CN114514034A - 稳定的血红蛋白组合物及其药物制剂 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供了稳定的血红蛋白组合物、其用途和用于其施用的装置。稳定的血红蛋白组合物可用于治疗涉及血液或氧气供应不足的各种贫血或创伤性病症。

Description

稳定的血红蛋白组合物及其药物制剂

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年10月11日提交的美国临时申请号62/914,118的权益。

序列表的并入

以电子方式同时提交的文本文件的内容通过引用整体并入本文：序列表的计算机可读格式副本(文件名：MTAI_001_00US_SeqList_ST25.TXT，记录日期：2019年10月11日，文件大小：9,370字节)。

发明领域

本公开内容涉及包含血红蛋白的组合物、其用途以及用于其静脉内施用的装置。该组合物可用于治疗贫血和其他血液缺乏症。

背景

在人和哺乳动物中，血红蛋白是红细胞中的含铁氧转运金属蛋白，其将氧气从肺部运送到身体的其他部位(即组织)。在那里，它释放氧气以允许有氧呼吸，从而在新陈代谢过程中为有机体的驱动功能提供能量。一个健康个体每100mL血液中具有12至20克血红蛋白。血红蛋白氧容量为每克1.34mL O₂，与血液中的溶解氧相比，这将总血氧容量增加70倍。哺乳动物血红蛋白分子可以结合多达四个氧分子。在大多数脊椎动物中，血红蛋白分子是四个球状蛋白质亚单位的组装体。每个亚单位由与非蛋白质血红素辅基紧密结合的蛋白质链组成。每条蛋白质链排列成一组以珠蛋白折叠排列连接在一起的α-螺旋结构片段。这种折叠模式包含一个紧密结合血红素基的口袋。

在创伤患者的治疗中，用全异体全血进行输血是普遍存在的。然而，在全球范围内，安全和可行的同种异体供血短缺，这个问题预计只会随着时间的推移而增加。此外，全血输血也存在风险，包括血源性疾病、致命的ABO血型不合、全身炎症反应和多器官衰竭。此外，人全血的保质期有限，只有42天，可用数量不足以应对涉及大量外伤的例如战争或自然灾害后的紧急情况。

已经进行了许多努力来开发基于血红蛋白的氧载体(HBOC)，但是大多数基于血红蛋白的血液替代品由于包括严重的血管收缩和增加的死亡率在内的安全问题而未能通过临床试验。尽管有这些失败，但因为此类产品与天然氧载体的生物学相似性以及它们在兽医应用中的成功应用，基于血红蛋白的血液替代品仍然是一种有吸引力的替代品。

对用于人治疗的安全的基于血红蛋白的血液替代品存在未满足的需求。

概述

本文公开了一种基于血红蛋白的组合物，其包含稳定的血红蛋白。在一个方面，本公开内容提供了一种组合物，该组合物包含浓度介于150克(g)/升(L)(g/L)和200g/L之间并且包括端点的稳定的血红蛋白，其中所述组合物包含小于0.02毫克(mg)/毫升(mL)(mg/mL)的溶解氧。在另一个方面，本公开内容提供了一种包含稳定的血红蛋白的组合物，其中稳定的血红蛋白包括：总血红蛋白的20-35％为四聚体形式；总血红蛋白的15-20％为八聚体形式；总血红蛋白的40-55％为多于八聚体形式；总血红蛋白的小于5％为二聚体形式；或其任何组合。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白在稳定的血红蛋白溶液中。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白包括：总血红蛋白的20-35％为四聚体形式，例如总血红蛋白的20-25％、20-30％、25-30％、25-35％或30-35％为四聚体形式。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白包括：总血红蛋白的15-20％为八聚体形式。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白包括：总血红蛋白的40-55％为多于八聚体形式，例如总血红蛋白的40-45％、40-50％、45-50％、45-55％或50-55％为多于八聚体形式。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白包括：总血红蛋白的小于5％为二聚体形式。

在一些实施方案中，组合物包含小于0.02mg/mL的溶解氧。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白浓度介于70和200克/升(g/L)之间并且包括端点。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白浓度介于150和200g/L之间并且包括端点。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白浓度为70g/L至200g/L。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白浓度至少为70g/L。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白浓度最多为200g/L。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白浓度为70g/L至80g/L、70g/L至90g/L、70g/L至100g/L、70g/L至120g/L、70g/L至140g/L、70g/L至160g/L、70g/L至180g/L、70g/L至200g/L、80g/L至90g/L、80g/L至100g/L、80g/L至120g/L、80g/L至140g/L、80g/L至160g/L、80g/L至180g/L、80g/L至200g/L、90g/L至100g/L、90g/L至120g/L、90g/L至140g/L、90g/L至160g/L、90g/L至180g/L、90g/L至200g/L、100g/L至120g/L、100g/L至140g/L、100g/L至160g/L、100g/L至180g/L、100g/L至200g/L、120g/L至140g/L、120g/L至160g/L、120g/L至180g/L、120g/L至200g/L、140g/L至160g/L、140g/L至180g/L、140g/L至200g/L、160g/L至180g/L、160g/L至200g/L或180g/L至200g/L。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白浓度为70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、120g/L、140g/L、160g/L、180g/L或200g/L。

在一些实施方案中，稳定的血红蛋白通过与选自以下的至少一种稳定剂接触而稳定：戊二醛、丁二醛、聚氧乙烯和葡聚糖的活化形式、α-羟基醛、乙醇醛、N-马来酰亚胺-6-氨基己酰基-(2'-硝基,4'-磺酸)-苯基酯、间马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯、磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯、琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯、磺基琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N,N'-苯二马来酰亚胺、双亚胺化合物、酰基二叠氮化合物、芳基二卤化物及其组合。

在一些实施方案中，组合物还包含制剂缓冲剂，所述制剂缓冲剂包含硼酸盐、抗氧化剂和电解质中的一种或多种。在一些实施方案中，硼酸盐是还原的。在一些实施方案中，抗氧化剂包含N-乙酰-L-半胱氨酸。在一些实施方案中，电解质包含Na、Cl和/或K。在一些实施方案中，组合物包含小于0.05个内毒素单位(EU)/毫升(mL)(EU/mL)。在一些实施方案中，血红蛋白包括从人、人细胞或人细胞系分离或衍生的血红蛋白。在一些实施方案中，血红蛋白是从不超过100个可变来源中分离或衍生的。在一些实施方案中，血红蛋白是从小于90、80、70、60、50、40、30、20、10、5或3个可变来源中分离或衍生的。在一些实施方案中，血红蛋白是从单个可变来源中分离或衍生的。在一些实施方案中，血红蛋白是从收获的红细胞中分离或衍生的。在一些实施方案中，血红蛋白是在收获后15、10、5或2天内从收获的红细胞中分离或衍生的。在一些实施方案中，血红蛋白包括从非人动物、非人细胞或非人细胞系中分离或衍生的血红蛋白。在一些实施方案中，血红蛋白是在收获后15、10、5或2天内从收获的红细胞中分离或衍生的。在一些实施方案中，非人动物是非人脊椎动物、非人灵长类动物、鲸类动物、哺乳动物、爬行动物、鸟类、两栖动物或鱼类。在一些实施方案中，非人动物是牛种。在一些实施方案中，非人动物是羊种。在一些实施方案中，非人动物是鼬科动物、圈养鼬科动物、啮齿动物、圈养啮齿动物、猛禽或圈养鸟类。在一些实施方案中，圈养鸟类属于鹦形目、雀形目或鸽形目。在一些实施方案中，非人动物不是为食用而饲养的雏鸟。

