CN111406737B - 用于器官持续维持的成分、装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医疗器械领域，具体涉及用于器官持续维持的成分、装置和方法。本发明提供了离体器官灌注液、保存离体器官的方法以及离体器官灌注装置。离体器官灌注液以及利用离体器官灌注液和离体器官灌注装置保存离体器官的方法，可发挥更长时间载氧和释氧功能，从而显著延长离体器官的灌注保存时间。

Description

用于器官持续维持的成分、装置和方法
技术领域
本发明涉及医疗器械领域，具体涉及用于器官持续维持的成分、装置和方法。
背景技术
在人类和哺乳动物中，血红蛋白是红血球中含铁的氧转运金属蛋白，它将氧气从肺部输送到身体的其他部位(即组织)。在那里，它释放氧气，使有氧呼吸提供能量，在新陈代谢过程中为有机体的功能提供动力。健康人每100毫升血液中含有12至20克血红蛋白。血红蛋白的氧结合能力为每克1.34毫升氧气，与血液中溶解氧相比，总血氧容量增加了70倍。哺乳动物的血红蛋白分子可以与四个氧分子结合。在大多数脊椎动物中，血红蛋白分子是由四个球状蛋白亚基组成的。每一个亚单位都由一个与非蛋白质修复血红素组紧密相连的蛋白质链组成。每个蛋白质链排列成一组α-螺旋结构片段，以珠蛋白折叠的方式连接在一起。这种折叠模式包含一个口袋，紧密结合血红素组。
在创伤患者的治疗中，以及在保存供体器官(例如动态)中，例如在移植前供体器官的机器灌注中，输注全异基因血是普遍存在的。然而，在世界范围内，缺乏安全可行的同种异体献血者血液，这一问题只会随着时间的推移而增加。此外，全血输血也有风险，包括血液传播疾病、致命的ABO血型不合、全身炎症反应和多器官衰竭。此外，全人类血液的保质期有限，只有42天，而且可用的数量通常不足，例如用于提供器官保存，或用于涉及许多创伤的紧急情况，如战争或自然灾害后。
人类很多的疾病来自细胞、组织、器官坏死，从而导致功能丧失，引发人体残疾，甚至死亡，随着现代医学的发展，器官移植技术日趋成熟，单从手术角度来说，器官移植技术已很完美，换头手术都不是大问题。而事实上，器官移植目前仍面临种种困难，对离体器官的保存就是其中之一。器官移植必需移植活的器官，因此，供移植用的器官，从切离供者体内之时起直到其主要血管与受者血管接通期间，始终保持着完整的解剖结构和活性，是移植成功的一个前提。但是，任何器官一旦失去血液供应，细胞得不到所必需的氧和养料，在常温下于短期内即会死亡，能耐受的时间是极短的，如心、肝仅10-15分钟，肾约在45-60分钟，若超过上述时限，移植后就很难恢复功能。在临床实际工作中，则要求常温下的缺血时间越短越好，最好不超过3-5分钟，最长不超过7-8分钟。但是，根本不可能在如此短促的时间内完成移植手术。因此，必需设法使离体器官的活性能长时间维持。
因此，对安全的基于血红蛋白的成分以及与之结合使用的系统、装置和方法的需求，例如用于人类治疗、器官可持续性或储存等未得到满足。
发明内容
本发明是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
第一方面：
其一，发明人发现，高分子聚合血红蛋白的分子量分布不同时，包含不同分子量分 布的高分子聚合血红蛋白的本发明灌注液对离体器官的保存效果差异显著且不可预料，具 体来说：发明人发现，相比于本发明分子量为320kD～1024kD的高分子聚合血红蛋白，高分 子聚合血红蛋白的分子量若小于320kD(如为32kD～256kD或128kD～256kD)，灌注液对离体 器官的保存安全时限降低了一倍以上，安全时限显著缩短；而对于大于1024kD的聚合血红 蛋白蛋白，在实际生产中能够获得的量非常少，基本无研究意义。因此，本发明包含分子量 为320kD～1024kD的高分子聚合血红蛋白的灌注液对于离体器官的灌注保存具有明显的安 全时限优势。
其二，发明人意外地发现，本发明灌注液中分子量为320kD～1024kD的高分子聚合 血红蛋白的纯度不同时，灌注液对离体器官的保存效果同样差异显著且不可预料，具体来 说：发明人意外地发现，本发明的灌注液对离体器官的保存安全时限随着分子量为320kD～ 1024kD的高分子聚合血红蛋白纯度的升高呈波动式延长。具体地，分子量为320kD～1024kD 的高分子聚合血红蛋白的纯度由65％升高至80％甚至继续升高至90％时，灌注液对离体器 官的保存安全时限基本保持不变甚至有所降低；然而，高分子聚合血红蛋白的纯度升高至 95％时，灌注液对离体器官的保存安全时限却显著延长，延长了约50％，且高分子聚合血红 蛋白的纯度由95％再继续升高至97％、99％甚至更高时，灌注液对离体器官的保存安全时 限基本保持稳定不再改变。因此，本发明包含分子量为320kD～1024kD≥95％的高分子聚合 血红蛋白的灌注液对于离体器官的灌注保存具有明显的安全时限优势。
综上，本发明制备的包含高分子聚合血红蛋白(分子量320kD～1024kD≥95％)的 灌注液，可发挥更长时间载氧和释氧功能，进而，该灌注液与本发明的离体器官灌注装置的 组合，实现了对离体器官的有效灌注，显著延长了离体器官的保存时间，取得了预料不到的 技术效果，对现有技术做出了实质性贡献。
第二方面：
戊二醛聚合血红蛋白作为一种红细胞代用品，其稳定性极其重要。若其作为一种 药物，在临床医学上使用，稳定性就更加重要。因此，戊二醛聚合血红蛋白的稳定性(即防止 聚合血红蛋白降解为游离血红蛋白)是研制红细胞代用品首先要解决的问题。
为了解决上述问题，发明人通过大量的实验探索后发现，在本发明的器官灌注液 中，聚合血红蛋白通过与硫氧还蛋白过氧化物酶的协同配合，显著降低了聚合血红蛋白的 降解速率，显著增强了聚合血红蛋白的稳定性，从而显著延长了聚合血红蛋白发挥携氧作 用的时间，显著延长了离体器官的保存时间。另外，灌注液中硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ通过 与聚合血红蛋白的协同配合，还对组织中一氧化氮的生产与清除具有重要的调控作用，这 些特性有效地中和了聚合血红蛋白在这方面的副作用，可以更长时间的维持NO、ET-1等器 官活性指标在正常范围内。
特别需要说明的是，虽然现有技术中有部分研究初步证明，在人红细胞内，硫氧还 蛋白过氧化物酶可能在多种复杂因素(如pH、盐浓度等)的影响下通过构象变化与血红蛋白 进行结合，从而防止血红蛋白的氧化损伤；然而，
其一，目前的研究尚不深入，两者究竟是如何相结合，作用力强度如何，尚没有定 论；
其二，红细胞内和红细胞外(体外)是截然不同的两种环境，失去了细胞膜的保护 且脱离了红细胞内复杂环境的辅助后，在体外环境下，游离血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化 物酶是否还能相互结合，完全是一个未知数；
其三，聚合血红蛋白相比于游离血红蛋白，空间结构以及反应位点均已发生显著 的改变，在此前提下，在体外环境中时，硫氧还蛋白过氧化物酶是否还能与聚合血红蛋白相 互结合并作用，根本无法预知；
其四，现有技术的研究仅仅表明，在红细胞内时，硫氧还蛋白过氧化物酶可以与游 离的血红蛋白相结合，从而防止血红蛋白的氧化损伤，但是，在本发明的器官灌注液中，硫 氧还蛋白过氧化物酶是否能与相比游离血红蛋白结构差异巨大的聚合血红蛋白协同作用， 从而发挥与常规抗氧化作用显著不同的新功能—即防止聚合血红蛋白降解为游离血红蛋 白，增强聚合血红蛋白的稳定性，更是完全无法预知；
其五，发明人发现，其他同属于红细胞内还原酶系统的超氧化物歧化酶或者硫氧 还蛋白，在与聚合血红蛋白进行组合后，相比于仅添加聚合血红蛋白的灌注液，器官保存时 间几乎没有延长，而本发明的灌注液中，聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶可以有效 地协同配合，显著延长了离体器官的保存时间。
由此可知，本发明的离体器官灌注液(聚合血红蛋白通过与硫氧还蛋白过氧化物 酶协同配合)相比于现有技术，具有非显而易见性，且该灌注液可发挥更长时间载氧和释氧 功能，其与本发明的离体器官灌注装置的组合实现了对离体器官的有效灌注，显著延长了 离体器官的保存时间，取得了预料不到的技术效果，对现有技术做出了实质性贡献。
为此，在本发明的第一方面，本发明提供了一种保存移植用离体器官的方法，其包括：
将离体器官灌注液灌注到所述移植用离体器官的血管中，所述灌注是利用离体器官灌注装置进行的，
其中：
基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
基于每10g的高分子聚合血红蛋白，所述离体器官灌注液包括：
高分子聚合血红蛋白10g，
葡萄糖2.5g-4g(如3g或3.5g)，
肝素钠7500u-10000u(8000u、8333u、8500u、9000u或9500u)，
氯化钠2g-3g(如2.3g、2.5g或2.7g)，
头孢西丁钠0.5g-0.75g(如0.55g、0.6g、0.65g、0.66g或0.7g)，
碳酸氢钠0.37g-0.5g(如0.375g、0.4g、0.42g、0.45g、0.47g或0.49g)，
10％复方氨基酸注射液15mL-20mL(如16.5mL、16.7mL、17mL、18mL、19mL或19.5mL)，
注射用12种复合维生素0.05mL-0.08mL(如0.055mL、0.06mL、0.065mL、0.066mL、0.07mL或0.075mL)，
胰岛素50u-80u(如55u、60u、65u、70u或75u),和
余量水；
其中，所述高分子聚合血红蛋白中分子量为320kD-1024kD的聚合血红蛋白含量≥95％，且所述高分子聚合血红蛋白是通过如下方法获得的：
采集新鲜血液1L，用0.5-1倍于血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液进行稀释；
用60μm的深层过滤器过滤所述稀释后的所述血液，并用6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗60μm的深层过滤器上的残留物直至通过所述过滤器的血红蛋白达到95％以上；
将上述通过60μm的深层过滤器的物质置于0.65μm中空纤维膜上，使用5-8倍于初始血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗0.65μm中空纤维膜上的物质使得小于0.65μm的物质通过0.65μm中空纤维膜；
向被0.65μm中空纤维膜截留的物质按1:1-2于初始血液体积加入注射水以裂解红细胞，用100KD滤膜超滤裂解的红细胞，透过端为所需的血红蛋白，同时依据透过速率加入注射用水以保持恒定的超滤体积，直至血红蛋白的收率≥95％，停止100KD超滤；
用30KD膜包浓缩前述经100KD滤膜纯化的血红蛋白至其浓度为血红蛋白浓度10-14g/dL；
将上述浓度为10-14g/dL的纯化的血红蛋白经阴离子层析纯化(20mM tris的溶液平衡柱子→40min上完样品→3倍于浓度为10-14g/dL的纯化的血红蛋白体积的29Mmtris溶液洗杂→4-5倍于浓度为10-14g/dL的纯化的血红蛋白体积的50mM tris溶液洗脱)以得到精纯的血红蛋白；
将上述获得的精纯的血红蛋白置于30KD滤膜上，用3倍于精纯的血红蛋白体积的50mM磷酸氢二钠缓冲换液；
然后通入惰性气体脱氧至氧合血红蛋白小于5％，按1g血红蛋白35-45mg戊二醛的比例以雾化的方法加入戊二醛(具体见已有专利：201910846580.9)，接着按1g的血红蛋白13-18mg的硼氢化钠终止聚合反应；
接着将获得的聚合血红蛋白浓缩至6-7g/dL，将浓缩至6-7g/dL的聚合血红蛋白置于300KD的超滤膜包上，使用5-10倍于6-7g/dL的聚合血红蛋白的体积的乳酸林格氏液(氯化钠6.73g/L、氯化钾0.3g/L、二水氯化钙0.2g/L、40％乳酸钠3.07g/L、N-乙酰-L-半胱氨酸22g/L)换液得到聚合血红蛋白，在换液过程中分子量320-1024kD的聚合血红蛋白含量达到≥95％指标时，收集蛋白溶液，通入惰性气体进行脱氧至氧合血红蛋白含量≤5％，0.2μm过滤除菌，获得所述高分子聚合血红蛋白；
其中：
所述离体器官灌注装置包括容器、泵送单元、氧合器和超滤单元；所述容器中设有保持架，用于布置所述移植用离体器官，所述容器还设有出口和进口，用于连接所述移植用离体器官的血管；所述泵送单元和所述氧合器串联布设在所述容器的出口和进口之间的管路中，所述泵送单元中设有灌注液包，所述灌注液包中设有所述灌注液，所述泵送单元用于驱动所述灌注液流动形成循环的连续灌注流，所述氧合器用于对流经的所述灌注液进行体外氧合和二氧化碳排出，提高所述灌注液中血红蛋白的携氧量和对处于松散的R态血红蛋白的超滤效果；所述超滤单元与所述泵送单元中的所述灌注液包连接形成超滤循环，用于对所述灌注液包中的所述灌注液进行小分子有毒血红蛋白的超滤除去。
在一些实施方案中，所述高分子聚合血红蛋白中分子量为320kD～1024kD的聚合血红蛋白含量为95％-99％(如为95％、97％或99％)；相应地，在其制备方法中320kD～1024kD的蛋白含量指标进行适应性变化。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
高分子聚合血红蛋白30g，
葡萄糖9g，
肝素钠25000u，
氯化钠7g，
头孢西丁钠2g，
碳酸氢钠1.25g，
10％复方氨基酸注射液50mL，
注射用12种复合维生素0.2mL，
胰岛素180u，和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
高分子聚合血红蛋白40g，
葡萄糖10g，
肝素钠30000u，
氯化钠8g，
头孢西丁钠3g，
碳酸氢钠1.5g，
10％复方氨基酸注射液60mL，
注射用12种复合维生素0.3mL，
胰岛素200u，和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
高分子聚合血红蛋白20g，
葡萄糖8g，
肝素钠20000u，
氯化钠6g，
头孢西丁钠1g，
碳酸氢钠1g，
10％复方氨基酸注射液40mL，
注射用12种复合维生素0.1mL，
胰岛素160u，和
余量水。
在一些实施方案中，所述保存在2-40℃(如2℃、4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃)进行。
在一些实施方案中，所述保存在4-37℃(如4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃)进行。
在一些实施方案中，所述保存在10-30℃(如10℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、25℃或30℃)进行。
在一些实施方案中，所述保存在16-20℃(如18℃)进行。
在一些实施方案中，所述保存在18℃进行。
在一些实施方案中，所述头孢西丁钠为注射用头孢西丁钠。
在一些实施方案中，所述水为注射水。
在一些实施方案中，所述10％复方氨基酸注射液为辰欣药业生产的10％复方氨基酸注射液。
在一些实施方案中，所述注射用12种复合维生素为山西普德药业股份有限公司生产的“注射用12种复合维生素”。
在一些实施方案中，所述离体器官为心脏、肝脏、肾脏或肺脏。
在一些实施方案中，所述离体器官为人、狗、大鼠或猪的离体器官。
在一些实施方案中，所述超滤单元包括超滤泵、超滤器和加液管，其中，所述超滤泵和所述超滤器串联连接，并且与所述泵送单元中的灌注液包形成超滤循环，所述加液管与超滤器的下游管路连通，用于向超滤循环中补加缓冲液。
在一些实施方案中，所述超滤器选用30KD。
在一些实施方案中，所述离体器官灌注装置还设有氧合单元；所述氧合单元与所述泵送单元连接形成氧合循环，用于对流经泵送单元的灌注液进行气体交换，提升灌注液中血红蛋白的氧饱和度。
在一些实施方案中，所述氧合单元包括循环泵和氧合膜，所述循环泵与氧合膜串联连接，并且与所述泵送单元中的灌注液包连接形成氧合循环。
在一些实施方案中，所述离体器官灌注装置中还设有气体过滤器；所述气体过滤器位于所述氧合器的下游位置。
在一些实施方案中，所述容器的出口与所述泵送单元的进口之间还设有灌注器官回液管，所述泵送单元的出口与所述容器的进口之间还直接设有灌注器官进液管。
在一些实施方案中，所述离体器官灌注装置还设有流量控制单元和温度控制单元；所述流量控制单元包括至少两个流量指示器，并且分别布设在所述泵送单元的进口管路和出口管路；所述温度控制单元位于所述泵送单元的出口位置，用于控制灌注液温度。
在一些实施方案中，所述离体器官灌注装置还设有压力控制单元；所述压力控制单元位于所述容器的进口位置，用于对回流至容器的灌注液进行压力调节控制。
在一些实施方案中，所述离体器官灌注装置中设有多组泵送单元、氧合器和超滤单元，形成对所述容器的多组并联灌注液循环。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种保存移植用离体器官的方法，其包括：
将离体器官灌注液灌注到所述移植用离体器官的血管中，所述灌注是利用离体器官灌注装置进行的，
其中：
基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：高分子聚合血红蛋白20g-40g(如25g、30g或35g)，葡萄糖8g-10g(如8.5g、9g或9.5g)，肝素钠20000u-30000u(23000u、25000u或27000u)，氯化钠6g-8g(如6.5g、7g或7.5g)，头孢西丁钠1g-3g(如1.5g、2g或2.5g)，碳酸氢钠1g-1.5g(如1.0g、1.25g或1.5g)，10％复方氨基酸注射液40mL-60mL(如45mL、50mL或55mL)，注射用12种复合维生素0.1mL-0.3mL(如0.15mL、0.2mL或0.25mL)，胰岛素160u-200u(如170u、180u或190u)，和余量水；
其中，所述高分子聚合血红蛋白中分子量为320kD-1024kD的聚合血红蛋白含量≥95％，且所述高分子聚合血红蛋白是通过如下方法获得的：
利用60μm的深层过滤器过滤血液，获得红细胞；利用0.65μm中空纤维膜洗涤所述红细胞；利用低渗液裂解所述洗涤后的所述红细胞，获得裂解产物；通过100KD超滤所述裂解产物获得粗纯血红蛋白；利用阴离子交换层析纯化所述粗纯血红蛋白，获得精纯血红蛋白；将戊二醛以雾化的方式与所述精纯血红蛋白进行聚合反应；利用硼氢化钠终止所述聚合反应，并进行300KD超滤换液，获得所述聚合血红蛋白，所述聚合血红蛋白的指标要求为：分子量320kD～1024kD≥95％，高铁血红蛋白<5％，氧合血红蛋白<5％；
其中：
所述离体器官灌注装置包括容器、泵送单元、氧合器和超滤单元；所述容器中设有保持架，用于布置所述移植用离体器官，所述容器还设有出口和进口，用于连接所述移植用离体器官的血管；所述泵送单元和所述氧合器串联布设在所述容器的出口和进口之间的管路中，所述泵送单元中设有灌注液包，所述灌注液包中设有所述灌注液，所述泵送单元用于驱动所述灌注液流动形成循环的连续灌注流，所述氧合器用于对流经的所述灌注液进行体外氧合和二氧化碳排出，提高所述灌注液中血红蛋白的携氧量和对处于松散的R态血红蛋白的超滤效果；所述超滤单元与所述泵送单元中的所述灌注液包连接形成超滤循环，用于对所述灌注液包中的所述灌注液进行小分子有毒血红蛋白的超滤除去。
在一些实施方案中，所述高分子聚合血红蛋白是通过如下方法获得的：
采集新鲜血液1L，用0.5～1倍于血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液进行稀释；
用60μm的深层过滤器过滤所述稀释后的所述血液，并用6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗60μm的深层过滤器上的残留物直至通过所述过滤器的血红蛋白达到95％以上；
将上述通过60μm的深层过滤器的物质置于0.65μm中空纤维膜上，使用5～8倍于初始血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗0.65μm中空纤维膜上的物质使得小于0.65μm的物质通过0.65μm中空纤维膜；
向被0.65μm中空纤维膜截留的物质按1:1～2于初始血液体积加入注射水以裂解红细胞，用100KD滤膜超滤裂解的红细胞，透过端为所需的血红蛋白，同时依据透过速率加入注射用水以保持恒定的超滤体积，直至血红蛋白的收率≥95％，停止100KD超滤；
用30KD膜包浓缩前述经100KD滤膜纯化的血红蛋白至其浓度为血红蛋白浓度10～14g/dL；
将上述浓度为10～14g/dL的纯化的血红蛋白经阴离子层析纯化(20mM tris的溶液平衡柱子→40min上完样品→3倍于浓度为10～14g/dL的纯化的血红蛋白体积的29Mmtris溶液洗杂→4-5倍于浓度为10～14g/dL的纯化的血红蛋白体积的50mM tris溶液洗脱)以得到精纯的血红蛋白；
将上述获得的精纯的血红蛋白置于30KD滤膜上，用3倍于精纯的血红蛋白体积的50mM磷酸氢二钠缓冲换液；
然后通入惰性气体脱氧至氧合血红蛋白小于5％，按1g血红蛋白35～45mg戊二醛的比例以雾化的方法加入戊二醛(具体见已有专利：201910846580.9)，接着按1g的血红蛋白13～18mg的硼氢化钠终止聚合反应；
接着将获得的聚合血红蛋白浓缩至6-7g/dL，将浓缩至6-7g/dL的聚合血红蛋白置于300KD的超滤膜包上，使用5～10倍于6-7g/dL的聚合血红蛋白的体积的乳酸林格氏液(氯化钠6.73g/L、氯化钾0.3g/L、二水氯化钙0.2g/L、40％乳酸钠3.07g/L、N-乙酰-L-半胱氨酸22g/L)换液得到聚合血红蛋白，在换液过程中分子量320～1024kD的蛋白含量达到≥95％指标时，收集蛋白溶液，通入惰性气体进行脱氧至氧合血红蛋白含量≤5％，0.2μm过滤除菌，获得所述高分子聚合血红蛋白。
在一些实施方案中，所述高分子聚合血红蛋白中分子量为320kD～1024kD的聚合血红蛋白含量为95％-99％(如为95％、97％或99％)；相应地，在其制备方法中320kD～1024kD的蛋白含量指标进行适应性变化。
在一些实施方案中，基于每10g的高分子聚合血红蛋白，所述离体器官灌注液包括：
高分子聚合血红蛋白10g，
葡萄糖2.5g-4g(如3g或3.5g)，
肝素钠7500u-10000u(8000u、8333u、8500u、9000u或9500u)，
氯化钠2g-3g(如2.3g、2.5g或2.7g)，
头孢西丁钠0.5g-0.75g(如0.55g、0.6g、0.65g、0.66g或0.7g)，
碳酸氢钠0.37g-0.5g(如0.375g、0.4g、0.42g、0.45g、0.47g或0.49g)，
10％复方氨基酸注射液15mL-20mL(如16.5mL、16.7mL、17mL、18mL、19mL或19.5mL)，
注射用12种复合维生素0.05mL-0.08mL(如0.055mL、0.06mL、0.065mL、0.066mL、0.07mL或0.075mL)，
胰岛素50u-80u(如55u、60u、65u、70u或75u),和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
高分子聚合血红蛋白30g，
葡萄糖9g，
肝素钠25000u，
氯化钠7g，
头孢西丁钠2g，
碳酸氢钠1.25g，
10％复方氨基酸注射液50mL，
注射用12种复合维生素0.2mL，
胰岛素180u，和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
高分子聚合血红蛋白40g，
葡萄糖10g，
肝素钠30000u，
氯化钠8g，
头孢西丁钠3g，
碳酸氢钠1.5g，
10％复方氨基酸注射液60mL，
注射用12种复合维生素0.3mL，
胰岛素200u，和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
高分子聚合血红蛋白20g，
葡萄糖8g，
肝素钠20000u，
氯化钠6g，
头孢西丁钠1g，
碳酸氢钠1g，
10％复方氨基酸注射液40mL，
注射用12种复合维生素0.1mL，
胰岛素160u，和
余量水。
在一些实施方案中，所述保存在2-40℃(如2℃、4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃)进行。
在一些实施方案中，所述保存在4-37℃(如4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃)进行。
在一些实施方案中，所述保存在10-30℃(如10℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、25℃或30℃)进行。
在一些实施方案中，所述保存在16-20℃(如18℃)进行。
在一些实施方案中，所述保存在18℃进行。
在一些实施方案中，所述头孢西丁钠为注射用头孢西丁钠。
在一些实施方案中，所述水为注射水。
在一些实施方案中，所述10％复方氨基酸注射液为辰欣药业生产的10％复方氨基酸注射液。
在一些实施方案中，所述注射用12种复合维生素为山西普德药业股份有限公司生产的“注射用12种复合维生素”。
在一些实施方案中，所述离体器官为心脏、肝脏、肾脏或肺脏。
在一些实施方案中，所述离体器官为人、狗、大鼠或猪的离体器官。
在一些实施方案中，所述超滤单元包括超滤泵、超滤器和加液管，其中，所述超滤泵和所述超滤器串联连接，并且与所述泵送单元中的灌注液包形成超滤循环，所述加液管与超滤器的下游管路连通，用于向超滤循环中补加缓冲液。
在一些实施方案中，所述超滤器选用30KD。
在一些实施方案中，所述离体器官灌注装置还设有氧合单元；所述氧合单元与所述泵送单元连接形成氧合循环，用于对流经泵送单元的灌注液进行气体交换，提升灌注液中血红蛋白的氧饱和度。
在一些实施方案中，所述氧合单元包括循环泵和氧合膜，所述循环泵与氧合膜串联连接，并且与所述泵送单元中的灌注液包连接形成氧合循环。
在一些实施方案中，所述离体器官灌注装置中还设有气体过滤器；所述气体过滤器位于所述氧合器的下游位置。
在一些实施方案中，所述容器的出口与所述泵送单元的进口之间还设有灌注器官回液管，所述泵送单元的出口与所述容器的进口之间还直接设有灌注器官进液管。
在一些实施方案中，所述离体器官灌注装置还设有流量控制单元和温度控制单元；所述流量控制单元包括至少两个流量指示器，并且分别布设在所述泵送单元的进口管路和出口管路；所述温度控制单元位于所述泵送单元的出口位置，用于控制灌注液温度。
在一些实施方案中，所述离体器官灌注装置还设有压力控制单元；所述压力控制单元位于所述容器的进口位置，用于对回流至容器的灌注液进行压力调节控制。
在一些实施方案中，所述离体器官灌注装置中设有多组泵送单元、氧合器和超滤单元，形成对所述容器的多组并联灌注液循环。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种保存移植用离体器官的方法，其包括：
将离体器官灌注液灌注到所述移植用离体器官的血管中，所述灌注是利用离体器官灌注装置进行的，
其中：
基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
基于每1g的硫氧还蛋白过氧化物酶II，所述离体器官灌注液包括：
聚合血红蛋白4～5g，如4.3g、4.5g或4.7g；
硫氧还蛋白过氧化物酶II 1g；
肝素钠3000～5000u，如3500u、3700u、4000u、4500u或4700u；
葡萄糖1～2g，如1.3g、1.5g或1.7g；
氯化钠0.8～1.5g，如1.0g、1.2g或1.4g；
头孢西丁钠0.25～0.3g，如0.26g、0.27g、0.28g或0.29g；
碳酸氢钠0.15～0.25g，如0.17g、0.18g、0.19g、0.20g、0.21g、0.22g或0.23g；
10％复方氨基酸注射液6～10mL，如7.5mL、8mL、8.5mL、9mL或9.5mL；
注射用12种复合维生素0.025～0.03mL，如0.026mL、0.027mL、0.028mL或0.029mL；和
余量水；
其中，所述聚合血红蛋白通过如下方法获得：
采集新鲜血液，用0.5～1倍所述血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液进行稀释；
用60μm的深层过滤器过滤所述稀释后的所述血液，并用6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗60μm的深层过滤器上的残留物直至通过所述过滤器的血红蛋白达到95％以上；
将上述通过60μm的深层过滤器的物质置于0.65μm中空纤维膜上，使用5～8倍于初始血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗0.65μm中空纤维膜上的物质使得小于0.65μm的物质通过0.65μm中空纤维膜；
向被0.65μm中空纤维膜截留的物质按1:1～2于初始血液体积加入注射水以裂解红细胞，用100KD滤膜超滤裂解的红细胞，透过端为所需的血红蛋白，同时依据透过速率加入注射用水以保持恒定的超滤体积，直至血红蛋白的收率≥95％，停止100KD超滤；
用30KD膜包浓缩前述经100KD滤膜纯化的血红蛋白至其浓度为血红蛋白浓度10～14g/dl；
将上述浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白经阴离子层析纯化(20mM tris的溶液平衡柱子→40min上完样品→3倍于浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白体积的29Mmtris溶液洗杂→4-5倍于浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白体积的50mM tris溶液洗脱)以得到精纯的血红蛋白；
将上述获得的精纯的血红蛋白置于30KD滤膜上，用3倍于精纯的血红蛋白体积的50mM磷酸氢二钠缓冲换液；
然后通入惰性气体脱氧至氧合血红蛋白小于5％，按1g血红蛋白35～45mg戊二醛的比例以雾化的方法加入戊二醛(具体见已有专利：201910846580.9)，接着按1g的血红蛋白13～18mg的硼氢化钠终止聚合反应；
接着将获得的聚合血红蛋白浓缩至6-7g/dL，将浓缩至6-7g/dL的聚合血红蛋白置于30KD的超滤膜包上，使用5～8倍于6-7g/dL的聚合血红蛋白的体积的乳酸林格氏液(氯化钠6.73g/L、氯化钾0.3g/L、二水氯化钙0.2g/L、40％乳酸钠3.07g/L、N-乙酰-L-半胱氨酸22g/L)换液得到聚合血红蛋白，通入惰性气体进行脱氧至氧合血红蛋白含量≤5％，0.2um过滤除菌，获得所述聚合血红蛋白；
其中：
所述离体器官灌注装置包括容器、泵送单元、氧合器和超滤单元；所述容器中设有保持架，用于布置所述移植用离体器官，所述容器还设有出口和进口，用于连接所述移植用离体器官的血管；所述泵送单元和所述氧合器串联布设在所述容器的出口和进口之间的管路中，所述泵送单元中设有灌注液包，所述灌注液包中设有所述灌注液，所述泵送单元用于驱动所述灌注液流动形成循环的连续灌注流，所述氧合器用于对流经的所述灌注液进行体外氧合和二氧化碳排出，提高所述灌注液中血红蛋白的携氧量和对处于松散的R态血红蛋白的超滤效果；所述超滤单元与所述泵送单元中的所述灌注液包连接形成超滤循环，用于对所述灌注液包中的所述灌注液进行小分子有毒血红蛋白的超滤除去。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
