血少于20％。

44.权利要求35-37中任一项的方法，其中所述个体为人。

45.权利要求44的方法，其中所述个体的血红蛋白低于7g/dL。

46.权利要求35-37中任一项的方法，其中所述外科手术为择期外科手术。

47.用于治疗个体在外科手术期间发生的失血的方法，该方法包括给有需要的个体施用有效量的交联血红蛋白血液代用品，以提高所述个体的血容量和对抗与急性失血性贫血相关的缺氧，其中在常氧条件下的细胞培养中试验时，所述交联血红蛋白血液代用品诱导促红细胞生成素的表达。

48.用于治疗个体在外科手术期间发生的失血的方法，该方法包括给有需要的个体施用有效量的交联血红蛋白血液代用品，以提高所述个体的血容量和对抗与急性失血性贫血相关的缺氧，其中通过个体的红细胞压积或血红蛋白的倍增时间减少来检测，所述交联血红蛋白述血液代用品在常氧条件下诱导红细胞生成。

49.用于治疗个体在外科手术期间发生的失血的方法，该方法包括给有需要的个体施用有效量的交联血红蛋白血液代用品，以提高所述个体的血容量和对抗与急性失血性贫血相关的缺氧，其中通过所述个体的促红细胞生成素循环水平增加来检测，所述交联血红蛋白血液代用品在常氧条件下诱导红细胞生成。

50.权利要求47-49中任一项的方法，其中所述急性失血为重度。

51.权利要求50的方法，其中所述个体的失血超过33％。

52.权利要求47-49中任一项的方法，其中所述急性失血为中度。

53.权利要求52的方法，其中所述个体的失血为20％至33％。

54.权利要求47-49中任一项的方法，其中所述急性失血为轻度。

55.权利要求54的方法，其中所述个体的失血少于20％。

56.权利要求47-49中任一项的方法，其中所述个体为人。

57.权利要求56的方法，其中所述个体的血红蛋白低于7g/dL。

58.权利要求47-49中任一项的方法，其中所述外科手术为择期外科手术。

59.治疗个体在外科手术期间发生的失血的方法，该方法包括给有需要的个体施用治疗有效量的交联血红蛋白，其中所述交联血红蛋白包含的血红蛋白：

(a)与高碘酸氧化的ATP分子内交联；

(b)与高碘酸氧化的腺苷分子间交联；和

(c)与还原型谷胱甘肽偶联。

60.权利要求59的方法，其中所述急性失血为重度。

61.权利要求60的方法，其中所述个体的失血超过33％。

62.权利要求59的方法，其中所述急性失血为中度。

63.权利要求62的方法，其中所述个体的失血为20％至33％。

64.权利要求59的方法，其中所述急性失血为轻度。

65.权利要求64的方法，其中所述个体的失血少于20％。

66.权利要求59的方法，其中所述个体为人。

67.权利要求66的方法，其中所述个体的血红蛋白低于7g/dL。

68.权利要求59的方法，其中所述交联血红蛋白中血红蛋白和高碘酸氧化的ATP的摩尔比为1:1至1:3。

69.权利要求59的方法，其中所述交联血红蛋白中血红蛋白和高碘酸氧化的腺苷的摩尔比为1∶1至1∶10。

70.权利要求59的方法，其中所述交联血红蛋白中血红蛋白和还原型谷胱甘肽的摩尔比为1:1至1:20。

71.权利要求59的方法，其中所述外科手术为择期外科手术。

72.用于治疗个体由创伤引起的失血的方法，该方法包括给有需要的个体施用有效量的血液代用品，以提该高个体的血容量和对抗与急性失血性贫血相关的缺氧，其中在常氧条件下的细胞培养中试验时，所述血液代用品诱导促红细胞生成素的表达。

73.用于治疗个体由创伤引起的失血的方法，该方法包括给有需要的个体施用有效量的血液代用品，以提高所述个体的血容量和对抗与急性失血性贫血相关的缺氧，其中通过所述个体的红细胞压积或血红蛋白的倍增时间减少来检测，所述血液代用品在常氧条件下诱导红细胞生成。

74.用于治疗个体由创伤引起的失血的方法，该方法包括给有需要的个体施用有效量的血液代用品，以提高所述个体的血容量和对抗与急性失血性贫血相关的缺氧，其中通过所述个体的促红细胞生成素循环水平增加来检测，所述血液代用品在常氧条件下诱导红细胞生成。

75.权利要求72-74中任一项的方法，其中所述急性失血为重度。

76.权利要求75的方法，其中所述个体的失血超过33％。

77.权利要求12-14中任一项的方法，其中所述急性失血为中度。

78.权利要求77的方法，其中所述个体的失血为20％至33％。

79.权利要求72-74中任一项的方法，其中所述急性失血为轻度。

80.权利要求79的方法，其中所述个体的失血少于20％。

81.权利要求72-74中任一项的方法，其中所述个体是人。

82.权利要求81的方法，其中所述个体的血红蛋白低于7g/dL。

83.用于治疗个体由创伤引起的失血的方法，该方法包括给有需要的个体施用有效量的交联血红蛋白血液代用品，以提高所述个体的血容量和对抗与急性失血性贫血相关的缺氧，其中在常氧条件下的细胞培养中试验时，所述交联血红蛋白血液代用品诱导促红细胞生成素的表达。

84.用于治疗个体由创伤引起的失血的方法，该方法包括给有需要的个体施用有效量的交联血红蛋白血液代用品，以提高所述个体的血容量和对抗与急性失血性贫血相关的缺氧，其中通过所述个体的红细胞压积或血红蛋白的倍增时间减少来检测，所述交联血红蛋白血液代用品在常氧条件下诱导红细胞生成。