在一些实施方案中，血红蛋白包含：(a)亚单位阿尔法(α)，其中亚单位α包含以下的氨基酸序列：

1 MVLSPADKTN VKAAWGKVGA HAGEYGAEAL ERMFLSFPTT KTYFPHFDLS HGSAQVKGHG

61 KKVADALTNA VAHVDDMPNA LSALSDLHAH KLRVDPVNFK LLSHCLLVTL AAHLPAEFTP

121 AVHASLDKFL ASVSTVLTSK YR(SEQ ID NO:1),

或与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％同一性的序列，或其中亚单位α由以下的核酸序列编码

1 actcttctgg tccccacaga ctcagagaga acccaccatg gtgctgtctc ctgccgacaa

61 gaccaacgtc aaggccgcct ggggcaaggt tggcgcgcac gctggcgagt atggtgcgga

121 ggccctggag aggatgttcc tgtccttccc caccaccaag acctacttcc cgcacttcga

181 cctgagccac ggctctgccc aggttaaggg ccacggcaag aaggtggccg acgcgctgac

241 caacgccgtg gcgcacgtgg acgacatgcc caacgcgctg tccgccctga gcgacctgca

301 cgcgcacaag cttcgggtgg acccggtcaa cttcaagctc ctaagccact gcctgctggt

361 gaccctggcc gcccacctcc ccgccgagtt cacccctgcg gtgcacgcct ccctggacaa

421 gttcctggct tctgtgagca ccgtgctgac ctccaaatac cgttaagctg gagcctcggt

481 agcagttcct cctgccagat gggcctccca acgggccctc ctcccctcct tgcaccggcc

541 cttcctggtc tttgaataaa gtctgagtgg gcggc(SEQ ID NO:2),

或与SEQ ID NO:2的序列具有至少90％同一性的序列；或(b)亚单位贝塔(β)，其中亚单位β包含以下的氨基酸序列

1 MVHLTPEEKS AVTALWGKVN VDEVGGEALG RLLVVYPWTQ RFFESFGDLS TPDAVMGNPK

61 VKAHGKKVLG AFSDGLAHLD NLKGTFATLS ELHCDKLHVD PENFRLLGNV LVCVLAHHFG

121 KEFTPPVQAA YQKVVAGVAN ALAHKYH(SEQ ID NO:3),

或与SEQ ID NO:3的序列具有至少90％同一性的序列，

或其中亚单位β由以下的核酸序列编码

1 acatttgctt ctgacacaac tgtgttcact agcaacctca aacagacacc atggtgcatc

61 tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac gtggatgaag

121 ttggtggtga ggccctgggc aggctgctgg tggtctaccc ttggacccag aggttctttg

181 agtcctttgg ggatctgtcc actcctgatg ctgttatggg caaccctaag gtgaaggctc

241 atggcaagaa agtgctcggt gcctttagtg atggcctggc tcacctggac aacctcaagg

301 gcacctttgc cacactgagt gagctgcact gtgacaagct gcacgtggat cctgagaact

361 tcaggctcct gggcaacgtg ctggtctgtg tgctggccca tcactttggc aaagaattca

421 ccccaccagt gcaggctgcc tatcagaaag tggtggctgg tgtggctaat gccctggccc

481 acaagtatca ctaagctcgc tttcttgctg tccaatttct attaaaggtt cctttgttcc

541 ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc ttgagcatct ggattctgcc

601 taataaaaaa catttatttt cattgcaa(SEQ ID NO:4),

或与SEQ ID NO:4的序列具有至少90％同一性的序列；

(c)亚单位伽马(γ)，其中亚单位γ包含以下的氨基酸序列

1 MGHFTEEDKA TITSLWGKVN VEDAGGETLG RLLVVYPWTQ RFFDSFGNLS SASAIMGNPK

61 VKAHGKKVLT SLGDAIKHLD DLKGTFAQLS ELHCDKLHVD PENFKLLGNV LVTVLAIHFG

121 KEFTPEVQAS WQKMVTGVAS ALSSRYH(SEQ ID NO:5),

或与SEQ ID NO:5的序列具有至少90％同一性的序列，或

其中亚单位γ由以下的核酸序列编码

1 acactcgctt ctggaacgtc tgaggttatc aataagctcc tagtccagac gccatgggtc

61 atttcacaga ggaggacaag gctactatca caagcctgtg gggcaaggtg aatgtggaag

121 atgctggagg agaaaccctg ggaaggctcc tggttgtcta cccatggacc cagaggttct

181 ttgacagctt tggcaacctg tcctctgcct ctgccatcat gggcaacccc aaagtcaagg

241 cacatggcaa gaaggtgctg acttccttgg gagatgccat aaagcacctg gatgatctca

301 agggcacctt tgcccagctg agtgaactgc actgtgacaa gctgcatgtg gatcctgaga

361 acttcaagct cctgggaaat gtgctggtga ccgttttggc aatccatttc ggcaaagaat

421 tcacccctga ggtgcaggct tcctggcaga agatggtgac tggagtggcc agtgccctgt

481 cctccagata ccactgagct cactgcccat gatgcagagc tttcaaggat aggctttatt

541 ctgcaagcaa tcaaataata aatctattct gctaagagat cacaca(SEQ ID NO:6),

或与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％同一性的序列；或

(d)亚单位伽马(γ)，其中亚单位γ包含以下的氨基酸序列

1 MGHFTEEDKA TITSLWGKVN VEDAGGETLG RLLVVYPWTQ RFFDSFGNLS SASAIMGNPK

61 VKAHGKKVLT SLGDATKHLD DLKGTFAQLS ELHCDKLHVD PENFKLLGNV LVTVLAIHFG

121 KEFTPEVQAS WQKMVTAVAS ALSSRYH(SEQ ID NO:7),

或与SEQ ID NO:7的序列具有至少90％同一性的序列，或

其中亚单位γ由以下的核酸序列编码

1 acactcgctt ctggaacgtc tgaggttatc aataagctcc tagtccagac gccatgggtc

61 atttcacaga ggaggacaag gctactatca caagcctgtg gggcaaggtg aatgtggaag

121 atgctggagg agaaaccctg ggaaggctcc tggttgtcta cccatggacc cagaggttct

181 ttgacagctt tggcaacctg tcctctgcct ctgccatcat gggcaacccc aaagtcaagg

241 cacatggcaa gaaggtgctg acttccttgg gagatgccac aaagcacctg gatgatctca

301 agggcacctt tgcccagctg agtgaactgc actgtgacaa gctgcatgtg gatcctgaga

361 acttcaagct cctgggaaat gtgctggtga ccgttttggc aatccatttc ggcaaagaat

421 tcacccctga ggtgcaggct tcctggcaga agatggtgac tgcagtggcc agtgccctgt

481 cctccagata ccactgagct cactgcccat gattcagagc tttcaaggat aggctttatt

541 ctgcaagcaa tacaaataat aaatctattc tgctgagaga tcac(SEQ ID NO:8),

或与SEQ ID NO:8的序列具有至少90％同一性的序列。

在一些实施方案中，组合物在环境温度下是稳定的。在一些实施方案中，组合物在冷藏温度下是稳定的。在一些实施方案中，组合物在高于至少4℃的温度下是稳定的。在一些实施方案中，组合物在低于30℃的温度下是稳定的。

在一些实施方案中，内毒素包括细胞脂质、细胞脂质层或脂多糖。在一些实施方案中，细胞脂质、细胞脂质层或脂多糖来自人细胞。在一些实施方案中，细胞脂质、细胞脂质层或脂多糖来自非人脊椎动物细胞。在一些实施方案中，细胞脂质、细胞脂质层或脂多糖来自微生物。在一些实施方案中，细胞脂质、细胞脂质层或脂多糖来自细菌。

在一些实施方案中，稳定的血红蛋白是非天然存在的。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白是聚合的。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白与醛交联形成聚戊二醛血红蛋白(hemoglobin glutamer)。在一些实施方案中，醛是戊二醛。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白具有200千道尔顿(kDa)的平均分子量。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白具有68kDa至500kDa的平均分子量。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白具有至少68kDa的平均分子量。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白具有最多500kDa的平均分子量。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白具有68kDa至100kDa、68kDa至200kDa、68kDa至300kDa、68kDa至400kDa、68kDa至500kDa、100kDa至200kDa、100kDa至300kDa、100kDa至400kDa、100kDa至500kDa、200kDa至300kDa、200kDa至400kDa、200kDa至500kDa、300kDa至400kDa、300kDa至500kDa或400kDa至500kDa的平均分子量。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白具有68kDa、100kDa、200kDa、300kDa、400kDa或500kDa的平均分子量。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白在500kDa上具有小于15％的分子量分布。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白在用稳定剂稳定之前已经基本上脱氧。在一些实施方案中，稳定包括聚合。在一些实施方案中，稳定包括还原稳定剂。在一些实施方案中，通过过滤和/或用电解质溶液渗滤来浓缩稳定的血红蛋白。在一些实施方案中，电解质溶液是生理电解质溶液。在一些实施方案中，过滤是超滤。在一些实施方案中，电解质溶液使高铁血红蛋白(MetHb)的形成最小化。在一些实施方案中，电解质溶液包含N-乙酰基-L-半胱氨酸。

在一些实施方案中，组合物包含：(a)小于10％的MetHb，任选地小于6％的MetHb；和/或(b)小于10％的血红蛋白二聚体，任选地小于6％的血红蛋白二聚体。在一些实施方案中，通过一氧化碳测氧法(cooximetry)测量MetHb的水平。在一些实施方案中，通过尺寸分离技术测量血红蛋白二聚体的水平。在一些实施方案中，组合物包含至少20％的稳定的活性四聚体血红蛋白，任选地25％至35％的稳定的活性四聚体血红蛋白。在一些实施方案中，组合物包含至少60％的多于四聚体分子量的血红蛋白低聚物，任选地至少70％的多于四聚体分子量的血红蛋白低聚物。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白具有比非稳定的血红蛋白或含氧血红蛋白更长的半衰期并且使四聚体血红蛋白分解成引起肾毒性的二聚体最小化。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白包含体外合成的至少一种亚单位。在一些实施方案中，至少一个亚单位包括伽马(γ)亚单位。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白不是从人胎儿中分离的。

本公开内容还提供一种药物制剂，其包含根据前述实施方案中任一项的稳定的血红蛋白组合物，其中该组合物还包含药学上可接受的赋形剂、药学上可接受的溶剂或药学上可接受的载体。在一些实施方案中，组合物被配制用于静脉内注射。在一些实施方案中，组合物被配制用于骨内注射。本公开内容另外提供了一种注射装置，其包含根据前述实施方案中任一项的组合物。在另一个方面，本公开内容提供了一种注射装置，其包含根据前述实施方案中任一项的药物制剂。在一些实施方案中，该装置包括针、注射笔、静脉内(IV)线、中心IV线、注射器、导管和血液交换和/或过滤装置中的一种或多种。在一些实施方案中，该装置旨在供非医学专业人员的个体施用。在一些实施方案中，该装置包括预加载的自注射装置。在一些实施方案中，该装置包括预加载的自注射笔。在一些实施方案中，该装置包含一个或多个治疗有效剂量。在一些实施方案中，该装置包括一个或多个单位剂量。在一些实施方案中，一个或多个单位剂量具有介于10mL和30mL之间并且包括端点的体积。在一些实施方案中，一个或多个单位剂量具有介于18mL和25mL之间并且包括端点的体积。在一些实施方案中，注射装置包括计量装置。在一些实施方案中，注射装置可操作地连接到计量装置。在一些实施方案中，注射装置可以连接到计量装置。在一些实施方案中，注射装置包含滴定剂量。在一些实施方案中，注射装置包括一个或多个隔室，每个隔室能够维持预加载体积的根据前述实施方案中任一项的组合物，并且每个隔室能够将不同体积的组合物递送至受试者，其中每个隔室中的组合物体积可以同时或依次递送。在一些实施方案中，注射装置包括一个或多个隔室，每个隔室能够包含不同量的制剂缓冲液以选择性地将组合物稀释至每个隔室的预定最终浓度。

在另一方面，本公开内容提供根据前述实施方案中任一项的组合物用于治疗有需要的受试者的用途。本公开内容还提供根据前述实施方案中任一项的药物制剂用于治疗有需要的受试者的用途。本公开内容还提供根据前述实施方案中任一项的注射装置用于治疗有需要的受试者的用途。在一些实施方案中，受试者是缺氧和/或贫血的。在一些实施方案中，受试者经历了因受伤而失血、因医学干预而失血、溶血或造血减少。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是非人动物。在一些实施方案中，非人动物是非人脊椎动物、非人灵长类动物、鲸类动物、哺乳动物、爬行动物、鸟类、两栖动物或鱼类。在一些实施方案中，非人动物是牛或绵羊。在一些实施方案中，非人动物是鼬科动物、圈养鼬科动物、啮齿动物、圈养啮齿动物、猛禽或圈养鸟类。在一些实施方案中，圈养鸟类属于鹦形目、雀形目或鸽形目。