聚合血红蛋白30g，
硫氧还蛋白过氧化物酶II 6.7g，
肝素钠25000u，
葡萄糖9g，
氯化钠7g，
头孢西丁钠2g，
碳酸氢钠1.25g，
10％复方氨基酸注射液50mL，
注射用12种复合维生素0.2mL，和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
聚合血红蛋白40g，
硫氧还蛋白过氧化物酶II 10g，
肝素钠30000u，
葡萄糖10g，
氯化钠8g，
头孢西丁钠3g，
碳酸氢钠1.5g，
10％复方氨基酸注射液60mL，
注射用12种复合维生素0.3mL，和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
聚合血红蛋白20g，
硫氧还蛋白过氧化物酶II 4g，
肝素钠20000u，
葡萄糖8g，
氯化钠6g，
头孢西丁钠1g，
碳酸氢钠1g，
10％复方氨基酸注射液40mL，
注射用12种复合维生素0.1mL，和
余量水。
在一些实施方案中，所述保存在2～40℃(如2℃、4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃)进行。
在一些实施方案中，所述保存在4～37℃(如4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃)进行。
在一些实施方案中，所述保存在10～30℃(如10℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、25℃或30℃)进行。
在一些实施方案中，所述保存在16-20℃(如18℃)进行。
在一些实施方案中，所述保存在18℃进行。
在一些实施方案中，所述头孢西丁钠为注射用头孢西丁钠。
在一些实施方案中，所述水为注射水。
在一些实施方案中，所述10％复方氨基酸注射液为辰欣药业生产的10％复方氨基酸注射液。
在一些实施方案中，所述注射用12种复合维生素为山西普德药业股份有限公司生产的“注射用12种复合维生素”。
在一些实施方案中，所述离体器官为心脏、肝脏、肾脏或肺脏。
在一些实施方案中，所述离体器官为人、狗、大鼠或猪的离体器官。
在一些实施方案中，所述超滤单元包括超滤泵、超滤器和加液管，其中，所述超滤泵和所述超滤器串联连接，并且与所述泵送单元中的灌注液包形成超滤循环，所述加液管与超滤器的下游管路连通，用于向超滤循环中补加缓冲液。
在一些实施方案中，所述超滤器选用30KD。
在一些实施方案中，所述离体器官灌注装置还设有氧合单元；所述氧合单元与所述泵送单元连接形成氧合循环，用于对流经泵送单元的灌注液进行气体交换，提升灌注液中血红蛋白的氧饱和度。
在一些实施方案中，所述氧合单元包括循环泵和氧合膜，所述循环泵与氧合膜串联连接，并且与所述泵送单元中的灌注液包连接形成氧合循环。
在一些实施方案中，所述离体器官灌注装置中还设有气体过滤器；所述气体过滤器位于所述氧合器的下游位置。
在一些实施方案中，所述容器的出口与所述泵送单元的进口之间还设有灌注器官回液管，所述泵送单元的出口与所述容器的进口之间还直接设有灌注器官进液管。
在一些实施方案中，所述离体器官灌注装置还设有流量控制单元和温度控制单元；所述流量控制单元包括至少两个流量指示器，并且分别布设在所述泵送单元的进口管路和出口管路；所述温度控制单元位于所述泵送单元的出口位置，用于控制灌注液温度。
在一些实施方案中，所述离体器官灌注装置还设有压力控制单元；所述压力控制单元位于所述容器的进口位置，用于对回流至容器的灌注液进行压力调节控制。
在一些实施方案中，所述离体器官灌注装置中设有多组泵送单元、氧合器和超滤单元，形成对所述容器的多组并联灌注液循环。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种保存移植用离体器官的方法，其包括：
将离体器官灌注液灌注到所述移植用离体器官的血管中，所述灌注是利用离体器官灌注装置进行的，
其中：
所述离体器官灌注液包括：聚合血红蛋白和硫氧还原蛋白过氧化物酶；
其中：
所述离体器官灌注装置包括容器、泵送单元、氧合器和超滤单元；所述容器中设有保持架，用于布置所述移植用离体器官，所述容器还设有出口和进口，用于连接所述移植用离体器官的血管；所述泵送单元和所述氧合器串联布设在所述容器的出口和进口之间的管路中，所述泵送单元中设有灌注液包，所述灌注液包中设有所述灌注液，所述泵送单元用于驱动所述灌注液流动形成循环的连续灌注流，所述氧合器用于对流经的所述灌注液进行体外氧合和二氧化碳排出，提高所述灌注液中血红蛋白的携氧量和对处于松散的R态血红蛋白的超滤效果；所述超滤单元与所述泵送单元中的所述灌注液包连接形成超滤循环，用于对所述灌注液包中的所述灌注液进行小分子有毒血红蛋白的超滤除去。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液包括：
聚合血红蛋白20～40g，如25g、30g或35g；
硫氧还蛋白过氧化物酶4～10g，如6g、6.7g或8g。
在一些实施方案中，所述聚合血红蛋白与所述硫氧还原蛋白过氧化物酶的重量比为4：1～5：1，如为4.3：1、4.5：1或4.7：1。
在一些实施方案中，所述离体器官灌注液进一步包括：
肝素钠；
葡萄糖；
氯化钠；
头孢西丁钠；
碳酸氢钠；
10％复方氨基酸注射液；和
注射用12种复合维生素。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液进一步包括：
肝素钠20000～30000u，如23000u、25000u或27000u；
葡萄糖8～10g，如8.5g、9g或9.5g；
氯化钠6～8g，如6.5g、7g或7.5g；
头孢西丁钠1～3g，如1.5g、2g或2.5g；
碳酸氢钠1～1.5g，如1.0g、1.25g或1.5g；
10％复方氨基酸注射液40～60mL，如45mL、50mL或55mL；
注射用12种复合维生素0.1～0.3mL，如0.15mL、0.2mL或0.25mL。
在一些实施方案中，基于每1g的硫氧还蛋白过氧化物酶，所述离体器官灌注液包括：
聚合血红蛋白4～5g，如4.3g、4.5g或4.7g；
硫氧还蛋白过氧化物酶1g；
肝素钠3000～5000u，如3500u、3700u、4000u、4500u或4700u；
葡萄糖1～2g，如1.3g、1.5g或1.7g；
氯化钠0.8～1.5g，如1.0g、1.2g或1.4g；
头孢西丁钠0.25～0.3g，如0.26g、0.27g、0.28g或0.29g；
碳酸氢钠0.15～0.25g，如0.17g、0.18g、0.19g、0.20g、0.21g、0.22g或0.23g；
10％复方氨基酸注射液6～10mL，如7.5mL、8mL、8.5mL、9mL或9.5mL；
注射用12种复合维生素0.025～0.03mL，如0.026mL、0.027mL、0.028mL或0.029mL。
在上述的实施方案中，在所述离体器官灌注液中还可以加入160-200U胰岛素，例如万邦金桥制药公司生产的胰岛素；优选，180U胰岛素，例如万邦金桥制药公司生产的胰岛素。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
聚合血红蛋白20～40g；
硫氧还蛋白过氧化物酶4～10g；
肝素钠20000～30000u；
葡萄糖8～10g；
氯化钠6～8g；
头孢西丁钠1～3g；
碳酸氢钠1～1.5g；
10％复方氨基酸注射液40～60mL；
注射用12种复合维生素0.1～0.3mL；和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
聚合血红蛋白30g，
硫氧还蛋白过氧化物酶6.7g，
肝素钠25000u，
葡萄糖9g，
氯化钠7g，
头孢西丁钠2g，
碳酸氢钠1.25g
10％复方氨基酸注射液50mL，
注射用12种复合维生素0.2mL，和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
聚合血红蛋白40g，
硫氧还蛋白过氧化物酶10g，
肝素钠30000u，
葡萄糖10g，
氯化钠8g，
头孢西丁钠3g，
碳酸氢钠1.5g,
10％复方氨基酸注射液60mL，
注射用12种复合维生素0.3mL，和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
聚合血红蛋白20g，
硫氧还蛋白过氧化物酶4g，
肝素钠20000u，
葡萄糖8g，
氯化钠6g，
头孢西丁钠1g，
碳酸氢钠1g,
10％复方氨基酸注射液40mL，
注射用12种复合维生素0.1mL，和
余量水。
在一些实施方案中，所述硫氧还蛋白过氧化物酶为硫氧还蛋白过氧化物酶II。
在一些实施方案中，所述头孢西丁钠为注射用头孢西丁钠。
在一些实施方案中，所述水为注射水。
在一些实施方案中，所述10％复方氨基酸注射液为辰欣药业生产的10％复方氨基酸注射液。
在一些实施方案中，所述注射用12种复合维生素为山西普德药业股份有限公司生产的“注射用12种复合维生素”。
在一些实施方案中，所述保存在2～40℃(如2℃、4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃)进行。
在一些实施方案中，所述保存在4～37℃(如4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃)进行。
在一些实施方案中，所述保存在10～30℃(如10℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、25℃或30℃)进行。
在一些实施方案中，所述保存在16-20℃(如18℃)进行。
在一些实施方案中，所述保存在18℃进行。
在一些实施方案中，所述聚合血红蛋白是通过如下方法获得的：
利用60μm的深层过滤器过滤血液，获得红细胞；利用0.65μm中空纤维膜洗涤所述红细胞；利用低渗液裂解所述洗涤后的所述红细胞，获得裂解产物；通过100KD超滤所述裂解产物获得粗纯血红蛋白；利用阴离子交换层析纯化所述粗纯血红蛋白，获得精纯血红蛋白；将戊二醛以雾化的方式与所述精纯血红蛋白进行聚合反应；利用硼氢化钠终止所述聚合反应，并进行30KD超滤换液，获得所述聚合血红蛋白。
在一些实施方案中，所述聚合血红蛋白是通过如下方法获得的：
采集新鲜血液，用0.5～1倍所述血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液进行稀释；
用60μm的深层过滤器过滤所述稀释后的所述血液，并用6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗60μm的深层过滤器上的残留物直至通过所述过滤器的血红蛋白达到95％以上；
将上述通过60μm的深层过滤器的物质置于0.65μm中空纤维膜上，使用5～8倍于初始血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗0.65μm中空纤维膜上的物质使得小于0.65μm的物质通过0.65μm中空纤维膜；
向被0.65μm中空纤维膜截留的物质按1:1～2于初始血液体积加入注射水以裂解红细胞，用100KD滤膜超滤裂解的红细胞，透过端为所需的血红蛋白，同时依据透过速率加入注射用水以保持恒定的超滤体积，直至血红蛋白的收率≥95％，停止100KD超滤；
用30KD膜包浓缩前述经100KD滤膜纯化的血红蛋白至其浓度为血红蛋白浓度10～14g/dl；
将上述浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白经阴离子层析纯化(20mM tris的溶液平衡柱子→40min上完样品→3倍于浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白体积的29Mmtris溶液洗杂→4-5倍于浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白体积的50mM tris溶液洗脱)以得到精纯的血红蛋白；
将上述获得的精纯的血红蛋白置于30KD滤膜上，用3倍于精纯的血红蛋白体积的50mM磷酸氢二钠缓冲换液；
然后通入惰性气体脱氧至氧合血红蛋白小于5％，按1g血红蛋白35～45mg戊二醛的比例以雾化的方法加入戊二醛(具体见已有专利：201910846580.9)，接着按1g的血红蛋白13～18mg的硼氢化钠终止聚合反应；
接着将获得的聚合血红蛋白浓缩至6-7g/dL，将浓缩至6-7g/dL的聚合血红蛋白置于30KD的超滤膜包上，使用5～8倍于6-7g/dL的聚合血红蛋白的体积的乳酸林格氏液(氯化钠6.73g/L、氯化钾0.3g/L、二水氯化钙0.2g/L、40％乳酸钠3.07g/L、N-乙酰-L-半胱氨酸22g/L)换液得到聚合血红蛋白，通入惰性气体进行脱氧至氧合血红蛋白含量≤5％，0.2um过滤除菌，获得所述聚合血红蛋白。
在上述的实施方案中，在所述离体器官灌注液中还可以加入160-200U胰岛素，例如万邦金桥制药公司生产的胰岛素；优选，180U胰岛素，例如万邦金桥制药公司生产的胰岛素。
在一些实施方案中，所述超滤单元包括超滤泵、超滤器和加液管，其中，所述超滤泵和所述超滤器串联连接，并且与所述泵送单元中的灌注液包形成超滤循环，所述加液管与超滤器的下游管路连通，用于向超滤循环中补加缓冲液。
在一些实施方案中，所述超滤器选用30KD。
在一些实施方案中，所述离体器官灌注装置还设有氧合单元；所述氧合单元与所述泵送单元连接形成氧合循环，用于对流经泵送单元的灌注液进行气体交换，提升灌注液中血红蛋白的氧饱和度。
在一些实施方案中，所述氧合单元包括循环泵和氧合膜，所述循环泵与氧合膜串联连接，并且与所述泵送单元中的灌注液包连接形成氧合循环。
在一些实施方案中，所述离体器官灌注装置中还设有气体过滤器；所述气体过滤器位于所述氧合器的下游位置。
在一些实施方案中，所述容器的出口与所述泵送单元的进口之间还设有灌注器官回液管，所述泵送单元的出口与所述容器的进口之间还直接设有灌注器官进液管。
在一些实施方案中，所述离体器官灌注装置还设有流量控制单元和温度控制单元；所述流量控制单元包括至少两个流量指示器，并且分别布设在所述泵送单元的进口管路和出口管路；所述温度控制单元位于所述泵送单元的出口位置，用于控制灌注液温度。
在一些实施方案中，所述离体器官灌注装置还设有压力控制单元；所述压力控制单元位于所述容器的进口位置，用于对回流至容器的灌注液进行压力调节控制。
在一些实施方案中，所述离体器官灌注装置中设有多组泵送单元、氧合器和超滤单元，形成对所述容器的多组并联灌注液循环。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种静脉给药的方法，其包括：
向受试者静脉注射有效量的离体器官灌注液，所述静脉注射是利用静脉给药装置进行的，
其中：
基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
基于每10g的高分子聚合血红蛋白，所述离体器官灌注液包括：
高分子聚合血红蛋白10g，
葡萄糖2.5g-4g(如3g或3.5g)，
肝素钠7500u-10000u(8000u、8333u、8500u、9000u或9500u)，
氯化钠2g-3g(如2.3g、2.5g或2.7g)，
头孢西丁钠0.5g-0.75g(如0.55g、0.6g、0.65g、0.66g或0.7g)，
碳酸氢钠0.37g-0.5g(如0.375g、0.4g、0.42g、0.45g、0.47g或0.49g)，
10％复方氨基酸注射液15mL-20mL(如16.5mL、16.7mL、17mL、18mL、19mL或19.5mL)，
注射用12种复合维生素0.05mL-0.08mL(如0.055mL、0.06mL、0.065mL、0.066mL、0.07mL或0.075mL)，
胰岛素50u-80u(如55u、60u、65u、70u或75u),和
余量水；
其中，所述高分子聚合血红蛋白中分子量为320kD-1024kD的聚合血红蛋白含量≥95％，且所述高分子聚合血红蛋白是通过如下方法获得的：
采集新鲜血液1L，用0.5-1倍于血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液进行稀释；
用60μm的深层过滤器过滤所述稀释后的所述血液，并用6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗60μm的深层过滤器上的残留物直至通过所述过滤器的血红蛋白达到95％以上；
将上述通过60μm的深层过滤器的物质置于0.65μm中空纤维膜上，使用5-8倍于初始血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗0.65μm中空纤维膜上的物质使得小于0.65μm的物质通过0.65μm中空纤维膜；
向被0.65μm中空纤维膜截留的物质按1:1-2于初始血液体积加入注射水以裂解红细胞，用100KD滤膜超滤裂解的红细胞，透过端为所需的血红蛋白，同时依据透过速率加入注射用水以保持恒定的超滤体积，直至血红蛋白的收率≥95％，停止100KD超滤；
用30KD膜包浓缩前述经100KD滤膜纯化的血红蛋白至其浓度为血红蛋白浓度10-14g/dL；
将上述浓度为10-14g/dL的纯化的血红蛋白经阴离子层析纯化(20mM tris的溶液平衡柱子→40min上完样品→3倍于浓度为10-14g/dL的纯化的血红蛋白体积的29Mmtris溶液洗杂→4-5倍于浓度为10-14g/dL的纯化的血红蛋白体积的50mM tris溶液洗脱)以得到精纯的血红蛋白；
将上述获得的精纯的血红蛋白置于30KD滤膜上，用3倍于精纯的血红蛋白体积的50mM磷酸氢二钠缓冲换液；
然后通入惰性气体脱氧至氧合血红蛋白小于5％，按1g血红蛋白35-45mg戊二醛的比例以雾化的方法加入戊二醛(具体见已有专利：201910846580.9)，接着按1g的血红蛋白13-18mg的硼氢化钠终止聚合反应；
接着将获得的聚合血红蛋白浓缩至6-7g/dL，将浓缩至6-7g/dL的聚合血红蛋白置于300KD的超滤膜包上，使用5-10倍于6-7g/dL的聚合血红蛋白的体积的乳酸林格氏液(氯化钠6.73g/L、氯化钾0.3g/L、二水氯化钙0.2g/L、40％乳酸钠3.07g/L、N-乙酰-L-半胱氨酸22g/L)换液得到聚合血红蛋白，在换液过程中分子量320-1024kD的聚合血红蛋白含量达到≥95％指标时，收集蛋白溶液，通入惰性气体进行脱氧至氧合血红蛋白含量≤5％，0.2μm过滤除菌，获得所述高分子聚合血红蛋白；
其中：
所述静脉给药装置包括多个注射器、多个定量推注器、注射头以及氧合器；其中，多个所述注射器中分别设有不同液剂，且至少一个所述注射器中设有所述离体器官灌注液，多个所述注射器之间通过管路形成并联连接后汇流至所述注射头；多个定量推注器分别与多个注射器进行连接，以驱动多个所述注射器以独立速度进行液剂输出；所述氧合器位于所述注射头的上游管路中，用于对混合液剂中的血红蛋白进行预氧化处理。
在一些实施方案中，所述高分子聚合血红蛋白中分子量为320kD～1024kD的聚合血红蛋白含量为95％-99％(如为95％、97％或99％)；相应地，在其制备方法中320kD～1024kD的蛋白含量指标进行适应性变化。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
高分子聚合血红蛋白30g，
葡萄糖9g，
肝素钠25000u，
氯化钠7g，
头孢西丁钠2g，
碳酸氢钠1.25g，
10％复方氨基酸注射液50mL，
注射用12种复合维生素0.2mL，
胰岛素180u，和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
高分子聚合血红蛋白40g，
葡萄糖10g，
肝素钠30000u，
氯化钠8g，
头孢西丁钠3g，
碳酸氢钠1.5g，
10％复方氨基酸注射液60mL，
注射用12种复合维生素0.3mL，
胰岛素200u，和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
高分子聚合血红蛋白20g，
葡萄糖8g，
肝素钠20000u，
氯化钠6g，
头孢西丁钠1g，
碳酸氢钠1g，
10％复方氨基酸注射液40mL，
注射用12种复合维生素0.1mL，
胰岛素160u，和
余量水。
在一些实施方案中，所述头孢西丁钠为注射用头孢西丁钠。
在一些实施方案中，所述水为注射水。
在一些实施方案中，所述10％复方氨基酸注射液为辰欣药业生产的10％复方氨基酸注射液。
在一些实施方案中，所述注射用12种复合维生素为山西普德药业股份有限公司生产的“注射用12种复合维生素”。
在一些实施方案中，所述静脉给药装置中还设有一个静态混合器；所述静态混合器位于所述氧合器的上游位置，用于对多个所述注射器输出的不同液剂进行静态混合。
在一些实施方案中，所述静脉给药装置中还设有排气管，并且所述排气管位于所述注射头和所述氧合器之间。
在一些实施方案中，在每一个所述注射器的出口位置分别设有一个单向阀。
在一些实施方案中，在每一个所述注射器的出口位置分别设有一个截止阀。
在一些实施方案中，所述截止阀采用电控截止阀。
在一些实施方案中，所述定量推进器选用步进电机驱动，并且由PLC控制系统进行所述步进电机与所述截止阀的联动控制。
在一些实施方案中，所述定量推进器由电机、驱动带、推杆、导向板组成；其中，所述导向板上设有位置传感器，所述推杆穿过所述导向板后一端与所述注射器连接，另一端与所述驱动带的一端连接，所述驱动带的另一端与所述电机的输出轴连接；所述位置传感器与所述导向板活动连接，可以沿所述推杆往复移动的方向调整其固定位置，并且与所述推杆接触时控制所述电机停止运转。
在本发明的第六方面，本发明提供了一种静脉给药的方法，其包括：
向受试者静脉注射有效量的离体器官灌注液，所述静脉注射是利用静脉给药装置进行的，
其中：
基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：高分子聚合血红蛋白20g-40g(如25g、30g或35g)，葡萄糖8g-10g(如8.5g、9g或9.5g)，肝素钠20000u-30000u(23000u、25000u或27000u)，氯化钠6g-8g(如6.5g、7g或7.5g)，头孢西丁钠1g-3g(如1.5g、2g或2.5g)，碳酸氢钠1g-1.5g(如1.0g、1.25g或1.5g)，10％复方氨基酸注射液40mL-60mL(如45mL、50mL或55mL)，注射用12种复合维生素0.1mL-0.3mL(如0.15mL、0.2mL或0.25mL)，胰岛素160u-200u(如170u、180u或190u)，和余量水；
其中，所述高分子聚合血红蛋白中分子量为320kD-1024kD的聚合血红蛋白含量≥95％，且所述高分子聚合血红蛋白是通过如下方法获得的：
利用60μm的深层过滤器过滤血液，获得红细胞；利用0.65μm中空纤维膜洗涤所述红细胞；利用低渗液裂解所述洗涤后的所述红细胞，获得裂解产物；通过100KD超滤所述裂解产物获得粗纯血红蛋白；利用阴离子交换层析纯化所述粗纯血红蛋白，获得精纯血红蛋白；将戊二醛以雾化的方式与所述精纯血红蛋白进行聚合反应；利用硼氢化钠终止所述聚合反应，并进行300KD超滤换液，获得所述聚合血红蛋白，所述聚合血红蛋白的指标要求为：分子量320kD～1024kD≥95％，高铁血红蛋白<5％，氧合血红蛋白<5％；
其中：
所述静脉给药装置包括多个注射器、多个定量推注器、注射头以及氧合器；其中，多个所述注射器中分别设有不同液剂，且至少一个所述注射器中设有所述离体器官灌注液，多个所述注射器之间通过管路形成并联连接后汇流至所述注射头；多个定量推注器分别与多个注射器进行连接，以驱动多个所述注射器以独立速度进行液剂输出；所述氧合器位于所述注射头的上游管路中，用于对混合液剂中的血红蛋白进行预氧化处理。
在一些实施方案中，所述高分子聚合血红蛋白是通过如下方法获得的：
采集新鲜血液1L，用0.5～1倍于血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液进行稀释；
用60μm的深层过滤器过滤所述稀释后的所述血液，并用6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗60μm的深层过滤器上的残留物直至通过所述过滤器的血红蛋白达到95％以上；
将上述通过60μm的深层过滤器的物质置于0.65μm中空纤维膜上，使用5～8倍于初始血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗0.65μm中空纤维膜上的物质使得小于0.65μm的物质通过0.65μm中空纤维膜；
向被0.65μm中空纤维膜截留的物质按1:1～2于初始血液体积加入注射水以裂解红细胞，用100KD滤膜超滤裂解的红细胞，透过端为所需的血红蛋白，同时依据透过速率加入注射用水以保持恒定的超滤体积，直至血红蛋白的收率≥95％，停止100KD超滤；
用30KD膜包浓缩前述经100KD滤膜纯化的血红蛋白至其浓度为血红蛋白浓度10～14g/dL；
将上述浓度为10～14g/dL的纯化的血红蛋白经阴离子层析纯化(20mM tris的溶液平衡柱子→40min上完样品→3倍于浓度为10～14g/dL的纯化的血红蛋白体积的29Mmtris溶液洗杂→4-5倍于浓度为10～14g/dL的纯化的血红蛋白体积的50mM tris溶液洗脱)以得到精纯的血红蛋白；
将上述获得的精纯的血红蛋白置于30KD滤膜上，用3倍于精纯的血红蛋白体积的50mM磷酸氢二钠缓冲换液；
然后通入惰性气体脱氧至氧合血红蛋白小于5％，按1g血红蛋白35～45mg戊二醛的比例以雾化的方法加入戊二醛(具体见已有专利：201910846580.9)，接着按1g的血红蛋白13～18mg的硼氢化钠终止聚合反应；
接着将获得的聚合血红蛋白浓缩至6-7g/dL，将浓缩至6-7g/dL的聚合血红蛋白置于300KD的超滤膜包上，使用5～10倍于6-7g/dL的聚合血红蛋白的体积的乳酸林格氏液(氯化钠6.73g/L、氯化钾0.3g/L、二水氯化钙0.2g/L、40％乳酸钠3.07g/L、N-乙酰-L-半胱氨酸22g/L)换液得到聚合血红蛋白，在换液过程中分子量320～1024kD的蛋白含量达到≥95％指标时，收集蛋白溶液，通入惰性气体进行脱氧至氧合血红蛋白含量≤5％，0.2μm过滤除菌，获得所述高分子聚合血红蛋白。
在一些实施方案中，所述高分子聚合血红蛋白中分子量为320kD～1024kD的聚合血红蛋白含量为95％-99％(如为95％、97％或99％)；相应地，在其制备方法中320kD～1024kD的蛋白含量指标进行适应性变化。
在一些实施方案中，基于每10g的高分子聚合血红蛋白，所述离体器官灌注液包括：
高分子聚合血红蛋白10g，
葡萄糖2.5g-4g(如3g或3.5g)，
肝素钠7500u-10000u(8000u、8333u、8500u、9000u或9500u)，
氯化钠2g-3g(如2.3g、2.5g或2.7g)，
头孢西丁钠0.5g-0.75g(如0.55g、0.6g、0.65g、0.66g或0.7g)，
碳酸氢钠0.37g-0.5g(如0.375g、0.4g、0.42g、0.45g、0.47g或0.49g)，
10％复方氨基酸注射液15mL-20mL(如16.5mL、16.7mL、17mL、18mL、19mL或19.5mL)，
注射用12种复合维生素0.05mL-0.08mL(如0.055mL、0.06mL、0.065mL、0.066mL、0.07mL或0.075mL)，
胰岛素50u-80u(如55u、60u、65u、70u或75u),和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
高分子聚合血红蛋白30g，
葡萄糖9g，
肝素钠25000u，
氯化钠7g，
头孢西丁钠2g，
碳酸氢钠1.25g，
10％复方氨基酸注射液50mL，
注射用12种复合维生素0.2mL，
胰岛素180u，和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
高分子聚合血红蛋白40g，
葡萄糖10g，
肝素钠30000u，
氯化钠8g，
头孢西丁钠3g，
碳酸氢钠1.5g，
10％复方氨基酸注射液60mL，
注射用12种复合维生素0.3mL，
胰岛素200u，和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
高分子聚合血红蛋白20g，
葡萄糖8g，
肝素钠20000u，
氯化钠6g，
头孢西丁钠1g，
碳酸氢钠1g，
10％复方氨基酸注射液40mL，
注射用12种复合维生素0.1mL，
胰岛素160u，和
余量水。
在一些实施方案中，所述头孢西丁钠为注射用头孢西丁钠。
在一些实施方案中，所述水为注射水。
在一些实施方案中，所述10％复方氨基酸注射液为辰欣药业生产的10％复方氨基酸注射液。
在一些实施方案中，所述注射用12种复合维生素为山西普德药业股份有限公司生产的“注射用12种复合维生素”。
在一些实施方案中，所述静脉给药装置中还设有一个静态混合器；所述静态混合器位于所述氧合器的上游位置，用于对多个所述注射器输出的不同液剂进行静态混合。
在一些实施方案中，所述静脉给药装置中还设有排气管，并且所述排气管位于所述注射头和所述氧合器之间。
在一些实施方案中，在每一个所述注射器的出口位置分别设有一个单向阀。
在一些实施方案中，在每一个所述注射器的出口位置分别设有一个截止阀。
在一些实施方案中，所述截止阀采用电控截止阀。
在一些实施方案中，所述定量推进器选用步进电机驱动，并且由PLC控制系统进行所述步进电机与所述截止阀的联动控制。
在一些实施方案中，所述定量推进器由电机、驱动带、推杆、导向板组成；其中，所述导向板上设有位置传感器，所述推杆穿过所述导向板后一端与所述注射器连接，另一端与所述驱动带的一端连接，所述驱动带的另一端与所述电机的输出轴连接；所述位置传感器与所述导向板活动连接，可以沿所述推杆往复移动的方向调整其固定位置，并且与所述推杆接触时控制所述电机停止运转。
在本发明的第七方面，本发明提供了一种静脉给药的方法，其包括：
向受试者静脉注射有效量的离体器官灌注液，所述静脉注射是利用静脉给药装置进行的，
其中：
基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
基于每1g的硫氧还蛋白过氧化物酶II，所述离体器官灌注液包括：
聚合血红蛋白4～5g，如4.3g、4.5g或4.7g；
硫氧还蛋白过氧化物酶II 1g；
肝素钠3000～5000u，如3500u、3700u、4000u、4500u或4700u；
葡萄糖1～2g，如1.3g、1.5g或1.7g；
氯化钠0.8～1.5g，如1.0g、1.2g或1.4g；
头孢西丁钠0.25～0.3g，如0.26g、0.27g、0.28g或0.29g；
碳酸氢钠0.15～0.25g，如0.17g、0.18g、0.19g、0.20g、0.21g、0.22g或0.23g；
10％复方氨基酸注射液6～10mL，如7.5mL、8mL、8.5mL、9mL或9.5mL；
注射用12种复合维生素0.025～0.03mL，如0.026mL、0.027mL、0.028mL或0.029mL；和
余量水；
其中，所述聚合血红蛋白通过如下方法获得：
采集新鲜血液，用0.5～1倍所述血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液进行稀释；
用60μm的深层过滤器过滤所述稀释后的所述血液，并用6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗60μm的深层过滤器上的残留物直至通过所述过滤器的血红蛋白达到95％以上；