85.用于治疗个体由创伤引起的失血的方法，该方法包括给有需要的个体施用有效量的交联血红蛋白血液代用品，以提高所述个体的血容量和对抗与急性失血性贫血相关的缺氧，其中通过所述个体的促红细胞生成素循环水平增加来检测，所述交联血红蛋白血液代用品在常氧条件下诱导红细胞生成。

86.权利要求83-85中任一项的方法，其中所述急性失血为重度。

87.权利要求86的方法，其中所述个体的失血超过33％。

88.权利要求83-85中任一项的方法，其中所述急性失血为中度。

89.权利要求88的方法，其中所述个体的失血为20％至33％。

90.权利要求83-85中任一项的方法，其中所述急性失血为轻度。

91.权利要求90的方法，其中所述个体的失血少于20％。

92.权利要求83-85中任一项的方法，其中所述个体为人。

93.权利要求92的方法，其中所述个体的血红蛋白低于7g/dL。

94.用于治疗个体由创伤引起的失血的方法，该方法包括给有需要的个体施用治疗有效量交联血红蛋白，其中所述交联血红蛋白包含的血红蛋白：

(a)与高碘酸氧化的ATP分子内交联；

(b)与高碘酸氧化的腺苷分子间交联；和

(c)与还原型谷胱甘肽偶联。

95.权利要求94的方法，其中所述急性失血为重度。

96.权利要求95的方法，其中所述个体的失血超过33％。

97.权利要求94的方法，其中所述急性失血为中度。

98.权利要求97的方法，其中所述个体的失血为20％至33％。

99.权利要求94的方法，其中所述急性失血为轻度。

100.权利要求99的方法，其中所述个体的失血少于20％。

101.权利要求94的方法，其中所述个体为人。

102.权利要求101的方法，其中所述个体的血红蛋白低于7g/dL。

103.权利要求94的方法，其中所述交联血红蛋白中血红蛋白和高碘酸氧化的ATP的摩尔比为1:1至1:3。

104.权利要求94的方法，其中所述交联血红蛋白中血红蛋白和高碘酸氧化的腺苷的摩尔比为1:1至1:10。

105.权利要求94的方法，其中所述交联血红蛋白中血红蛋白和还原型谷胱甘肽的摩尔比为1:1至1:20。

106.药物组合物，其包含在药学可接受的载体中的治疗有效量的交联血红蛋白血液代用品，其中所述治疗有效量为7g至小于122.5g，其中在常氧条件下的细胞培养中试验时，所述交联血红蛋白血液代用品诱导促红细胞生成素的表达。

107.药物组合物，其包含在药学可接受的载体中的治疗有效量的交联血红蛋白血液代用品，其中所述治疗有效量为大于122.5g至700g，其中在常氧条件下的细胞培养中试验时，所述交联血红蛋白血液代用品诱导促红细胞生成素的表达。

108.药物组合物，其包括在药学可接受的载体中的治疗有效体积的交联血红蛋白血液代用品，其中所述治疗有效体积为小于0.6升，其中在常氧条件下的细胞培养中试验时，所述交联血红蛋白血液代用品诱导促红细胞生成素的表达。

109.权利要求106-108中任一项的药物组合物，其中在细胞培养中试验时，所述交联血红蛋白血液代用品稳定HIF-1α的表达。

110.权利要求106-108中任一项的药物组合物，其中在细胞培养中试验时，所述交联血红蛋白血液代用品下调NF-κB。

111.药物组合物，其包含在药学可接受的载体中的治疗有效量的交联血红蛋白，其中所述治疗有效量为7g至小于122.5g，其中所述交联血红蛋白包含的血红蛋白：

(a)与高碘酸氧化的ATP分子内交联；

(b)与高碘酸氧化的腺苷分子间交联；和

(c)与还原型谷胱甘肽偶联。

112.药物组合物，其包含在药学可接受的载体中的治疗有效量的交联血红蛋白，其中所述治疗有效量为大于122.5g至700g，其中所述交联血红蛋白包含的血红蛋白：

(a)与高碘酸氧化的ATP分子内交联；

(b)与高碘酸氧化的腺苷分子间交联；和

(c)与还原型谷胱甘肽偶联。

113.药物组合物，其包含在药学可接受的载体中的治疗有效体积的交联血红蛋白，其中所述治疗有效体积为小于0.6升，其中所述交联血红蛋白包含的血红蛋白：

(a)与高碘酸氧化的ATP分子内交联；

(b)与高碘酸氧化的腺苷分子间交联；和

(c)与还原型谷胱甘肽偶联。

114.权利要求111-113中任一项的药物组合物，其中在细胞培养中试验时，所述交联血红蛋白稳定HIF-1α的表达。

115.权利要求111-113中任一项的药物组合物，其中在细胞培养中试验时，所述交联血红蛋白下调NF-κB。

116.权利要求111-113中任一项的药物组合物，其中所述交联血红蛋白中血红蛋白和高碘酸氧化的ATP的摩尔比为1:1至1:3。

117.权利要求111-113中任一项的药物组合物，其中所述交联血红蛋白中血红蛋白和高碘酸氧化的腺苷的摩尔比为1:1至1:10。

118.权利要求111-113中任一项的药物组合物，其中所述交联血红蛋白中血红蛋白和还原型谷胱甘肽的摩尔比为1:1至1:20。

119.权利要求111-113中任一项的药物组合物，其中所述交联血红蛋白溶于非电解水溶液中。

120.权利要求111-113中任一项的药物组合物，其进一步包含甘露醇。

121.权利要求111-113中任一项的药物组合物，其进一步包含电解质。

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