本公开内容的另一方面提供一种治疗方法，包括向有需要的受试者施用根据前述实施方案中任一项的组合物。在一些实施方案中，施用包括以一个或多个剂量向受试者提供治疗有效量的组合物。本公开内容还提供一种治疗方法，包括向有需要的受试者施用根据前述实施方案中任一项的药物制剂。在一些实施方案中，施用包括以一个或多个剂量向受试者提供治疗有效量的药物制剂。本公开内容另外提供一种治疗方法，包括向有需要的受试者提供根据前述实施方案中任一项的注射装置，其中该装置将组合物注射到受试者中，从而治疗受试者。在一些实施方案中，注射装置包含治疗有效量的组合物。在一些实施方案中，注射装置包含一个或多个剂量的组合物。在一些实施方案中，注射装置通过从一个或多个隔室中的每一个依次注射：(a)分别增加或减少体积的根据前述实施方案中任一项的组合物，或(b)分别增加或减少浓度的根据前述实施方案中任一项的组合物，来提供递增或递减剂量方案。在一些实施方案中，注射装置通过从一个或多个隔室中的每一个依次注射：(a)分别增加或减少体积的根据前述实施方案中任一项的药物制剂，或(b)分别增加或减少浓度的根据前述实施方案中任一项的药物制剂，来提供递增或递减剂量方案。

在一些实施方案中，受试者是缺氧和/或贫血的。在一些实施方案中，受试者经历了因受伤而失血、因医学干预而失血、溶血或造血减少。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是非人动物。在一些实施方案中，非人动物是非人脊椎动物、非人灵长类动物、鲸类动物、哺乳动物、爬行动物、鸟类、两栖动物或鱼类。在一些实施方案中，非人动物是牛。在一些实施方案中，非人动物是鼬科动物、圈养鼬科动物、啮齿动物、圈养啮齿动物、猛禽或圈养鸟类。在一些实施方案中，圈养鸟类属于鹦形目、雀形目或鸽形目。在一些实施方案中，组合物、药物制剂或注射剂以重复的给药方案施用于受试者。在一些实施方案中，施用重复剂量以实现和/或维持0.3-0.4g/dL的稳定的血红蛋白的血浆浓度。

在一个实施方案中，本公开内容提供了一种基于血红蛋白的组合物，其包含小于0.02毫克/毫升(mg/mL)的溶解氧和通过暴露于至少一种稳定剂而稳定的稳定的血红蛋白，并且具有总血红蛋白的20-35％为四聚体形式，总血红蛋白的15-20％为八聚体形式，总血红蛋白的40-55％为多于八聚体形式，和总血红蛋白的小于5％为二聚体形式。

在一些实施方案中，稳定的血红蛋白的浓度介于70和200克/升(g/L)之间并且包括端点，并且浓度可以介于150和200g/L之间并且包括端点。

在一些实施方案中，稳定剂选自：戊二醛、丁二醛、聚氧乙烯和葡聚糖的活化形式、α-羟基醛、乙醇醛、N-马来酰亚胺-6-氨基己酰基-(2'-硝基,4'-磺酸)-苯基酯、间马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯、磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯、琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯、磺基琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N,N'-苯二马来酰亚胺、双亚胺化合物、酰基二叠氮化合物、芳基二卤化物或其组合。

在一些实施方案中，基于血红蛋白的组合物具有制剂缓冲剂，所述制剂缓冲剂具有硼酸盐、抗氧化剂和电解质中的一种或多种。在一些实施方案中，抗氧化剂包括N-乙酰基-L-半胱氨酸。

在一些实施方案中，基于血红蛋白的组合物具有小于0.05个内毒素单位(EU)/毫升(mL)(EU/mL)。在一些实施方案中，内毒素包括细胞脂质、细胞脂质层或脂多糖。在各种实施方案中，内毒素可以来自人细胞、非人脊椎动物细胞、微生物或细菌。

在一些实施方案中，基于血红蛋白的组合物包括从人、人细胞、人细胞系、非人动物、非人细胞或非人细胞系分离或衍生的血红蛋白。

在一些实施方案中，组合物在选自环境、冷藏、高于至少4℃的温度或低于30℃的温度的温度下是稳定的。

在一些实施方案中，基于血红蛋白的组合物中的稳定的血红蛋白是非天然存在的。

在一些实施方案中，稳定的血红蛋白是聚合的。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白已经与醛交联形成聚戊二醛血红蛋白。在一些实施方案中，醛是戊二醛。

在一些实施方案中，基于血红蛋白的组合物提供具有200千道尔顿(kDa)的平均分子量的稳定的血红蛋白。

在一些实施方案中，稳定的血红蛋白在用至少一种稳定剂稳定之前已经基本脱氧。稳定可以包括聚合过程。在一些实施方案中，稳定进一步包括稳定剂的还原过程。

在一些方面，基于血红蛋白的组合物中的稳定的血红蛋白包括小于10％的高铁血红蛋白。

在一些实施方案中，基于血红蛋白的组合物具有体外合成的稳定的血红蛋白的至少一个亚单位。

在一些方面，基于血红蛋白的组合物包括药学上可接受的赋形剂、药学上可接受的溶剂或药学上可接受的载体。在一些实施方案中，组合物被配制用于静脉内或骨内注射。

在一些方面，基于血红蛋白的组合物具有大于约80％的具有68千道尔顿至500千道尔顿的限定分子量分布的稳定的血红蛋白。在一些方面，基于血红蛋白的组合物具有大于约80％的具有68kDa至500kDa的限定分子量分布的稳定的血红蛋白。在一些方面，基于血红蛋白的组合物具有大于约80％的具有至少68kDa的限定分子量分布的稳定的血红蛋白。在一些方面，基于血红蛋白的组合物具有大于约80％的具有最多500kDa的限定分子量分布的稳定的血红蛋白。在一些方面，基于血红蛋白的组合物具有大于约80％的具有68kDa至100kDa、68kDa至200kDa、68kDa至300kDa、68kDa至400kDa、68kDa至500kDa、100kDa至200kDa、100kDa至300kDa、100kDa至400kDa、100kDa至500kDa、200kDa至300kDa、200kDa至400kDa、200kDa至500kDa、300kDa至400kDa、300kDa至500kDa或400kDa至500kDa的限定分子量分布的稳定的血红蛋白。在一些方面，基于血红蛋白的组合物具有大于约80％的具有68kDa、100kDa、200kDa、300kDa、400kDa或500kDa的限定分子量分布的稳定的血红蛋白。

附图的简要说明

图1显示了如实施例2中所述的稳定的血红蛋白溶液的示例性批次的低聚物成分分析的结果。

图2显示了实施例4中总结的示例性药代动力学研究的实验设计。

图3显示了实施例5中总结的示例性药代动力学研究的实验设计。

发明详述

本公开内容涉及稳定的血红蛋白溶液，以及这种稳定的血红蛋白溶液在治疗有需要的受试者中的用途。稳定的血红蛋白溶液是交联形式的单体哺乳动物血红蛋白，基本上不含内毒素、磷脂和诸如酶的非血红蛋白蛋白质。

定义

术语“血液替代品”或“基于血红蛋白的氧载体”或“HBOC”旨在为具有向重要器官和组织输送和供应氧气并维持血管内渗透压的能力的材料。因此，该术语也包括在本领域中称为“血浆膨胀剂”和“复苏液”的材料。

术语“交联”或“聚合”旨在涵盖分子间和分子内多血红蛋白，其中至少50％的多血红蛋白为多于四聚体形式。

术语“脱氧(deoxygenized)”和“脱氧(deoxygenated)”在本文中可互换使用，是指已从其中除去氧的血红蛋白组合物，例如，通过针对脱气膜进行渗滤，其中氮气流过膜的相对侧。如本文所用，已经“基本上脱氧”的组合物是指包含小于0.02毫克(mg)/毫升(mL)(mg/mL)的溶解氧的组合物。

术语“内毒素”是指作为细菌细胞壁外层的一部分产生的一般与细胞结合的脂多糖，其在许多条件下是有毒的。当注射到动物体内时，内毒素会引起发烧、腹泻、失血性休克和其他组织损伤。

术语“内毒素单位”(EU)是指由1983年美国药典第3014页给出的含义，其将EU定义为在0.2纳克美国参考标准批次EC-2中含有的活性。一瓶EC-2含有5,000EU。

“血红蛋白”或“Hb”是红细胞中的蛋白质分子，其将氧气从肺部运送到身体组织，并将二氧化碳从组织返回到肺部。血红蛋白通常由四个球蛋白链组成。正常成人血红蛋白分子含有两条α-球蛋白链和两条β-球蛋白链。在胎儿和婴儿中，β链并不常见，血红蛋白分子由两条α链和两条γ链组成。每个球蛋白链都含有一种重要的含铁卟啉化合物，称为血红素。包埋在血红素化合物中的是一个铁原子，它对于在我们的血液中运输氧气和二氧化碳至关重要。血红蛋白中所含的铁也是导致血液呈红色的原因。

如本文中所提到的“聚戊二醛(glutamer)”或“聚戊二醛血红蛋白”是指如在WHO药物信息的“国际非专有药名(INN)”中所述的血液替代品或基于血红蛋白的氧载体。此类物质的其他通用名称包括Hemoglobin Glutamer-200、HBOC-301、Hemoglobin Glutamer-250和HBOC-201。

“高铁血红蛋白(methemoglobin)”或“高铁血红蛋白(methaemoglobin)”是金属蛋白形式的血红蛋白，其中血红素基中的铁处于Fe3+(铁)状态，而不是正常血红蛋白的Fe2+(亚铁)。高铁血红蛋白不能结合氧气，这意味着它不能将氧气输送到组织中。在人体血液中，通常会自发产生微量的高铁血红蛋白，但当过量时，血液会变成异常的深蓝棕色。NADH依赖性酶高铁血红蛋白还原酶(一类心肌黄酶)负责将高铁血红蛋白转化回血红蛋白。通常一个人的血红蛋白中有1％到2％是高铁血红蛋白；比这更高的百分比可能是遗传的或由接触各种化学物质引起的，并且取决于水平可能导致称为高铁血红蛋白血症的健康问题。高铁血红蛋白的异常增加会增加正常血红蛋白的氧结合亲和力，导致向组织的氧卸载减少和可能的组织缺氧。