将上述通过60μm的深层过滤器的物质置于0.65μm中空纤维膜上，使用5～8倍于初始血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗0.65μm中空纤维膜上的物质使得小于0.65μm的物质通过0.65μm中空纤维膜；
向被0.65μm中空纤维膜截留的物质按1:1～2于初始血液体积加入注射水以裂解红细胞，用100KD滤膜超滤裂解的红细胞，透过端为所需的血红蛋白，同时依据透过速率加入注射用水以保持恒定的超滤体积，直至血红蛋白的收率≥95％，停止100KD超滤；
用30KD膜包浓缩前述经100KD滤膜纯化的血红蛋白至其浓度为血红蛋白浓度10～14g/dl；
将上述浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白经阴离子层析纯化(20mM tris的溶液平衡柱子→40min上完样品→3倍于浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白体积的29Mmtris溶液洗杂→4-5倍于浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白体积的50mM tris溶液洗脱)以得到精纯的血红蛋白；
将上述获得的精纯的血红蛋白置于30KD滤膜上，用3倍于精纯的血红蛋白体积的50mM磷酸氢二钠缓冲换液；
然后通入惰性气体脱氧至氧合血红蛋白小于5％，按1g血红蛋白35～45mg戊二醛的比例以雾化的方法加入戊二醛(具体见已有专利：201910846580.9)，接着按1g的血红蛋白13～18mg的硼氢化钠终止聚合反应；
接着将获得的聚合血红蛋白浓缩至6-7g/dL，将浓缩至6-7g/dL的聚合血红蛋白置于30KD的超滤膜包上，使用5～8倍于6-7g/dL的聚合血红蛋白的体积的乳酸林格氏液(氯化钠6.73g/L、氯化钾0.3g/L、二水氯化钙0.2g/L、40％乳酸钠3.07g/L、N-乙酰-L-半胱氨酸22g/L)换液得到聚合血红蛋白，通入惰性气体进行脱氧至氧合血红蛋白含量≤5％，0.2um过滤除菌，获得所述聚合血红蛋白；
其中：
所述静脉给药装置包括多个注射器、多个定量推注器、注射头以及氧合器；其中，多个所述注射器中分别设有不同液剂，且至少一个所述注射器中设有所述离体器官灌注液，多个所述注射器之间通过管路形成并联连接后汇流至所述注射头；多个定量推注器分别与多个注射器进行连接，以驱动多个所述注射器以独立速度进行液剂输出；所述氧合器位于所述注射头的上游管路中，用于对混合液剂中的血红蛋白进行预氧化处理。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
聚合血红蛋白30g，
硫氧还蛋白过氧化物酶II 6.7g，
肝素钠25000u，
葡萄糖9g，
氯化钠7g，
头孢西丁钠2g，
碳酸氢钠1.25g，
10％复方氨基酸注射液50mL，
注射用12种复合维生素0.2mL，和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
聚合血红蛋白40g，
硫氧还蛋白过氧化物酶II 10g，
肝素钠30000u，
葡萄糖10g，
氯化钠8g，
头孢西丁钠3g，
碳酸氢钠1.5g，
10％复方氨基酸注射液60mL，
注射用12种复合维生素0.3mL，和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
聚合血红蛋白20g，
硫氧还蛋白过氧化物酶II 4g，
肝素钠20000u，
葡萄糖8g，
氯化钠6g，
头孢西丁钠1g，
碳酸氢钠1g，
10％复方氨基酸注射液40mL，
注射用12种复合维生素0.1mL，和
余量水。
在一些实施方案中，所述头孢西丁钠为注射用头孢西丁钠。
在一些实施方案中，所述水为注射水。
在一些实施方案中，所述10％复方氨基酸注射液为辰欣药业生产的10％复方氨基酸注射液。
在一些实施方案中，所述注射用12种复合维生素为山西普德药业股份有限公司生产的“注射用12种复合维生素”。
在一些实施方案中，所述静脉给药装置中还设有一个静态混合器；所述静态混合器位于所述氧合器的上游位置，用于对多个所述注射器输出的不同液剂进行静态混合。
在一些实施方案中，所述静脉给药装置中还设有排气管，并且所述排气管位于所述注射头和所述氧合器之间。
在一些实施方案中，在每一个所述注射器的出口位置分别设有一个单向阀。
在一些实施方案中，在每一个所述注射器的出口位置分别设有一个截止阀。
在一些实施方案中，所述截止阀采用电控截止阀。
在一些实施方案中，所述定量推进器选用步进电机驱动，并且由PLC控制系统进行所述步进电机与所述截止阀的联动控制。
在一些实施方案中，所述定量推进器由电机、驱动带、推杆、导向板组成；其中，所述导向板上设有位置传感器，所述推杆穿过所述导向板后一端与所述注射器连接，另一端与所述驱动带的一端连接，所述驱动带的另一端与所述电机的输出轴连接；所述位置传感器与所述导向板活动连接，可以沿所述推杆往复移动的方向调整其固定位置，并且与所述推杆接触时控制所述电机停止运转。
在本发明的第八方面，本发明提供了一种静脉给药的方法，其包括：
向受试者静脉注射有效量的离体器官灌注液，所述静脉注射是利用静脉给药装置进行的，
其中：
所述离体器官灌注液包括：聚合血红蛋白和硫氧还原蛋白过氧化物酶；
其中：
所述静脉给药装置包括多个注射器、多个定量推注器、注射头以及氧合器；其中，多个所述注射器中分别设有不同液剂，且至少一个所述注射器中设有所述离体器官灌注液，多个所述注射器之间通过管路形成并联连接后汇流至所述注射头；多个定量推注器分别与多个注射器进行连接，以驱动多个所述注射器以独立速度进行液剂输出；所述氧合器位于所述注射头的上游管路中，用于对混合液剂中的血红蛋白进行预氧化处理。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液包括：
聚合血红蛋白20～40g，如25g、30g或35g；
硫氧还蛋白过氧化物酶4～10g，如6g、6.7g或8g。
在一些实施方案中，所述聚合血红蛋白与所述硫氧还原蛋白过氧化物酶的重量比为4：1～5：1，如为4.3：1、4.5：1或4.7：1。
在一些实施方案中，所述离体器官灌注液进一步包括：
肝素钠；
葡萄糖；
氯化钠；
头孢西丁钠；
碳酸氢钠；
10％复方氨基酸注射液；和
注射用12种复合维生素。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液进一步包括：
肝素钠20000～30000u，如23000u、25000u或27000u；
葡萄糖8～10g，如8.5g、9g或9.5g；
氯化钠6～8g，如6.5g、7g或7.5g；
头孢西丁钠1～3g，如1.5g、2g或2.5g；
碳酸氢钠1～1.5g，如1.0g、1.25g或1.5g；
10％复方氨基酸注射液40～60mL，如45mL、50mL或55mL；
注射用12种复合维生素0.1～0.3mL，如0.15mL、0.2mL或0.25mL。
在一些实施方案中，基于每1g的硫氧还蛋白过氧化物酶，所述离体器官灌注液包括：
聚合血红蛋白4～5g，如4.3g、4.5g或4.7g；
硫氧还蛋白过氧化物酶1g；
肝素钠3000～5000u，如3500u、3700u、4000u、4500u或4700u；
葡萄糖1～2g，如1.3g、1.5g或1.7g；
氯化钠0.8～1.5g，如1.0g、1.2g或1.4g；
头孢西丁钠0.25～0.3g，如0.26g、0.27g、0.28g或0.29g；
碳酸氢钠0.15～0.25g，如0.17g、0.18g、0.19g、0.20g、0.21g、0.22g或0.23g；
10％复方氨基酸注射液6～10mL，如7.5mL、8mL、8.5mL、9mL或9.5mL；
注射用12种复合维生素0.025～0.03mL，如0.026mL、0.027mL、0.028mL或0.029mL。
在上述的实施方案中，在所述离体器官灌注液中还可以加入160-200U胰岛素，例如万邦金桥制药公司生产的胰岛素；优选，180U胰岛素，例如万邦金桥制药公司生产的胰岛素。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
聚合血红蛋白20～40g；
硫氧还蛋白过氧化物酶4～10g；
肝素钠20000～30000u；
葡萄糖8～10g；
氯化钠6～8g；
头孢西丁钠1～3g；
碳酸氢钠1～1.5g；
10％复方氨基酸注射液40～60mL；
注射用12种复合维生素0.1～0.3mL；和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
聚合血红蛋白30g，
硫氧还蛋白过氧化物酶6.7g，
肝素钠25000u，
葡萄糖9g，
氯化钠7g，
头孢西丁钠2g，
碳酸氢钠1.25g
10％复方氨基酸注射液50mL，
注射用12种复合维生素0.2mL，和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
聚合血红蛋白40g，
硫氧还蛋白过氧化物酶10g，
肝素钠30000u，
葡萄糖10g，
氯化钠8g，
头孢西丁钠3g，
碳酸氢钠1.5g,
10％复方氨基酸注射液60mL，
注射用12种复合维生素0.3mL，和
余量水。
在一些实施方案中，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
聚合血红蛋白20g，
硫氧还蛋白过氧化物酶4g，
肝素钠20000u，
葡萄糖8g，
氯化钠6g，
头孢西丁钠1g，
碳酸氢钠1g,
10％复方氨基酸注射液40mL，
注射用12种复合维生素0.1mL，和
余量水。
在一些实施方案中，所述硫氧还蛋白过氧化物酶为硫氧还蛋白过氧化物酶II。
在一些实施方案中，所述头孢西丁钠为注射用头孢西丁钠。
在一些实施方案中，所述水为注射水。
在一些实施方案中，所述10％复方氨基酸注射液为辰欣药业生产的10％复方氨基酸注射液。
在一些实施方案中，所述注射用12种复合维生素为山西普德药业股份有限公司生产的“注射用12种复合维生素”。
在一些实施方案中，所述聚合血红蛋白是通过如下方法获得的：
利用60μm的深层过滤器过滤血液，获得红细胞；利用0.65μm中空纤维膜洗涤所述红细胞；利用低渗液裂解所述洗涤后的所述红细胞，获得裂解产物；通过100KD超滤所述裂解产物获得粗纯血红蛋白；利用阴离子交换层析纯化所述粗纯血红蛋白，获得精纯血红蛋白；将戊二醛以雾化的方式与所述精纯血红蛋白进行聚合反应；利用硼氢化钠终止所述聚合反应，并进行30KD超滤换液，获得所述聚合血红蛋白。
在一些实施方案中，所述聚合血红蛋白是通过如下方法获得的：
采集新鲜血液，用0.5～1倍所述血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液进行稀释；
用60μm的深层过滤器过滤所述稀释后的所述血液，并用6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗60μm的深层过滤器上的残留物直至通过所述过滤器的血红蛋白达到95％以上；
将上述通过60μm的深层过滤器的物质置于0.65μm中空纤维膜上，使用5～8倍于初始血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗0.65μm中空纤维膜上的物质使得小于0.65μm的物质通过0.65μm中空纤维膜；
向被0.65μm中空纤维膜截留的物质按1:1～2于初始血液体积加入注射水以裂解红细胞，用100KD滤膜超滤裂解的红细胞，透过端为所需的血红蛋白，同时依据透过速率加入注射用水以保持恒定的超滤体积，直至血红蛋白的收率≥95％，停止100KD超滤；
用30KD膜包浓缩前述经100KD滤膜纯化的血红蛋白至其浓度为血红蛋白浓度10～14g/dl；
将上述浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白经阴离子层析纯化(20mM tris的溶液平衡柱子→40min上完样品→3倍于浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白体积的29Mmtris溶液洗杂→4-5倍于浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白体积的50mM tris溶液洗脱)以得到精纯的血红蛋白；
将上述获得的精纯的血红蛋白置于30KD滤膜上，用3倍于精纯的血红蛋白体积的50mM磷酸氢二钠缓冲换液；
然后通入惰性气体脱氧至氧合血红蛋白小于5％，按1g血红蛋白35～45mg戊二醛的比例以雾化的方法加入戊二醛(具体见已有专利：201910846580.9)，接着按1g的血红蛋白13～18mg的硼氢化钠终止聚合反应；
接着将获得的聚合血红蛋白浓缩至6-7g/dL，将浓缩至6-7g/dL的聚合血红蛋白置于30KD的超滤膜包上，使用5～8倍于6-7g/dL的聚合血红蛋白的体积的乳酸林格氏液(氯化钠6.73g/L、氯化钾0.3g/L、二水氯化钙0.2g/L、40％乳酸钠3.07g/L、N-乙酰-L-半胱氨酸22g/L)换液得到聚合血红蛋白，通入惰性气体进行脱氧至氧合血红蛋白含量≤5％，0.2um过滤除菌，获得所述聚合血红蛋白。
在上述的实施方案中，在所述离体器官灌注液中还可以加入160-200U胰岛素，例如万邦金桥制药公司生产的胰岛素；优选，180U胰岛素，例如万邦金桥制药公司生产的胰岛素。
在一些实施方案中，所述静脉给药装置中还设有一个静态混合器；所述静态混合器位于所述氧合器的上游位置，用于对多个所述注射器输出的不同液剂进行静态混合。
在一些实施方案中，所述静脉给药装置中还设有排气管，并且所述排气管位于所述注射头和所述氧合器之间。
在一些实施方案中，在每一个所述注射器的出口位置分别设有一个单向阀。
在一些实施方案中，在每一个所述注射器的出口位置分别设有一个截止阀。
在一些实施方案中，所述截止阀采用电控截止阀。
在一些实施方案中，所述定量推进器选用步进电机驱动，并且由PLC控制系统进行所述步进电机与所述截止阀的联动控制。
在一些实施方案中，所述定量推进器由电机、驱动带、推杆、导向板组成；其中，所述导向板上设有位置传感器，所述推杆穿过所述导向板后一端与所述注射器连接，另一端与所述驱动带的一端连接，所述驱动带的另一端与所述电机的输出轴连接；所述位置传感器与所述导向板活动连接，可以沿所述推杆往复移动的方向调整其固定位置，并且与所述推杆接触时控制所述电机停止运转。
有益效果
一方面：
1、本发明制备的大分子量聚合血红蛋白(分子量320kD～1024kD≥95％)，可发挥更长时间载氧和释氧功能，有效延长了器官的灌注保存时间；
2、本发明通过加入本发明的高分子聚合血红蛋白，极大地延长了体外器官保存的时间，为因供体与受体的错配时间差、异地移植等问题提供了充分的解决时间，减少了因保存时间短造成的器官浪费现象，提高了移植器官的利用率；
3、本发明提供的在常温下携氧灌注液，解决了在缺氧的条件下保存的器官，在其移植再灌注中会造成显著的二次损伤的问题，同时满足常温灌注的条件；
4、随着器官移植的逐年增加及不可预料的对长时间器官保存的需求，本发明具有重要的临床应用价值，具有可推广性；
5、本发明包含大分子量聚合血红蛋白(分子量320kD～1024kD≥95％)的灌注液与本发明的离体器官灌注装置的组合实现了对离体器官的有效灌注，可以有效延长离体器官的保存时间。
另一方面：
1、加入的硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ与聚合血红蛋白在灌注液中的相互协同作用，降低了聚合血红蛋白的降解速率，使聚合血红蛋白更长时间的发挥携氧作用。另外，灌注液中硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ通过与聚合血红蛋白的协同配合，还对组织中一氧化氮的生产与清除具有重要的调控作用，这些特性有效的中和了聚合血红蛋白在这方面的副作用，可以更长时间的维持NO、ET-1等器官活性指标在正常范围内；
2、本发明通过硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ与聚合血红蛋白的联合使用极大的延长了体外器官保存的时间，为因供体与受体的错配时间差、异地移植等问题提供了充分的解决时间，减少了因保存时间短造成的器官浪费现象，提高了移植器官的利用率；
3、本发明提供的在常温下携氧灌注液，解决了在缺氧的条件下保存的器官，在其移植再灌注中会造成显著的二次损伤的问题。
4、随着器官移植的逐年增加及不可预料的对长时间器官保存的需求，本发明具有重要的临床应用价值，具有可推广性；
5、本发明包含聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶的灌注液与本发明的离体器官灌注装置的组合实现了对离体器官的有效灌注，可以有效延长离体器官的保存时间。
附图说明
图1为本发明实施例1中用于器官机械灌注的装置结构示意图；
图2为本发明实施例2中用于器官机械灌注的装置结构示意图；
图3为本发明实施例3中用于器官机械灌注的装置结构示意图；
图4为根据本发明实施例的灌注器官的示意图；
图5为本发明实施例静脉给药装置的结构示意图；
图6为本发明实施例中定量推注器与注射器连接的结构示意图；
图7是根据本发明一个实施例的制造过程的示例性图示；
图8是对大鼠模型进行的4小时连续输注研究的示例性图示，随时间监测并分析受试动物的血浆血红蛋白水平、平均动脉压、心率和心输出量。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明的一个目的是提供一种维持一个器官的方法，包括：将一种成分输送到该器官，从而维持该器官的生存能力，其中该成分包括一种稳定的血红蛋白或者灌注液，其浓度在每升50克(g/L)到200克/升之间，并且含有每毫升(mg/mL)溶解氧少于0.02毫克(mg)，其中：
所述灌注液是通过如下方法获得的：
聚合血红蛋白20～40g，硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ4～10g，肝素钠20000～30000u，葡萄糖8～10g，氯化钠6～8g，注射用头孢西丁钠1～3g，碳酸氢钠1.0～1.5g，10％复方氨基酸注射液40～60ml，注射用12种复合维生素0.1～0.3ml，加注射水至1000mL，通入惰性气体进行脱氧，直到氧合血红蛋白含量<5％，密封隔氧保存；
或者，所述灌注液是通过如下方法获得的：
聚合血红蛋白(分子量320kD～1024kD≥95％)20～40g，肝素钠20000～30000u，葡萄糖8～10g，氯化钠6～8g，注射用头孢西丁钠1～3g，碳酸氢钠1～1.5g，10％复方氨基酸注射液40～60mL，注射用12种复合维生素0.1～0.3mL、胰岛素160～200U，加注射水至1000mL，通入惰性气体进行脱氧，直到氧合血红蛋白含量<5％，密封隔氧保存。
在一些实施方案中，所述递送所述组合物是使用灌注装置来执行的。
在一些实施方案中，所述灌注装置包括容器、泵单元、氧合器、温度控制单元、压力传感器、温度传感器、流量传感器、流体流量组件、超滤系统或其任何组合。
在一些实施方案中，所述器官从供体中移除。
在一些实施方案中，所述器官是植入人体以代替自然器官的人工器官。
在一些实施方案中，所述器官为心脏、肾脏、肝脏、肺、胰腺、肠或胸腺。
本发明的另一个目的是提供一种准备移植器官的方法，包括：a)从捐赠者那里获得器官；b)使含有浓度在50克/升(g/L)到200克/升之间的稳定血红蛋白或灌注液和浓度小于0.02毫克/毫升(mg/mL)的溶解氧的成分氧化，以形成含氧血红蛋白成分；以及c)将含氧血红蛋白成分输送到器官，从而在器官移植之前维持器官的生存能力，
其中：
所述灌注液是通过如下方法获得的：
聚合血红蛋白20～40g，硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ4～10g，肝素钠20000～30000u，葡萄糖8～10g，氯化钠6～8g，注射用头孢西丁钠1～3g，碳酸氢钠1.0～1.5g，10％复方氨基酸注射液40～60ml，注射用12种复合维生素0.1～0.3ml，加注射水至1000mL进行离体器官灌注，通入惰性气体进行脱氧，直到氧合血红蛋白含量<5％，密封隔氧保存；
或者，所述灌注液是通过如下方法获得的：
聚合血红蛋白(分子量320kD～1024kD≥95％)20～40g，肝素钠20000～30000u，葡萄糖8～10g，氯化钠6～8g，注射用头孢西丁钠1～3g，碳酸氢钠1～1.5g，10％复方氨基酸注射液40～60mL，注射用12种复合维生素0.1～0.3mL、胰岛素160～200U，加注射水至1000mL，通入惰性气体进行脱氧，直到氧合血红蛋白含量<5％，密封隔氧保存。
在一些实施方案中，使用灌注装置进行充氧和/或输送。
在一些实施方案中，所述灌注装置包括容器、泵单元、氧合器、温度控制单元、压力传感器、温度传感器、流量传感器、流体流量组件、超滤系统或其任何组合。
在一些实施方案中，所述器官系从供体移除。
在一些实施方案中，所述器官是植入人体以代替自然器官的人工器官。
在一些实施方案中，所述器官为心脏、肾脏、肝脏、肺、胰腺、肠或胸腺。
在一些实施方案中，所述成分还包括配方缓冲液，所述配方缓冲液包含一种或多种硼酸盐、抗氧化剂和电解质。
在一些实施方案中，所述硼酸盐被还原。
在一些实施方案中，所述抗氧化剂包含N-乙酰-L-半胱氨酸。
在一些实施方案中，所述电解质包含Na、Cl及/或K。
在一些实施方案中，所述成分包含每毫升少于0.05个内毒素单位(EU)。
在一些实施方案中，所述内毒素包含细胞脂质、细胞脂质层或脂多糖。
在一些实施方案中，所述细胞脂质、细胞脂质层或脂多糖来源于人类细胞、非人类脊椎动物细胞、微生物或细菌。
在一些实施方案中，所述血红蛋白在收获后15天内从收获的红细胞中分离或衍生。
在一些实施方案中，所述血红蛋白在收获后10天内从收获的红细胞中分离或衍生。
在一些实施方案中，所述血红蛋白包含从非人类动物、非人类细胞或非人类细胞系分离或衍生的血红蛋白。
在一些实施方案中，所述非人类动物系牛种。
在一些实施方案中，所述成分在环境温度下稳定。
在一些实施方案中，所述成分在冷冻温度下稳定。
在一些实施方案中，所述成分在至少2℃的温度以上是稳定的。
在一些实施方案中，所述成分在40℃以下稳定。
在一些实施方案中，所述稳定血红蛋白为聚合的血红蛋白。
在一些实施方案中，所述稳定血红蛋白已与醛交联以形成血红蛋白谷氨酰胺。
在一些实施方案中，所述醛系戊二醛。
在一些实施方案中，所述稳定血红蛋白的平均分子量为200千道尔顿(kDa)。
在一些实施方案中，所述稳定血红蛋白在500kDa以上具有小于15％的分子量分布。
在一些实施方案中，所述稳定血红蛋白在用稳定剂稳定之前已基本脱氧。
在一些实施方案中，所述稳定化包含聚合。
在一些实施方案中，所述稳定化包含该稳定剂之还原。
在一些实施方案中，所述稳定血红蛋白通过过滤和/或用电解质溶液重过滤来浓缩。
在一些实施方案中，所述电解质溶液系生理电解质溶液。
在一些实施方案中，所述过滤系超滤。
在一些实施方案中，所述电解质溶液使高铁血红蛋白(MetHb)之形成最小化。
在一些实施方案中，所述电解质溶液包含N-乙酰-L-半胱氨酸。
在一些实施方案中，所述组合物包括：(a)低于10％高铁血红蛋白，任选低于6％高铁血红蛋白；和/或(b)低于10％血红蛋白二聚体，任选低于6％血红蛋白二聚体。
在一些实施方案中，所述高铁血红蛋白的水平通过比色法测量。
在一些实施方案中，血红蛋白二聚体的水平通过尺寸分离技术测量。
在一些实施方案中，所述组合物包含至少20％稳定的活性四聚血红蛋白，任选25％至35％稳定的活性四聚血红蛋白。
在一些实施方案中，所述组合物包含至少60％大于四聚体分子量血红蛋白低聚物，任选地至少70％大于四聚体分子量血红蛋白低聚物。
在一些实施方案中，所述稳定血红蛋白的半衰期比未稳定血红蛋白或含氧血红蛋白的半衰期更长，并且将四聚血红蛋白分解为二聚体从而导致肾毒性最小化。
在一些实施方案中，所述血红蛋白包括：
(a)亚单位α，其中亚单位α包含以下氨基酸序列：
1MVLSPADKTN VKAAWGKVGA HAGEYGAEAL ERMFLSFPTT KTYFPHFDLS HGSAQVKGHG
61 KKVADALTNA VAHVDDMPNA LSALSDLHAH KLRVDPVNFK LLSHCLLVTL AAHLPAEFTP
121 AVHASLDKFL ASVSTVLTSK YR
(SEQ ID NO:1)，
或者序列与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％的同源性，或者其中亚单位α由以下核酸序列编码：
Figure BDA0002465283840000441
(SEQ ID NO:2).
或者序列与SEQ ID NO:2的序列具有至少90％的同源性；
(b)或者亚单位β，其中亚单位β由以下氨基酸序列组成：
1MVHLTPEEKS AVTALWGKVN VDEVGGEALG RLLVVYPWTQ RFFESFGDLS TPDAVMGNPK
61 VKAHGKKVLG AFSDGLAHLD NLKGTFATLS ELHCDKLHVD PENFRLLGNV LVCVLAHHFG
121 KEFTPPVQAA YQKVVAGVAN ALAHKYH
(SEQ ID NO:3).
或者序列与SEQ ID NO:3的序列具有至少90％的同源性，或者其中亚单位β由以下核酸序列编码：
Figure BDA0002465283840000451
(SEQ ID NO:4).
或者序列与SEQ ID NO:4的序列具有至少90％的同源性；
(c)或者亚单位(γ)，或者其中亚单位γ由以下氨基酸序列组成：
1 MGHFTEEDKA TITSLWGKVN VEDAGGETLG RLLVVYPWTQ RFFDSFGNLS SASAIMGNPK
61 VKAHGKKVLT SLGDAIKHLD DLKGTFAQLS ELHCDKLHVD PENFKLLGNV LVTVLAIHFG
121 KEFTPEVQAS WQKMVTGVAS ALSSRYH
(SEQ ID NO:5),
或者序列与SEQ ID NO:5的序列具有至少90％的同源性，或者其中亚单位γ由以下核酸序列组成：
Figure BDA0002465283840000452
Figure BDA0002465283840000461
(SEQ ID NO:6),
或者序列与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％的同源性；
(d)或者其中亚单位(γ)，亚单位γ由以下氨基酸序列组成：
1 MGHFTEEDKA TITSLWGKVN VEDAGGETLG RLLVVYPWTQ RFFDSFGNLS SASAIMGNPK
61 VKAHGKKVLT SLGDATKHLD DLKGTFAQLS ELHCDKLHVD PENFKLLGNV LVTVLAIHFG
121 KEFTPEVQAS WQKMVTAVAS ALSSRYH
(SEQ ID NO:7),
或者序列与SEQ ID NO:7的序列具有至少90％的同源性，或者其中亚单位(γ)由以下核酸序列编码：
Figure BDA0002465283840000462
Figure BDA0002465283840000471
或者序列与SEQ ID NO:8的序列具有至少90％的同源性。
根据本发明的各个方面，提供了一种处理与氧有关的条件的系统、装置和方法。在某些方面，本发明提供了一种维持器官的方法，包括：向器官输送成分，从而维持器官的生存能力。其中，在一些实施例中，所述成分包括浓度在50克/升(g/L)到200克/升之间的稳定血红蛋白，并且包含小于0.02毫克/毫升(mg/mL)的溶解氧。在一些实施例中，稳定血红蛋白的浓度为50-100g/L、100-150g/L或150-200g/L。
在一些实施例中，使用灌注装置来执行递送该组合物。在一些实施例中，灌注装置包括容器、泵单元、氧合器、温度控制单元、压力传感器、温度传感器、流量传感器、流体流量组件或其任何组合。在一些实施例中，从供体移除器官。在一些实施例中，该器官是从人工器官移植到人体以代替自然器官的器官。在一些实施例中，该器官是心脏、肾脏、肝脏、肺、胰腺、肠或胸腺。
在一些方面，本发明提供了一种包含浓度在150克/升(g/L)到400克/升(包括终点)之间的稳定血红蛋白的成分，其中该成分包含小于0.02毫克/毫升(mg/mL)溶解氧。在一些实施例中，所述组合物还包括配方缓冲液，所述配方缓冲液包含一种或多种硼酸盐、抗氧化剂和电解质。在一些实施例中，硼酸盐被还原。在一些实施例中，抗氧化剂包含N-乙酰-L-半胱氨酸。在一些实施例中，电解质包含Na、Cl和/或K。在一些实施例中，所述组合物包含内毒素小于0.05EU/mL。在一些实施例中，血红蛋白包含从人类、人类细胞或人类细胞系分离或衍生的血红蛋白。在一些实施例中，血红蛋白是从不超过100个可变来源分离或衍生的。在一些实施例中，血红蛋白是从小于90、80、70、60、50、40、30、20、10、5或3个可变源分离或衍生的。在一些实施例中，血红蛋白是从单一来源分离或衍生的。在一些实施例中，血红蛋白是从采集的红细胞中分离或衍生的。在一些实施例中，血红蛋白在收获后15、10、5或2天内从收获的红细胞中分离或衍生。在一些实施例中，血红蛋白包括从非人类动物、非人类细胞或非人类细胞系分离或衍生的血红蛋白。在一些实施例中，血红蛋白在收获后15、10、5或2天内从收获的红细胞中分离或衍生。在一些实施例中，非人类动物是非人类脊椎动物、非人类灵长类动物、鲸目动物、哺乳动物、爬行动物、鸟、两栖动物或鱼。在一些实施例中，非人类动物是牛物种。在一些实施例中，非人类动物是绵羊物种。在一些实施例中，捕获的鸟属于鹦形目、雀形目或鸽形目。在一些实施例中，非人类动物不是为食物而饲养的雏鸟。
在一些实施例中，由本稳定血红蛋白溶液组成的血红蛋白包含亚单位α(α)，其中亚单位α包含以下氨基酸序列：
1MVLSPADKTN VKAAWGKVGAHAGEYGAEAL ERMFLSFPTT KTYFPHFDLS HGSAQVKGHG
61 KKVADALTNA VAHVDDMPNA LSALSDLHAH KLRVDPVNFK LLSHCLLVTL AAHLPAEFTP
121 AVHASLDKFL ASVSTVLTSK YR
(SEQ ID NO:1)，
或者序列与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％的同源性，或者其中亚单位α由以下核酸序列编码：
Figure BDA0002465283840000481
(SEQ ID NO:2).
或者序列与SEQ ID NO:2的序列具有至少90％的同源性，
或者其中亚单位β由以下氨基酸序列组成：
1 MVHLTPEEKS AVTALWGKVN VDEVGGEALG RLLVVYPWTQ RFFESFGDLS TPDAVMGNPK
61 VKAHGKKVLG AFSDGLAHLD NLKGTFATLS ELHCDKLHVD PENFRLLGNV LVCVLAHHFG
121 KEFTPPVQAA YQKVVAGVAN ALAHKYH
(SEQ ID NO:3).
或者序列与SEQ ID NO:3的序列具有至少90％的同源性，或者其中亚单位β由以下核酸序列编码：
Figure BDA0002465283840000491
(SEQ ID NO:4).