“氧合血红蛋白(oxyhemoglobin)”或“氧合血红蛋白(oxyhaemoglobin)”是血红蛋白的载氧形式。一般来说，血红蛋白可以被氧分子饱和(氧合血红蛋白)，或被氧分子去饱和(脱氧血红蛋白)。氧合血红蛋白是在生理呼吸过程中形成的，此时氧气与红细胞中血红蛋白的血红素成分结合。这个过程发生在与肺泡相邻的肺毛细血管中。氧气然后通过血液移动并在细胞被放下，在细胞中被用作末端电子受体，通过氧化磷酸化过程产生ATP。

术语“稳定的血红蛋白溶液”和“稳定的血红蛋白组合物”是指所公开的包含交联(即稳定的)脱氧血红蛋白的组合物。这种溶液可以制备成药物制剂和/或提供在注射装置中，并且可以用于治疗一种或多种贫血或缺氧病症。

如本文所用，术语“稳定的活性四聚体血红蛋白”是指稳定的，例如交联的，包含连接的α-β和α-β亚链的四聚体血红蛋白。

如本文所用，“稳定剂”是指可用于稳定、聚合或交联根据本公开的血红蛋白组合物所包含的血红蛋白低聚物的任何试剂。示例性的稳定剂包括例如醛。作为非限制性实例，合适的稳定剂包括戊二醛、丁二醛、聚氧乙烯和葡聚糖的活化形式、α-羟基醛例如乙醇醛、N-马来酰亚胺-6-氨基己酰基-(2'-硝基,4'-磺酸)-苯基酯、间马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯、磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯、琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯、磺基琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N,N'-苯二马来酰亚胺和属于双亚胺化合物类、酰基二叠氮化合物类或芳基二卤化物的化合物，等等。

就本发明而言，术语“基本上不含内毒素”在功能上可以描述为稳定的血红蛋白组合物，其每毫升溶液含有少于1.0个内毒素单位，浓度为每分升溶液10克血红蛋白，尽管最终浓度可能为每分升溶液15至20克血红蛋白。在一些实施方案中，如由鲎试验(LAL测定)所测量的，本公开内容的“基本上不含内毒素”的血红蛋白药物物质将含有小于0.5、优选小于0.25、最优选小于0.02个内毒素单位/毫升溶液(EU/ml)。LAL测定由Nachum et al.,Laboratory Medicine,13:112-117(1982)和Pearson III et al.,Bioscience,30:416-464(1980)描述，其通过引用并入本文。

稳定的血红蛋白组合物及其制剂

本公开内容涉及稳定的血红蛋白溶液。不希望受制于理论，理论上现有的基于血红蛋白的氧载体和血液替代品已引起不希望的并且有时是危险的副作用，部分原因是此类溶液所包含的高氧含量的血红蛋白。然而，历史证明很难获得高度浓缩的脱氧血红蛋白溶液。本申请首次公开了高度浓缩的、主要是脱氧的、稳定的血红蛋白溶液。以下小节提供用于获得和生产本公开内容的稳定的血红蛋白溶液的示例性方法并提供所得溶液的示例性特征。可在国际公开号WO 2019/055489中找到可用于本公开内容的其他特征，其内容通过引用整体并入本文。

血红蛋白和/或红细胞来源

包含在本公开内容的稳定的血红蛋白组合物中的血红蛋白可获自生物体或可合成配制。

在一些实施方案中，血红蛋白从红细胞(erythrocyte)(红细胞(red bloodcell))来源获得。在一些实施方案中，血红蛋白衍生自人来源。在一些实施方案中，血红蛋白包括从人、人细胞或人细胞系分离或衍生的血红蛋白。在一些实施方案中，红细胞可以来自新鲜抽取的人血、来自血库的过期血液(即，已超过其保质期的捐献的血液)、胎盘或从人供体中心获得的包装红细胞。在一些实施方案中，血红蛋白来源于收获后超过15天的人细胞。在一些实施方案中，血红蛋白衍生自少于100个可变来源。在一些实施方案中，血红蛋白衍生自少于200、少于100、少于90、少于80、少于70、少于60、少于50、少于40、少于30、少于20、或少于10个可变来源。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白不是从人胎儿中分离的。

在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液包含从非人动物、非人细胞或非人细胞系分离或衍生的血红蛋白。在一些实施方案中，血红蛋白衍生自新鲜的红细胞来源。在一些实施方案中，血红蛋白是从收获后少于十天的细胞中分离或衍生的。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液可以包含衍生自或分离自非人动物的血红蛋白，该非人动物是非人脊椎动物、非人灵长类动物、鲸类动物、哺乳动物、爬行动物、鸟类、两栖动物或鱼类。在一些实施方案中，使用从动物血液中获得的红细胞。在一些实施方案中，血红蛋白衍生自非人哺乳动物血源。可以使用来自例如牛、羊或猪的各种来源的血液。在一些实施方案中，可以使用羊血。在一些实施方案中，由于其容易获得，可以使用牛血。在一些实施方案中，血红蛋白来源于牛血来源。

在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液可以包含衍生自或分离自非人动物的血红蛋白，该动物是鼬科动物、圈养鼬科动物、啮齿动物、圈养啮齿动物、猛禽或圈养鸟类。在一些实施方案中，圈养鸟类属于鹦形目、雀形目或鸽形目。在一些实施方案中，非人动物不是为食用而饲养的雏鸟。

在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液可以包含部分或完全合成的血红蛋白。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液可以包含至少一种体外合成的亚单位。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液可包含至少一种合成亚单位，该合成亚单位包含伽马(γ)亚基。

红细胞收集

在一些实施方案中，本发明的稳定的血红蛋白溶液可以包含衍生自或分离自收集自非人动物来源的红细胞的血红蛋白。对于从例如牛来源收集红细胞，收集套管针可用于以无菌方式提取血液。套管针被小心地插入和处理，并连接到大约2英尺长的管道上。为了插入套管针，将皮切掉并剥开，然后将套管针插入动物靠近心脏的主要血管中，小心不要刺破食道。避免引入细菌和保持低内毒素水平材料不含内毒素是很重要的。这可以使用预装了抗凝剂、去热原并重新检查内毒素的单独容器来完成。典型的抗凝剂包括柠檬酸钠。在所有情况下，容器的内毒素水平必须低于0.01个如LAL检测到的内毒素单位。

在收集期间或之后，可以对收集的血液进行处理以防止凝血。在一些实施方案中，收集容器可以用抗凝剂处理。在一些实施方案中，收集的血液可以是去纤维化的或柠檬酸盐化的。去纤维化血液是已去除纤维蛋白或已被处理以使纤维蛋白原变性而不引起细胞裂解的血液。柠檬酸盐化血液是用柠檬酸钠或柠檬酸处理以防止凝血的血液。

可以将红细胞溶液分配到小容器中，这些小容器可以以无菌方式容纳2至10加仑集中的血液，因此将血液保持在无内毒素状态。在其容器中收集的血液可以立即盖上盖子以避免暴露于环境中。收集过程完成后，将材料冷却，通常冷却至约4℃，以限制细菌生长。此时没有血液的合并(pooling)；随后检查血液中的内毒素和无菌性，以确保(1)没有一头奶牛是生病的；或(2)不合格的收集技术未污染当天的整个批次或收集。

前述部分中描述的示例性收集方法不意味着限制，因为存在许多适合本领域技术人员并且可用的收集方法。

红细胞处理和稳定的血红蛋白组合物制剂

本公开内容的另一方面描述了制备稳定的血红蛋白组合物的方法。下文实施例1中提供了根据本公开内容的用于处理红细胞和配制稳定的血红蛋白组合物的示例性方法。

一般而言，在一些实施方案中，通过包括以下的方法从哺乳动物血液级分中制备稳定的血红蛋白组合物：1)从哺乳动物血液部分中分离红细胞；2)红细胞溶血产生单体血红蛋白和基质的复合物；3)血红蛋白的过滤分离；4)通过高效液相色谱法(HPLC)纯化单体血红蛋白，将血红蛋白与红细胞的所有其他残留蛋白质以及磷脂、酶和内毒素污染物分离；5)脱氧和渗滤；6)交联(聚合或聚集)单体血红蛋白；和/或7)浓缩稳定的血红蛋白溶液。

在一些实施方案中，该方法可以包括以下步骤：(1)获得原始血液产品，(2)分级分离原始血液产品，以产生基本上不含白细胞和血小板的红细胞级分，(3)机械破坏红细胞级分，以产生含血红蛋白的溶液，(4)澄清含血红蛋白的溶液，以产生基本上不含细胞碎片的血红蛋白溶液，(5)微孔过滤基本上不含细胞碎片的血红蛋白溶液，以产生部分灭菌的含血红蛋白溶液，(6)超滤部分灭菌的含血红蛋白溶液，以产生尺寸分离的含血红蛋白溶液，(7)色谱分离尺寸分离的含血红蛋白溶液，以产生基本上不含磷脂、非血红蛋白蛋白质和内毒素的血红蛋白，(8)使基本上不含内毒素的血红蛋白脱氧，以产生基本上脱氧的血红蛋白溶液，(9)交联所述基本上脱氧的血红蛋白溶液，以产生稳定的血红蛋白溶液，和/或(10)浓缩稳定的血红蛋白溶液，所有步骤在基本上不含内毒素的环境下进行。

在一些实施方案中，稳定血红蛋白溶液包括聚合血红蛋白溶液，例如通过交联。可以使用本领域已知的任何交联剂。在一些实施方案中，交联剂是醛。在一些实施方案中，醛是戊二醛。在一些实施方案中，该方法可以包括在交联步骤之后的步骤，以从交联期间形成的较高分子量聚合物中分离或部分分离血红蛋白的单体和低分子量物质。在一些实施方案中，该方法还包括将稳定的脱氧血红蛋白溶液浓缩至70g/L-200g/L的浓度的步骤，并且可以理想地浓缩至合适的范围，包括：70g/L-100g/L、85g/L-125g/L、95g/L-150g/L或150g/L至约200g/L(包括端点)溶液中的血红蛋白。