或者序列与SEQ ID NO:4的序列具有至少90％的同源性，
或者其中亚单位γ由以下氨基酸序列组成：
1 MGHFTEEDKA TITSLWGKVN VEDAGGETLG RLLVVYPWTQ RFFDSFGNLS SASAIMGNPK
61 VKAHGKKVLT SLGDAIKHLD DLKGTFAQLS ELHCDKLHVD PENFKLLGNV LVTVLAIHFG
121 KEFTPEVQAS WQKMVTGVAS ALSSRYH
(SEQ ID NO:5),
或者序列与SEQ ID NO:5的序列具有至少90％的同源性，或者其中亚单位γ由以下核酸序列组成：
Figure BDA0002465283840000492
Figure BDA0002465283840000501
(SEQ ID NO:6),
或者序列与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％的同源性，
或者其中亚单位γ由以下氨基酸序列组成：
1 MGHFTEEDKA TITSLWGKVN VEDAGGETLG RLLVVYPWTQ RFFDSFGNLS SASAIMGNPK
61 VKAHGKKVLT SLGDATKHLD DLKGTFAQLS ELHCDKLHVD PENFKLLGNV LVTVLAIHFG
121 KEFTPEVQAS WQKMVTAVAS ALSSRYH
(SEQ ID NO:7),
或者序列与SEQ ID NO:7的序列具有至少90％的同源性，或者其中亚单位γ由以下核酸序列编码：
Figure BDA0002465283840000502
或者序列与SEQ ID NO:8的序列具有至少90％的同源性。
在一些实施例中，该组合物在环境温度下稳定。在一些实施例中，该组合物在冷冻温度下稳定。在一些实施例中，所述成分在至少2℃的温度以上稳定。在一些实施例中，所述成分在40℃的温度以下稳定。
在一些实施例中，内毒素包括细胞脂质、细胞脂质层或脂多糖。在一些实施例中，细胞脂质、细胞脂质层或脂多糖来自人类细胞。在一些实施例中，细胞脂质、细胞脂质层或脂多糖来自非人类脊椎动物细胞。在一些实施例中，细胞脂质、细胞脂质层或脂多糖来自微生物。在一些实施例中，细胞脂质、细胞脂质层和脂多糖来自细菌。
在一些实施方案中，稳定化的血红蛋白是非天然存在的。在一些实施方案中，稳定化的血红蛋白被聚合。在一些实施方案中，稳定化的血红蛋白已经与醛交联以形成血红蛋白谷氨酸。在一些实施方案中，醛是戊二醛。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白具有200千道尔顿(kDa)的平均分子量。在一些实施方案中，稳定化的血红蛋白在500kDa上具有小于15％的分子量分布。在一些实施方案中，在用稳定剂稳定化之前，已稳定化的血红蛋白已经基本脱氧。在一些实施方案中，稳定化包括聚合。在一些实施方案中，稳定包括还原稳定剂。在一些实施方案中，通过用电解质溶液过滤和/或渗滤来浓缩稳定化的血红蛋白。在一些实施方案中，电解质溶液是生理电解质溶液。在一些实施方案中，过滤是超滤。在一些实施方案中，电解质溶液使高铁血红蛋白(MetHb)的形成最小化。在一些实施方案中，电解质溶液包含N-乙酰基-L-半胱氨酸。
在一些实施方案中，该组合物包含：(a)小于10％的高铁血红蛋白(MetHb)，任选地小于6％的高铁血红蛋白(MetHb)；和/或(b)小于10％的血红蛋白二聚体，可选地小于6％的血红蛋白二聚体。在一些实施方案中，MetHb的水平通过比色法测量。在一些实施方案中，血红蛋白二聚体的水平通过大小分离技术测量。在一些实施方案中，该组合物包含至少20％的稳定的活性四聚体血红蛋白，任选地25％至35％的稳定的活性四聚体血红蛋白。在一些实施方案中，所述组合物包含比四聚体分子量大至少四分之一的血红蛋白低聚物，任选地比四聚体分子量大至少四分之一的血红蛋白低聚物。在一些实施方案中，稳定化的血红蛋白比未稳定化或氧化的血红蛋白具有更长的半衰期，并且使四聚体血红蛋白分解成引起肾毒性的二聚体最小化。在一些实施方案中，稳定化的血红蛋白包含至少一种在体外合成的亚基。在一些实施方案中，至少一个亚基包括γ(γ)亚基。在一些实施方案中，未从人胎儿分离稳定的血红蛋白。
本公开还提供了包含根据前述实施方案中任一项的稳定化血红蛋白组合物的药物制剂，其中该组合物还包含药学上可接受的赋形剂，药学上可接受的溶剂或药学上可接受的载体。在一些实施方案中，将组合物配制用于静脉内注射。在一些实施方案中，将组合物配制为骨内注射。
本公开另外提供了一种注射装置，其包含根据前述实施方案中任一项的组合物。在另一方面，本公开提供了一种注射装置，包括多个注射器、多个定量推注器、注射头以及氧合器；其中，多个所述注射器中分别设有不同液剂，多个所述注射器之间通过管路形成并联连接后汇流至所述注射头；多个定量推注器分别与多个注射器进行连接，以驱动多个所述注射器以不同速度进行液剂输出；所述氧合器位于所述注射头的上游管路中，用于对混合液剂中的血红蛋白进行预氧化处理。采用本发明的装置进行血红蛋白输注可以实现多种液剂的同步输注，提高对血红蛋白的输注效率和效果。
在另一方面，本公开提供根据前述实施方案中任一项的组合物在治疗需要其的受试者中的用途。本公开还提供了根据前述实施方案中任一项的药物制剂在治疗需要其的受试者中的用途。本公开还提供了根据前述实施方案中任一项的注射装置在治疗需要其的受试者中的用途。在一些实施方案中，受试者是低氧和/或贫血的。在一些实施方案中，受试者经历了因受伤引起的失血，因医疗干预引起的失血，溶血或造血功能降低。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是非人类动物。在一些实施方案中，非人类动物是非人类脊椎动物，非人类灵长类动物，鲸类，哺乳动物，爬行动物，鸟类，两栖动物或鱼类。在一些实施方案中，非人类动物是牛或绵羊。在一些实施方案中，非人类动物是鼬，圈养的鼬，啮齿动物，圈养的啮齿动物，猛禽或圈养的鸟。在一些实施方案中，圈养鸟为斜形目，雀形目或鸽形目。
在一些实施方案中，受试者是低氧和/或贫血的。在一些实施方案中，受试者经历了因受伤引起的失血，因医疗干预引起的失血，溶血或造血功能降低。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是非人类动物。在一些实施方案中，非人类动物是非人类脊椎动物，非人类灵长类动物，鲸类，哺乳动物，爬行动物，鸟类，两栖动物或鱼类。在一些实施方案中，非人类动物是牛。在一些实施方案中，非人类动物是鼬，圈养的鼬，啮齿动物，圈养的啮齿动物，猛禽或圈养的鸟。在一些实施方案中，圈养鸟为斜形目，雀形目或鸽形目。在一些实施方案中，以重复的给药方案将组合物，药物制剂或注射剂施用于受试者。在一些实施方案中，给予重复剂量以达到和/或维持0.3-0.4g/dL的稳定化血红蛋白的血浆浓度。
本公开涉及稳定化的血红蛋白溶液，以及这种稳定化的血红蛋白溶液在治疗需要其的受试者中的用途。稳定的血红蛋白溶液是交联形式的单体哺乳动物血红蛋白，基本上不含内毒素，磷脂和非血红蛋白蛋白，例如酶。此外，本公开总体上涉及包含血红蛋白的溶液，制剂和组合物，其用途以及与其结合使用的装置，并且尤其涉及用于所公开和使用的机器灌注装置，包括系统和方法，包含血红蛋白的溶液，制剂和组合物。其中，在一些实施例中，所述包含血红蛋白的溶液是通过如下方法获得的：聚合血红蛋白20～40g，硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ4～10g，肝素钠20000～30000u，葡萄糖8～10g，氯化钠6～8g，注射用头孢西丁钠1～3g，碳酸氢钠1.0～1.5g，10％复方氨基酸注射液40～60ml，注射用12种复合维生素0.1～0.3ml，加注射水至1000mL，通入惰性气体进行脱氧，直到氧合血红蛋白含量<5％，密封隔氧保存。在另一些实施例中，所述包含血红蛋白的溶液是通过如下方法获得的：聚合血红蛋白(分子量320kD～1024kD≥95％)20～40g，肝素钠20000～30000u，葡萄糖8～10g，氯化钠6～8g，注射用头孢西丁钠1～3g，碳酸氢钠1～1.5g，10％复方氨基酸注射液40～60mL，注射用12种复合维生素0.1～0.3mL、胰岛素160～200U，加注射水至1000mL，通入惰性气体进行脱氧，直到氧合血红蛋白含量<5％，密封隔氧保存。
定义
术语“血液替代物”或“基于血红蛋白的氧载体”或“HBOC”旨在为具有向器官和组织输送和供应氧并维持血管内渗透压的能力的材料。因此，该术语涵盖本领域中也称为“血浆膨胀剂”和“复苏液”的材料。
术语“交联的”或“聚合的”旨在涵盖分子间和分子内的多血红蛋白，在一些实施方案中，至少50％的多血红蛋白大于四聚体形式。
术语“去氧的”和“脱氧的”在本文中可互换使用，是指血红蛋白组合物，例如通过针对脱气膜的渗滤(其中氮气流过膜的相反侧)从中除去了氧的血红蛋白组合物。如本文所用，已经“基本上脱氧”的组合物是指每毫升(mL)(mg/mL)的溶解氧包含小于0.02毫克(mg)的组合物。
术语“一种或多种内毒素”是指作为细菌细胞壁外层的一部分而产生的通常与细胞结合的脂多糖，其在许多条件下是有毒的。内毒素注射到动物体内后会引起发烧，腹泻，失血性休克和其他组织损伤。
术语“内毒素单位”(EU)旨在表示1983年美国药典公约第3014页所给出的含义，该定义将EU定义为0.2纳克美国参考标准批次EC-2中所含的活性。一小瓶EC-2含有5,000EU。
“血红蛋白”或“Hb”是红细胞中的蛋白质分子，其将氧气从肺部运送到人体组织，并将二氧化碳从组织中返回到肺部。血红蛋白通常由四个球蛋白链组成。正常的成人血红蛋白分子包含两条α-球蛋白链和两条β-球蛋白链。在胎儿和婴儿中，β链并不常见，并且血红蛋白分子由两条α链和两条γ链组成。每条球蛋白链均包含重要的含铁卟啉化合物，称为血红素。嵌入血红素化合物中的是铁原子，对我们血液中的氧气和二氧化碳的运输至关重要。血红蛋白中所含的铁还导致血液呈红色。
如本文所提及，“谷氨酸”或“血红蛋白谷氨酸”是指如WHO药品信息中的“国际非专利药物名称(INN)”中所述的基于血液替代物或基于血红蛋白的氧气载体。此类物质的其他通用名称包括血红蛋白谷氨酰胺-200，HBOC-301和HBOC-201。
"高铁血红蛋白"是金属蛋白形式的血红蛋白，其中血红素基团中的铁处于正常血红蛋白的Fe3+(铁)状态，而不是Fe2+(亚铁)状态。高铁血红蛋白不能结合氧气，这意味着它不能将氧气携带到组织中。在人的血液中，通常会自发产生微量的高铁血红蛋白，但是当过量存在时，血液会变成异常的深蓝褐色。NADH依赖性酶高铁血红蛋白还原酶(一种黄递酶)负责将高铁血红蛋白转换回血红蛋白。通常，一个人的血红蛋白的百分之一到二是高铁血红蛋白。高于该百分比的原因可能是遗传因素，也可能是由于暴露于各种化学物质引起的，并且取决于水平，可能导致称为高铁血红蛋白血症的健康问题。高铁血红蛋白的异常增加会增加正常血红蛋白的氧结合亲和力，导致减少氧向组织的释放和可能的组织缺氧。
"氧合血红蛋白"是氧合形式的血红蛋白。通常，血红蛋白可被氧分子饱和(氧合血红蛋白)，或被氧分子去饱和(脱氧血红蛋白)。氧合血红蛋白是在生理呼吸过程中当氧结合到红细胞中血红蛋白的血红素成分上时形成的。该过程发生在邻近肺泡的肺毛细血管中。氧气随后穿过血流，在细胞中滴落下来，在细胞中，氧气通过氧化磷酸化作用被用作ATP的末端电子受体。
术语“稳定血红蛋白溶液”和“稳定血红蛋白组成”是指包含交联(即稳定)脱氧血红蛋白的公开的组成。此类溶液可在药物制剂中制备和/或在注射装置中提供，且可用于治疗一种或多种贫血或缺氧条件。
如本文所用，术语“稳定的活性四聚血红蛋白”是指稳定的，例如交联的，包含连接的α-β和α-β亚链的四聚血红蛋白。
如本文所使用，“稳定剂”是指根据本发明可用于稳定、聚合或交联由血红蛋白组成的血红蛋白低聚物的任何试剂。示例性稳定剂包括醛，例如戊二醛。
就本发明而言，“基本上不含内毒素”一词在功能上可描述为稳定的血红蛋白成分，其每毫升溶液中含有少于1.0个内毒素单位，每分升溶液中含有10克血红蛋白，尽管最终浓度可能在每分升溶液中15到20克血红蛋白之间。在一些实施例中，本发明的“基本上不含内毒素”的血红蛋白药物将含有小于0.5、优选小于0.25、最优选小于0.02内毒素单位/毫升的溶液(EU/ml)，如通过鲎试剂(LAL)分析测定的。LAL分析由Nachum等人，实验室医学，13:112-117(1982)和Pearson III等人，生物科学，30:416-464(1980)通过引用并入本文中描述。
如本文所用，“大约”通常指所述价值的正负10％。例如，约0.5将包括0.45和0.55，约10将包括9到11，约1000将包括900到1100等。
血红蛋白和/或红细胞来源
本发明的稳定血红蛋白成分中包含的血红蛋白可以从生物体中获得，或者可以合成配制。
在一些实施例中，血红蛋白从红细胞(红细胞)来源获得。在一些实施例中，血红蛋白来自人类来源。在一些实施例中，血红蛋白包含从人类、人类细胞或人类细胞系分离或衍生的血红蛋白。在一些实施例中，红细胞可以来自新鲜抽取的人类血液、来自血库的过期血液(即，已超过其保质期的捐赠血液)、胎盘或从人类捐赠中心获得的填充红细胞。在一些实施例中，血红蛋白在收获后超过15天从人类细胞中衍生。在一些实施例中，血红蛋白来自少于100个可变来源。在一些实施例中，血红蛋白来自少于200、少于100、少于90、少于80、少于70、少于60、少于50、少于40、少于30、少于20或少于10个可变源。在一些实施例中，稳定血红蛋白不是从人类胎儿中分离出来的。
在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液包括从非人类动物、非人类细胞或非人类细胞系分离或衍生的血红蛋白。在一些实施例中，血红蛋白来自新鲜的红细胞来源。在一些实施例中，血红蛋白在收获后不到10天从细胞中分离或衍生。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液可包含从非人类脊椎动物、非人类灵长类动物、鲸目动物、哺乳动物、爬行动物、鸟类、两栖动物或鱼类中衍生或分离的血红蛋白。在一些实施例中，使用从动物血液中获得的红细胞。在一些实施例中，血红蛋白来自非人类哺乳动物血液源。可使用牛、羊或猪等多种来源的血液。在一些实施例中，可以使用绵羊血。由于其现成可用性，在一些实施例中，可使用牛血。在一些实施例中，血红蛋白来自牛血源。
在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液可包含从非人类动物(即鼬、圈养鼬、啮齿动物、圈养啮齿动物、猛禽或圈养鸟类)中衍生或分离的血红蛋白。在一些实施例中，捕获的鸟属于鹦鹉螺目、雀形目或鸽形目。在一些实施例中，非人类动物不是为食物而饲养的雏鸽。
在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液可包含部分或全部合成的血红蛋白。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液可包含在体外合成的至少一个亚单位。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液可包含至少一个合成亚单位，其包含伽马(γ)亚单位。
红血球收集
在一些实施例中，本稳定血红蛋白溶液可包括从从非人类动物来源收集的红血球中衍生或分离的血红蛋白。从牛等来源采集红细胞时，可使用采集套管针以无菌方式提取血液。套管针是小心插入和处理，并连接到约2英尺长的胶管。为了插入套管针，将皮切掉并剥开，然后将套管针插入动物靠近心脏的主要血管中，小心不要刺穿食道。避免细菌的引入和维持低内毒素水平物质中的内毒素是很重要的。这可以通过使用单独的容器来实现，这些容器预先充有抗凝剂，并被去除热原，重新检查内毒素。典型的抗凝剂包括柠檬酸钠。在所有情况下，容器的内毒素水平必须低于LAL检测到的0.01个内毒素单位。
采集期间或采集后，可对采集的血液进行处理，以防止凝血。在一些实施例中，可使用抗凝剂处理收集血管。在一些实施例中，所收集的血液可被脱盐水或柠檬酸。脱纤维血是指去除纤维蛋白或在不引起细胞溶解的情况下使纤维蛋白原变性的血液。柠檬酸盐血是用柠檬酸钠或柠檬酸处理以防止凝血的血液。
红细胞溶液可以以无菌的方式分配到能够容纳2到10加仑采集血液的小血管中，从而使血液保持在无内毒素状态。容器中收集的血液可以立即封盖，以避免暴露在环境中。收集过程完成后，将材料冷却，通常为4℃左右，以限制细菌生长。此时没有血液池；随后检查血液是否有内毒素和无菌，以确保(1)没有一头牛生病；或(2)不良的采集技术没有污染整批或当天的采集。
前文所述的说明性收集方法并不意味着是限制性的，因为有许多收集方法适合于本领域普通技术人员并且可供其使用
红细胞处理和稳定血红蛋白成分配方
本发明的另一方面描述了制备稳定血红蛋白成分的过程。下面的实施例23提供了根据本发明处理红血球和稳定血红蛋白成分的配方的示例性方法。
通常，在一些实施例中，稳定的血红蛋白组成是通过以下过程从哺乳动物血液部分制备的：1)从哺乳动物血液部分分离红血球；2)溶血红血球以产生单体血红蛋白和基质的复合物；3)血红蛋白的过滤分离；4)单体血红蛋白的高效液相色谱(HPLC)纯化，将血红蛋白与红细胞中所有其他残留蛋白以及磷脂、酶和内毒素污染物分离；5)脱氧和重过滤；6)交联(聚合或聚集)单体血红蛋白；和/或7)浓缩稳定血红蛋白溶液。
在一些实施例中，该过程可包括以下步骤：(1)获得血液生制品，(2)分离血液生制品以产生基本上不含白细胞和血小板的红细胞部分，(3)机械地破坏红细胞部分以产生含血红蛋白溶液，(4)澄清含血红蛋白溶液以产生基本上不含细胞碎片的血红蛋白溶液，(5)微孔过滤基本上不含细胞碎片的血红蛋白溶液以产生部分灭菌的含血红蛋白溶液，(6)超滤部分灭菌的含血红蛋白溶液以产生大小分离的含血红蛋白溶液，(7)色谱分离大小分离的含血红蛋白溶液以产生基本上不含磷脂、非血红蛋白蛋白质和内毒素的血红蛋白，(8)使基本上不含内毒素的血红蛋白脱氧以产生基本上脱氧的血红蛋白溶液，(9)交联所述基本上脱氧的血红蛋白溶液以产生稳定的血红蛋白溶液，和/或(10)浓缩稳定的血红蛋白溶液，在基本上不含内毒素的环境中进行的所有步骤。
在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液包括例如通过交联聚合血红蛋白溶液。可使用本领域已知的任何交联剂。在一些实施例中，交联剂是醛。在一些实施例中，醛是戊二醛。在一些实施例中，该过程可包括在交联步骤之后的步骤，以从在交联期间形成的高分子量聚合物中分离或部分分离血红蛋白的单体和低分子量物种。在一些实施例中，该过程还包括将稳定的脱氧血红蛋白溶液浓缩至溶液中血红蛋白的浓度在150g/L到200g/L(包括终点)之间的步骤。
在一些实施例中，该过程可包括在交联之前的任何阶段添加体外合成的血红蛋白。在一些实施例中，该方法包括从合成来源配制高浓度、脱氧、稳定血红蛋白。
在一些实施例中，该过程可包括在导致产物基本上不含内毒素、磷脂和非血红蛋白蛋白质(例如酶)且在68,000道尔顿到500,000道尔顿之间具有大于约90％的限定分子量分布的条件下进行上述任何一个或多个步骤。
在一些实施例中，该过程可在基本上不含内毒素的环境中进行，使得在制造过程的任何阶段内毒素读数不超过0.05EU/mL。
稳定血红蛋白溶液的特性
根据本发明的稳定血红蛋白溶液可以具有一个或多个特征，使得它们特别适合于体外、体内、实验和/或治疗应用。在一些实施例中，稳定的血红蛋白溶液可以具有以下一个或多个属性：高血红蛋白浓度、低溶解氧浓度、低内毒素浓度、长半衰期、高平均分子量和高百分比的大于二聚体的血红蛋白聚合物。
在一些实施例中，根据本发明的稳定血红蛋白溶液的浓度可能高于市售的或正在临床审查中的其他基于血红蛋白的氧载体或基于血红蛋白的血液替代物。在一些实施例中，本发明的稳定血红蛋白溶液的浓度可为约150g/L至约200g/L。在一些实施例中，本发明的稳定血红蛋白溶液的浓度可为至少约150g/L。在一些实施例中，本发明的稳定血红蛋白溶液的浓度最多可为约200g/L。在一些实施例中，本发明的稳定血红蛋白溶液的浓度可为约150g/L至约155g/L、约150g/L至约160g/L、约150g/L至约165g/L、约150g/L至约170g/L，约150g/L至约175g/L，约150g/L至约180g/L，约150g/L至约185g/L，约150g/L至约190g/L，约150g/L至约195g/L，约150g/L至约200g/L，约155g/L至约160g/L，约155g/L至约165g/L，约155g/L至约170g/L，约155g/L至约175g/L，约155g/L至约180g/L，约155g/L至约185g/L，约155g/L至约190g/L，约155g/L至约195g/L，约155g/L至约200g/L，约160g/L至约165g/L，约160g/L至约170g/L，约160g/L至约175g/L，约160g/L至约180g/L，约160g/L至约185g/L，约160g/L至约190g/L，约160g/L至约195g/L，约160g/L至约200g/L，约165g/L至约170g/L，约165g/L至约175g/L，约165g/L至约180g/L，约165g/L至约185g/L，约165g/L至约190g/L，约165g/L至约195g/L，约165g/L至约200g/L，约170g/L至约175g/L，约170g/L至约180g/L，约170g/L至约185g/L，约170g/L至约190g/L，约170g/L至约195g/L，约170g/L至约200g/L，约175g/L至约180g/L，约175g/L至约185g/L，约175g/L至约190g/L，约175g/L至约195g/L，约175g/L至约200g/L，约180g/L至约185g/L，约180g/L至约190g/L，约180g/L至约195g/L，约180g/L至约200g/L，约185g/L至约190g/L，约185g/L至约195g/L，约185g/L至约200g/L，约190g/L至约195g/L，约190g/L至约200g/L，或约195g/L至约200g/L。在一些实施例中，本发明的稳定血红蛋白溶液的浓度可为约150g/L、约155g/L、约160g/L、约165g/L、约170g/L、约175g/L、约180g/L、约185g/L、约190g/L、约195g/L或约200g/L。
在一些实施例中，本发明的稳定血红蛋白溶液的氧浓度可能低于市售的或正在临床审查中的其他基于血红蛋白的氧载体或基于血红蛋白的血液替代物。在一些实施例中，溶解氧浓度小于0.1mg/mL、小于0.09mg/mL、小于0.08mg/mL、小于0.07mg/mL、小于0.06mg/mL、小于0.05mg/mL、小于0.04mg/mL、小于0.03mg/mL、小于0.02mg/mL或小于0.01mg/mL。在一些实施例中，溶解氧浓度小于0.02mg/mL。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液包含小于5％的含氧血红蛋白(占总血红蛋白的百分比)。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液包括小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％或小于2％的含氧血红蛋白占总血红蛋白的百分比。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液包含小于3％的含氧血红蛋白作为总血红蛋白的百分比。
在一些实施例中，稳定的血红蛋白溶液可能含有少量到无内毒素污染。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液基本上不含内毒素、磷脂和非血红蛋白蛋白质(例如酶)。在一些实施例中，稳定的血红蛋白溶液可实际上不含内毒素。在一些实施例中，根据本发明的稳定血红蛋白溶液的内毒素浓度可以小于约0.05内毒素单位(EU)/毫升(mL)。在一些实施例中，根据本发明的稳定血红蛋白溶液的内毒素浓度可小于约0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.04、0.03、0.02或0.01EU/mL。在一些实施例中，所测量的内毒素可包括一种或多种细胞脂质，细胞脂质层和脂多糖。在一些实施例中，内毒素可从人类细胞中衍生或分离。在一些实施例中，内毒素可从非人类脊椎动物细胞中衍生或分离。在一些实施例中，内毒素可从微生物中衍生或分离。在一些实施例中，内毒素可从细菌中衍生或分离。在一些实施例中，内毒素可从病毒中衍生或分离。
在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液可包括不同大小的血红蛋白低聚物的分布。在一些实施例中，稳定的血红蛋白溶液可以实际上不包含血红蛋白单体。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液可包含小于15％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％或小于5％的血红蛋白二聚体。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液可包含小于10％的血红蛋白二聚体。在一些实施例中，该组合物可包含小于6％的血红蛋白二聚体。血红蛋白二聚体的水平可以用已知的方法测量。在一些实施例中，通过尺寸分离技术(例如，色谱法或SDS-PAGE)测量由溶液组成的血红蛋白二聚体的水平。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液可包含大于80％、大于85％或大于90％的68000道尔顿至500000道尔顿之间的血红蛋白低聚物。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液可包含20％至35％血红蛋白四聚体。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液可包含约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％或约35％的血红蛋白四聚体。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液可包含约25％的血红蛋白四聚体。在一些实施例中，血红蛋白溶液可包含15％至25％血红蛋白八聚体。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液可包含约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％或约25％血红蛋白八聚体。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液可包含约20％的血红蛋白八聚体。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液可包含40％至55％大于八聚体大小的血红蛋白低聚物。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液可包含约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％或约55％大于八聚体分子量的血红蛋白低聚物。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液包含约50％的大于八聚体分子量的血红蛋白低聚物。
在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液包含血红蛋白低聚物，其限定分子量分布在68000道尔顿到500000道尔顿之间大于约90％。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液可包含平均分子量为200千道尔顿(kDa)的血红蛋白低聚物。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液可具有分子量分布，其包含小于15％的尺寸大于500kDa的低聚物。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液可具有分子量分布，其包含小于20％、小于19％、小于18％、小于17％、小于16％、小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％或小于7％的大于500kDa的低聚物。
高铁血红蛋白的存在可能降低血红蛋白溶液释放氧气的能力。在一些实施例中，稳定的血红蛋白溶液包含低于10％的高铁血红蛋白作为总血红蛋白的百分比。在一些实施例中，稳定的血红蛋白溶液包含小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％或小于0.5％的高铁血红蛋白作为总血红蛋白的百分比。在一些实施例中，稳定的血红蛋白溶液包含低于6％的高铁血红蛋白作为总血红蛋白的百分比。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液包含小于约1％的高铁血红蛋白作为总血红蛋白的百分比。高铁血红蛋白的水平可根据本领域已知的方法测量。在一些实施例中，高铁血红蛋白的水平是通过坐标滴定法测量的。
在一些实施例中，稳定血红蛋白比不稳定或含氧血红蛋白具有更长的半衰期，并将四聚血红蛋白分解为二聚体导致肾毒性降至最低。在一些实施例中，稳定血红蛋白具有至少60分钟、至少90分钟、至少120分钟、至少150分钟、至少180分钟、至少210分钟或至少240分钟的半衰期。在一些实施例中，稳定血红蛋白的半衰期约为3.5小时或约210分钟。
在一些实施例中，稳定的血红蛋白成分可在各种温度下稳定。在一些实施例中，稳定血红蛋白在环境温度下稳定。在一些实施例中，稳定血红蛋白在冷藏温度下稳定。在一些实施例中，稳定血红蛋白在高于约2℃的温度下稳定。在一些实施例中，稳定血红蛋白在高于2℃、高于3℃、高于4℃或高于5℃的温度下稳定。在一些实施例中，稳定血红蛋白在温度低于约40℃时稳定。在一些实施例中，稳定血红蛋白在温度低于35℃、低于34℃、低于33℃、低于32℃、低于31℃或低于30℃时稳定。
血红蛋白序列
在一些实施例中，由本稳定血红蛋白溶液组成的血红蛋白包含亚单位α(α)，其中亚单位α包含以下氨基酸序列：
1MVLSPADKTN VKAAWGKVGA HAGEYGAEAL ERMFLSFPTT KTYFPHFDLS HGSAQVKGHG
61 KKVADALTNA VAHVDDMPNA LSALSDLHAH KLRVDPVNFK LLSHCLLVTL AAHLPAEFTP
121 AVHASLDKFL ASVSTVLTSK YR
(SEQ ID NO:1).
在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位α，该亚单位α包含氨基酸序列，该氨基酸序列与序SEQ ID NO:1的序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同源性。在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位α，该亚单位α包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％的同源性的氨基酸序列。
在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位α，其中亚单位α由以下核酸序列编码：
Figure BDA0002465283840000611
(SEQ ID NO:2).
在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位α，其中亚单位α由具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％与SEQ ID NO:2序列相同性的核酸序列编码。在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位α，其中亚单位α由与SEQ IDNO:2的序列具有至少90％相同性的核酸序列编码。
在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位β(β)，其中亚单位β包含以下氨基酸序列：
1 MVHLTPEEKS AVTALWGKVN VDEVGGEALG RLLVVYPWTQ RFFESFGDLS TPDAVMGNPK
61 VKAHGKKVLG AFSDGLAHLD NLKGTFATLS ELHCDKLHVD PENFRLLGNV LVCVLAHHFG
121 KEFTPPVQAA YQKVVAGVAN ALAHKYH
(SEQ ID NO:3).
在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位β，该亚单位β包含氨基酸序列β，该氨基酸序列与序SEQ ID NO:3的序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同源性。在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位β，该亚单位β包含与SEQ ID NO:3的序列具有至少90％的同源性的氨基酸序列。
在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位β，其中亚单位β由以下核酸序列编码：
Figure BDA0002465283840000621
(SEQ ID NO:4).
在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位β，其中亚单位β由具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％与SEQ ID NO:4序列相同性的核酸序列编码。在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位β，其中亚单位β由与SEQIDNO:4的序列具有至少90％相同性的核酸序列编码。
在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位γ(γ)，其中亚单位γ包含以下氨基酸序列：
1 MGHFTEEDKA TITSLWGKVN VEDAGGETLG RLLVVYPWTQ RFFDSFGNLS SASAIMGNPK
61 VKAHGKKVLT SLGDAIKHLD DLKGTFAQLS ELHCDKLHVD PENFKLLGNV LVTVLAIHFG
121 KEFTPEVQAS WQKMVTGVAS ALSSRYH
(SEQ ID NO:5),
在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位γ，该亚单位γ包含氨基酸序列γ，该氨基酸序列与序SEQ ID NO:5的序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同源性。在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位γ，该亚单位γ包含与SEQ ID NO:5的序列具有至少90％的同源性的氨基酸序列。
在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位γ，其中亚单位γ由以下核酸序列编码：
Figure BDA0002465283840000631
(SEQ ID NO:6),
在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位γ，其中亚单位γ由具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％与SEQ ID NO:6序列相同性的核酸序列编码。在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位γ，其中亚单位γ由与SEQID NO:6的序列具有至少90％相同性的核酸序列编码。
在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位γ(γ)，其中亚单位γ包含以下氨基酸序列：
1 MGHFTEEDKA TITSLWGKVN VEDAGGETLG RLLVVYPWTQ RFFDSFGNLS SASAIMGNPK
61 VKAHGKKVLT SLGDATKHLD DLKGTFAQLS ELHCDKLHVD PENFKLLGNV LVTVLAIHFG
121 KEFTPEVQAS WQKMVTAVAS ALSSRYH
(SEQ ID NO:7),
在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位γ，该亚单位γ包含氨基酸序列γ，该氨基酸序列与序SEQ ID NO:7的序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同源性。在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位γ，该亚单位γ包含与SEQ ID NO:7的序列具有至少90％的同源性的氨基酸序列。
在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位γ，其中亚单位γ由以下核酸序列编码：
Figure BDA0002465283840000641
(SEQ ID NO:8),
在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位γ，其中亚单位γ由具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％与SEQ ID NO:8序列相同性的核酸序列编码。在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位γ，其中亚单位γ由与SEQID NO:8的序列具有至少90％相同性的核酸序列编码。
药物制剂
本发明的另一方面涉及包含本发明的稳定血红蛋白溶液的药物制剂。本文所述的药物制剂可以通过药理学领域中已知的任何方法制备。一般而言，此类制备方法包括将稳定血红蛋白溶液与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合，然后，如有必要和/或需要，将产品包装成所需的单剂量或多剂量单位，即使用下文公开的设备与管理兼容的单元。
根据本发明的药物制剂还可包括惰性成分，包括医药上可接受的赋形剂、载体、溶剂、稀释剂、填料、盐和/或其他本领域众所周知的材料，其选择取决于所使用的剂型、所处理的条件，根据本领域普通技术人员的确定和此类添加剂的特性来实现的特定目的。根据本发明的稳定血红蛋白溶液可包括一种或多种医药上可接受的载体和/或赋形剂。
医药上可接受的赋形剂包括任何和所有溶剂、稀释剂或其他液体载体、分散剂或悬浮剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等，如适合所需的特定剂型。赋形剂的例子包括氯化钠和生理上可接受的缓冲液。
药物上可接受的载体优选无毒、惰性且与血红蛋白相容。此类载体的实例包括但不限于水、平衡盐水溶液、生理盐水溶液(例如，乳酸林格溶液、哈特曼氏溶液等)、葡萄糖溶液等。
示例性稀释剂包括碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、甘露醇、山梨醇、肌醇、氯化钠等及其组合。
在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液或其配方可另外包含氯化钠、氯化钾、氯化钙、氢氧化钠、N-乙酰-L-半胱氨酸、乳酸钠、硼酸钠和/或tris。稳定血红蛋白溶液或其药物制剂可进一步包含含有硼酸盐或另一适当缓冲剂的制剂缓冲液。硼酸盐可以被还原。
在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液可包含一种或多种电解质。本发明中有用的电解质包括钠、氯、钾等。
在一些实施例中，稳定血红蛋白以有效量存在于药物制剂中，例如治疗有效量或预防有效量。
药物制剂可制备为单单位剂量和/或多个单单位剂量。如本文所使用的，“单位剂量”是包含预定量的稳定血红蛋白的药物组合物的离散量。稳定血红蛋白的量通常等于将给予受试者的血红蛋白的剂量和/或该剂量的方便分数，例如，该剂量的一半或三分之一。
本发明的药物成分中稳定血红蛋白、药物上可接受的载体和/或任何附加成分的相对量将变化，这取决于所治疗的受试者的身份、大小和/或条件，并且进一步取决于所述成分的给药途径。举例来说，该制剂可包含0.1％至100％(w/w)活性成分。
本发明的药物制剂可通过任何方式配制用于给受试者服用。在一些实施例中，可制备制剂以供通过包括口服、通过气雾剂、通过经皮吸附、通过粘液膜吸附或通过注射等途径施用。在一些实施例中，所述制剂制备用于肠外给药。在一些实施例中，所述制剂制备用于静脉给药。在一些实施例中，该制剂制备用于骨内给药。
可以使用一次性使用技术来制造本文公开的成分和配方，如图7所示。
稳定血红蛋白成分管理装置
本发明的另一方面提供了用于管理所公开的稳定血红蛋白溶液及其药物制剂的装置。
在一些实施例中，为了解决现有机械灌注设备通过对灌注液进行定期更换的方式维持灌注液质量时，存在的成本高、浪费大以及操作复杂的问题，提出了一种用于器官机械灌注的装置，包括容器、泵送单元、氧合器和超滤单元；所述容器中设有保持架，用于布置器官；所述泵送单元和所述氧合器串联布设在所述容器的出口和进口之间的管路中，所述泵送单元用于驱动灌注液流动形成循环的连续灌注流，所述氧合器用于对流经的灌注液进行体外氧合和二氧化碳排出，提高灌注液中血红蛋白的携氧量和对处于松散的R态血红蛋白的超滤效果；所述超滤单元与所述泵送单元的灌注液包连接形成超滤循环，用于对灌注液包中的灌注液进行小分子有毒血红蛋白的超滤除去。
优选的，所述超滤单元包括超滤泵、超滤器和加液管，其中，所述超滤泵和所述超滤器串联连接，并且与所述泵送单元中的灌注液包形成超滤循环，所述加液管与超滤器的下游管路连通，用于向超滤循环中补加缓冲液。
进一步优选的，所述超滤器选用30KD。
优选的，该装置还设有氧合单元；所述氧合单元与所述泵送单元连接形成氧合循环，用于对流经泵送单元的灌注液进行气体交换，提升灌注液中血红蛋白的氧饱和度和对处于松散的R态血红蛋白的超滤效果。
进一步优选的，所述氧合单元包括循环泵和氧合膜，所述循环泵与氧合膜串联连接，并且与所述泵送单元中的灌注液包连接形成氧合循环。
优选的，该装置中还设有气体过滤器；所述气体过滤器位于所述氧合器的下游位置。
优选的，所述容器的出口与所述泵送单元的进口之间还设有灌装器官回液管，所述泵送单元的出口与所述容器的进口之间还直接设有灌注器官进液管。
优选的，该装置还设有流量控制单元和温度控制单元；所述流量控制单元包括至少两个流量指示器，并且分别布设在所述泵送单元的进口管路和出口管路；所述温度控制单元位于所述泵送单元的出口位置，用于控制灌注液温度。
优选的，该装置还设有压力控制单元；所述压力控制单元位于所述容器的进口位置，用于对回流至容器的灌注液进行压力调节控制。
优选的，该装置中设有多组泵送单元、氧合器和超滤单元，形成对所述容器的多组并联灌注液循环。
在一些实施例中，公开了一种血红蛋白注射装置。
在一些实施例中，为了提高对血红蛋白输注的效率和效果，本发明提出了一种可以同时对血红蛋白和不同液剂进行输注的静脉给药装置，包括多个注射器、多个定量推注器、注射头以及氧合器；其中，多个所述注射器中分别设有不同液剂，多个所述注射器之间通过管路形成并联连接后汇流至所述注射头；多个定量推注器分别与多个注射器进行连接，以驱动多个所述注射器以独立速度进行液剂输出；所述氧合器位于所述注射头的上游管路中，用于对混合液剂中的血红蛋白进行预氧化处理。
优选的，该装置中还设有一个静态混合器；所述静态混合器位于所述氧合器的上游位置，用于对多个所述注射器输出的不同液剂进行静态混合。
优选的，该装置中还设有排气管，并且所述排气管位于所述注射头和所述氧合器之间。
优选的，在每一个所述注射器的出口位置分别设有一个单向阀。
优选的，在每一个所述注射器的出口位置分别设有一个截止阀。
进一步优选的，所述截止阀采用电控截止阀。
进一步优选的，所述定量推进器选用步进电机驱动，并且由PLC控制系统进行所述步进电机与所述截止阀的联动控制。
进一步优选的，所述定量推进器由电机、驱动带、推杆、导向板组成；其中，所述导向板上设有位置传感器，所述推杆穿过所述导向板后一端与所述注射器连接，另一端与所述驱动带的一端连接，所述驱动带的另一端与所述电机的输出轴连接；所述位置传感器与所述导向板活动连接，可以沿所述推杆往复移动的方向调整其固定位置，并且与所述推杆接触时控制所述电机停止运转。
稳定血红蛋白成分和装置的用途
本发明的另一个方面涉及所公开的溶液、药物制剂和装置在治疗需要的受试者中的使用。
本发明的溶液、药物制剂和装置可用于治疗各种不同的受试者。在一些实施例中，对象是动物，例如人类。在一些实施例中，对象是非人类动物。在一些实施例中，非人类动物是非人类脊椎动物、非人类灵长类动物、鲸目动物、哺乳动物、爬行动物、鸟、两栖动物或鱼。在一些实施例中，非人类动物是狗或猫。在一些实施例中，非人类动物是牛。在一些实施例中，非人类动物是鼬、圈养鼬、啮齿动物、圈养啮齿动物、猛禽或圈养鸟。在一些实施例中，捕获的鸟属于鹦形目、雀形目或鸽形目。
或者，另外，本发明的溶液、药物制剂和装置可用于治疗、维持或以其他方式支持受试者的移植、器官或植入物，并在其移植(或植入，视情况而定)之前，例如在本文所述的任何不同受试者中。在一些实施例中，移植物是器官移植或供者器官，例如肝移植(例如从器官移植供者处获得)。在一些实施例中，所述移植物是器官植入物，例如肝脏植入物(例如在体外生长或人工制造的)。
疾病和条件
本发明的溶液、制剂和装置可用于治疗各种条件或疾病，包括缺血(或缺血)、贫血、缺氧和血红蛋白病。
在一些实施例中，本发明的溶液、制剂和装置可用于治疗缺血。缺血包括组织或器官的血液供应受到限制、减少或丧失，导致缺氧，而缺氧是大多数细胞代谢(如维持组织活力)所需要或消耗的。
血红蛋白病包括一些遗传性贫血，其中红细胞(RBC)的产生减少和/或破坏(溶血)增加。这些还包括导致产生异常血红蛋白的遗传缺陷，同时导致维持氧浓度的能力受损。一些此类疾病包括未能产生足够数量的正常β-珠蛋白，而另一些则涉及未能完全产生正常β-珠蛋白。这些与β-珠蛋白相关的疾病通常被称为β-血红蛋白病。例如，β-地中海贫血是由于β-珠蛋白基因的部分或完全表达缺陷，导致HbA缺乏或缺失。镰状细胞贫血是β-珠蛋白结构基因点突变的结果，导致异常(镰状)血红蛋白(HbS)的产生。HbS红细胞比正常红细胞更脆弱，更容易发生溶血，最终导致贫血(Atweh,Semin.Hematol.38(4):367-73(2001))。
在一些实施例中，本发明的溶液、制剂和装置可用于治疗贫血。在一些实施例中，贫血可为再生障碍性贫血、缺铁性贫血、镰状细胞贫血、地中海贫血或维生素缺乏性贫血。在一些实施例中，贫血的特征是疲劳、虚弱、皮肤苍白或发黄、心跳不规则、呼吸短促、头晕或头晕、胸痛、手脚冰冷、头痛。贫血可能是由于红细胞丢失、红细胞生成不足或红细胞过度溶解所致。
在一些实施例中，本发明的溶液、制剂和装置可用于治疗缺铁性贫血。缺铁性贫血可能是由于制造血红蛋白所需的铁缺乏引起的。这种贫血在许多孕妇中很常见。它也是由失血引起的，如月经大出血、溃疡、癌症和经常使用一些非处方止痛药，特别是阿司匹林，这些药物会导致胃壁发炎导致失血。
在一些实施例中，本发明的溶液、制剂和装置可用于治疗维生素缺乏性贫血，也称为恶性贫血。维生素缺乏性贫血可能是由于缺乏足够的叶酸、维生素B-12或其他重要维生素所致。缺乏可能是由于饮食供应不足或无法吸收所需的维生素。
在一些实施例中，本发明的溶液、制剂和装置可用于治疗炎症性贫血。某些疾病——包括癌症、艾滋病毒/艾滋病、类风湿性关节炎、肾病、克罗恩病和其他急慢性炎症疾病——会干扰红细胞的产生。
在一些实施例中，本发明的溶液、制剂和装置可用于治疗再生障碍性贫血。这种罕见的、危及生命的贫血发生在身体不能产生足够的红细胞的时候。再生障碍性贫血的病因包括感染、某些药物、自身免疫性疾病和接触有毒化学物质。
在一些实施例中，本发明的溶液、制剂和装置可用于治疗与骨髓疾病相关的贫血。多种疾病，如白血病和骨髓纤维化，会影响骨髓中的血液生成，从而导致贫血。这些类型的癌症和癌症样疾病的影响从轻微到危及生命。在一些实施例中，本发明可用于治疗因血癌或癌症治疗而经历失血的受试者。
在一些实施例中，本发明的溶液、制剂和装置可用于治疗溶血性贫血。当红细胞被破坏的速度超过骨髓替代红细胞的速度时，这组贫血就会发展。某些血液疾病会增加红细胞的破坏。溶血性贫血可以遗传或在以后的生活中发展。
在一些实施例中，本发明的溶液、制剂和装置可用于治疗镰状细胞性贫血。这种遗传性的，有时严重的疾病是溶血性贫血。它是由血红蛋白的缺陷造成的，这种缺陷迫使红细胞呈现出不正常的新月形(镰刀形)。这些不规则的血细胞过早死亡，导致红细胞长期短缺。
在一些实施例中，本发明的溶液、制剂和装置可用于治疗缺氧。缺氧是身体或身体某一部位在组织水平上缺乏足够氧气供应的一种状态。缺氧可分为全身性缺氧和局部性缺氧。在一些实施例中，本治疗可用于治疗全身性缺氧。在一些实施例中，本治疗可用于治疗局部缺氧。尽管缺氧可能是一种病理状态，但动脉氧浓度的变化可能是正常生理的一部分，例如，在低通气训练或剧烈体育锻炼期间。在一些实施例中，本治疗用于治疗由于剧烈体力活动而经历缺氧的个体。
在一些实施例中，本治疗用于治疗已上升到高空的个体。全身性缺氧发生在健康人登上高原时，它会导致高原病，导致潜在的致命并发症：高原肺水肿(HAPE)和高原脑水肿(HACE)。在一些实施例中，本发明的治疗用于治疗经历高原病、HAPE或HACE的受试者。
在一些实施例中，本治疗用于治疗潜入水下的个体。当呼吸含氧量较低的混合气体时，如在水下潜水时，特别是当使用控制供应空气中氧气量的闭路再呼吸系统时，健康人可能会发生缺氧。
在一些实施例中，本治疗可改善或减轻一种或多种缺氧症状。缺氧时，逐渐出现的症状包括疲劳、四肢麻木/刺痛、恶心和脑缺氧。在严重缺氧或缺氧的情况下，很快发作，共济失调，迷茫/定向障碍/幻觉/行为改变，严重头痛/意识下降，乳头水肿，呼吸困难，脸色苍白，心动过速和肺动脉高压，最终导致晚期症状，紫绀，心率减慢/肺心病，低血压后心力衰竭最终导致休克和死亡。在一些实施例中，本治疗可改善或防止缺氧的一个或多个副作用。
在一些实施方案中，受试者经历了损伤引起的失血、医疗干预引起的失血、溶血或造血减少。在一些实施例中，本治疗将动脉流量、体积和/或压力恢复到可接受的水平，并将组织的氧合恢复到可接受的水平。在一些实施例中，所述成分可用于治疗遭受失血、内伤(例如内脏损伤)、出血、失血性休克或创伤性脑损伤的受试者。在一些实施例中，本发明的成分可以用作复苏的手段。
在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液可在不输血的情况下施用。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液可与全血输血一起施用。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液可在全血输血之前或之后施用。
在一些实施例中，本发明的成分可用于术前血液稀释。在一些实施例中，本发明可用于在操作之前处理对象。在一些实施例中，本发明可用于治疗、维持或以其他方式支持受试者的器官(例如，移植物、移植或植入物)及其在移植(或植入物，视情况而定)之前，包括在本文所述的任何一种中。在一些实施例中，该操作是，例如主动脉手术、肝切除或器官移植。
给药途径
稳定血红蛋白溶液及其药物制剂可通过任何途径给药。在一些实施例中，给药为口服、局部、非肠道、肠内、经皮、皮内、眼内、玻璃体内、皮下、静脉或骨内。在一些实施例中，给药是非肠道给药。在一些实施例中，给药是静脉注射的。在一些实施例中，给药是骨内的。
剂量和剂量表
给药可包括以一种或多种剂量给药治疗有效量。在一些实施例中，稳定血红蛋白溶液或药物制剂可以单剂量或两个或更多剂量施用。在一些实施例中，将稳定的血红蛋白溶液计量成需要的对象。在一些实施例中，给药包括滴定稳定的血红蛋白成分，而不是单次注射。测量和/或滴定稳定的血红蛋白成分和/或制剂，例如使用本发明的注射装置，可以结合监测被治疗对象的一个或多个生理症状来执行。一个或多个生理症状可选自：血压、核心温度、肝组织氧合张力、呼吸频率、尿量、中风量、心率、心输出量、收缩期血流峰值速度、动脉PO2、动脉PCO2、动脉pH值和动脉碱过剩。
在一些实施例中，本稳定血红蛋白组分可在重复给药计划中施用以达到0.3-0.4g/dL的血浆水平。可能需要额外的剂量来维持这种浓度。在一些实施例中，本稳定血红蛋白溶液可在15-20g/dL的浓度范围内调配并以足以达到稳定血红蛋白的0.3-0.4g/dL血浆浓度的总剂量投与给受试者。总剂量可以单次给药、多次给药或根据重复给药计划给药。在重复给药计划中，可以重复给药，间隔几秒、几分钟、几小时或几天。在一些实施例中，重复剂量被约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时的时段分开小时，大约20小时，大约21小时，大约22小时，大约23小时，大约1天，大约1.5天，大约2天，大约3天，大约4天，大约5天，大约6天，或者大约一周。在一些实施例中，随后的剂量被大约6小时的时间间隔。在一些实施例中，随后的剂量间隔约12小时。在一些实施例中，后续剂量以大约1天的时间间隔。在一些实施例中，监测血浆血红蛋白水平以确定后续剂量的时间。在一些实施例中，监测稳定血红蛋白水平以确定后续剂量的时间，以实现并保持稳定血红蛋白溶液的浓度为0.3-0.4g/dL。
体内特性
本文公开的稳定血红蛋白成分可用作氧载体和/或血液替代物。在一些实施例中，该物质基本上不含内毒素，具有可逆结合的气态配体(例如氧)的性质，并且可用于向重要组织和器官输送和供应氧。因此，在一些实施例中，本发明的稳定血红蛋白组分可用作血液扩张器和复苏液，用于疾病管理和在需要时维持循环完整性，即响应突然和大量失血。
在一些实施例中，稳定的血红蛋白成分基本上不含内毒素和热原。在一些实施例中，其在体内不会导致以下任何异常和有害的化学和生理功能：(1)不激活补体；(2)不会导致出血性疾病；(3)不会导致异常血小板功能或聚集；(4)不会导致异常凝血酶原时间(PT)；(5)不引起部分凝血活酶时间异常；(6)不干扰血型或交叉配型；(7)对肾脏无毒，每公斤体重3.5克或每分升循环血容量8克；(8)循环持续时间至少7天；(9)促进红细胞生成。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的解释说明。
实施例1
图1为实施例1中器官机械灌注装置的结构示意图。在该实施例中器官机械灌注装置，包括容器1、泵送单元2、氧合器3和超滤单元4。容器1内设有保持架11，容器1顶部设有盖子12。泵送单元2和氧合器3串联布设在容器1的出口和进口之间的管路中，其中，泵送单元2用于驱动整个装置中的灌注液进行流动从而形成连续灌注流，氧合器3用于对流经的灌注液进行体外氧合和二氧化碳排出，提高回流至容器1中灌注液血红蛋白的含氧量和对处于松散的R态血红蛋白的超滤效果。超滤单元4与泵送单元2中的灌注液包连接并且形成超滤循环，用于对灌注液包中的灌注液进行小分子有毒血红蛋白的超滤除去。
此时，采用本实施例的器官机械灌注装置对器官进行保存维持过程中，针对含血红蛋白灌注液中所产生的小分子有毒血红蛋白，就可以直接借助超滤单元对流至泵送单元中灌注液包的灌注液进行引出超滤操作，对灌注液中的小分子有毒血红蛋白进行超滤除去，而经过超滤处理的灌注液直接回流至灌注液包中由泵送单元继续输送至氧合器进行处理。这样，不仅实现了对灌注液中小分子有毒血红蛋白的实时在线去除操作，保证灌注液的质量，而且避免了对灌注液直接替换所造成的浪费和高成本，从而降低了整个器官灌注的成本和操作复杂度。
在本实施中，保持架根据不同使用环境可以选用移植保持架、植入保持架、器官保持架或组织保持架中的任意一种进行器官的置放，而且保持架的材质优选生物相容性材料，同样，也可以根据器官和灌注环境选用其他材质的保持架进行器官的置放。
结合图1所示，在本实施例中，超滤单元4包括超滤泵41、超滤器42和加液管43组成。其中，超滤泵41选用蠕动泵，并且与超滤器42形成串联连接，进而与泵送单元2中的灌注液包形成超滤循环，而加液管43的一端与补液单元连接，另一端与超滤器42的下游管路连通，从而引入缓冲液至灌注液包中。
此时，根据灌注液中小分子有毒血红蛋白的含量就可以通过控制蠕动泵的运转，将灌注液包中的灌注液引出至过滤器中进行超滤处理，以去除灌注液中的小分子有毒血红蛋白，同时由加液管引入缓冲液，以平衡灌注液中的成份含量，保持整个灌注液的体积和成分稳定性。
其中，在本实施例中，针对灌注液中小分子有毒血红蛋白的超滤处理，超滤器优选为30KD，对灌注液的超滤精度和超滤效率进行最佳匹配，保证对灌注液的超滤效果。
结合图1所示，在本实施例的装置中还设有一个氧合单元5。其中，氧合单元5与泵送单元2的灌注液包连接形成氧合循环，用于对灌注液包中灌注液的气体交换，提升灌注液中血红蛋白的氧饱和度和对处于松散的R态血红蛋白的超滤效果。
本实施例的氧合单元5由采用蠕动泵51和氧合膜52组成，并且蠕动泵51与氧合膜52串联连接之后与泵送单元2中的灌注液包连接形成氧合循环。这样，在超滤单元进行灌注液超滤处理的过程中，可以对循环的灌注液进行氧气交换，以使血红蛋白达到更高的氧饱和度携带更多的氧气，提高后续对器官的灌注保存效果。
结合图1所示，在氧合器3的下游管路上还设有一个气体过滤器6，用于进一步对灌注液的气体进行交换，以最大效果的发挥血红蛋白的功能，提高对器官的保护。
同时，该装置中还设有流量控制单元7和温度控制单元8。其中，流量控制单元7包括至少两个独立运转的流量指示器，并且两个流量指示器分别布设在泵送单元2的进口管路和出口管路，分别用于对灌注液流量进行测量，从而可以据此调整灌注液的流速，维持灌注循环的有效灌注液量。温度控制单元8则位于泵送单元2的出口位置，用于控制流回至容器1中的灌注液温度，保证对器官的灌注保存效果。此外，根据实际使用过程中的需要，也可以安装压力检测设备对管路中灌注液的压力进行检测和稳压控制，尤其是对流回至容器中的灌注液压力进行检测和稳压控制，将灌注液的压力维持在最佳范围，避免将存在不稳定压力波动的灌注液直接输送至容器内而对器官造成损伤。
实施例2
图2为实施例2中器官机械灌注装置的结构示意图。该实施例器官机械灌注装置与实施例1中器官机械灌注装置的差异在于：容器1的出口与泵送单元2的进口之间还设有一个灌注器官回液管13，泵送单元2的出口与容器1的进口之间还设有一个灌注器官进液管21，从而形成对器官的双管路灌注结构形式。这样，针对部分器官的灌注操作，例如肝脏的灌注操作，就可以实现具有门静脉和主动脉的双管路灌注，从而提高该装置对不同器官的灌注使用，扩大该装置的使用范围，提高其使用效率。
实施例3
图3为实施例3中器官机械灌注装置的结构示意图。该实施例器官机械灌注装置与实施例1中器官机械灌注装置的差异在于：设有两组相互独立的泵送单元2、氧合器3和超滤单元4，从而形成对容器1的双组并联灌注液循环。这样就可以形成对容器中器官的双灌注液循环，不仅可以提高对器官的灌注处理效率和灌注处理的可靠稳定性，而且还可以实现对单独循环系统如压力、流量的设置以满足更复杂的灌注需求。同样，在其他实施例中，根据灌注保持器官的情况也可以调整泵送单元、氧合器和超滤单元的数量，满足不同器官灌注保存情况的需求。
实施例4
结合图5所示，本实施例中静脉给药装置，包括三个注射器1、三个定量推注器2、一个注射头3以及一个氧合器4。其中，三个注射器1中分别设有血红蛋白、抗氧化剂和晶体缓冲液，并且三个注射器1之间通过管路形成并联连接后汇流至注射头3处进行输出。三个独立的定量推注器2分别与三个注射器1进行连接，以分别驱动三个注射器1以各自独立的速度进行不同液剂的输出。氧合器4位于注射头3的上游管路位置，用于对混合液剂中的血红蛋白进行输注前的预氧化处理。
此时，借助三个定量推注器对三个盛有不同液剂注射器的独立驱动，就可以根据所输注混合液剂中不同液剂之间的比例关系进行三种液剂的准确输出，并且在通过注射头输注前完成混合，从而实现对三种不同液剂的同时输注。与此同时，通过在注射头前设置氧合器，可以对混合液剂中的血红蛋白进行输注前的预氧化处理，提高血红蛋白的携氧量，达到即可供氧效果。同样，在其他实施例中，根据待输注液剂的种类数量，可以调整注射器的数量，从而满足不同使用工况中，对不同液剂的同步输注要求。
结合图5所述，在本实施例的静脉给药装置中还设有一个静态混合器5。静态混合器5位于氧合器4的上游位置，用于对三个注射器1输出的三种液剂进行混合，以提高三种液剂的混合均匀度，保证液剂的输注效果。同时，借助静态混合器可以最大限度降低三种液剂混合过程中可能产生的气体混入，保证混合液剂输注的安全有效性。
结合图5所述，在本实施例的静脉给药装置中还设有一个排气管6，并且排气管6位于注射头3和氧合器4之间，用于对最终输注的混合液剂进行多余气体和废气的排放，例如预氧化液剂过程中形成的气泡，从而进一步提高剂输出的安全性。
此外，结合图5所示，在本实施例中每一个注射器1的出口位置分别设有一个单向阀7和一个截止阀8。这样，借助截止阀可以主动控制不同注射器之间的连接关系，将不参与输注的注射器进行切断隔离，防止误操作，保证液剂成分的精准度。同时，利用单向阀可以避免输注液剂的回流，保证液剂的正常输出。
结合图6所示，在本实施例中，定量推进器2由电机21、驱动带22、推杆23和导向板24组成。其中，导向板24上设有位置传感器25，推杆23穿过导向板24后一端与注射器1的推杆端连接，另一端与驱动带22的一端连接，而驱动带22的另一端则与电机21的输出轴连接。位置传感器25与导向板24采用活动连接，可以沿推杆23移动的方向调整其固定位置，用于定位推杆23的移动距离并控制电机21的启停动作。
此时，根据最终输注混合液剂中不同液剂之间的比例关系，调整不同定量推进器中位置传感器在各自导向板上的位置，这样，在电机通过驱动带和推杆驱动注射器进行液剂输出过程中，当推杆移动至位置传感器所在位置时，位置传感器发送信号控制电机暂停运转，就可以自动停止该注射器对液剂的继续输出，达到对不同液剂的精准输出，保证混合液剂成分精度的情况下，实现自动化控制，提高液剂输注的自动化。
此外，本实施例中的截止阀8还可以采用电控截止阀，例如电磁开关阀。这样，可以将位置传感器与电控截止阀的动作进行关联，实现对截止阀的远程自动化启闭控制，提高整个液剂输注过程的自动化，提高对液剂的输注精度。
同样，在其他实施例中，定量推进器也可以直接选用控制精度更高的步进电机进行驱动，并且借助PLC控制系统进行步进电机与截止阀的联动控制。此时，不仅可以通过对步进电机的控制，直接控制注射器的液剂输出动作，包括液剂输出的速度和总量以及输注时间，而且还可以根据液剂输注过程中成分的变化，直接由PLC控制系统对各个截止阀的启闭和注射器的输出动作进行控制，从而实现针对不同液剂的不同输出控制效果，这样就可以同时并联多个盛有不同液剂的注射器，根据需求由PLC控制系统对不同注射器对应的截止阀进行启闭控制以及控制对应注射器进行输出动作，从而实现不同成分液剂的输出和混合，达到对不同混合液剂的精准输出，提高整个装置的使用效率和自动化程度。
实施例5牛血高分子聚合血红蛋白的制备
1.制备方法
采集新鲜牛血(自养牛)1L，用0.5～1倍于血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液进行稀释；
用60μm的深层过滤器过滤所述稀释后的所述血液，并用6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗60μm的深层过滤器上的残留物直至通过所述过滤器的血红蛋白达到95％以上；
将上述通过60μm的深层过滤器的物质置于0.65μm中空纤维膜上，使用5～8倍于初始血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗0.65μm中空纤维膜上的物质使得小于0.65μm的物质通过0.65μm中空纤维膜；
向被0.65μm中空纤维膜截留的物质按1:1～2于初始血液体积加入注射水以裂解红细胞，用100KD滤膜超滤裂解的红细胞，透过端为所需的血红蛋白，同时依据透过速率加入注射用水以保持恒定的超滤体积，直至血红蛋白的收率≥95％，停止100KD超滤；
用30KD膜包浓缩前述经100KD滤膜纯化的血红蛋白至其浓度为血红蛋白浓度10～14g/dL；
将上述浓度为10～14g/dL的纯化的血红蛋白经阴离子层析纯化(20mM tris的溶液平衡柱子→40min上完样品→3倍于浓度为10～14g/dL的纯化的血红蛋白体积的29Mmtris溶液洗杂→4-5倍于浓度为10～14g/dL的纯化的血红蛋白体积的50mM tris溶液洗脱)以得到精纯的血红蛋白；
将上述获得的精纯的血红蛋白置于30KD滤膜上，用3倍于精纯的血红蛋白体积的50mM磷酸氢二钠缓冲换液；
然后通入惰性气体脱氧至氧合血红蛋白小于5％，按1g血红蛋白35～45mg戊二醛的比例以雾化的方法加入戊二醛(具体见已有专利：201910846580.9)，接着按1g的血红蛋白13～18mg的硼氢化钠终止聚合反应；
接着将获得的聚合血红蛋白浓缩至6-7g/dL，将浓缩至6-7g/dL的聚合血红蛋白置于300KD的超滤膜包上，使用5～10倍于6-7g/dL的聚合血红蛋白的体积的乳酸林格氏液(氯化钠6.73g/L、氯化钾0.3g/L、二水氯化钙0.2g/L、40％乳酸钠3.07g/L、N-乙酰-L-半胱氨酸22g/L)换液，保留端为本发明的大分子聚合血红蛋白，其换液体积通过下述2(即下述分子量含量检测部分)中的分子量含量检测指标决定，在换液过程中分子量320～1024kD的蛋白含量达到65％、80％、90％、95％、97％、99％指标时，分别收集相应的蛋白溶液，通入惰性气体进行脱氧至氧合血红蛋白含量＜5％，0.2μm过滤除菌，密封隔氧保存。同时收集透过液用30kD的超滤膜包对其进行浓缩，用上述乳酸林格氏液5倍体积换液得到分子量32kD～256kD≥95％的聚合血红蛋白，通入惰性气体进行脱氧至氧合血红蛋白含量＜5％，0.2μm过滤除菌，密封隔氧保存。另外，用100kD的超滤膜包用乳酸林格氏液对上步32kD～256kD≥95％的聚合血红蛋白进行进一步超滤，直到分子量128kD～256kD≥95％时，停止超滤换液，通入惰性气体进行脱氧至氧合血红蛋白含量＜5％，0.2μm过滤除菌，密封隔氧保存。
2.分子量含量检测
2.1检测需要准备的主要材料：
Figure BDA0002465283840000771
2.2检测需要准备的主要设备：
Figure BDA0002465283840000772
Figure BDA0002465283840000781
2.3检测所需缓冲液的制备：
按下述方法制备缓冲液750mM MgCl2，50mM tris，0.1mM EDTA pH 6.5。
2.3.1用1000mL量筒测量800mL的超纯水，并将其转移到1L烧杯中。
2.3.2向1L烧杯中加入10.46±0.05g的Bis-Tris，用磁力搅拌棒轻轻搅拌直至完全溶解。
2.3.3用浓盐酸调节溶液的pH值为6.7±0.1，轻轻搅拌。
2.3.4向1L烧杯中加入152.48±0.05g的MgCl2·6H2O。
2.3.5向1L烧杯中加入0.030±0.001g的EDTA，用磁力搅拌棒轻轻搅拌直至完全溶解。
2.3.6用浓盐酸调节溶液的pH值为6.5±0.1，轻轻搅拌。
2.3.7调整pH到要求范围内，使用1000毫升量筒，用超纯水将体积增加到1000毫升。
2.3.8使用0.1μm PES过滤器过滤溶液。
2.4样品的制备
2.4.1标准品制备(Bio Rad Gel Filtration Standard)
2.4.1.1向标准品中加入500微升超纯水并轻轻旋转。
2.4.1.2在冰上静置2-3分钟，将溶液转移至1.5毫升的EP试管中。
2.4.1.3 13000转/分，4℃下离心10分钟。
2.4.1.4将上清液转移到高效液相色谱小瓶中。
2.4.2检测样品的制备
2.4.2.1将稀释后的样品转移至1.5毫升EP管中。
2.4.2.2 13000转/分，4℃下离心10分钟。
2.4.2.3将上清液转移到高效液相色谱小瓶中。
2.5检测方法
2.5.1所用层析柱：Agilent AdvanceBio SEC 2.7μm,
Figure BDA0002465283840000783
7.8×300mm
2.5.2参数设置
Figure BDA0002465283840000782
Figure BDA0002465283840000791
2.5.3保存检测数据，对其进行分析,满足分子量320kD～1024kD≥95％条件为合格；
3.血气检测
用ABL90FLEX血气分析仪上样60um上述脱氧聚合血红蛋白进行血气值检测，其高铁血红蛋白<5％、氧合血红蛋白<5％为合格。
实施例6猪血高分子聚合血红蛋白的制备
采集新鲜猪血(自养猪)1L，其余制备过程及检测方法同实施例5。
实施例7器官灌注液的制备
按每1000mL器官灌注液的配制比例称量各组分：
高分子聚合血红蛋白(实施例5方法制备，分子量320kD～1024kD，含量分别为95％、97％、99％)30g
葡萄糖(α-D-葡萄糖，阿拉丁试剂公司)9g
肝素钠(heparin sodium，阿拉丁试剂公司)25000u
氯化钠(sodium chloride，国药试剂公司)7g
注射用头孢西丁钠(Cefoxitin Sodium for Injection，信立泰药业)2g
碳酸氢钠(sodium bicarbonate，国药试剂公司)1.25g
10％复方氨基酸注射液(辰欣药业)50mL
注射用12种复合维生素(山西普德药业股份有限公司)0.2mL
胰岛素(万邦金桥制药公司)180U
无菌条件下，按上述量依次加入葡萄糖、氯化钠、肝素钠、注射用头孢西丁钠、碳酸氢钠，加注射水至200mL，搅拌至溶解，再加入10％复方氨基酸注射液、注射用12种复合维生素、胰岛素、聚合血红蛋白，注射水定容至1000mL，通入氮气脱氧，直到氧合血红蛋白含量<5％，0.2μm过滤除菌，无菌无氧环境下灌装到隔氧塑料袋，热塑封口，即得实施例7灌注液。
实施例8器官灌注液的制备
按每1000mL器官灌注液的配制比例称量各组分：
高分子聚合血红蛋白(实施例6方法制备，分子量320kD～1024kD，含量分别为95％、97％、99％)40g
葡萄糖(α-D-葡萄糖，阿拉丁试剂公司)10g
肝素钠(heparin sodium，阿拉丁试剂公司)30000u
氯化钠(sodium chloride，国药试剂公司)8g
注射用头孢西丁钠(Cefoxitin Sodium for Injection，信立泰药业)3g
碳酸氢钠(sodium bicarbonate，国药试剂公司)1.5g
10％复方氨基酸注射液(辰欣药业)60mL
注射用12种复合维生素(山西普德药业股份有限公司)0.3mL
胰岛素(万邦金桥制药公司)200U
无菌条件下，按上述量依次加入葡萄糖、氯化钠、肝素钠、注射用头孢西丁钠、碳酸氢钠，加注射水至200mL，搅拌至溶解，再加入10％复方氨基酸注射液、注射用12种复合维生素、胰岛素、聚合血红蛋白，注射水定容至1000mL，通入氮气脱氧，直到氧合血红蛋白含量<5％，0.2μm过滤除菌，无菌无氧环境下灌装到隔氧塑料袋，热塑封口，即得实施例8灌注液。
实施例9器官灌注液的制备
按每1000mL器官灌注液的配制比例称量各组分：
高分子聚合血红蛋白(实施例5方法制备，分子量320kD～1024kD，含量分别为95％、97％、99％)20g
葡萄糖(α-D-葡萄糖，阿拉丁试剂公司)8g
肝素钠(heparin sodium，阿拉丁试剂公司)20000u
氯化钠(sodium chloride，国药试剂公司)6g
注射用头孢西丁钠(Cefoxitin Sodium for Injection，信立泰药业)1g
碳酸氢钠(sodium bicarbonate，国药试剂公司)1.0g
10％复方氨基酸注射液(辰欣药业)40mL
注射用12种复合维生素(山西普德药业股份有限公司)0.1mL
胰岛素(万邦金桥制药公司)160U
无菌条件下，按上述量依次加入葡萄糖、氯化钠、肝素钠、注射用头孢西丁钠、碳酸氢钠，加注射水至200mL，搅拌至溶解，再加入10％复方氨基酸注射液、注射用12种复合维生素、胰岛素、聚合血红蛋白，注射水定容至1000mL，通入氮气脱氧，直到氧合血红蛋白含量<5％，0.2μm过滤除菌，无菌无氧环境下灌装到隔氧塑料袋，热塑封口，即得实施例9灌注液。
实施例10本发明不同浓度配方的灌注液结合本发明的器官灌注装置对离体猪肝脏的灌注研究
肝脏获取：
实验猪(巴马小型猪、10-12月龄、20-28kg，购自北京实创世纪小型猪养殖基地)术前禁食12h，禁水6h，麻醉，仰卧固定于手术台上，腹部中线切口进腹，切口上抵胸骨剑突，下达耻骨联合，松解膈下左右三角韧带，结扎胆总管和胰腺分支，肝脏游离、获取在保护第一肝门的情况下，离断肝脏周围的韧带于胸主动脉结扎处上方切断胸主动脉，切断肝上下腔静脉，以切断的胸主动脉作为牵引，将肝脏从后腹壁游离，紧贴脊柱向上游离、剪开肝周后腹膜组织及膈肌，游离主动脉至肝动脉分支以下，并于肝动脉分支以下1cm处切断腹主动脉，获取肝脏，修整肝脏修整肝门区多余组织，剔清肝门淋巴结。
灌注：
本发明实施例3器官灌注装置的进液管路连接肝动脉和门静脉，出液管路连接下腔静脉，采用门静脉流量恒定模式进行灌注，流量设定为0.5mL/min/g(肝重)，肝动脉采用压力控制模式进行灌注，压力为80/60mmHg，开始18℃灌注。将获得的肝脏分为四组：第一组为乳酸林格液；第二组为本发明实施例7中聚合血红蛋白含量为95％的配方；第三组为本发明实施例8中聚合血红蛋白含量为95％的配方；第四组为本发明实施例9中聚合血红蛋白含量为95％的配方。
各组灌注脏器在0h-1h内每隔20min，1h-72h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中AST(谷草转氨酶)、ALT(谷丙转氨酶)、TBIL(总胆红素)、ET-1(内皮素1)及聚合血红蛋白半衰期(指灌注液中血红蛋白浓度减低到二分之一所花费的时间，为本领域的常规术语)的变化水平；
组织中NO(一氧化氮)的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果：
结果表明：经上述不同灌注液对灌注肝脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以AST的含量不大于40U/L、ALT的含量不大于40U/L、TBIL的含量不大于20.5umol/L、ET-1的含量不大于20ng/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为40min、26h、28h、23h。上述第二组、第三组、第四组灌注液中聚合血红蛋白的半衰期依次为29h、30h、25h。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于1.80umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察，以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，肝小叶轮廓清楚，小叶内的肝窦状隙呈放射状排列，并相互吻合成网，相邻肝小叶间有广泛吻合，并可见到汇管区内的小叶间动脉和小叶间静脉，肝动脉的终末支沿着肝小叶的周边不断汇入肝窦状隙。
综合上述，在常温机械灌注下，本发明的灌注液结合本发明的器官灌注装置可维持第一组、第二组、第三组、第四组上述各指标维持的安全时限分别为40min、26h、28h、23h，表明上述灌注液与灌注设备的组合实现了对离体肝脏的有效灌注，可以有效延长离体肝脏的保存时间。
实施例11本发明不同浓度配方的灌注液结合本发明的器官灌注装置对离体大鼠心脏的灌注研究
心脏获取：
取大鼠(Wistar、9-11周、雌性220-240g、雄性300-350g，购自北京实验动物中心)，麻醉，置于动物台上并固定。剪开腹部皮肤，沿腹白线开腹，至剑突。提出肠道置于一侧，暴露下腔静脉，经下腔静脉注射肝素生理盐水，1min后充分肝素化，剪开腹腔血管放血。迅速开胸，剪去胸腺组织，充分暴露心脏及大血管。游离主动脉无名动脉远端，并剪断，迅速剪断其余大血管，取出心脏，简单修剪。
灌注：
显微器械提起主动脉连接本发明实施例1的器官灌注装置的进液管路，置于主动脉瓣及冠状动脉开口上方，无创血管夹固定，丝线打结固定，心脏下腔静脉连接出液管路，无创血管夹固定，丝线打结固定，取下血管夹，开启灌注系统，流量约15ml/min，开始18℃灌注。将获得的心脏分为四组：第一组为乳酸林格液；第二组为本发明实施例7中聚合血红蛋白含量为95％的配方；第三组为本发明实施例8中聚合血红蛋白含量为95％的配方；第四组为本发明实施例9中聚合血红蛋白含量为95％的配方。