在一些实施方案中，该方法可以包括在交联之前的任何阶段添加体外合成的血红蛋白。在一些实施方案中，该方法包括从合成来源配制高度浓缩的、脱氧的、稳定的血红蛋白。

在一些实施方案中，该方法可以包括在产生基本上不含内毒素、磷脂和诸如酶的非血红蛋白蛋白质并且具有在68,000道尔顿至500,000道尔顿上具有大于约90％的限定分子量分布的产物的条件下进行上述步骤中的任何一个或多个步骤。

在一些实施方案中，该方法可以在基本上无内毒素的环境中进行，使得内毒素读数在制造过程的任何阶段不超过0.05EU/mL。

稳定的血红蛋白溶液的特征

根据本公开内容的稳定的血红蛋白溶液可以具有一种或多种特征，使其特别适用于体外、体内、实验和/或治疗应用。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液可具有以下属性中的一种或多种：高血红蛋白浓度、低溶解氧浓度、低内毒素浓度、长半衰期、高平均分子量和高百分比的多于二聚体的血红蛋白。

在一些实施方案中，根据本公开内容的稳定的血红蛋白溶液可以具有比可商购或临床审查中的其他基于血红蛋白的氧载体或基于血红蛋白的血液替代品更高的浓度。在一些实施方案中，本公开内容的稳定的血红蛋白溶液可具有约70g/L-200g/L的浓度，并且可理想地浓缩至合适的范围，包括：70g/L-100g/L、85g/L-125g/L、95g/L-150g/L或150g/L至约200g/L。在一些实施方案中，本公开内容的稳定的血红蛋白溶液可以具有至少约150g/L的浓度。在一些实施方案中，本公开内容的稳定的血红蛋白溶液可具有至多约200g/L的浓度。在一些实施方案中，本公开内容的稳定的血红蛋白溶液可具有约150g/L至约155g/L、约150g/L至约160g/L、约150g/L至约165g/L、约150g/L至约170g/L、约150g/L至约175g/L、约150g/L至约180g/L、约150g/L至约185g/L、约150g/L至约190g/L、约150g/L至约195g/L、约150g/L至约200g/L、约155g/L至约160g/L、约155g/L至约165g/L、约155g/L至约170g/L、约155g/L至约175g/L、约155g/L至约180g/L、约155g/L至约185g/L、约155g/L至约190g/L、约155g/L至约195g/L、约155g/L至约200g/L、约160g/L至约165g/L、约160g/L至约170g/L、约160g/L至约175g/L、约160g/L至约180g/L、约160g/L至约185g/L、约160g/L至约190g/L、约160g/L至约195g/L、约160g/L至约200g/L、约165g/L至约170g/L、约165g/L至约175g/L、约165g/L至约180g/L、约165g/L至约185g/L、约165g/L至约190g/L、约165g/L至约195g/L、约165g/L至约200g/L、约170g/L至约175g/L、约170g/L至约180g/L、约170g/L至约185g/L、约170g/L至约190g/L、约170g/L至约195g/L、约170g/L至约200g/L、约175g/L至约180g/L、约175g/L至约185g/L、约175g/L至约190g/L、约175g/L至约195g/L、约175g/L至约200g/L、约180g/L至约185g/L、约180g/L至约190g/L、约180g/L至约195g/L、约180g/L至约200g/L、约185g/L至约190g/L、约185g/L至约195g/L、约185g/L至约200g/L、约190g/L至约195g/L、约190g/L至约200g/L或约195g/L至约200g/L的浓度。在一些实施方案中，本公开内容的稳定的血红蛋白溶液可以具有约150g/L、约155g/L、约160g/L、约165g/L、约170g/L、约175g/L、约180g/L、约185g/L、约190g/L、约195g/L或约200g/L的浓度。

在一些实施方案中，本公开内容的稳定的可以具有比可商购或临床审查中的其他基于血红蛋白的氧载体或基于血红蛋白的血液替代品更低的氧浓度。在一些实施方案中，溶解氧浓度小于0.1mg/mL、小于0.09mg/mL、小于0.08mg/mL、小于0.07mg/mL、小于0.06mg/mL、小于0.05mg/mL、小于0.04mg/mL、小于0.03mg/mL、小于0.02mg/mL或小于0.01mg/mL。在一些实施方案中，溶解氧浓度小于0.02mg/mL。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液包含占总血红蛋白的百分比小于5％的氧合血红蛋白。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液包含占总血红蛋白的百分比小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％或小于2％的氧合血红蛋白。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液包含占总血红蛋白百分比小于3％的氧合血红蛋白。

在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液可以含有很少或不含内毒素污染。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液基本上不含内毒素、磷脂和诸如酶的非血红蛋白蛋白质。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液可以实际上不含内毒素。在一些实施方案中，根据本公开内容的稳定的血红蛋白溶液的内毒素浓度可以小于约0.05内毒素单位(EU)/毫升(mL)。在一些实施方案中，根据本公开内容的稳定的血红蛋白溶液的内毒素浓度可以小于约0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.04、0.03、0.02或0.01EU/mL。在一些实施方案中，测量的内毒素可包含细胞脂质、细胞脂质层和脂多糖中的一种或多种。在一些实施方案中，内毒素可以衍生自或分离自人细胞。在一些实施方案中，内毒素可以衍生自或分离自非人脊椎动物细胞。在一些实施方案中，内毒素可以衍生自或分离自微生物。在一些实施方案中，内毒素可以衍生自或分离自细菌。在一些实施方案中，内毒素可以衍生自或分离自病毒。

在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液可以包含不同大小的血红蛋白低聚物的分布。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液可以实际上不包含血红蛋白单体。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液可包含小于15％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％或小于5％的血红蛋白二聚体。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液可包含小于10％的血红蛋白二聚体。在一些实施方案中，组合物可包含小于6％的血红蛋白二聚体。可以通过已知方法测量血红蛋白二聚体的水平。在一些实施方案中，溶液所包含的血红蛋白二聚体的水平通过例如色谱或SDS-PAGE的尺寸分离技术测量。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液可以包含大于80％、大于85％或大于90％的68,000道尔顿至500,000道尔顿的血红蛋白低聚物。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液可包含20％至35％的血红蛋白四聚体。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液可包含约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％或约35％的血红蛋白四聚体。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液可包含约25％的血红蛋白四聚体。在一些实施方案中，血红蛋白溶液可包含15％至25％的血红蛋白八聚体。在一些实施方案中，血红蛋白溶液可包含15％至20％的血红蛋白八聚体。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液可包含约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、或约25％的血红蛋白八聚体。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液可包含约20％的血红蛋白八聚体。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液可以包含40％至55％的大小多于八聚体的血红蛋白低聚物。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液可包含约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％或约55％的分子量多于八聚体的血红蛋白低聚物。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液包含约50％的分子量多于八聚体的血红蛋白低聚物。

在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液包含在68,000道尔顿至500,000道尔顿具有大于约90％的限定分子量分布的血红蛋白低聚物。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液包含在68,000道尔顿至500,000道尔顿具有大于约80％的限定分子量分布的血红蛋白低聚物。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液可包含平均分子量为200千道尔顿(kDa)的血红蛋白低聚物。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液在500kDa大小上可具有包含小于15％的低聚物的分子量分布。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液在500kDa大小上可具有包括小于20％、小于19％、小于18％、小于17％、小于16％、小于15％、小于14％、小于13％、小于12％、小于11％、小于10％、小于9％、小于8％或小于7％的低聚物的分子量分布。

高铁血红蛋白的存在可能会降低血红蛋白溶液释放氧气的能力。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液包含占总血红蛋白的百分比小于10％的高铁血红蛋白。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液包含占总血红蛋白的百分比小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％或小于0.5％的高铁血红蛋白。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液包含占总血红蛋白的百分比小于6％的高铁血红蛋白。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液包含占总血红蛋白的百分比小于约1％的高铁血红蛋白。可以根据本领域已知的方法测量高铁血红蛋白的水平。在一些实施方案中，高铁血红蛋白的水平是通过一氧化碳测氧法测量的。

在一些实施方案中，稳定的血红蛋白具有比非稳定的血红蛋白或氧合血红蛋白更长的半衰期，并且使四聚体血红蛋白分解成引起肾毒性的二聚体最小化。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白具有至少60分钟、至少90分钟、至少120分钟、至少150分钟、至少180分钟、至少210分钟或至少240分钟的半衰期。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白具有约3.5小时或约210分钟的半衰期。

在一些实施方案中，稳定的血红蛋白组合物可以在各种温度下是稳定的。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白在环境温度下是稳定的。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白在冷藏温度下是稳定的。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白在高于约4℃的温度下是稳定的。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白在高于1℃、高于2℃、高于3℃、高于4℃或高于5℃的温度下是稳定的。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白在低于约30℃的温度下是稳定的。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白在低于35℃、低于34℃、低于33℃、低于32℃、低于31℃或低于30℃的温度下是稳定的。

血红蛋白序列

在一些实施方案中，本发明的稳定的血红蛋白溶液所包括的血红蛋白包含亚单位阿尔法(α)，其中亚单位α包含以下的氨基酸序列：

1 MVLSPADKTN VKAAWGKVGA HAGEYGAEAL ERMFLSFPTT KTYFPHFDLS HGSAQVKGHG

61 KKVADALTNA VAHVDDMPNA LSALSDLHAH KLRVDPVNFK LLSHCLLVTL AAHLPAEFTP

121 AVHASLDKFL ASVSTVLTSK YR(SEQ ID NO:1)。

在一些实施方案中，血红蛋白包含亚单位α，亚单位α包含与SEQID NO:1的序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，血红蛋白包含亚单位α，亚单位α包含与SEQ IDNO:1的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，血红蛋白包含亚单位α，其中亚单位α由以下的核酸序列编码：