灌注的心脏在0h-1h内每隔10min，1h-72h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中的CTN(肌钙蛋白)、CK-MB(肌酸激酶同工酶)、ANP(血心纳肽)及聚合血红蛋白半衰期的变化水平；
组织中NO(一氧化氮)的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果：
结果表明：经上述不同灌注液对灌注心脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以CTN的含量不大于0.13ug/L、CK-MB的含量不大于16U/L、ANP的含量不大于54pmol/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为50min、27h、30h、25h。上述第二组、第三组、第四组灌注液中聚合血红蛋白的半衰期依次为30h、34h、26h。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于2.30umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察，以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，心肌间质网络呈现密集蜂巢状，肌细胞位于肌细胞鞘内，肌细胞鞘呈现出圆形或椭圆形结构，鞘外表面的胶原纤维呈网状排列，肌细胞鞘外表面胶原纤维的走向不一致，呈现出网状结构，胶原纤维直径粗细不等，都呈现正常状态。
综合上述，在常温机械灌注下，本发明的灌注液结合本发明的器官灌注装置可维持第一组、第二组、第三组、第四组上述各指标维持的安全时限分别为50min、27h、30h、25h，表明上述灌注液与灌注设备的组合实现了对离体心脏的有效灌注，可以有效延长离体心脏的保存时间。
实施例12本发明不同浓度配方的灌注液结合本发明的器官灌注装置对离体狗肾脏的灌注研究
肾脏获取：
取实验狗(成年比格犬、7-10kg、购自北京实验动物中心)，麻醉，呈正中仰卧位固定，开腹后分离组织，暴露并切取肾脏，修整。
灌注：
显微器械提起肾动脉连接本发明实施例1的器官灌注装置的进液管路，无创血管夹固定，丝线打结固定，肾静脉连接出液管路，无创血管夹固定，丝线打结固定，取下血管夹，开启灌注系统，开始18℃灌注。将获得的肾脏分为四组：第一组为乳酸林格液；第二组为本发实施例7中聚合血红蛋白含量为95％的配方；第三组为本发明实施例8中聚合血红蛋白含量为95％的配方；第四组为本发明实施例9中聚合血红蛋白含量为95％的配方。
各组灌注脏器在0h-120h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中的Scr(肌酐)、BUN(尿素氮)、ET-1(内皮素1)及聚合血红蛋白半衰期的变化水平；
组织中NO(一氧化氮)的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果：
结果表明：经上述不同灌注液对灌注肾脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以Scr的含量不大于120μmol/L、BUN的含量不大于7.0mmol/L、ET-1的含量不大于20ng/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为2h、89h、97h、82h。上述第二组、第三组、第四组灌注液中聚合血红蛋白的半衰期依次为51h、58h、50h。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果都为不低于3.40umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察，以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，核型大致正常，核质分布均匀，线粒体轻微肿胀，但嵴排列尚良好，个别嵴膜间隙略增宽。内质网亦有轻度肿胀。近曲小管上皮细胞微绒毛水肿、增粗，个别脱落。毛细血管内皮与滤过膜内皮细胞轻微水肿，结构尚清，呈现正常状态。
综合上述，在常温机械灌注下，本发明的灌注液结合本发明的器官灌注装置可维持第一组、第二组、第三组、第四组上述各指标维持的安全时限分别为2h、89h、97h、82h，表明上述灌注液与灌注设备的组合实现了对离体肾脏的有效灌注，可以有效延长离体肾脏的保存时间。
实施例13本发明不同浓度配方的灌注液结合本发明的器官灌注装置对废弃人肝的灌注研究
肝脏获取：
从医院获取废弃人肝脏，修整肝脏修整肝门区多余组织，剔清肝门淋巴结。
灌注：
本发明实施例3的器官灌注装置的进液管路连接肝动脉和门静脉，出液管路连接下腔静脉，采用门静脉流量恒定模式进行灌注，流量设定为0.5mL/min/g(肝重)，肝动脉采用压力控制模式进行灌注，压力为80/60mmHg，开始18℃灌注。将获得的肝脏分为四组：第一组为乳酸林格液；第二组为本发明实施例7中聚合血红蛋白含量为95％的配方；第三组为本发明实施例8中聚合血红蛋白含量为95％的配方；第四组为本发明实施例9中聚合血红蛋白含量为95％的配方。
各组灌注脏器在0h-1h内每隔20min，1h-72h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中AST(谷草转氨酶)、ALT(谷丙转氨酶)、TBIL(总胆红素)、ET-1(内皮素1)及聚合血红蛋白半衰期(指灌注液中血红蛋白浓度减低到二分之一所花费的时间，为本领域的常规术语)的变化水平；
组织中NO(一氧化氮)的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果：
结果表明：经上述不同灌注液对灌注肝脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以AST的含量不大于40U/L、ALT的含量不大于40U/L、TBIL的含量不大于20.5umol/L、ET-1的含量不大于20ng/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为40min、26h、28h、23h。上述第二组、第三组、第四组灌注液中聚合血红蛋白的半衰期依次为29h、30h、25h。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于1.80umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察，以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，肝小叶轮廓清楚，小叶内的肝窦状隙呈放射状排列，并相互吻合成网，相邻肝小叶间有广泛吻合，并可见到汇管区内的小叶间动脉和小叶间静脉，肝动脉的终末支沿着肝小叶的周边不断汇入肝窦状隙。
综合上述，在常温机械灌注下，本发明的灌注液结合本发明的器官灌注装置可维持第一组、第二组、第三组、第四组上述各指标维持的安全时限分别为40min、26h、28h、23h，表明上述灌注液与灌注设备的组合实现了对离体肝脏的有效灌注，可以有效延长离体肝脏的保存时间。
对比例1离体猪肝脏在不同配方灌注液下的灌注实验效果对比
肝脏获取：
实验猪(巴马小型猪、10-12月龄、20-28kg，购自北京实创世纪小型猪养殖基地)术前禁食12h，禁水6h，麻醉，仰卧固定于手术台上，腹部中线切口进腹，切口上抵胸骨剑突，下达耻骨联合，松解膈下左右三角韧带，结扎胆总管和胰腺分支，肝脏游离、获取在保护第一肝门的情况下，离断肝脏周围的韧带于胸主动脉结扎处上方切断胸主动脉，切断肝上下腔静脉，以切断的胸主动脉作为牵引，将肝脏从后腹壁游离，紧贴脊柱向上游离、剪开肝周后腹膜组织及膈肌，游离主动脉至肝动脉分支以下，并于肝动脉分支以下1cm处切断腹主动脉，获取肝脏，修整肝脏修整肝门区多余组织，剔清肝门淋巴结。
灌注：
本发明实施例3的器官灌注装置的进液管路连接肝动脉和门静脉，出液管路连接下腔静脉，采用门静脉流量恒定模式进行灌注，流量设定为0.5mL/min/g(肝重)，肝动脉采用压力控制模式进行灌注，压力为80/60mmHg，开始18℃灌注。将获得的肝脏分为十组：第一组为乳酸林格液；第二组为实施例7中的血红蛋白更换为分子量为32kD～256kD含量≥95％的血红蛋白；第三组为实施例7中的血红蛋白更换为分子量为128kD～256kD含量≥95％的血红蛋白；第四组为实施例7中的血红蛋白更换为分子量为320kD～1024kD含量为65％的血红蛋白；第五组为实施例7中的血红蛋白更换为分子量为320kD～1024kD含量为80％的血红蛋白；第六组为实施例7中的血红蛋白更换为分子量为320kD～1024kD含量为90％的血红蛋白；第七组为本发明实施例7配方，即分子量为320kD～1024kD含量为95％的血红蛋白；第八组为本发明实施例7配方，即分子量为320kD～1024kD含量为97％的血红蛋白；第九组为本发明实施例7配方，即分子量为320kD～1024kD含量为99％的血红蛋白；第十组为本公司专利号201910846580.9方法制备的聚合血红蛋白(分子量320kD～1024kD<45％)。
各组灌注脏器在0h-1h内每隔20min，1h-72h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中AST、ALT、TBIL、ET-1及聚合血红蛋白的半衰期的变化水平；
组织中NO的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果：
结果表明：经上述不同灌注液对灌注肝脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以AST的含量不大于40U/L、ALT的含量不大于40U/L、TBIL的含量不大于20.5umol/L、ET-1的含量不大于20ng/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为40min、10h、12h、19h、17h、18h、26h、27h、27h、18h。上述第二组、第三组、第四组、第五组、第六组、第七组、第八组、第九组、第十组灌注液中聚合血红蛋白的半衰期依次为12h、15h、22h、21h、21h、29h、30h、30h、20h(如下表1所示)。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于1.80umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察，以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，肝小叶轮廓清楚，小叶内的肝窦状隙呈放射状排列，并相互吻合成网，相邻肝小叶间有广泛吻合，并可见到汇管区内的小叶间动脉和小叶间静脉，肝动脉的终末支沿着肝小叶的周边不断汇入肝窦状隙。
综合上述，在常温机械灌注下，各灌注液结合本发明的器官灌注装置可维持第一组、第二组、第三组、第四组、第五组、第六组、第七组、第八组、第九组、第十组上述各指标维持的安全时限分别为40min、10h、12h、19h、17h、18h、26h、27h、27h、18h(如下表1所示)。第二组、第三组使用低于320kD的不同段的聚合血红蛋白其灌注安全时限略有差别，但灌注安全时限都较短。第十组使用不分离混合的聚合血红蛋白其有效灌注时长一般，不具有选择优势。第四组、第五组、第六组、第七组使用320-1024kD的聚合血红蛋白，其随含量的升高(65％、80％、90％、95％)呈波动式延长灌注安全时限，但第七组、第八组、第九组使用的分子量为320-1024kD含量为95％、97％、99％的血红蛋白的灌注安全时限不再波动，且具有明显的灌注安全时限优势。
表1：离体猪肝脏在不同配方灌注液下的灌注实验效果对比
Figure BDA0002465283840000881
Figure BDA0002465283840000891
对比例2离体大鼠心脏在不同配方灌注液下的灌注实验效果对比
心脏获取：
取大鼠(Wistar、9-11周、雌性220-240g、雄性300-350g，购自北京实验动物中心)，麻醉，置于动物台上并固定。剪开腹部皮肤，沿腹白线开腹，至剑突。提出肠道置于一侧，暴露下腔静脉，经下腔静脉注射肝素生理盐水，1min后充分肝素化，剪开腹腔血管放血。迅速开胸，剪去胸腺组织，充分暴露心脏及大血管。游离主动脉无名动脉远端，并剪断，迅速剪断其余大血管，取出心脏，简单修剪。
灌注：
显微器械提起主动脉连接本发明实施例1的器官灌注装置的进液管路，置于主动脉瓣及冠状动脉开口上方，无创血管夹固定，丝线打结固定，心脏下腔静脉连接出液管路，无创血管夹固定，丝线打结固定，取下血管夹，开启灌注系统，流量约15ml/min，开始18℃灌注。将获得的心脏分为十组：第一组为乳酸林格液；第二组为实施例7中的血红蛋白更换为分子量为32kD～256kD含量≥95％的血红蛋白；第三组为实施例7中的血红蛋白更换为分子量为128kD～256kD含量≥95％的血红蛋白；第四组为实施例7中的血红蛋白更换为分子量为320kD～1024kD含量为65％的血红蛋白；第五组为实施例7中的血红蛋白更换为分子量为320kD～1024kD含量为80％的血红蛋白；第六组为实施例7中的血红蛋白更换为分子量为320kD～1024kD含量为90％的血红蛋白；第七组为本发明实施例7配方，即分子量为320kD～1024kD含量为95％的血红蛋白；第八组为本发明实施例7配方，即分子量为320kD～1024kD含量为97％的血红蛋白；第九组为本发明实施例7配方，即分子量为320kD～1024kD含量为99％的血红蛋白；第十组为本公司专利号201910846580.9方法制备的聚合血红蛋白(分子量320kD～1024kD<45％)。
灌注的心脏在0h-1h内每隔10min，1h-72h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中的CTN、CK-MB、ANP及聚合血红蛋白半衰期的变化水平；
组织中NO的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果：
结果表明：经上述不同灌注液对灌注心脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以CTN的含量不大于0.13ug/L、CK-MB的含量不大于16U/L、ANP的含量不大于54pmol/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为50min、12h、13h、20h、17h、19h、27h、28h、28h、20h。上述第二组、第三组、第四组、第五组、第六组、第七组、第八组、第九组、第十组灌注液中聚合血红蛋白的半衰期依次为14h、15h、22h、20h、22h、30h、31h、31h、24h(如下表2所示)。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于2.30umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察，以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，心肌间质网络呈现密集蜂巢状，肌细胞位于肌细胞鞘内，肌细胞鞘呈现出圆形或椭圆形结构，鞘外表面的胶原纤维呈网状排列，肌细胞鞘外表面胶原纤维的走向不一致，呈现出网状结构，胶原纤维直径粗细不等，结果呈现正常状态。
综合上述，在常温机械灌注下，各灌注液结合本发明的器官灌注装置可维持第一组、第二组、第三组、第四组、第五组、第六组、第七组、第八组、第九组、第十组上述各指标维持的安全时限分别为50min、12h、13h、20h、17h、19h、27h、28h、28h、20h(如下表2所示)。第二组、第三组使用低于320kD的不同段的聚合血红蛋白其灌注安全时限略有差别，但灌注安全时限都较短。第十组使用不分离混合的聚合血红蛋白其有效灌注时长一般，不具有选择优势。第四组、第五组、第六组、第七组使用320-1024kD的聚合血红蛋白，其随含量的升高(65％、80％、90％、95％)呈波动式延长灌注安全时限，但第七组、第八组、第九组使用的分子量为320-1024kD含量为95％、97％、99％的血红蛋白的灌注安全时限不再波动，且具有明显的灌注安全时限优势。
表2：离体大鼠心脏在不同配方灌注液下的灌注实验效果对比
Figure BDA0002465283840000911
Figure BDA0002465283840000921
对比例3离体狗肾脏在不同配方灌注液下的灌注实验效果对比肾脏获取：
取实验狗(成年比格犬、7-10kg、购自北京实验动物中心)，麻醉，呈正中仰卧位固定，开腹后分离组织，暴露并切取肾脏，修整。
灌注：
显微器械提起肾动脉连接本发明实施例1的器官灌注装置的进液管路，无创血管夹固定，丝线打结固定，肾静脉连接出液管路，无创血管夹固定，丝线打结固定，取下血管夹，开启灌注系统，开始18℃灌注。将获得的肾脏分为十组：第一组为乳酸林格液；第二组为实施例7中的血红蛋白更换为分子量为32kD～256kD含量≥95％的血红蛋白；第三组为实施例7中的血红蛋白更换为分子量为128kD～256kD含量≥95％的血红蛋白；第四组为实施例7中的血红蛋白更换为分子量为320kD～1024kD含量为65％的血红蛋白；第五组为实施例7中的血红蛋白更换为分子量为320kD～1024kD含量为80％的血红蛋白；第六组为实施例7中的血红蛋白更换为分子量为320kD～1024kD含量为90％的血红蛋白；第七组为本发明实施例7配方，即分子量为320kD～1024kD含量为95％的血红蛋白；第八组为本发明实施例7配方，即分子量为320kD～1024kD含量为97％的血红蛋白；第九组为本发明实施例7配方，即分子量为320kD～1024kD含量为99％的血红蛋白；第十组为本公司专利号201910846580.9方法制备的聚合血红蛋白(分子量320kD～1024kD<45％)。
各组灌注脏器在0h-120h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中的Scr、BUN、ET-1及聚合血红蛋白半衰期的变化水平；
组织中NO的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果：
结果表明：经上述不同灌注液对灌注肾脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以Scr的含量不大于120μmol/L、BUN的含量不大于7.0mmol/L、ET-1的含量不大于20ng/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为2h、40h、43h、73h、68h、71h、89h、91h、92h、72h。上述第二组、第三组、第四组、第五组、第六组、第七组灌注液中聚合血红蛋白的半衰期依次为30h、33h、42h、40h、42h、51h、53h、53h、36h(如下表3所示)。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于3.40umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察，以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，核型大致正常，核质分布均匀，线粒体轻微肿胀，但嵴排列尚良好，个别嵴膜间隙略增宽。内质网亦有轻度肿胀。近曲小管上皮细胞微绒毛水肿、增粗，个别脱落。毛细血管内皮与滤过膜内皮细胞轻微水肿，结构尚清，呈现正常状态。
综合上述，在常温机械灌注下，各灌注液结合本发明的器官灌注装置可维持第一组、第二组、第三组、第四组、第五组、第六组、第七组、第八组、第九组、第十组上述各指标维持的安全时限分别为2h、40h、43h、73h、68h、71h、89h、91h、92h、72h(如下表3所示)。第二组、第三组使用低于320kD的不同段的聚合血红蛋白其灌注安全时限略有差别，但灌注安全时限都较短。第十组使用不分离混合的聚合血红蛋白其有效灌注时长一般，不具有选择优势。第四组、第五组、第六组、第七组使用320-1024kD的聚合血红蛋白，其随含量的升高(65％、80％、90％、95％)呈波动式延长灌注安全时限，但第七组、第八组、第九组使用的分子量为320-1024kD含量为95％、97％、99％的血红蛋白的灌注安全时限不再波动，且具有明显的灌注安全时限优势。
表3：离体狗肾脏在不同配方灌注液下的灌注实验效果对比
Figure BDA0002465283840000941
Figure BDA0002465283840000951
对比例4废弃人肝在不同配方灌注液下的灌注实验效果对比
肝脏获取：
从医院获取废弃人肝脏，修整肝脏修整肝门区多余组织，剔清肝门淋巴结。
灌注：
本发明实施例3的器官灌注装置的进液管路连接肝动脉和门静脉，出液管路连接下腔静脉，采用门静脉流量恒定模式进行灌注，流量设定为0.5mL/min/g(肝重)，肝动脉采用压力控制模式进行18℃灌注，压力为80/60mmHg，开始18℃灌注。将获得的肝脏分为十组：第一组为乳酸林格液；第二组为实施例7中的血红蛋白更换为分子量为32kD～256kD含量≥95％的血红蛋白；第三组为实施例7中的血红蛋白更换为分子量为128kD～256kD含量≥95％的血红蛋白；第四组为实施例7中的血红蛋白更换为分子量为320kD～1024kD含量为65％的血红蛋白；第五组为实施例7中的血红蛋白更换为分子量为320kD～1024kD含量为80％的血红蛋白；第六组为实施例7中的血红蛋白更换为分子量为320kD～1024kD含量为90％的血红蛋白；第七组为本发明实施例7配方，即分子量为320kD～1024kD含量为95％的血红蛋白；第八组为本发明实施例7配方，即分子量为320kD～1024kD含量为97％的血红蛋白；第九组为本发明实施例7配方，即分子量为320kD～1024kD含量为99％的血红蛋白；第十组为本公司专利号201910846580.9方法制备的聚合血红蛋白(分子量320kD～1024kD<45％)。
各组灌注脏器在0h-1h内每隔20min，1h-72h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中AST、ALT、TBIL、ET-1及聚合血红蛋白的半衰期的变化水平；
组织中NO的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果：
结果表明：经上述不同灌注液对灌注肝脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以AST的含量不大于40U/L、ALT的含量不大于40U/L、TBIL的含量不大于20.5umol/L、ET-1的含量不大于20ng/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为40min、10h、12h、19h、17h、18h、26h、27h、27h、18h。上述第二组、第三组、第四组、第五组、第六组、第七组、第八组、第九组、第十组灌注液中聚合血红蛋白的半衰期依次为12h、15h、22h、21h、21h、29h、30h、30h、20h(如下表4所示)。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于1.80umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察，以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，肝小叶轮廓清楚，小叶内的肝窦状隙呈放射状排列，并相互吻合成网，相邻肝小叶间有广泛吻合，并可见到汇管区内的小叶间动脉和小叶间静脉，肝动脉的终末支沿着肝小叶的周边不断汇入肝窦状隙。
综合上述，在常温机械灌注下，各灌注液结合本发明的器官灌注装置可维持第一组、第二组、第三组、第四组、第五组、第六组、第七组、第八组、第九组、第十组上述各指标维持的安全时限分别为40min、10h、12h、19h、17h、18h、26h、27h、27h、18h(如下表4所示)。第二组、第三组使用低于320kD的不同段的聚合血红蛋白其灌注安全时限略有差别，但灌注安全时限都较短。第十组使用不分离混合的聚合血红蛋白其有效灌注时长一般，不具有选择优势。第四组、第五组、第六组、第七组使用320-1024kD的聚合血红蛋白，其随含量的升高(65％、80％、90％、95％)呈波动式延长灌注安全时限，但第七组、第八组、第九组使用的分子量为320-1024kD含量为95％、97％、99％的血红蛋白的灌注安全时限不再波动，且具有明显的灌注安全时限优势。
表4：废弃人肝在不同配方灌注液下的灌注实验效果对比
Figure BDA0002465283840000971
Figure BDA0002465283840000981
实施例14牛血聚合血红蛋白的制备
采集新鲜牛血(自养牛)1L，用0.5～1倍于血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液进行稀释；
用60μm的深层过滤器过滤所述稀释后的所述血液，并用6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗60μm的深层过滤器上的残留物直至通过所述过滤器的血红蛋白达到95％以上；
将上述通过60μm的深层过滤器的物质置于0.65μm中空纤维膜上，使用5～8倍于初始血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗0.65μm中空纤维膜上的物质使得小于0.65μm的物质通过0.65μm中空纤维膜；
向被0.65μm中空纤维膜截留的物质按1:1～2于初始血液体积加入注射水以裂解红细胞，用100KD滤膜超滤裂解的红细胞，透过端为所需的血红蛋白，同时依据透过速率加入注射用水以保持恒定的超滤体积，直至血红蛋白的收率≥95％，停止100KD超滤；
用30KD膜包浓缩前述经100KD滤膜纯化的血红蛋白至其浓度为血红蛋白浓度10～14g/dl；
将上述浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白经阴离子层析纯化(20mM tris的溶液平衡柱子→40min上完样品→3倍于浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白体积的29Mmtris溶液洗杂→4-5倍于浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白体积的50mM tris溶液洗脱)以得到精纯的血红蛋白；
将上述获得的精纯的血红蛋白置于30KD滤膜上，用3倍于精纯的血红蛋白体积的50mM磷酸氢二钠缓冲换液；
然后通入惰性气体脱氧至氧合血红蛋白小于5％，按1g血红蛋白35～45mg戊二醛的比例以雾化的方法加入戊二醛(具体见已有专利：201910846580.9)，接着按1g的血红蛋白13～18mg的硼氢化钠终止聚合反应；
接着将获得的聚合血红蛋白浓缩至6-7g/dL，将浓缩至6-7g/dL的聚合血红蛋白置于30KD的超滤膜包上，使用5～8倍于6-7g/dL的聚合血红蛋白的体积的乳酸林格氏液(氯化钠6.73g/L、氯化钾0.3g/L、二水氯化钙0.2g/L、40％乳酸钠3.07g/L、N-乙酰-L-半胱氨酸22g/L)换液得到聚合血红蛋白，通入惰性气体进行脱氧至氧合血红蛋白含量≤5％，0.2um过滤除菌，获得所述聚合血红蛋白。
用Thermo的HPLC(ULTMATE3000)进行分子量分布分析，所用分子筛柱AgilentAdvance BioSEC2.7um,7.8×300mm，所用流动相为：750mM氯化镁、50mM Tris、0.1mM EDTA，取上述交联的血红蛋白制备样品进行上样，每针上样交联血红蛋白20ug，其MW≤32,000(游离血红蛋白)≤5％为合格；用ABL90FLEX血气分析仪上样60um上述脱氧聚合血红蛋白进行血气值检测，其高铁血红蛋白<5％、氧合血红蛋白<5％为合格。
实施例15猪血聚合血红蛋白的制备
采集新鲜猪血(自养猪)1L，之后的制备过程同实施例14。
实施例16器官灌注液的制备
按每1000ml器官灌注液的配制比例称量各组分：
聚合血红蛋白(实施例14的方法制备)30g
葡萄糖(α-D-葡萄糖，阿拉丁试剂公司)9g
硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ(Thioredoxin peroxidaseⅡ，ProSpec公司)6.7g
肝素钠(heparin sodium，阿拉丁试剂公司)25000u
氯化钠(sodium chloride，国药试剂公司)7g
注射用头孢西丁钠(Cefoxitin Sodium for Injection，信立泰药业)2g
碳酸氢钠(sodium bicarbonate，国药试剂公司)1.25g
10％复方氨基酸注射液(辰欣药业)50ml
注射用12种复合维生素(山西普德药业股份有限公司)0.2ml
无菌条件下，按上述量依次加入葡萄糖、硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ、氯化钠、肝素钠、注射用头孢西丁钠、碳酸氢钠，加注射水至200ml，搅拌至溶解，再加入10％复方氨基酸注射液、注射用12种复合维生素、聚合血红蛋白，注射水定容至1000ml，通入氮气脱氧，直到氧合血红蛋白含量<5％，0.2um过滤除菌，无菌无氧环境下灌装到隔氧塑料袋，热塑封口，即得实施例16灌注液。
实施例17器官灌注液的制备
按每1000ml器官灌注液的配制比例称量各组分：
聚合血红蛋白(实施例15的方法制备)40g
葡萄糖(α-D-葡萄糖，阿拉丁试剂公司)10g
硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ(Thioredoxin peroxidaseⅡ，ProSpec公司)10g
肝素钠(heparin sodium，阿拉丁试剂公司)30000u
氯化钠(sodium chloride，国药试剂公司)8g
注射用头孢西丁钠(Cefoxitin Sodium for Injection，信立泰药业)3g
碳酸氢钠(sodium bicarbonate，国药试剂公司)1.5g
10％复方氨基酸注射液(辰欣药业)60ml
注射用12种复合维生素(山西普德药业股份有限公司)0.3ml
无菌条件下，按上述量依次加入葡萄糖、硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ、氯化钠、肝素钠、注射用头孢西丁钠、碳酸氢钠，加注射水至200ml，搅拌至溶解，再加入10％复方氨基酸注射液、注射用12种复合维生素、聚合血红蛋白，注射水定容至1000ml，通入氮气脱氧，直到氧合血红蛋白含量<5％，0.2um过滤除菌，无菌无氧环境下灌装到隔氧塑料袋，热塑封口，即得实施例17灌注液。
实施例18器官灌注液的制备
按每1000ml器官灌注液的配制比例称量各组分：
聚合血红蛋白(实施例14的方法制备)20g
葡萄糖(α-D-葡萄糖，阿拉丁试剂公司)8g
硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ(Thioredoxin peroxidaseⅡ，自ProSpec公司)4g
肝素钠(heparin sodium，阿拉丁试剂公司)20000u
氯化钠(sodium chloride，国药试剂公司)6g
注射用头孢西丁钠(Cefoxitin Sodium for Injection，信立泰药业)1g
碳酸氢钠(sodium bicarbonate，国药试剂公司)1.0g
10％复方氨基酸注射液(辰欣药业)40ml
注射用12种复合维生素(山西普德药业股份有限公司)0.1ml
无菌条件下，按上述量依次加入葡萄糖、硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ、氯化钠、肝素钠、注射用头孢西丁钠、碳酸氢钠，加注射水至200ml，搅拌至溶解，再加入10％复方氨基酸注射液、注射用12种复合维生素、聚合血红蛋白，注射水定容至1000ml，通入氮气脱氧，直到氧合血红蛋白含量<5％，0.2um过滤除菌，无菌无氧环境下灌装到隔氧塑料袋，热塑封口，即得实施例18灌注液。
实施例19本发明不同浓度配方的灌注液结合本发明的器官灌注装置对离体猪肝脏的灌注研究
肝脏获取：
实验猪(巴马小型猪、10-12月龄、20-28kg，购自北京实创世纪小型猪养殖基地)术前禁食12h，禁水6h，麻醉，仰卧固定于手术台上，腹部中线切口进腹，切口上抵胸骨剑突，下达耻骨联合，松解膈下左右三角韧带，结扎胆总管和胰腺分支，肝脏游离、获取在保护第一肝门的情况下，离断肝脏周围的韧带于胸主动脉结扎处上方切断胸主动脉，切断肝上下腔静脉，以切断的胸主动脉作为牵引，将肝脏从后腹壁游离，紧贴脊柱向上游离、剪开肝周后腹膜组织及膈肌，游离主动脉至肝动脉分支以下，并于肝动脉分支以下1cm处切断腹主动脉，获取肝脏，修整肝脏修整肝门区多余组织，剔清肝门淋巴结。
灌注：
本发明实施例3的器官灌注装置的进液管路连接肝动脉和门静脉，出液管路连接下腔静脉，采用门静脉流量恒定模式进行灌注，流量设定为0.5mL/min/g(肝重)，肝动脉采用压力控制模式进行灌注，压力为80/60mmHg，开始18℃灌注。将获得的肝脏分为四组：第一组为乳酸林格液；第二组为本发明实施例16配方；第三组为本发明实施例17配方；第四组为本发明实施例18配方。
各组灌注脏器在0h-1h内每隔20min，1h-72h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中AST(谷草转氨酶)、ALT(谷丙转氨酶)、TBIL(总胆红素)、ET-1(内皮素1)及聚合血红蛋白半衰期(指灌注液中血红蛋白浓度减低到二分之一所花费的时间，为本领域的常规术语)的变化水平；
组织中NO(一氧化氮)的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果：
结果表明：经上述不同灌注液对灌注肝脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以AST的含量不大于40U/L、ALT的含量不大于40U/L、TBIL的含量不大于20.5umol/L、ET-1的含量不大于20ng/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为40min、30h、32h、28h。上述第二、三、四组灌注液中聚合血红蛋白的半衰期依次为30h、34h、27h。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于1.80umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察,以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，肝小叶轮廓清楚，小叶内的肝窦状隙呈放射状排列，并相互吻合成网，相邻肝小叶间有广泛吻合，并可见到汇管区内的小叶间动脉和小叶间静脉，肝动脉的终末支沿着肝小叶的周边不断汇入肝窦状隙。
综合上述，在常温机械灌注下，本发明的灌注液结合本发明的器官灌注装置可维持第一组、第二组、第三组、第四组上述各指标维持的安全时限分别为40min、30h、32h、28h，表明上述灌注液与灌注设备的组合实现了对离体肝脏的有效灌注，可以有效延长离体肝脏的保存时间。
实施例20本发明不同浓度配方的灌注液结合本发明的器官灌注装置对离体大鼠心脏的灌注研究
心脏获取：
取大鼠(Wistar、9-11周、雌性220-240g、雄性300-350g，购自北京实验动物中心)，麻醉，置于动物台上并固定。剪开腹部皮肤，沿腹白线开腹，至剑突。提出肠道置于一侧，暴露下腔静脉，经下腔静脉注射肝素生理盐水，1min后充分肝素化，剪开腹腔血管放血。迅速开胸，剪去胸腺组织，充分暴露心脏及大血管。游离主动脉无名动脉远端，并剪断，迅速剪断其余大血管，取出心脏，简单修剪。
灌注：
显微器械提起主动脉连接本发明实施例1的器官灌注装置的进液管路，置于主动脉瓣及冠状动脉开口上方，无创血管夹固定，丝线打结固定，心脏下腔静脉连接出液管路，无创血管夹固定，丝线打结固定，取下血管夹，开启灌注系统，流量约15ml/min，开始18℃灌注。将获得的心脏分为四组：第一组为乳酸林格液；第二组为本发明实施例16配方；第三组为本发明实施例17配方；第四组为本发明实施例18配方。
灌注的心脏在0h-1h内每隔10min，1h-72h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中的CTN(肌钙蛋白)、CK-MB(肌酸激酶同工酶)、ANP(血心纳肽)及聚合血红蛋白半衰期的变化水平；
组织中NO的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果：
结果表明：经上述不同灌注液对灌注心脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以CTN的含量不大于0.13ug/L、CK-MB的含量不大于16U/L、ANP的含量不大于54pmol/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为50min、32h、34h、30h。上述第二、三、四组灌注液中聚合血红蛋白的半衰期依次为32h、35h、28h。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于2.30umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察,以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，心肌间质网络呈现密集蜂巢状，肌细胞位于肌细胞鞘内，肌细胞鞘呈现出圆形或椭圆形结构，鞘外表面的胶原纤维呈网状排列，肌细胞鞘外表面胶原纤维的走向不一致，呈现出网状结构，胶原纤维直径粗细不等，都呈现正常状态。