1 actcttctgg tccccacaga ctcagagaga acccaccatg gtgctgtctc ctgccgacaa

61 gaccaacgtc aaggccgcct ggggcaaggt tggcgcgcac gctggcgagt atggtgcgga

121 ggccctggag aggatgttcc tgtccttccc caccaccaag acctacttcc cgcacttcga

181 cctgagccac ggctctgccc aggttaaggg ccacggcaag aaggtggccg acgcgctgac

241 caacgccgtg gcgcacgtgg acgacatgcc caacgcgctg tccgccctga gcgacctgca

301 cgcgcacaag cttcgggtgg acccggtcaa cttcaagctc ctaagccact gcctgctggt

361 gaccctggcc gcccacctcc ccgccgagtt cacccctgcg gtgcacgcct ccctggacaa

421 gttcctggct tctgtgagca ccgtgctgac ctccaaatac cgttaagctg gagcctcggt

481 agcagttcct cctgccagat gggcctccca acgggccctc ctcccctcct tgcaccggcc

541 cttcctggtc tttgaataaa gtctgagtgg gcggc(SEQ ID NO:2)。

在一些实施方案中，血红蛋白包含亚单位α，其中亚单位α由与SEQ ID NO:2的序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，血红蛋白包含亚单位α，其中亚单位α由与SEQID NO:2的序列具有至少90％同一性核酸序列编码。

在一些实施方案中，血红蛋白包含亚单位贝塔(β)，其中亚单位β包含以下的氨基酸序列：

1 MVHLTPEEKS AVTALWGKVN VDEVGGEALG RLLVVYPWTQ RFFESFGDLS TPDAVMGNPK

61 VKAHGKKVLG AFSDGLAHLD NLKGTFATLS ELHCDKLHVD PENFRLLGNV LVCVLAHHFG

121 KEFTPPVQAA YQKVVAGVAN ALAHKYH(SEQ ID NO:3)。

在一些实施方案中，血红蛋白包含亚单位β，其中亚单位β包含与SEQ ID NO:3的序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，血红蛋白包含亚单位β，其中亚单位β包含与SEQ ID NO:3的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，血红蛋白包含亚单位β，其中亚单位β由以下的核酸序列编码：

1 acatttgctt ctgacacaac tgtgttcact agcaacctca aacagacacc atggtgcatc

61 tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac gtggatgaag

121 ttggtggtga ggccctgggc aggctgctgg tggtctaccc ttggacccag aggttctttg

181 agtcctttgg ggatctgtcc actcctgatg ctgttatggg caaccctaag gtgaaggctc

241 atggcaagaa agtgctcggt gcctttagtg atggcctggc tcacctggac aacctcaagg

301 gcacctttgc cacactgagt gagctgcact gtgacaagct gcacgtggat cctgagaact

361 tcaggctcct gggcaacgtg ctggtctgtg tgctggccca tcactttggc aaagaattca

421 ccccaccagt gcaggctgcc tatcagaaag tggtggctgg tgtggctaat gccctggccc

481 acaagtatca ctaagctcgc tttcttgctg tccaatttct attaaaggtt cctttgttcc

541 ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc ttgagcatct ggattctgcc

601 taataaaaaa catttatttt cattgcaa(SEQ ID NO:4)。

在一些实施方案中，血红蛋白包含亚单位β，其中亚单位β由与SEQ ID NO:4的序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，血红蛋白包含亚单位β，其中亚单位β由与SEQIDNO:4的序列具有至少90％同一性核酸序列编码。

在一些实施方案中，血红蛋白包含亚单位伽马(γ)，其中亚单位γ包含以下的氨基酸序列：

1 MGHFTEEDKA TITSLWGKVN VEDAGGETLG RLLVVYPWTQ RFFDSFGNLS SASAIMGNPK

61 VKAHGKKVLT SLGDAIKHLD DLKGTFAQLS ELHCDKLHVD PENFKLLGNV LVTVLAIHFG

121 KEFTPEVQAS WQKMVTGVAS ALSSRYH(SEQ ID NO:5),

在一些实施方案中，血红蛋白包含亚单位γ，其中亚单位γ包含与SEQ ID NO:5的序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，血红蛋白包含亚单位γ，其中亚单位γ包含与SEQ ID NO:5的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，血红蛋白包含亚单位γ，其中亚单位γ由以下的核酸序列编码：

1 acactcgctt ctggaacgtc tgaggttatc aataagctcc tagtccagac gccatgggtc

61 atttcacaga ggaggacaag gctactatca caagcctgtg gggcaaggtg aatgtggaag

121 atgctggagg agaaaccctg ggaaggctcc tggttgtcta cccatggacc cagaggttct

181 ttgacagctt tggcaacctg tcctctgcct ctgccatcat gggcaacccc aaagtcaagg

241 cacatggcaa gaaggtgctg acttccttgg gagatgccat aaagcacctg gatgatctca

301 agggcacctt tgcccagctg agtgaactgc actgtgacaa gctgcatgtg gatcctgaga

361 acttcaagct cctgggaaat gtgctggtga ccgttttggc aatccatttc ggcaaagaat

421 tcacccctga ggtgcaggct tcctggcaga agatggtgac tggagtggcc agtgccctgt

481 cctccagata ccactgagct cactgcccat gatgcagagc tttcaaggat aggctttatt

541 ctgcaagcaa tcaaataata aatctattct gctaagagat cacaca(SEQ ID NO:6),

在一些实施方案中，血红蛋白包含亚单位γ，其中亚单位γ由与SEQ ID NO:6的序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，血红蛋白包含亚单位γ，其中亚单位γ由与SEQ IDNO:6的序列具有至少90％同一性核酸序列编码。

在一些实施方案中，血红蛋白包含亚单位伽马(γ)，其中亚单位γ包含以下的氨基酸序列：

1 MGHFTEEDKA TITSLWGKVN VEDAGGETLG RLLVVYPWTQ RFFDSFGNLS SASAIMGNPK

61 VKAHGKKVLT SLGDATKHLD DLKGTFAQLS ELHCDKLHVD PENFKLLGNV LVTVLAIHFG

121 KEFTPEVQAS WQKMVTAVAS ALSSRYH(SEQ ID NO:7)。

在一些实施方案中，血红蛋白包含亚单位γ，其中亚单位γ包含与SEQ ID NO:7的序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，血红蛋白包含亚单位γ，其中亚单位γ包含与SEQ ID NO:7的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，血红蛋白包含亚单位γ，其中亚单位γ由以下的核酸序列编码：

1 acactcgctt ctggaacgtc tgaggttatc aataagctcc tagtccagac gccatgggtc

61 atttcacaga ggaggacaag gctactatca caagcctgtg gggcaaggtg aatgtggaag

121 atgctggagg agaaaccctg ggaaggctcc tggttgtcta cccatggacc cagaggttct

181 ttgacagctt tggcaacctg tcctctgcct ctgccatcat gggcaacccc aaagtcaagg

241 cacatggcaa gaaggtgctg acttccttgg gagatgccac aaagcacctg gatgatctca

301 agggcacctt tgcccagctg agtgaactgc actgtgacaa gctgcatgtg gatcctgaga

361 acttcaagct cctgggaaat gtgctggtga ccgttttggc aatccatttc ggcaaagaat

421 tcacccctga ggtgcaggct tcctggcaga agatggtgac tgcagtggcc agtgccctgt

481 cctccagata ccactgagct cactgcccat gattcagagc tttcaaggat aggctttatt

541 ctgcaagcaa tacaaataat aaatctattc tgctgagaga tcac(SEQ ID NO:8)。

在一些实施方案中，血红蛋白包含亚单位γ，其中亚单位γ由与SEQ ID NO:8的序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，血红蛋白包含亚单位γ，其中亚单位γ由与SEQ ID NO:8的序列具有至少90％同一性核酸序列编码。

药物制剂

本公开内容的另一方面涉及包含本公开内容的稳定的血红蛋白溶液的药物制剂。本文所述的药物制剂可以通过药理学领域已知的任何方法制备。通常，此类制备方法包括使稳定的血红蛋白溶液与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合的步骤，然后，如有必要和/或需要，将产品包装成所需的单剂量单位或多剂量单位，即与使用下文公开的装置进行施用兼容的单位。

根据本公开内容的药物制剂可以另外包含惰性成分，包括药学上可接受的赋形剂、载体、溶剂、稀释剂、填充剂、盐和/或本领域众所周知的其他材料，其选择取决于使用的剂型、治疗的病症、根据本领域普通技术人员的确定要达到的特定目的以及这些添加剂的性质。根据本公开内容的稳定的血红蛋白溶液可以包括一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂。

药学上可接受的赋形剂包括任何和所有溶剂、稀释剂或其他液体载体、分散剂或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等，如适合于所需的特定剂型。赋形剂的实例包括氯化钠和生理上可接受的缓冲剂。

药学上可接受的载体优选是无毒的、惰性的并且与血红蛋白相容。此类载体的实例包括但不限于水、平衡盐水溶液、生理盐水溶液(例如，乳酸盐林格溶液、哈特曼溶液等)、葡萄糖溶液等。

示例性稀释剂包括碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠等，及其组合。

在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液或其制剂可以另外包含氯化钠、氯化钾、氯化钙、氢氧化钠、N-乙酰基-L-半胱氨酸、乳酸钠、硼酸钠和/或tris。稳定的血红蛋白溶液或其药物制剂可以进一步包含制剂缓冲剂，制剂缓冲剂包含硼酸盐或另一种合适的缓冲剂。硼酸盐可以是还原的。

在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液可以包含一种或多种电解质。可用于本公开内容的电解质包括Na、Cl、K等。

在一些实施方案中，稳定的血红蛋白以例如治疗有效量或预防有效量的有效量存在于药物制剂中。

药物制剂可以制备为单一单位剂量，和/或制备为多个单一单位剂量。如本文所用，“单位剂量”是离散量的包含预定量的稳定的血红蛋白的药物组合物。稳定的血红蛋白的量通常等于将施用于受试者的血红蛋白的剂量和/或该剂量的方便部分，例如该剂量的二分之一或三分之一。

本发明的药物组合物中的稳定的血红蛋白、药学上可接受的载体和/或任何其他成分的相对量将根据治疗受试者的身份、大小和/或病症以及进一步取决于待施用组合物的途径。例如，制剂可包含0.1％至100％(w/w)的活性成分。

本公开内容的药物制剂可以配制用于通过任何方式施用于受试者。在一些实施方案中，制剂可以制备用于通过包括口服、气雾剂、透皮吸附、通过粘膜吸附或注射在内的途径施用。在一些实施方案中，制剂被制备用于肠胃外施用。在一些实施方案中，制剂被制备用于静脉内施用。在一些实施方案中，制剂被制备用于骨内施用。

用于施用稳定的血红蛋白组合物的装置

本公开内容的另一方面提供了用于施用所公开的稳定的血红蛋白溶液及其药物制剂的装置。

在一些实施方案中，该装置是注射装置。在一些实施方案中，该装置包括针、注射笔、静脉内(IV)线、中心IV线、注射器、导管和血液交换和/或过滤装置中的一种或多种。

在一些实施方案中，该装置旨在由非医学专业人员的个体施用。在一些实施方案中，该装置旨在用于医院环境之外的施用。在一些实施方案中，该装置旨在用于在紧急情况下施用。在一些实施方案中，该装置旨在用于在救护车中施用。

在一些实施方案中，该装置包括预加载的自注射装置。在一些实施方案中，该装置包括预加载的自注射笔。

在一些实施方案中，该装置包括一个或多个治疗有效剂量。在一些实施方案中，该装置包括一个或多个单位剂量。在一些实施方案中，一个或多个单位剂量包括介于10mL和30mL之间并且包括端点的体积。在一些实施方案中，一个或多个单位剂量包含介于18mL和25mL之间并且包括端点的体积。

在一些实施方案中，注射装置包括计量装置。在一些实施方案中，注射装置可操作地连接到计量装置。在一些实施方案中，注射装置可以连接到计量装置。

在一些实施方案中，注射装置可以包括滴定剂量。计量和/或滴定稳定的血红蛋白组合物和/或制剂可以与监测正在治疗的受试者的一种或多种生理症状一起进行。一种或多种生理症状可以选自：血压、体核体温、肝组织氧合张力、呼吸频率、尿量、每搏输出量、心率、心输出量、收缩期最大血流速度、动脉PO₂、动脉PCO₂、动脉pH和动脉碱过剩。

在一些实施方案中，注射装置包括一个或多个隔室，每个隔室能够维持预加载体积的稳定的血红蛋白溶液，并且每个隔室能够将不同体积的组合物递送至受试者，其中每个隔室中的组合物体积可以同时或依次递送。

在一些实施方案中，注射装置包括一个或多个隔室，每个隔室能够包含不同量的制剂缓冲液以选择性地将稳定的血红蛋白溶液和/或制剂稀释至每个隔室的预定最终浓度。

在一些实施方案中，注射装置通过从一个或多个隔室中的每一个依次注射：(a)分别增加或减少体积的稳定的血红蛋白溶液和/或制剂，或(b)分别增加或减少浓度的稳定的血红蛋白溶液和/或制剂，来提供递增或递减剂量方案。

稳定的血红蛋白组合物和装置的用途

本公开内容的另一方面涉及所公开的溶液、药物制剂和装置在治疗有需要的受试者中的用途。

受试者

本发明的溶液、药物制剂和装置可用于治疗各种不同的受试者。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是非人动物。在一些实施方案中，非人动物是非人脊椎动物、非人灵长类动物、鲸类动物、哺乳动物、爬行动物、鸟类、两栖动物或鱼类。在一些实施方案中，非人动物是犬科动物或猫科动物。在一些实施方案中，非人动物是牛。在一些实施方案中，非人动物是鼬科动物、圈养鼬科动物、啮齿动物、圈养啮齿动物、猛禽或圈养鸟类。在一些实施方案中，圈养鸟类属于鹦形目、雀形目或鸽形目。

疾病和病症

本发明的溶液、制剂和装置可用于治疗各种病症或疾病，包括贫血、缺氧和血红蛋白病。血红蛋白病包括许多遗传性贫血，其中红细胞(RBC)的产生减少和/或破坏(溶血)增加。这些还包括导致产生异常血红蛋白并伴随着维持氧浓度的能力受损的遗传缺陷。一些这样的疾病涉及不能产生足够量的正常β-珠蛋白，而另一些涉及不能完全产生正常β-珠蛋白。这些与β-珠蛋白相关的疾病通常被称为β-血红蛋白病。例如，β-地中海贫血是由导致HbA缺乏或缺失的β-珠蛋白基因表达的部分或完全缺陷引起的。镰状细胞性贫血由导致产生异常(镰状)血红蛋白(HbS)的β-珠蛋白结构基因的点突变引起。HbS RBC比正常RBC更脆弱并且更容易发生溶血，最终导致贫血(Atweh,Semin.Hematol.38(4):367-73(2001))。

在一些实施方案中，本发明的溶液、制剂和装置可用于治疗贫血。在一些实施方案中，贫血可以是再生障碍性贫血、缺铁性贫血、镰状细胞性贫血、地中海贫血或维生素缺乏性贫血。在一些实施方案中，贫血的特征在于疲劳、虚弱、皮肤苍白或发黄、心跳不规则、气短、头晕或头昏眼花、胸痛、手脚冰凉、头痛。贫血可能是由于红细胞丢失、红细胞生成不足或红细胞过度裂解造成的。

在一些实施方案中，本发明的溶液、制剂和装置可用于治疗缺铁性贫血。缺铁性贫血可能是由制造血红蛋白所需的铁缺乏引起的。这种贫血在许多孕妇中很常见。它还由失血引起的，例如大量月经出血、溃疡、癌症和经常使用一些非处方止痛药，尤其是阿司匹林，其会导致胃壁发炎，导致失血。

在一些实施方案中，本发明的溶液、制剂和装置可用于治疗维生素缺乏性贫血，也称为恶性贫血。缺乏足够的叶酸、维生素B-12或其他重要维生素可能会导致维生素缺乏性贫血。该缺乏可能是由饮食供应不足或无法吸收所需的维生素引起的。

在一些实施方案中，本发明的溶液、制剂和装置可用于治疗炎症性贫血。某些疾病——包括癌症、HIV/AIDS、类风湿性关节炎、肾病、克罗恩病和其他急性或慢性炎症性疾病——会干扰红细胞的产生。

在一些实施方案中，本发明的溶液、制剂和装置可用于治疗再生障碍性贫血。当身体不能产生足够的红细胞时，就会发生这种罕见的、危及生命的贫血。再生障碍性贫血的原因包括感染、某些药物、自身免疫性疾病和接触有毒化学物质。

在一些实施方案中，本发明的溶液、制剂和装置可用于治疗与骨髓疾病相关的贫血。多种疾病，如白血病和骨髓纤维化，可通过影响骨髓中的血液生成而导致贫血。这些类型的癌症和癌症样疾病的影响从轻微到危及生命不等。在一些实施方案中，本发明的组合物可用于治疗因血癌或癌症治疗而经历失血的受试者。

在一些实施方案中，本发明的溶液、制剂和装置可用于治疗溶血性贫血。当红细胞被破坏的速度快于骨髓可以替代它们时，就会出现这类贫血。某些血液疾病会增加红细胞破坏。溶血性贫血可以是遗传的或在生活中后续发展。

在一些实施方案中，本发明的溶液、制剂和装置可用于治疗镰状细胞性贫血。这种遗传性且有时严重的病症是溶血性贫血。它是由血红蛋白的缺陷形式引起的，它迫使红细胞呈现异常的新月形(镰刀形)。这些不规则的血细胞过早死亡，导致红细胞长期缺乏。

在一些实施方案中，本发明的溶液、制剂和装置可用于治疗缺氧。缺氧是一种身体或身体的一个区域在组织水平上被剥夺足够氧气供应的状况。缺氧可分为全身性缺氧，影响全身，或局部缺氧，影响身体的一个区域。在一些实施方案中，本发明的治疗可用于治疗全身性缺氧。在一些实施方案中，本发明的治疗可用于治疗局部缺氧。尽管缺氧可能是一种病理状况，但动脉氧浓度的变化可能是正常生理的一部分，例如，在换气不足训练或剧烈体育锻炼期间。在一些实施方案中，本发明的治疗用于治疗由于剧烈体育活动而经历缺氧的个体。

在一些实施方案中，本发明的治疗用于治疗已经上升到高海拔的个体。健康人上升到高海拔地区时会出现全身性缺氧，导致高原反应，其导致潜在的致命并发症：高原肺水肿(HAPE)和高原脑水肿(HACE)。在一些实施方案中，本发明的治疗用于治疗经历高原反应、HAPE或HACE的受试者。

在一些实施方案中，本发明的治疗用于治疗已经在水下潜水的个体。健康个体在呼吸含氧量低的气体混合物时可能会出现缺氧，例如：在水下潜水时，尤其是在使用控制供应空气中氧气量的闭路循环呼吸器系统时。

在一些实施方案中，本发明的治疗可以改善或减轻缺氧的一种或多种症状。在缺氧时，逐渐出现的症状包括疲劳、四肢麻木/刺痛、恶心和脑缺氧。在严重缺氧或快速发作的缺氧中，共济失调、精神错乱/定向障碍/幻觉/行为改变、严重头痛/意识水平下降、视盘水肿、呼吸困难、苍白、心动过速和肺动脉高压最终导致晚期体征发绀、心率减慢/心律失常，并且血压低，随后心力衰竭，最终导致休克和死亡。在一些实施方案中，本发明的治疗可以改善或预防缺氧的一种或多种副作用。

在一些实施方案中，受试者经历了因受伤而失血、因医疗干预而失血、溶血或造血减少。在一些实施方案中，本发明的治疗使动脉流量、体积和/或压力恢复到可接受的水平，并且组织的氧合恢复到可接受的水平。在一些实施方案中，组合物可用于治疗患有失血、内伤(例如，内脏器官损伤)、出血、失血性休克或外伤性脑损伤的受试者。在一些实施方案中，本发明的组合物可用作复苏手段。

在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液可以在没有全血输注的情况下施用。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液可以与全血输注一起施用。在一些实施方案中，可以在全血输血之前或之后施用稳定的血红蛋白溶液。