综合上述，在常温机械灌注下，本发明的灌注液结合本发明的器官灌注装置可维持第一组、第二组、第三组、第四组上述各指标维持的安全时限分别为50min、32h、34h、30h，表明上述灌注液与灌注设备的组合实现了对离体心脏的有效灌注，可以有效延长离体心脏的保存时间。
实施例21本发明不同浓度配方的灌注液结合本发明的器官灌注装置对离体狗肾脏的灌注研究
肾脏获取：
取实验狗(成年比格犬、7-10kg、购自北京实验动物中心)，麻醉，呈正中仰卧位固定，开腹后分离组织，暴露并切取肾脏，修整。
灌注：
显微器械提起肾动脉连接实施例1的器官灌注装置的进液管路，无创血管夹固定，丝线打结固定，肾静脉连接出液管路，无创血管夹固定，丝线打结固定，取下血管夹，开启灌注系统，开始18℃灌注。将获得的肾脏分为四组：第一组为乳酸林格液；第二组为本发实施例16配方；第三组为本发明实施例17配方；第四组为本发明实施例18配方。
各组灌注脏器在0h-120h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中的Scr(肌酐)、BUN(尿素氮)、ET-1(内皮素1)及聚合血红蛋白半衰期的变化水平；
组织中NO的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果：
结果表明：经上述不同灌注液对灌注肾脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以Scr的含量不大于120μmol/L、BUN的含量不大于7.0mmol/L、ET-1的含量不大于20ng/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为2h、108h、113h、102h。上述第二、三、四组灌注液中聚合血红蛋白的半衰期依次为78h、86h、72h。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果都为不低于3.40umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察,以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，核型大致正常，核质分布均匀，线粒体轻微肿胀，但嵴排列尚良好，个别嵴膜间隙略增宽。内质网亦有轻度肿胀。近曲小管上皮细胞微绒毛水肿、增粗，个别脱落。毛细血管内皮与滤过膜内皮细胞轻微水肿，结构尚清，呈现正常状态。
综合上述，在常温机械灌注下，本发明的灌注液结合本发明的器官灌注装置可维持第一组、第二组、第三组、第四组上述各指标维持的安全时限分别为2h、108h、113h、102h，表明上述灌注液与灌注设备的组合实现了对离体肾脏的有效灌注，可以有效延长离体肾脏的保存时间。
实施例22本发明不同浓度配方的灌注液结合本发明的器官灌注装置对废弃人肝的灌注研究
肝脏获取：
从医院获取废弃人肝脏，修整肝脏修整肝门区多余组织，剔清肝门淋巴结。
灌注：
本发明实施例3的器官灌注装置的进液管路连接肝动脉和门静脉，出液管路连接下腔静脉，采用门静脉流量恒定模式进行灌注，流量设定为0.5mL/min/g(肝重)，肝动脉采用压力控制模式进行灌注，压力为80/60mmHg，开始18℃灌注。将获得的肝脏分为四组：第一组为乳酸林格液；第二组为本发明实施例16配方；第三组为本发明实施例17配方；第四组为本发明实施例18配方。
各组灌注脏器在0h-1h内每隔20min，1h-72h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中AST(谷草转氨酶)、ALT(谷丙转氨酶)、TBIL总胆红素)、ET-1(内皮素1)及聚合血红蛋白半衰期(指灌注液中血红蛋白浓度减低到二分之一所花费的时间，为本领域的常规术语)的变化水平；
组织中NO(一氧化氮)的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果：
结果表明：经上述不同灌注液对灌注肝脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以AST的含量不大于40U/L、ALT的含量不大于40U/L、TBIL的含量不大于20.5umol/L、ET-1的含量不大于20ng/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为40min、30h、32h、28h。上述第二、三、四组灌注液中聚合血红蛋白的半衰期依次为30h、34h、27h。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于1.80umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察,以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，肝小叶轮廓清楚，小叶内的肝窦状隙呈放射状排列，并相互吻合成网，相邻肝小叶间有广泛吻合，并可见到汇管区内的小叶间动脉和小叶间静脉，肝动脉的终末支沿着肝小叶的周边不断汇入肝窦状隙。
综合上述，在常温机械灌注下，本发明的灌注液结合本发明的器官灌注装置可维持第一组、第二组、第三组、第四组上述各指标维持的安全时限分别为40min、30h、32h、28h，表明上述灌注液与灌注设备的组合实现了对离体肝脏的有效灌注，可以有效延长离体肝脏的保存时间。
对比例5离体猪肝脏不同配方灌注液下的灌注实验结果对比
肝脏获取：
实验猪(巴马小型猪、10-12月龄、20-28kg，购自北京实创世纪小型猪养殖基地)术前禁食12h，禁水6h，麻醉，仰卧固定于手术台上，腹部中线切口进腹，切口上抵胸骨剑突，下达耻骨联合，松解膈下左右三角韧带，结扎胆总管和胰腺分支，肝脏游离、获取在保护第一肝门的情况下，离断肝脏周围的韧带于胸主动脉结扎处上方切断胸主动脉，切断肝上下腔静脉，以切断的胸主动脉作为牵引，将肝脏从后腹壁游离，紧贴脊柱向上游离、剪开肝周后腹膜组织及膈肌，游离主动脉至肝动脉分支以下，并于肝动脉分支以下1cm处切断腹主动脉，获取肝脏，修整肝脏修整肝门区多余组织，剔清肝门淋巴结。
灌注：
本发明实施例3的器官灌注装置的进液管路连接肝动脉和门静脉，出液管路连接下腔静脉，采用门静脉流量恒定模式进行灌注，流量设定为0.5mL/min/g(肝重)，肝动脉采用压力控制模式进行灌注，压力为80/60mmHg，开始18℃灌注。将获得的肝脏分为六组：第一组为乳酸林格液；第二组为本发明实施例16配方中去掉硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ的灌注液；第三组为本发明实施例16配方；第四组为本发明实施例16配方中用硫氧还蛋白(Thioredoxin购自sigma公司)替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ；第五组为本发明实施例16配方中用超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase购自sigma公司)替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ；第六组为本发明实施例16配方中去掉聚合血红蛋白的灌注液。
各组灌注脏器在0h-1h内每隔20min，1h-72h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中AST、ALT、TBIL、ET-1及聚合血红蛋白半衰期的变化水平；
组织中NO(一氧化氮)的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果：
结果表明：经上述不同灌注液对灌注肝脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以AST的含量不大于40U/L、ALT的含量不大于40U/L、TBIL的含量不大于20.5umol/L、ET-1的含量不大于20ng/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为40min、18h、30h、18h、18h、40min。上述第二、三、四、五组的聚合血红蛋白的半衰期依次为20h、30h、20h、20h。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于1.80umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察,以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，肝小叶轮廓清楚，小叶内的肝窦状隙呈放射状排列，并相互吻合成网，相邻肝小叶间有广泛吻合，并可见到汇管区内的小叶间动脉和小叶间静脉，肝动脉的终末支沿着肝小叶的周边不断汇入肝窦状隙。
结果分析：
在常温机械灌注下，上述第二、三、四、五组的聚合血红蛋白的半衰期依次为20h、30h、20h、20h(如下表5所示)，从第二组单独使用聚合血红蛋白和第三组本发明的半衰期结果对比可以看出，聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ联合使用，可以明显延长聚合血红蛋白的半衰期，显著降低了聚合血红蛋白的降解速率，显著增强了聚合血红蛋白的稳定性。第四组用硫氧还蛋白(Thioredoxin，abcam中国)替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ，并不能延长聚合血红蛋白的半衰期，第五组使用超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，ProSpec公司)代替硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ，也不能延长聚合血红蛋白的半衰期，说明本发明聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ在器官灌注液中的协同作用具有特异性。
在常温机械灌注下，各灌注液结合本发明的器官灌注装置可维持第一组、第二组、第三组、第四组、第五组、第六组上述各指标维持的安全时限分别为40min、18h、30h、18h、18h、40min(如下表5所示)，从第三组本发明可以看出聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ联合使用，可以明显延长肝脏的保存时间。第四组用硫氧还蛋白(Thioredoxin，abcam中国)替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ并不能延长肝脏的保存时间，第五组使用超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，ProSpec公司)代替硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ也不能延长肝脏的保存时间，第二组、第六组单独使用硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ或聚合血红蛋白都不能有效延长肝脏的保存时间，说明本发明聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ在器官灌注液中的协同作用具有特异性。
表5：离体猪肝脏不同配方灌注液下的灌注实验结果对比
Figure BDA0002465283840001091
对比例6离体大鼠心脏不同配方灌注液下的灌注实验结果对比
心脏获取：
取大鼠(Wistar、9-11周、雌性220-240g、雄性300-350g，购自北京实验动物中心)，麻醉，置于动物台上并固定。剪开腹部皮肤，沿腹白线开腹，至剑突。提出肠道置于一侧，暴露下腔静脉，经下腔静脉注射肝素生理盐水，1min后充分肝素化，剪开腹腔血管放血。迅速开胸，剪去胸腺组织，充分暴露心脏及大血管。游离主动脉无名动脉远端，并剪断，迅速剪断其余大血管，取出心脏，简单修剪。
灌注：
显微器械提起主动脉连接本发明实施例1的器官灌注装置的进液管路，置于主动脉瓣及冠状动脉开口上方，无创血管夹固定，丝线打结固定，心脏下腔静脉连接出液管路，无创血管夹固定，丝线打结固定，取下血管夹，开启灌注系统，流量约15ml/min，开始18℃灌注。将获得的心脏分为五组：第一组为乳酸林格液；第二组为本发明实施例16配方中去掉硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ的灌注液；第三组为本发明实施例16配方；第四组为本发明实施例16配方中用硫氧还蛋白替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ；第五组为本发明实施例16配方中用超氧化物歧化酶替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ；第六组为本发明实施例16配方中去掉聚合血红蛋白的灌注液。
灌注的心脏在0h-1h内每隔10min，1h-72h每隔1小时八个主要时间点采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液CTN、CK-MB、ANP及聚合血红蛋白半衰期的变化水平；
组织中NO(一氧化氮)的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果：
结果表明：经上述不同灌注液对灌注心脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以CTN的含量不大于0.13ug/L、CK-MB的含量不大于16U/L、ANP的含量不大于54pmol/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为50min、20h、32h、20h、20h、50min。上述第二、三、四、五组的聚合血红蛋白的半衰期依次为24h、32h、24h、24h。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于2.30umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察,以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，心肌间质网络呈现密集蜂巢状，肌细胞位于肌细胞鞘内，肌细胞鞘呈现出圆形或椭圆形结构，鞘外表面的胶原纤维呈网状排列，肌细胞鞘外表面胶原纤维的走向不一致，呈现出网状结构，胶原纤维直径粗细不等，结果呈现正常状态。
结果分析：
在常温机械灌注下，上述第二、三、四、五组的聚合血红蛋白的半衰期依次为24h、32h、24h、24h(如下表6所示)，从第二组单独使用聚合血红蛋白和第三组本发明的半衰期结果对比可以看出，聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ联合使用，可以明显延长聚合血红蛋白的半衰期，显著降低了聚合血红蛋白的降解速率，显著增强了聚合血红蛋白的稳定性。第四组用硫氧还蛋白(Thioredoxin，abcam中国)替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ，并不能延长聚合血红蛋白的半衰期，第五组使用超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，ProSpec公司)代替硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ，也不能延长聚合血红蛋白的半衰期，说明本发明聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ在器官灌注液中的协同作用具有特异性。
在常温机械灌注下，各灌注液结合本发明的器官灌注装置可维持第一组、第二组、第三组、第四组、第五组、第六组上述各指标维持的安全时限分别为50min、20h、32h、20h、20h、50min(如下表6所示)，从第三组本发明可以看出聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ联合使用，可以明显延长心脏的保存时间。第四组用硫氧还蛋白替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ并不能延长心脏的保存时间，第五组使用超氧化物歧化酶代替硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ也不能延长心脏的保存时间，第二组、第六组单独使用硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ或聚合血红蛋白都不能有效延长心脏的保存时间，说明本发明聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ在器官灌注液中的协同作用具有特异性。
表6：离体大鼠心脏不同配方灌注液下的灌注实验结果对比
Figure BDA0002465283840001111
Figure BDA0002465283840001121
对比例7离体狗肾脏不同配方灌注液下的灌注实验结果对比
肾脏获取：
取实验狗(成年比格犬、7-10kg、购自北京实验动物中心)，麻醉，呈正中仰卧位固定，开腹后分离组织，暴露并切取肾脏，修整。
灌注：
显微器械提起肾动脉连接实施例1的器官灌注装置的进液管路，无创血管夹固定，丝线打结固定，肾静脉连接出液管路，无创血管夹固定，丝线打结固定，取下血管夹，开启灌注系统，开始18℃灌注。将获得的肾脏分为六组：第一组为乳酸林格液；第二组为本发明实施例16配方中去掉硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ的灌注液；第三组为本发明实施例16配方；第四组为本发明实施例16配方中用硫氧还蛋白替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ；第五组为本发明实施例16配方中用超氧化物歧化酶替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ；第六组为本发明实施例16配方中去掉聚合血红蛋白的灌注液。
各组灌注脏器在0h-120h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中Scr、BUN、ET-1及聚合血红蛋白半衰期的变化水平；
组织中NO(一氧化氮)的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果：
结果表明：经上述不同灌注液对灌注肾脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以Scr的含量不大于120μmol/L、BUN的含量不大于7.0mmol/L、ET-1的含量不大于20ng/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为2h、72h、108h、72h、72h、2h。上述第二、三、四、五组的聚合血红蛋白的半衰期依次为36h、78h、36h、36h。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于3.40umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察,以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，核型大致正常，核质分布均匀，线粒体轻微肿胀，但嵴排列尚良好，个别嵴膜间隙略增宽。内质网亦有轻度肿胀。近曲小管上皮细胞微绒毛水肿、增粗，个别脱落。毛细血管内皮与滤过膜内皮细胞轻微水肿，结构尚清，呈现正常状态。
结果分析：
在常温机械灌注下，上述第二、三、四、五组的聚合血红蛋白的半衰期依次为36h、78h、36h、36h(如下表7所示)，从第二组单独使用聚合血红蛋白和第三组本发明的半衰期结果对比可以看出，聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ联合使用，可以明显延长聚合血红蛋白的半衰期，显著降低了聚合血红蛋白的降解速率，显著增强了聚合血红蛋白的稳定性。第四组用硫氧还蛋白(Thioredoxin，abcam中国)替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ，并不能延长聚合血红蛋白的半衰期，第五组使用超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，ProSpec公司)代替硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ，也不能延长聚合血红蛋白的半衰期，说明本发明聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ在器官灌注液中的协同作用具有特异性。
在常温机械灌注下，各灌注液结合本发明的器官灌注装置可维持第一组、第二组、第三组、第四组、第五组、第六组上述各指标维持的安全时限分别为2h、72h、108h、72h、72h、2h(如下表7所示)，从第三组本发明可以看出聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ联合使用，可以明显延长肾脏的保存时间。第四组用硫氧还蛋白替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ并不能延长肾脏的保存时间，第五组使用超氧化物歧化酶代替硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ也不能延长肾脏的保存时间，第二组、第六组单独使用硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ或聚合血红蛋白都不能有效延长肾脏的保存时间，说明本发明聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ在器官灌注液中的协同作用具有特异性。
表7：离体狗肾脏不同配方灌注液下的灌注实验结果对比
Figure BDA0002465283840001141
对比例8废弃人肝不同配方灌注液下的灌注实验结果对比
肝脏获取：
从医院获取废弃人肝脏，修整肝脏修整肝门区多余组织，剔清肝门淋巴结。
灌注：
本发明实施例3的器官灌注装置的进液管路连接肝动脉和门静脉，出液管路连接下腔静脉，采用门静脉流量恒定模式进行灌注，流量设定为0.5mL/min/g(肝重)，肝动脉采用压力控制模式进行灌注，压力为80/60mmHg，开始18℃灌注。将获得的肝脏分为六组：第一组为乳酸林格液；第二组为本发明实施例16配方中去掉硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ的灌注液；第三组为本发明实施例16配方；第四组为本发明实施例16配方中用硫氧还蛋白替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ；第五组为本发明实施例16配方中用超氧化物歧化酶替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ；第六组为本发明实施例16配方中去掉聚合血红蛋白的灌注液。
各组灌注脏器在0h-1h内每隔20min，1h-72h每隔1小时采集灌注液和在安全时限点采集灌注组织观察以下指标：
灌注液中AST(谷草转氨酶)、ALT(谷丙转氨酶)、TBIL(总胆红素)、ET-1(内皮素1)及聚合血红蛋白半衰期的变化水平
组织中NO(一氧化氮)的变化水平；
电镜观察组织变化情况。
结果：
结果表明：经上述不同灌注液对灌注肝脏都有保护作用，在不同灌注时间点取灌注液进行检测，以AST的含量不大于40U/L、ALT的含量不大于40U/L、TBIL的含量不大于20.5umol/L、ET-1的含量不大于20ng/L为灌注维持安全时限，上述各组灌注器官对上述各指标维持的安全时限分别为40min、18h、30h、18h、18h、40min。上述第二、三、四、五组的聚合血红蛋白的半衰期依次为20h、30h、20h、20h。然后在各组灌注液安全时限点剪小块组织，称量，剪碎，加入少量石英砂和冷生理盐水匀浆，匀浆在4℃以下10000r/min离心20min，取上清液测定组织NO含量，测定结果为都不低于1.80umol/L的下限标准。同时在各组灌注液安全时限点取0.8×0.8×0.2cm3组织，用pH7.4的2.5％戊二醛(0.1M)磷酸缓冲液4度下预固定2小时，在投入pH7.38的磷酸缓冲液中冲洗3次共1小时，然后用50％、70％、80％、90％、95％丙酮逐级脱水，每次15分钟，最后包埋于60度温箱内聚合48小时，用超薄切片机制备超薄切片，用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行双重电子染色，JEM-1200EX电镜观察,以观察细胞的形态的变化，进而判断器官活性的变化。电镜结果显示在各灌注液安全时限内，肝小叶轮廓清楚，小叶内的肝窦状隙呈放射状排列，并相互吻合成网，相邻肝小叶间有广泛吻合，并可见到汇管区内的小叶间动脉和小叶间静脉，肝动脉的终末支沿着肝小叶的周边不断汇入肝窦状隙。
结果分析：
在常温机械灌注下，上述第二、三、四、五组的聚合血红蛋白的半衰期依次为20h、30h、20h、20h(如下表8所示)，从第二组单独使用聚合血红蛋白和第三组本发明的半衰期结果对比可以看出，聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ联合使用，可以明显延长聚合血红蛋白的半衰期，显著降低了聚合血红蛋白的降解速率，显著增强了聚合血红蛋白的稳定性。第四组用硫氧还蛋白(Thioredoxin，abcam中国)替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ，并不能延长聚合血红蛋白的半衰期，第五组使用超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，ProSpec公司)代替硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ，也不能延长聚合血红蛋白的半衰期，说明本发明聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ在器官灌注液中的协同作用具有特异性。
在常温机械灌注下，各灌注液结合本发明的器官灌注装置可维持第一组、第二组、第三组、第四组、第五组、第六组上述各指标维持的安全时限分别为40min、18h、30h、18h、18h、40min(如下表8所示)，从第三组本发明可以看出聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ联合使用，可以明显延长肝脏的保存时间。第四组用硫氧还蛋白替换硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ并不能延长肝脏的保存时间，第五组使用超氧化物歧化酶代替硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ也不能延长肝脏的保存时间，第二组、第六组单独使用硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ或聚合血红蛋白都不能有效延长肝脏的保存时间，说明本发明聚合血红蛋白与硫氧还蛋白过氧化物酶Ⅱ在器官灌注液中的协同作用具有特异性。
表8：废弃人肝不同配方灌注液下的灌注实验结果对比
Figure BDA0002465283840001161
最后，本发明还提供了以下实施例，以便进一步解释本发明，但不能理解为对本发明的限制。
实施例23：高浓度、脱氧、稳定血红蛋白成分的生产。
集血：
通过静态混合器，用缓冲溶液稀释来源的血液材料(脱盐水或柠檬酸盐)。血液通过一个50微米的血液过滤器和一个60微米深的过滤器进行泵送，以去除多余的材料或大的聚集物(如果需要)。
超滤模块使用前用缓冲器冲洗。将过滤后的血液进一步稀释，然后浓缩至初始装载量，然后使用7倍体积的缓冲溶液使用超滤膜进行清洗。
将洗涤后的红细胞溶液泵入离心机。含有红细胞(RBC)的重相被排放到产品收集容器中。细胞溶液从产品收集容器中泵出；如果需要溶解，则通过静态混合器将其与脱热原水(DPW)在线稀释，同时转移至RBC容器。
过滤和储存：
采集细胞样本，检测血红蛋白，然后使用DPW调整至14.0-18.0g/dL。
100kDA和30kDA膜包使用前用DPW冲洗。红细胞溶液用100kDa膜和大约11体积的DPW进行重过滤。此操作可清除大于100kDa的细胞碎片。用30kDa膜同时对渗透的血红蛋白保持液进行超滤，以浓缩血红蛋白并去除较小的碎片和微量污染物。分析血红蛋白并继续超滤，直到中间体浓缩到约13g/dl。在这两个步骤之后，64kDa的血红蛋白被保留下来。浓缩血红蛋白被取样进行过程中检测。
测试后，血红蛋白通过0.5μm和0.22μm澄清过滤器泵入容器。对容器内容物进行取样，然后将容器重新放置在2-8℃的冷藏室中。
色谱法：
从冷藏库中取出粗血红蛋白进行色谱纯化。
在纯化之前，用缓冲液A(2.42g/L Tris，pH 9)平衡柱。将产品送入柱上，床高30cm，线流速400cm/hr。然后用缓冲液A清洗柱，然后用缓冲液A过渡到缓冲液B的pH梯度洗脱(6.05g/L Tris，pH 7)。这个缓冲液洗脱松散结合的非血红蛋白成分，这些成分被送到废物流中。通过识别OD或吸光度的变化来收集产品比例。
脱氧/浓缩：
将浓溶液转移到脱气容器中，并使用缓冲液C(2.42g/L Tris，58.38g/L NaCl pH8.9)将离子强度调整到>200mM。然后，通过对脱气膜进行重过滤，使溶液脱氧，氮气流过膜的另一侧。
使用30kDa MWCO(截留分子量)膜过滤器和3倍的脱氧储存缓冲液，将脱氧溶液重过滤到脱氧储存缓冲液中(含2g/L N-乙酰-L-半胱氨酸的磷酸盐溶液)。
脱氧血红蛋白中间体被取样进行过程中测试，并使用0.5μm和0.22μm过滤器过滤到储存袋中。该中间体在17-22℃下可稳定60天。
化合物负载、混合和聚合：
该过程开始时，将注射用脱氧水WFI(符合美国药典规定、约1/2中间体积)充入带有混合/再循环的反应堆容器，并加热至42℃。将血红蛋白中间物添加到反应堆容器中，再加入2.5体积的额外脱氧WFI(符合美国药典规定)。
一旦达到温度，血红蛋白中间体被转移到另一个罐中。将0.62％戊二醛活化液加入到血红蛋白溶液中，同时将其转移到另一个槽中以使血红蛋白聚合。聚合时间结束后，聚合血红蛋白溶液冷却至20℃。
重滤、浓缩和化合物储存：
将聚合血红蛋白溶液浓缩至约8g/dL，并使用30kDa MWCO(截留分子量)膜和3个倍体积的硼酸盐缓冲液(4.58g/L 10-水合硼酸钠，0.91g/L氢氧化钠，pH 10.4-10.6)进行二次过滤，以调整溶液的pH值。然后聚合血红蛋白通过脱氧过滤器与氮气交叉流动再循环，以从该过程中除去氢。
然后通过添加淬灭溶液(9.00-9.95g硼氢化钠/kg硼酸盐缓冲液)使再循环聚合血红蛋白溶液淬灭，并通过30kDa MWCO(截留分子量)过滤器和脱氧过滤器缓慢再循环1小时。此步骤将血红蛋白浓缩到大约70-100g/L或150-200g/L。
溶液用滤缓冲液A(6.67g/L氯化钠，0.30g/L氯化钾，0.20g/L氯化钙，0.445g/L氢氧化钠，2.02g/L N-乙酰-L-半胱氨酸，3.07g/L乳酸钠)进行6倍体积换液，同时使用脱氧过滤器进行脱氧。
最后，将该材料与3倍体积的滤缓冲液C(6.73g/L氯化钠、0.30g/L氯化钾、0.20g/L氯化钙二水合物，0.512g/L氢氧化钠，2.03g/L N-乙酰-1-L-半胱氨酸，3.08g/L乳酸钠，pH值7.75±0.15)进行缓冲交换。
使用预湿(脱氧WFI)0.22μm过滤器将得到的稳定血红蛋白原料药批次过滤到脱氧原料药容器中，并转移到仓库。散装原料储存在15-30℃，直到进一步运输或使用。
实施例24：稳定血红蛋白成分的体外表征。
如实施例23所述制备稳定血红蛋白成分，然后评估其效力、纯度和特性。下表9提供了一个稳定血红蛋白组成的示例性批次的说明性评价。如表9所示，对于所有测试指标，稳定血红蛋白成分的测试结果在规定的参数范围内。
表9：效价、纯度和特性试验结果
Figure BDA0002465283840001191
还分析了低聚物/八聚体/四聚体/二聚体在已与戊二醛交联并已与NaBH4还原的批次上的分布，显示了具有不同交联剂和还原剂水平的每种血红蛋白的可接受水平。结果如表10所示。
表10：成份百分比比较
Figure BDA0002465283840001192
Figure BDA0002465283840001201
实施例25：人用高浓度稳定血红蛋白溶液的体外特性。
如实施例24所示，测试浓度在150g/L到200g/L之间的高浓度稳定血红蛋白溶液的效价、纯度、特性和成分分布。结果显示每个测试参数在可接受值范围内。
实施例26：稳定血红蛋白成分在麻醉动物体内的药代动力学。
动物：
所有实验均采用雄性Wistar大鼠(体重300-400g)。动物从查尔斯河(Margate,Kent UK)购买，并在抵达伦敦大学学院(University College London)时获得健康和无病原体认证。实验前一周，动物被关在标准笼子里，4只/笼，每12小时进行一次光/暗循环，食物和水任其自由支配。
手术步骤：
所有动物均在室内空气中用异氟醚麻醉((Abbott,Maidenhead,Berks,UK)；5％用于诱导，2％用于手术，1.5％用于维持。它们被放置在一个加热的垫子上((HarvardApparatus,Cambridge,Cambs,UK)，以将直肠温度保持在37℃。对于麻醉模型，左颈总动脉和右颈内静脉使用0.96mm外径PVC导管插管(Scientific Commodities Inc.,Lake HavasuCity,AZ,USA)。动脉线与压力传感器(Powerlab；AD Instruments，Chalgrove，Oxon，UK)相连，用于连续监测平均动脉血压，静脉线用于注射林格乳酸±稳定血红蛋白成分。在这些自发呼吸的动物中，气管被插管以抽吸和固定气道。膀胱通过锁孔剖腹术插管，测量稳定血红蛋白成分的尿量和肾排泄量。组织氧分压(tPO2)是用光纤探针和OxyliteTM系统(OxfordOptronix，Oxon，UK)在肝脏中测量的。选择这种组织床是因为它对血流动力学扰动和心肺疾病最敏感。通过将传感器(通过锁孔剖腹术)放置在两个肺叶之间的密封袋中来监测肝脏tPO2。在这些非恢复性实验中，实验结束时使用静脉注射戊巴比妥钠进行安乐死。
麻醉剂量发现和药代动力学研究：
手术后和30分钟稳定期后，动物静脉注射稳定血红蛋白成分(n＝6)或等量的林格乳酸(2.5ml/kg；n＝6)，持续15分钟以上。稳定血红蛋白成分中添加了林格乳酸(通过Y形接头)，使总输注速率为10ml/kg/h。使用液体泵，以每30分钟递增的剂量检查50、100和200mg/kg稳定血红蛋白成分的输注，21号针头和(5毫升)泰尔茂注射器。最高输注量后，动物被维持3小时。
在基线(即预输注)时，进行一系列测量，如表11和图4所示。此外，还收集尿液和血液样本，用于基线药代动力学测量。将全血(0.3ml)移入含乙二胺四乙酸(EDTA)的注射器(最终浓度：2.5mM)并离心(1300x g)。然后，将血浆部分冷冻在液氮中进行随后的分光光度分析，或在可用时，立即使用血球装置进行处理。
在每次稳定血红蛋白成分输注的开始和结束时，以及在最高输注后的3小时内，每隔一段时间抽取血液进行药代动力学研究。在每次输液结束达到基线时，进行动脉血气分析，生命体征和心血管性能测量，然后每小时测量一次。尿液在基线时收集，在最高输液结束时收集，然后每小时收集一次。为了确定肾排泄的分数，采用了质量平衡法。这是通过计算尿液中排出的稳定血红蛋白成分的摩尔数来实现的，用注射摩尔数的分数表示。
表11：麻醉动物研究中心肺状态、组织氧张力和血浆和尿液药代动力学的测量。
Figure BDA0002465283840001211
Figure BDA0002465283840001212
Figure BDA0002465283840001221
Figure BDA0002465283840001222
Figure BDA0002465283840001231
在表11中，使用了以下缩写：Ca2+，钙；Cl-，氯化物；HCO3-，碳酸氢盐；K+，钾；×，测量点；空白，非测量点。注意，“血流速度”是收缩峰值血流速度，是心脏收缩力的标志。组织氧张力在对应于血浆药物水平的时间呈现。T＝时间(分钟)。
结果：
根据上述描述进行研究。许多参数，包括血红蛋白、动脉血氧饱和度、动脉血氧饱和度和血氧饱和度，在整个实验过程中都保持在适当的范围内。
在一个例子中，对大鼠模型进行了4小时连续输注研究，并随时间监测和分析了试验动物的血浆血红蛋白水平、平均动脉压、心率和心输出量，如图8所示。
实施例27：清醒动物体内稳定血红蛋白成分的药代动力学研究。
手术步骤：
对于恢复模型，按照实施例26中的详细说明对动物进行麻醉。血管线(左颈总动脉和右颈内静脉)是空心的，在颈部皮下打孔。它们被连接到一个旋转系带系统上，该系统允许动物在麻醉恢复后在笼子周围畅通无阻地移动。丁丙诺啡(0.05mg/kg s.c.)用于术前镇痛。
清醒动物的药代动力学研究：
术后30分钟稳定期后评估生命体征、心脏功能和动脉血气分析。从动脉线中取出额外的血液进行药代动力学分析。麻醉恢复后，给动物注射稳定血红蛋白成分(n＝6)或等量林格乳酸溶液(n＝6)超过15分钟，以达到稳定血红蛋白成分的血浆水平0.3-0.4g/dl。所需剂量水平根据实施例26的结果确定。再在15分钟时采集一份血样以确认血浆浓度。随后连续输注超过24小时，使血浆水平保持在0.3-0.4g/dl，在3、6和24小时采血。在实验结束时(24小时)，对动物重新麻醉；重新评估生命体征和心脏性能，并取血进行动脉血气和药代动力学测量。计划的测量也显示在表12。
药代动力学：
如果没有血液提示装置，则使用微型平板阅读器和美国宝特(Gen5)软件(Synergy2，North Star Scientific，Sandy，Beds，UK)评估血浆和尿液样本的吸光度(λ577和635)。根据标准曲线推导后测量稳定血红蛋白成分的浓度(CMAX，TMAX)。典型的氧合血红蛋白吸收光谱在541nm和577nm处有明显的峰。氧化后，氧血红蛋白(Fe2+)转化为高铁血红蛋白(Fe3 +)；高铁血红蛋白在577nm处吸收较少，在635nm处有一个额外的吸收峰。如果在635nm处观察到任何吸光度，表明存在高铁血红蛋白(在稳定的血红蛋白成分或血浆/尿液样本中)，则使用Drabkin方法确保测量总血红蛋白。
Drabkin的方法(如果需要)如下：
(1)添加K-铁氰化物(0.6mm)将所有血红蛋白转化为高铁血红蛋白。
(2)加入氰化钾(0.77mm)，将所有高铁血红蛋白转化为氰化高铁血红蛋白。
(3)540nm分光光度法测定氰化高铁血红蛋白。
数据和统计：
随机分配动物(抽签)接受稳定血红蛋白成分(n＝6)或作为对照(林格乳酸；n＝6)。数据表示为平均值±标准误差或中值、四分位数和范围。预期统计分析包括双向重复测量方差分析和邦弗朗尼事后检验。药代动力学数据(半衰期和暴露量的测定；AUC)是使用一个或两个阶段的衰变曲线和最小二乘拟合方法计算的。所有统计分析都是双尾的，并使用Prism 7.0.1软件(GraphPad软件，加利福尼亚州圣地亚哥)进行。多重性校正p值<0.05被认为具有统计学意义。
实施例26和27中所述的示范性体内研究还使用浓度为150g/L-200g/L的高浓度和稳定的血红蛋白成分进行。
表12：研究2中心肺功能状态和血浆药物水平的测量。
Figure BDA0002465283840001241
Figure BDA0002465283840001251
Figure BDA0002465283840001252
缩略语见表11。T＝时间(小时)。
实施例28：当通过机器灌注使用或投与所公开的机器灌注系统(例如设备附图3)一起使用或投与所公开的稳定血红蛋白溶液以维持或恢复供肝的肝功能时，所公开的稳定血红蛋白溶液的功效研究，供肝冷缺血后移植。
目标：
研究所公开的稳定血红蛋白溶液在受试者将器官置于冷缺血期后维持和恢复移植肝功能的功效和能力。
当与所公开的机器灌注系统(例如设备附图3)一起使用以维持和恢复供体肝脏时，表征所公开的稳定血红蛋白溶液的氧灌注特性。
确定将所公开的稳定血红蛋白溶液与所公开的机器灌注系统结合使用的临床优势。
确定所公开的稳定血红蛋白溶液作为改进的氧灌注材料的功效。
结合所公开的机器灌注系统，确定并建立用于肝移植的所公开的稳定血红蛋白溶液的标准化使用方案。
概述：
不适合直接移植的供肝已经获得器官捐献协调员(SNODs)的同意进行研究，可从NHS血液和移植(NHSBT)获得。
器官通过唯一的捐赠者参考标识符接受并分别匿名，由NHSBT发布，进入肝脏研究中心样本记录系统并发布，带有单独的内部CLR参考。该系统与用户一起跟踪相关组织的样本使用、收集、储存和处置，并每年向NHSBT和南伯明翰当地研究伦理委员会报告这些数据。
供体器官在冰冻的UW溶液中接受。供体器官是供体肝脏，例如肝脏，如图4所示。如图所示，图4中的缩写如下：RHV—右肝静脉，HV—肝静脉，IVC—腔静脉内，RPV—右门静脉，RHA—右肝动脉，CBD—胆总管，PV—门静脉，LHV—左肝静脉，MHV—肝中静脉，LBD—左胆管，LPV—左门静脉，左肝动脉，CT---肝总动脉，RL---肝圆韧带。
供体肝脏被“挑选”以去除通常包括在快速取回或收获过程中的多余组织和脂肪。确定下腔静脉(IVC)并清除组织，然后是门静脉(PV)和肝动脉(HA)。然后，这些血管朝供体肝脏向下，寻找分叉点。切除胆囊，清理胆管，观察分岔。
评估每个血管的分叉分支的方向，以确定供体肝的哪个叶由哪个叶提供服务。然后将供体肝平分，为每个肝叶提供一个供灌注的血管(如图4所示的肝)。然后沿着这些血管之间的线解剖供肝，将器官分成两个不相等的部分，每个部分由PV、HA和BD提供服务(参见，例如图4)。必要时进行血管重建以插入和固定插管。多余的血管组织，在取肝或取肝过程中收集，用于此目的。在重建后和插管前对血管进行完整性测试。
所公开的机器灌注系统(例如肝辅助)设置有所公开的一次性试剂盒，并填充2-2.5L本公开的灌注液。灌注液含有表13所列的成分：
表13：机器灌注液组成
Figure BDA0002465283840001261
Figure BDA0002465283840001271
研究方案：
根据与肝辅助装置(即装置附图3)制造商器官辅助BV的通信，肝辅助装置的总循环量可以减少到1L总灌注液，以减少浪费。研究中的器官放置在肝脏辅助装置中，用灌注液循环4小时。在再循环期之后评估器官的生存能力，以确定本发明公开的血红蛋白溶液的有效性。
本发明公开的血红蛋白溶液以大约0.3-0.4g/dL的循环血浆浓度使用，足以维持正常器官功能的组织氧合。在本研究中，肝器官将在寒冷或冷缺血一段时间后开始再循环，其流体构成缺少本发明公开的灌注液，如表13所示。
如本文所述，以逐渐的、预定的速率并在预定的时间段内，通过蠕动泵以7ml/min的速率运行，将本发明的所公开的灌注液逐渐引入循环体积。研究中的器官在机器灌注4小时后从所公开的机器灌注装置中取出，随后对其生存能力和功能进行评估。
样本采集：
在整个灌注过程中收集的数据包括：
(1)在罗氏B221血气分析仪上，从系统的动脉和静脉侧灌注2ml样品进行血气分析(BGA)。读数见表14。
表14-血气分析参数
Figure BDA0002465283840001272
(2)取系统静脉侧5ml灌流液，离心去除细胞物质，上清液以1ml等份液氮速冻存于-80℃下作进一步分析，详情如下。
(3)胆汁在生产时，每隔一段时间或时间点收集一次，间隔约两小时，用1毫升的等份液氮快速冷冻，并在-80℃下储存，以供下文进一步分析。
(4)每隔一段时间进行6mm的组织活检。每个样本的一半放在生理盐水中处理组织块，以便于组织学和免疫组化分析。剩下的一半在液氮中快速冷冻，用于生化分析。分析详情见下表15。
表15.采样时间协议
Figure BDA0002465283840001281
Figure BDA0002465283840001291
·，测试点；空白，非测试点。
数据分析：
活体灌注分析：由经验丰富的研究员和实验室人员以及服务提供商(如适用)对采集的样本进行分析。
在机器灌注过程中，血气分析数据用于监测和调整系统的操作参数，并保持供体器官的生理状态，包括氧合和pH值。乳酸数据是先前建立的存活标准之一；潜在存活率对供体器官进行评估，并根据从供体器官中清除或除去乳酸的速率对供体器官的潜在生存能力进行评估。如果乳酸从供体器官清除或去除，在大约4小时内达到灌注后水平2.5mmol/L或更低，则供体器官被认为是可移植的。对附加参数进行跟踪和趋势分析，以进一步表征供体器官的生存能力。在灌注过程中和整个灌注过程中，以不同的时间间隔记录压力和流量。
灌注后分析：
标准分析如下：
由于未稀释的样品低于分析仪的溶血指数，且未能给出结果，因此ALT/AST的样品被稀释5-10倍进行分析。这样的稀释避免了这个问题，而这些数字只需要重新计算就可以反映出这一点。
(a)对组织样本进行PPFE组织学处理，作为标准程序的一部分，进行H&E和PAS染色。如有需要，还可进行其他分析，如替代染色和免疫组织化学。(b)利用激光散斑对比成像仪分析肝叶微循环的实时灌注特性，以检测或确定微循环灌注的差异或损伤。(c)冷冻组织样本可用于酶促研究，如ATP分析和蛋白质研究。(d)还可对灌流液进行蛋白质组学和代谢组学分析。
潜在项目特定分析
(a)评估组织中的一氧化二氮(NO)水平，并在整个NMP中进行灌流取样。使用市售荧光分析法。组织活检和灌流评估NO水平，并比较HBOC和RBC灌注液。(b)通过血气分析来研究NMP中MetHb的积累，以确定是否存在该分子生成方面的问题，并确定对肝脏活力的不利影响。(c)用Griess法分析了灌流液中NO、亚硝酸盐/硝酸盐循环稳定的终产物。(d)测定灌流液总抗氧化能力是通过测量灌流液-例如小分子(如抗坏血酸、尿酸、谷胱甘肽、维生素e)和蛋白质(白蛋白，转铁蛋白)使用与我们的RANDOX生物分析系统兼容的商用试剂盒进行测量。
根据从NO分析获得的数据，调查可能的干预措施以提高NO产量，以及它们是否有可能抵消任何有害的NO清除特性。对灌流液中添加L-精氨酸或硝酸钠进行测试，以检测或确定一氧化氮合酶同工酶对NO形成的任何增加。
结果
根据上述描述进行研究。许多参数，包括灌流液BGA、胆汁、PPFE活检和灌流液ALT/AST等，在实验一定时间段保持在适当的范围内。
另外，本发明还提供了以下实施方案，以便进一步解释本发明，但不能理解为对本发明的限制。
本发明的一个方面是提供一种维持一个器官的方法，包括：将一种成分输送到该器官，从而维持该器官的生存能力，其中该成分包括一种稳定的血红蛋白，其浓度在每升50克(g/L)到200克/升之间，并且含有每毫升(mg/mL)溶解氧少于0.02毫克(mg)，
其中：
所述输送所述成分是使用灌注装置来执行的，
所述灌注装置包括容器、泵送单元、氧合器和超滤单元；所述容器中设有保持架，用于布置所述器官，所述容器还设有出口和进口，用于连接所述器官的血管；所述泵送单元和所述氧合器串联布设在所述容器的出口和进口之间的管路中，所述泵送单元中设有灌注液包，所述灌注液包中设有所述稳定的血红蛋白，所述泵送单元用于驱动所述稳定的血红蛋白流动形成循环的连续灌注流，所述氧合器用于对流经的所述稳定的血红蛋白进行体外氧合和二氧化碳排出，提高所述血红蛋白的携氧量和对处于松散的R态血红蛋白的超滤效果；所述超滤单元与所述泵送单元中的所述灌注液包连接形成超滤循环，用于对所述灌注液包中的所述稳定的血红蛋白进行小分子有毒血红蛋白的超滤除去。
在一些实施方案中，所述超滤单元包括超滤泵、超滤器和加液管，其中，所述超滤泵和所述超滤器串联连接，并且与所述泵送单元中的灌注液包形成超滤循环，所述加液管与超滤器的下游管路连通，用于向超滤循环中补加缓冲液。
在一些实施方案中，所述超滤器选用30KD。
在一些实施方案中，所述灌注装置还设有氧合单元；所述氧合单元与所述泵送单元连接形成氧合循环，用于对流经泵送单元的所述稳定的血红蛋白进行气体交换，提升血红蛋白的氧饱和度。
在一些实施方案中，所述氧合单元包括循环泵和氧合膜，所述循环泵与氧合膜串联连接，并且与所述泵送单元中的灌注液包连接形成氧合循环。
在一些实施方案中，所述灌注装置中还设有气体过滤器；所述气体过滤器位于所述氧合器的下游位置。
在一些实施方案中，所述容器的出口与所述泵送单元的进口之间还设有灌注器官回液管，所述泵送单元的出口与所述容器的进口之间还直接设有灌注器官进液管。
在一些实施方案中，所述灌注装置还设有流量控制单元和温度控制单元；所述流量控制单元包括至少两个流量指示器，并且分别布设在所述泵送单元的进口管路和出口管路；所述温度控制单元位于所述泵送单元的出口位置，用于控制所述稳定的血红蛋白的温度。
在一些实施方案中，所述灌注装置还设有压力控制单元；所述压力控制单元位于所述容器的进口位置，用于对回流至容器的所述稳定的血红蛋白进行压力调节控制。
在一些实施方案中，所述灌注装置中设有多组泵送单元、氧合器和超滤单元，形成对所述容器的多组并联稳定的血红蛋白循环。
在一些实施方案中，所述器官从供体中移除。
在一些实施方案中，所述器官是植入人体以代替自然器官的人工器官。
在一些实施方案中，所述器官为心脏、肾脏、肝脏、肺、胰腺、肠或胸腺。
本发明的另一个方面是提供一种准备移植器官的方法，包括：a)从捐赠者那里获得器官；b)使含有浓度在50克/升(g/L)到200克/升之间的稳定血红蛋白和浓度小于0.02毫克/毫升(mg/mL)的溶解氧的成分氧化，以形成含氧血红蛋白成分；以及c)将含氧血红蛋白成分输送到器官，从而在器官移植之前维持器官的生存能力，
其中：
使用灌注装置对所述成分进行充氧和/或输送，
所述灌注装置包括容器、泵送单元、氧合器和超滤单元；所述容器中设有保持架，用于布置所述器官，所述容器还设有出口和进口，用于连接所述器官的血管；所述泵送单元和所述氧合器串联布设在所述容器的出口和进口之间的管路中，所述泵送单元中设有灌注液包，所述灌注液包中设有所述稳定血红蛋白，所述泵送单元用于驱动所述稳定血红蛋白流动形成循环的连续灌注流，所述氧合器用于对流经的所述稳定血红蛋白进行体外氧合和二氧化碳排出，提高所述血红蛋白的携氧量和对处于松散的R态血红蛋白的超滤效果；所述超滤单元与所述泵送单元中的所述灌注液包连接形成超滤循环，用于对所述灌注液包中的所述稳定血红蛋白进行小分子有毒血红蛋白的超滤除去。
在一些实施方案中，所述超滤单元包括超滤泵、超滤器和加液管，其中，所述超滤泵和所述超滤器串联连接，并且与所述泵送单元中的灌注液包形成超滤循环，所述加液管与超滤器的下游管路连通，用于向超滤循环中补加缓冲液。
在一些实施方案中，所述超滤器选用30KD。
在一些实施方案中，所述灌注装置还设有氧合单元；所述氧合单元与所述泵送单元连接形成氧合循环，用于对流经泵送单元的所述稳定血红蛋白进行气体交换，提升血红蛋白的氧饱和度。
在一些实施方案中，所述氧合单元包括循环泵和氧合膜，所述循环泵与氧合膜串联连接，并且与所述泵送单元中的灌注液包连接形成氧合循环。
在一些实施方案中，所述灌注装置中还设有气体过滤器；所述气体过滤器位于所述氧合器的下游位置。
在一些实施方案中，所述容器的出口与所述泵送单元的进口之间还设有灌注器官回液管，所述泵送单元的出口与所述容器的进口之间还直接设有灌注器官进液管。
在一些实施方案中，所述灌注装置还设有流量控制单元和温度控制单元；所述流量控制单元包括至少两个流量指示器，并且分别布设在所述泵送单元的进口管路和出口管路；所述温度控制单元位于所述泵送单元的出口位置，用于控制所述稳定血红蛋白的温度。
在一些实施方案中，所述灌注装置还设有压力控制单元；所述压力控制单元位于所述容器的进口位置，用于对回流至容器的所述稳定血红蛋白进行压力调节控制。
在一些实施方案中，所述灌注装置中设有多组泵送单元、氧合器和超滤单元，形成对所述容器的多组并联稳定血红蛋白循环。
在一些实施方案中，所述器官系从供体移除。
在一些实施方案中，所述器官是植入人体以代替自然器官的人工器官。
在一些实施方案中，所述器官为心脏、肾脏、肝脏、肺、胰腺、肠或胸腺。
在一些实施方案中，所述成分还包括配方缓冲液，所述配方缓冲液包含一种或多种硼酸盐、抗氧化剂和电解质。
在一些实施方案中，所述硼酸盐被还原。
在一些实施方案中，所述抗氧化剂包含N-乙酰-L-半胱氨酸。
在一些实施方案中，所述电解质包含Na、Cl及/或K。
在一些实施方案中，所述成分包含每毫升少于0.05个内毒素单位(EU)。
在一些实施方案中，所述内毒素包含细胞脂质、细胞脂质层或脂多糖。
在一些实施方案中，所述细胞脂质、细胞脂质层或脂多糖来源于人类细胞、非人类脊椎动物细胞、微生物或细菌。
在一些实施方案中，所述血红蛋白在收获后15天内从收获的红细胞中分离或衍生。
在一些实施方案中，所述血红蛋白在收获后10天内从收获的红细胞中分离或衍生。
在一些实施方案中，所述血红蛋白包含从非人类动物、非人类细胞或非人类细胞系分离或衍生的血红蛋白。
在一些实施方案中，所述非人类动物系牛种。
在一些实施方案中，所述成分在环境温度下稳定。
在一些实施方案中，所述成分在冷冻温度下稳定。
在一些实施方案中，所述成分在至少2℃的温度以上是稳定的。
在一些实施方案中，所述成分在40℃以下稳定。
在一些实施方案中，所述稳定血红蛋白为聚合的血红蛋白。
在一些实施方案中，所述稳定血红蛋白已与醛交联以形成血红蛋白谷氨酰胺。
在一些实施方案中，所述醛系戊二醛。
在一些实施方案中，所述稳定血红蛋白的平均分子量为200千道尔顿(kDa)。
在一些实施方案中，所述稳定血红蛋白在500kDa以上具有小于15％的分子量分布。
在一些实施方案中，所述稳定血红蛋白在用稳定剂稳定之前已基本脱氧。
在一些实施方案中，所述稳定化包含聚合。
在一些实施方案中，所述稳定化包含该稳定剂之还原。
在一些实施方案中，所述稳定血红蛋白通过过滤和/或用电解质溶液重过滤来浓缩。
在一些实施方案中，所述电解质溶液系生理电解质溶液。
在一些实施方案中，所述过滤系超滤。
在一些实施方案中，所述电解质溶液使高铁血红蛋白(MetHb)之形成最小化。
在一些实施方案中，所述电解质溶液包含N-乙酰-L-半胱氨酸。
在一些实施方案中，所述成分包括：(a)低于10％高铁血红蛋白，任选低于6％高铁血红蛋白；和/或(b)低于10％血红蛋白二聚体，任选低于6％血红蛋白二聚体。
在一些实施方案中，所述高铁血红蛋白的水平通过比色法测量。
在一些实施方案中，血红蛋白二聚体的水平通过尺寸分离技术测量。
在一些实施方案中，所述成分包含至少20％稳定的活性四聚血红蛋白，任选25％至35％稳定的活性四聚血红蛋白。
在一些实施方案中，所述成分包含至少60％大于四聚体分子量血红蛋白低聚物，任选地至少70％大于四聚体分子量血红蛋白低聚物。
在一些实施方案中，所述稳定血红蛋白的半衰期比未稳定血红蛋白或含氧血红蛋白的半衰期更长，并且将四聚血红蛋白分解为二聚体从而导致肾毒性最小化。
在一些实施方案中，所述血红蛋白包括：
(a)亚单位α，其中亚单位α包含以下氨基酸序列：
1MVLSPADKTN VKAAWGKVGA HAGEYGAEAL ERMFLSFPTT KTYFPHFDLS HGSAQVKGHG
61 KKVADALTNA VAHVDDMPNA LSALSDLHAH KLRVDPVNFK LLSHCLLVTL AAHLPAEFTP
121 AVHASLDKFL ASVSTVLTSK YR
(SEQ ID NO:1)，
或者序列与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％的同源性，或者其中亚单位α由以下核酸序列编码：
Figure BDA0002465283840001341
Figure BDA0002465283840001351
(SEQ ID NO:2).
或者序列与SEQ ID NO:2的序列具有至少90％的同源性；
(b)或者亚单位β，其中亚单位β由以下氨基酸序列组成：
1 MVHLTPEEKS AVTALWGKVN VDEVGGEALG RLLVVYPWTQ RFFESFGDLS TPDAVMGNPK
61 VKAHGKKVLG AFSDGLAHLD NLKGTFATLS ELHCDKLHVD PENFRLLGNV LVCVLAHHFG
121 KEFTPPVQAA YQKVVAGVAN ALAHKYH
(SEQ ID NO:3).
或者序列与SEQ ID NO:3的序列具有至少90％的同源性，或者其中亚单位β由以下核酸序列编码：
Figure BDA0002465283840001352
(SEQ ID NO:4).
或者序列与SEQ ID NO:4的序列具有至少90％的同源性；
(c)或者亚单位(γ)，或者其中亚单位γ由以下氨基酸序列组成：
1 MGHFTEEDKA TITSLWGKVN VEDAGGETLG RLLVVYPWTQ RFFDSFGNLS SASAIMGNPK
61 VKAHGKKVLT SLGDAIKHLD DLKGTFAQLS ELHCDKLHVD PENFKLLGNV LVTVLAIHFG
121 KEFTPEVQAS WQKMVTGVAS ALSSRYH
(SEQ ID NO:5),
或者序列与SEQ ID NO:5的序列具有至少90％的同源性，或者其中亚单位γ由以下核酸序列组成：
Figure BDA0002465283840001361
(SEQ ID NO:6),
或者序列与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％的同源性；
(d)或者其中亚单位(γ)，亚单位γ由以下氨基酸序列组成：
1 MGHFTEEDKA TITSLWGKVN VEDAGGETLG RLLVVYPWTQ RFFDSFGNLS SASAIMGNPK
61 VKAHGKKVLT SLGDATKHLD DLKGTFAQLS ELHCDKLHVD PENFKLLGNV LVTVLAIHFG
121 KEFTPEVQAS WQKMVTAVAS ALSSRYH
(SEQ ID NO:7),
或者序列与SEQ ID NO:7的序列具有至少90％的同源性，或者其中亚单位(γ)由以下核酸序列编码：
Figure BDA0002465283840001362
Figure BDA0002465283840001371
或者序列与SEQ ID NO:8的序列具有至少90％的同源性。
说明书中对“一个实施例”的引用表明，所描述的实施例可以包括一个或多个特定特征、结构或特性，但是应当理解，这些特定特征、结构，或者，对于本公开的每个公开实施例，特征可以是或可能不是公共的。此外，这些短语本身不一定指任何一个具体实施例。因此，当结合一个或多个实施例(视情况而定)描述一个或多个特定特征、结构或特性时，提交本领域技术人员所知的影响该一个或多个特征、结构的信息，或与其他一个或多个实施例相关的特性，在适用的情况下或当这些实施例不是排他的时，无论是否明确描述。
本公开的详细实施例在此公开，目的在于描述和说明所要求保护的结构和方法，所要求保护的结构和方法可以以各种形式体现，并且不打算以任何方式穷尽，或者仅限于所公开的实施例。在不脱离所公开实施例的范围的情况下，许多修改和变化是显而易见的。选择本文中使用的术语是为了最好地解释一个或多个实施例的原理、实际应用或对当前技术的技术改进，或者使得能够理解本文中公开的实施例。如上所述，可以省略已知特征和技术的细节，以避免不必要地模糊本公开的实施例。
虽然具体示出和描述了实施例，但是可以理解，可以在形式和细节上进行各种改变。尽管各种实施例已被描述为具有特定特征和/或组件的组合，但如上文所讨论的，其他实施例可以具有来自任何实施例的任何特征和/或组件的组合。例如，在上面描述的示意图和/或实施例指示以特定方向或位置布置的某些组件的情况下，可以修改组件的布置。
如果上述方法和/或事件表明某些事件和/或过程以某种顺序发生，则可以修改某些事件和/或过程的顺序。此外，在可能的情况下，某些事件和/或过程可以在并行处理中同时执行，也可以如上所述顺序执行。此外，各种组件的具体配置也可以改变。例如，各种组件的大小和特定形状可以不同于所示的实施例，同时仍然提供如本文所述的功能。更具体地说，各种组件的大小和形状可以针对期望的或预期的用途而具体地选择。因此，应当理解，实施例和/或其组件的大小、形状和/或布置可以适合于给定的用途，除非上下文另有明确说明。
虽然这里已经描述和说明了一些实施例和/或实施例，但是用于执行功能和/或获得结果和/或一个或多个优点的各种其他装置和/或结构是可能的。更一般地，本文所描述的参数、尺寸、材料和配置是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于使用本发明教导的一个或多个特定应用。因此，应当理解，上述实施例仅以示例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等效权利要求的范围内；并且实施例可以在具体描述和权利要求以外的方式来实施。本发明的实施例针对在此描述的每个单独的特征、系统、物品、材料、工具包和/或方法。此外，如果两个或多个这样的特征、系统、物品、材料、套件和/或方法不是互斥或不一致的，则将两个或多个这样的特征、系统、物品、材料、套件和/或方法的任何组合包括在本公开的范围内。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0002503877350000011
Figure IDA0002503877350000021
Figure IDA0002503877350000031
Figure IDA0002503877350000041
Figure IDA0002503877350000051
Figure IDA0002503877350000061

Claims (28)

1.一种保存移植用离体器官的方法，其包括：
将离体器官灌注液灌注到所述移植用离体器官的血管中，所述灌注是利用离体器官灌注装置进行的，
其中：
基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
基于每10g的高分子聚合血红蛋白，所述离体器官灌注液包括：
高分子聚合血红蛋白10g，
葡萄糖2.5g-4g，
肝素钠7500u-10000u，
氯化钠2g-3g，
头孢西丁钠0.5g-0.75g，
碳酸氢钠0.37g-0.5g，
10％复方氨基酸注射液15mL-20mL，
注射用12种复合维生素0.05mL-0.08mL，
胰岛素50u-80u，和
余量水；
其中，所述高分子聚合血红蛋白中分子量为320kD-1024kD的聚合血红蛋白含量≥95％，且所述高分子聚合血红蛋白是通过如下方法获得的：
采集新鲜血液1L，用0.5-1倍于血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液进行稀释；
用60μm的深层过滤器过滤所述稀释后的所述血液，并用6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗60μm的深层过滤器上的残留物直至通过所述过滤器的血红蛋白达到95％以上；
将上述通过60μm的深层过滤器的物质置于0.65μm中空纤维膜上，使用5-8倍于初始血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗0.65μm中空纤维膜上的物质使得小于0.65μm的物质通过0.65μm中空纤维膜；
向被0.65μm中空纤维膜截留的物质按1:1-2于初始血液体积加入注射水以裂解红细胞，用100KD滤膜超滤裂解的红细胞，透过端为所需的血红蛋白，同时依据透过速率加入注射用水以保持恒定的超滤体积，直至血红蛋白的收率≥95％，停止100KD超滤；
用30KD膜包浓缩前述经100KD滤膜纯化的血红蛋白至其浓度为血红蛋白浓度10-14g/dL；
将上述浓度为10-14g/dL的纯化的血红蛋白经阴离子层析纯化以得到精纯的血红蛋白；
将上述获得的精纯的血红蛋白置于30KD滤膜上，用3倍于精纯的血红蛋白体积的50mM磷酸氢二钠缓冲换液；
然后通入惰性气体脱氧至氧合血红蛋白小于5％，按1g血红蛋白35-45mg戊二醛的比例以雾化的方法加入戊二醛，接着按1g的血红蛋白13-18mg的硼氢化钠终止聚合反应；
接着将获得的聚合血红蛋白浓缩至6-7g/dL，将浓缩至6-7g/dL的聚合血红蛋白置于300KD的超滤膜包上，使用5-10倍于6-7g/dL的聚合血红蛋白的体积的乳酸林格氏液换液得到聚合血红蛋白，在换液过程中分子量320-1024kD的聚合血红蛋白含量达到≥95％指标时，收集蛋白溶液，通入惰性气体进行脱氧至氧合血红蛋白含量≤5％，0.2μm过滤除菌，获得所述高分子聚合血红蛋白；
其中：
所述离体器官灌注装置包括容器、泵送单元、氧合器和超滤单元；所述容器中设有保持架，用于布置所述移植用离体器官，所述容器还设有出口和进口，用于连接所述移植用离体器官的血管；所述泵送单元和所述氧合器串联布设在所述容器的出口和进口之间的管路中，所述泵送单元中设有灌注液包，所述灌注液包中设有所述灌注液，所述泵送单元用于驱动所述灌注液流动形成循环的连续灌注流，所述氧合器用于对流经的所述灌注液进行体外氧合和二氧化碳排出，提高所述灌注液中血红蛋白的携氧量和对处于松散的R态血红蛋白的超滤效果；所述超滤单元与所述泵送单元中的所述灌注液包连接形成超滤循环，用于对所述灌注液包中的所述灌注液进行小分子有毒血红蛋白的超滤除去。
2.权利要求1所述的方法，其中，所述阴离子层析纯化是通过如下步骤进行的：
20mM tris的溶液平衡柱子；之后40min上完样品；之后3倍于浓度为10-14g/dL的纯化的血红蛋白体积的29Mmtris溶液洗杂；之后4-5倍于浓度为10-14g/dL的纯化的血红蛋白体积的50mM tris溶液洗脱。
3.权利要求1所述的方法，其中，所述乳酸林格氏液的组成为：氯化钠6.73g/L、氯化钾0.3g/L、二水氯化钙0.2g/L、40％乳酸钠3.07g/L、N-乙酰-L-半胱氨酸22g/L。
4.权利要求1所述的方法，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
高分子聚合血红蛋白30g，
葡萄糖9g，
肝素钠25000u，
氯化钠7g，
头孢西丁钠2g，
碳酸氢钠1.25g，
10％复方氨基酸注射液50mL，
注射用12种复合维生素0.2mL，
胰岛素180u，和
余量水；
或者，
高分子聚合血红蛋白40g，
葡萄糖10g，
肝素钠30000u，
氯化钠8g，
头孢西丁钠3g，
碳酸氢钠1.5g，
10％复方氨基酸注射液60mL，
注射用12种复合维生素0.3mL，
胰岛素200u，和
余量水；
或者，
高分子聚合血红蛋白20g，
葡萄糖8g，
肝素钠20000u，
氯化钠6g，
头孢西丁钠1g，
碳酸氢钠1g，
10％复方氨基酸注射液40mL，
注射用12种复合维生素0.1mL，
胰岛素160u，和
余量水。
5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中，所述保存在2-40℃下进行。
6.权利要求1-4任一项所述的方法，其中，所述保存在4-37℃下进行。
7.权利要求1-4任一项所述的方法，其中，所述保存在10-30℃下进行。
8.权利要求1-4任一项所述的方法，其中，所述保存在16-20℃下进行。
9.权利要求1-4任一项所述的方法，其中，所述保存在18℃下进行。
10.权利要求1-4任一项所述的方法，其中，所述头孢西丁钠为注射用头孢西丁钠；
或者，所述水为注射水；
或者，所述10％复方氨基酸注射液为辰欣药业生产的10％复方氨基酸注射液；
或者，所述注射用12种复合维生素为山西普德药业股份有限公司生产的“注射用12种复合维生素”；
或者，所述离体器官为心脏、肝脏、肾脏或肺脏。
11.权利要求10所述的方法，其中，所述离体器官为人、狗、大鼠或猪的离体器官。
12.权利要求1-4任一项所述的方法，其中，所述超滤单元包括超滤泵、超滤器和加液管，其中，所述超滤泵和所述超滤器串联连接，并且与所述泵送单元中的灌注液包形成超滤循环，所述加液管与超滤器的下游管路连通，用于向超滤循环中补加缓冲液；
或者，所述离体器官灌注装置还设有氧合单元；所述氧合单元与所述泵送单元连接形成氧合循环，用于对流经泵送单元的灌注液进行气体交换，提升灌注液中血红蛋白的氧饱和度；
或者，所述离体器官灌注装置中还设有气体过滤器；所述气体过滤器位于所述氧合器的下游位置；
或者，所述容器的出口与所述泵送单元的进口之间还设有灌注器官回液管，所述泵送单元的出口与所述容器的进口之间还直接设有灌注器官进液管；
或者，所述离体器官灌注装置还设有流量控制单元和温度控制单元；所述流量控制单元包括至少两个流量指示器，并且分别布设在所述泵送单元的进口管路和出口管路；所述温度控制单元位于所述泵送单元的出口位置，用于控制灌注液温度；
或者，所述离体器官灌注装置还设有压力控制单元；所述压力控制单元位于所述容器的进口位置，用于对回流至容器的灌注液进行压力调节控制；
或者，所述离体器官灌注装置中设有多组泵送单元、氧合器和超滤单元，形成对所述容器的多组并联灌注液循环。
13.权利要求12所述的方法，其中，所述超滤器选用30KD。
14.权利要求12所述的方法，其中，所述氧合单元包括循环泵和氧合膜，所述循环泵与氧合膜串联连接，并且与所述泵送单元中的灌注液包连接形成氧合循环。
15.一种保存移植用离体器官的方法，其包括：
将离体器官灌注液灌注到所述移植用离体器官的血管中，所述灌注是利用离体器官灌注装置进行的，
其中：
基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
基于每1g的硫氧还蛋白过氧化物酶II，所述离体器官灌注液包括：
聚合血红蛋白4～5g；
硫氧还蛋白过氧化物酶II 1g；
肝素钠3000～5000u；
葡萄糖1～2g；
氯化钠0.8～1.5g；
头孢西丁钠0.25～0.3g；
碳酸氢钠0.15～0.25g；
10％复方氨基酸注射液6～10mL；
注射用12种复合维生素0.025～0.03mL；
和余量水；
其中，所述聚合血红蛋白通过如下方法获得：
采集新鲜血液，用0.5～1倍所述血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液进行稀释；
用60μm的深层过滤器过滤所述稀释后的所述血液，并用6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗60μm的深层过滤器上的残留物直至通过所述过滤器的血红蛋白达到95％以上；
将上述通过60μm的深层过滤器的物质置于0.65μm中空纤维膜上，使用5～8倍于初始血液体积的6g/L的柠檬酸钠溶液冲洗0.65μm中空纤维膜上的物质使得小于0.65μm的物质通过0.65μm中空纤维膜；
向被0.65μm中空纤维膜截留的物质按1:1～2于初始血液体积加入注射水以裂解红细胞，用100KD滤膜超滤裂解的红细胞，透过端为所需的血红蛋白，同时依据透过速率加入注射用水以保持恒定的超滤体积，直至血红蛋白的收率≥95％，停止100KD超滤；
用30KD膜包浓缩前述经100KD滤膜纯化的血红蛋白至其浓度为血红蛋白浓度10～14g/dl；
将上述浓度为10～14g/dl的纯化的血红蛋白经阴离子层析纯化以得到精纯的血红蛋白；
将上述获得的精纯的血红蛋白置于30KD滤膜上，用3倍于精纯的血红蛋白体积的50mM磷酸氢二钠缓冲换液；
然后通入惰性气体脱氧至氧合血红蛋白小于5％，按1g血红蛋白35～45mg戊二醛的比例以雾化的方法加入戊二醛，接着按1g的血红蛋白13～18mg的硼氢化钠终止聚合反应；
接着将获得的聚合血红蛋白浓缩至6-7g/dL，将浓缩至6-7g/dL的聚合血红蛋白置于30KD的超滤膜包上，使用5～8倍于6-7g/dL的聚合血红蛋白的体积的乳酸林格氏液换液得到聚合血红蛋白，通入惰性气体进行脱氧至氧合血红蛋白含量≤5％，0.2um过滤除菌，获得所述聚合血红蛋白；
其中：
所述离体器官灌注装置包括容器、泵送单元、氧合器和超滤单元；所述容器中设有保持架，用于布置所述移植用离体器官，所述容器还设有出口和进口，用于连接所述移植用离体器官的血管；所述泵送单元和所述氧合器串联布设在所述容器的出口和进口之间的管路中，所述泵送单元中设有灌注液包，所述灌注液包中设有所述灌注液，所述泵送单元用于驱动所述灌注液流动形成循环的连续灌注流，所述氧合器用于对流经的所述灌注液进行体外氧合和二氧化碳排出，提高所述灌注液中血红蛋白的携氧量和对处于松散的R态血红蛋白的超滤效果；所述超滤单元与所述泵送单元中的所述灌注液包连接形成超滤循环，用于对所述灌注液包中的所述灌注液进行小分子有毒血红蛋白的超滤除去。
16.权利要求15所述的方法，其中，所述阴离子层析纯化是通过如下步骤进行的：
20mM tris的溶液平衡柱子；之后40min上完样品；之后3倍于浓度为10-14g/dL的纯化的血红蛋白体积的29Mmtris溶液洗杂；之后4-5倍于浓度为10-14g/dL的纯化的血红蛋白体积的50mM tris溶液洗脱。
17.权利要求15所述的方法，其中，所述乳酸林格氏液的组成为：氯化钠6.73g/L、氯化钾0.3g/L、二水氯化钙0.2g/L、40％乳酸钠3.07g/L、N-乙酰-L-半胱氨酸22g/L。
18.权利要求15所述的方法，基于每1000mL的总体积，所述离体器官灌注液由以下物质组成：
聚合血红蛋白30g，
硫氧还蛋白过氧化物酶II 6.7g，
肝素钠25000u，
葡萄糖9g，
氯化钠7g，
头孢西丁钠2g，
碳酸氢钠1.25g，
10％复方氨基酸注射液50mL，
注射用12种复合维生素0.2mL，和
余量水；
或者，
聚合血红蛋白40g，
硫氧还蛋白过氧化物酶II 10g，
肝素钠30000u，
葡萄糖10g，
氯化钠8g，
头孢西丁钠3g，
碳酸氢钠1.5g，
10％复方氨基酸注射液60mL，
注射用12种复合维生素0.3mL，和
余量水；
或者，
聚合血红蛋白20g，
硫氧还蛋白过氧化物酶II 4g，
肝素钠20000u，
葡萄糖8g，
氯化钠6g，
头孢西丁钠1g，
碳酸氢钠1g，
10％复方氨基酸注射液40mL，
注射用12种复合维生素0.1mL，和
余量水。
19.权利要求15-18任一项所述的方法，其中，所述保存在2～40℃下进行。
20.权利要求15-18任一项所述的方法，其中，所述保存在4-37℃下进行。
21.权利要求15-18任一项所述的方法，其中，所述保存在10-30℃下进行。
22.权利要求15-18任一项所述的方法，其中，所述保存在16-20℃下进行。
23.权利要求15-18任一项所述的方法，其中，所述保存在18℃下进行。
24.权利要求15-18任一项所述的方法，其中，所述头孢西丁钠为注射用头孢西丁钠；
或者，所述水为注射水；
或者，所述10％复方氨基酸注射液为辰欣药业生产的10％复方氨基酸注射液；
或者，所述注射用12种复合维生素为山西普德药业股份有限公司生产的“注射用12种复合维生素”；
或者，所述离体器官为心脏、肝脏、肾脏或肺脏。
25.权利要求24所述的方法，其中，所述离体器官为人、狗、大鼠或猪的离体器官。
26.权利要求15-18任一项所述的方法，其中，所述超滤单元包括超滤泵、超滤器和加液管，其中，所述超滤泵和所述超滤器串联连接，并且与所述泵送单元中的灌注液包形成超滤循环，所述加液管与超滤器的下游管路连通，用于向超滤循环中补加缓冲液；
或者，所述离体器官灌注装置还设有氧合单元；所述氧合单元与所述泵送单元连接形成氧合循环，用于对流经泵送单元的灌注液进行气体交换，提升灌注液中血红蛋白的氧饱和度；
或者，所述离体器官灌注装置中还设有气体过滤器；所述气体过滤器位于所述氧合器的下游位置；
或者，所述容器的出口与所述泵送单元的进口之间还设有灌注器官回液管，所述泵送单元的出口与所述容器的进口之间还直接设有灌注器官进液管；
或者，所述离体器官灌注装置还设有流量控制单元和温度控制单元；所述流量控制单元包括至少两个流量指示器，并且分别布设在所述泵送单元的进口管路和出口管路；所述温度控制单元位于所述泵送单元的出口位置，用于控制灌注液温度；
或者，所述离体器官灌注装置还设有压力控制单元；所述压力控制单元位于所述容器的进口位置，用于对回流至容器的灌注液进行压力调节控制；
或者，所述离体器官灌注装置中设有多组泵送单元、氧合器和超滤单元，形成对所述容器的多组并联灌注液循环。
27.权利要求26所述的方法，其中，所述超滤器选用30KD。
28.权利要求26所述的方法，其中，所述氧合单元包括循环泵和氧合膜，所述循环泵与氧合膜串联连接，并且与所述泵送单元中的灌注液包连接形成氧合循环。
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