在一些实施方案中，本发明的组合物可用于术前血液稀释。在一些实施方案中，本发明的组合物可用于在手术前治疗受试者。在一些实施方案中，手术是例如主动脉手术、肝切除术或器官移植。

施用途径

稳定的血红蛋白溶液、其药物制剂可以通过任何途径施用。在一些实施方案中，施用是口服的、局部的、肠胃外的、肠内的、经皮的、皮内的、眼内的、玻璃体内的、皮下的、静脉内的或骨内的。在一些实施方案中，施用是肠胃外的。在一些实施方案中，施用是静脉内的。在一些实施方案中，施用是骨内的。

剂量和给药方案

施用可以包括施用治疗有效量的一个或多个剂量。在一些实施方案中，稳定的血红蛋白溶液或药物制剂可以以单剂量或以两个或更多个剂量施用。在一些实施方案中，将稳定的血红蛋白溶液计量加入有需要的受试者中。在一些实施方案中，施用包括滴定稳定的血红蛋白组合物而不是单次推注。计量和/或滴定稳定的血红蛋白组合物和/或制剂，例如使用本公开内容的注射装置，可以结合监测被治疗受试者的一种或多种生理症状来执行。一种或多种生理症状可以选自：血压、体核体温、肝组织氧合张力、呼吸频率、尿量、每搏输出量、心率、心输出量、收缩期最大血流速度、动脉PO₂、动脉PCO₂、动脉pH和动脉碱过剩。

在一些实施方案中，本发明的稳定的血红蛋白组合物可以重复给药方案施用以实现0.3-0.4g/dL的血浆水平。可以施用额外的剂量以随时间维持该浓度。在一些实施方案中，本发明的稳定的血红蛋白溶液可以在15-20g/dL的浓度范围内配制并以足以实现0.3-0.4g/dL稳定的血红蛋白血浆浓度的总剂量施用于受试者。总剂量可以单剂量、若干剂量或根据重复给药方案施用。在重复给药方案中，可以重复施用剂量，间隔数秒、数分钟、数小时或数天的时间段。在一些实施方案中，重复剂量间隔约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时，约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约1天、约1.5天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约1周的时间段。在一些实施方案中，后续剂量相隔约6小时的时间段。在一些实施方案中，后续剂量间隔约12小时的时间段。在一些实施方案中，后续剂量相隔约1天的时间段。在一些实施方案中，监测血浆血红蛋白水平以确定后续剂量的时机。在一些实施方案中，监测稳定的血红蛋白水平以确定后续剂量的时机以便实现和维持0.3-0.4g/dL的稳定的血红蛋白溶液的浓度。

体内特征

本文公开的稳定的血红蛋白组合物可用作氧载体和/或血液替代物。在一些实施方案中，该物质基本上不含内毒素，具有可逆结合气态配体如氧的特性，并且可用于向重要组织和器官输送和供应氧。因此，在一些实施方案中，本发明的稳定的血红蛋白组合物可用作控制疾病的血液膨胀剂和复苏液，并在需要时、即响应突然和大量失血用于维持循环完整性。

在一些实施方案中，稳定的血红蛋白组合物基本上不含内毒素和热原。在一些实施方案中，它不会导致任何以下异常和有害的体内化学和生理功能：(1)不激活补体；(2)不引起出血性疾病；(3)不会引起血小板功能异常或聚集；(4)不引起凝血酶原时间(PT)异常；(5)不引起部分凝血活酶时间异常；(6)不干扰血型或交叉配型；(7)每公斤体重3.5克或每分升循环血量8克对肾脏无毒；(8)表现出至少7天的循环持久性；(9)作为加速红细胞生成的刺激物。

实施例

实施例1：生产高度浓缩、脱氧、稳定的血红蛋白组合物。

血液卸载：

将有来源的血液材料(去纤维化的或柠檬酸盐化的)通过静态混合器用合适的生理相容的缓冲溶液稀释。血液通过50μm血液过滤器和60μm深度过滤器泵送，以在需要时去除外来物质或大聚集体。

在使用前用缓冲液冲洗Ultrafilter Skid。使用Ultrafilter Skid将过滤后的血液进一步稀释，然后浓缩至原始加载体积，然后用7体积的缓冲溶液洗涤。

将洗涤过的红细胞溶液泵入离心机并以足够的转速和持续时间旋转，以便将含有红细胞(RBC)的重相与含有剩余血浆和缓冲液的较轻相分离。重相被排出到产品收集容器中。含有细胞的相从离心机中排出可能导致红细胞的破坏和裂解，例如，通过从离心机排出到产品收集容器中时的冲击。或者，红细胞的排出可能需要通过另一种方法裂解细胞。将细胞溶液从产品收集容器泵送到红细胞容器。如果需要裂解红细胞，可以通过静态混合器用去热原水(DPW)在管道中(inline)稀释红细胞，同时将其转移到RBC容器中。在该实施方案中，由于随着在转移过程中加入去热原水而导致渗透压的快速变化，红细胞可能会被裂解。

过滤和储存：

对收集的细胞进行取样，测试血红蛋白，然后使用DPW将其调整到14.0-18.0g/dL。

在使用前用DPW冲洗100kDA和30kDA skid。使用100kDa膜和约11体积的DPW对红细胞溶液进行渗滤。此操作可消除大于100kDa的细胞碎片。渗透的含血红蛋白溶液同时使用30kDa膜进行超滤，以浓缩血红蛋白并去除较小的碎片和微污染物。分析血红蛋白并继续超滤，直到中间体浓缩至约13g/dl。在这两个步骤之后，64kDa的血红蛋白被保留下来。对浓缩的血红蛋白进行取样以进行过程中(in-process)测试。

在测试之后，血红蛋白通过0.5μm和0.22μm澄清过滤器被泵送到容器中。对容器中的内容物进行采样，然后将容器转移到2-8℃的冷藏室。

色谱：

将粗血红蛋白从冷藏储存中取出进行色谱纯化。

在纯化前用缓冲液A(2.42g/L Tris,pH 9)平衡柱。产品被送入柱，床高为30cm，线性流速为400cm/hr。然后用缓冲液A洗涤柱，然后用缓冲液A过渡到缓冲液B(6.05g/L Tris,pH 7)进行pH梯度洗脱。这种缓冲液洗脱松散结合的非血红蛋白成分，这些成分被送到废物流中。通过在检测血红蛋白的合适波长(通常为541nm，更特别是577nm)中识别OD或吸光度的变化来收集产物级分，可有效地监测以指示血红蛋白的存在。

脱氧/浓缩：

将浓缩溶液转移到脱气容器中，并使用缓冲液C(2.42g/L Tris，58.38g/L NaClpH 8.9)将离子强度调节至>200mM。然后通过对脱气膜渗滤使溶液脱氧，其中氮气流过膜的相对侧。

使用30kDa MWCO膜过滤器和3倍体积的脱氧储存缓冲液(具有2g/L N-乙酰基-L-半胱氨酸的磷酸盐溶液)将脱氧溶液渗滤到脱氧储存缓冲液中。

对脱氧血红蛋白中间体进行取样用于过程中测试并使用0.5μm和0.22μm过滤器过滤到储存袋中。该中间体在17-22℃下可稳定长达60天。

化合物加载、混合和聚合：

该过程开始于将脱氧注射用水(WFI)(约1/2中间体体积)，USP装入反应器容器中，混合/再循环并加热至42℃。将血红蛋白中间体添加到反应器容器中，然后加入2.5体积的额外脱氧WFI，USP。

一旦达到温度，血红蛋白中间体就被转移到另一个罐中。将0.62％戊二醛活化溶液添加到血红蛋白溶液中，随着将其转移到另一个罐中以聚合血红蛋白。一旦聚合时间完成，将聚合的血红蛋白溶液冷却至20℃。

渗滤、浓缩和化合物储存：

将聚合的血红蛋白溶液浓缩至约8g/dL，并使用30kDa MWCO膜和3倍体积的硼酸盐缓冲液(4.58g/L 10水合硼酸钠，0.91g/L氢氧化钠，pH 10.4-10.6)调节溶液的pH值。聚合的血红蛋白然后再循环通过脱氧过滤器，逆着氮气的错流流动，以从过程中去除氢气。

然后通过加入淬灭溶液(9.00-9.95g硼氢化钠/kg硼酸盐缓冲液)来淬灭再循环的聚合的血红蛋白溶液，并通过30kDa MWCO过滤器和脱氧过滤器缓慢再循环1小时。该步骤将血红蛋白浓缩至大约70-200g/L，并且可以理想地浓缩至合适的范围，包括：70-100g/L、85-125g/L、95-150g/L或150-200g/L。

通过用6个渗滤体积的渗滤缓冲液A(6.67g/L氯化钠、0.30g/L氯化钾、0.20g/L二水合氯化钙、0.445g/L氢氧化钠、2.02g/L N-乙酰基-L-半胱氨酸、3.07g/L乳酸钠)并继续使用脱氧过滤器将溶液进行缓冲液交换。

最后，用3个渗滤体积的渗滤缓冲液C(6.73g/L氯化钠、0.30g/L氯化钾、0.20g/L无水氯化钙、0.512g/L氢氧化钠、2.03g/L N-乙酰1-L-半胱氨酸、3.08g/L乳酸钠，pH 7.75±0.15)将材料进行缓冲液交换。

使用预先润湿的(脱氧WFI)0.22μm过滤器将所得批次的稳定的血红蛋白原料药(Drug Substance)过滤到脱氧原料药容器中并转移至储存。散装DS储存在15-30℃直至进一步运输或使用。

实施例2：稳定的血红蛋白组合物的体外表征。

如实施例1中所述配制稳定的血红蛋白组合物，然后评估效力、纯度和身份。下表1中提供了示例性批次的稳定的血红蛋白组合物的说明性评价。如表1所示，对于所有测试指标，稳定的血红蛋白组合物的测试结果都在指定参数范围内。

a.表1：效力、纯度和身份测试结果

还对已用戊二醛交联并用NaBH₄还原的批次进行低聚物/八聚物/四聚物/二聚物分布的分析，证明具有不同水平的交联剂和还原剂的每种血红蛋白物质的可接受水平。结果如表2和图1所示。

b.表2：成分百分比比较

样品名称	低聚物(％)	八聚体(％)	四聚体(％)	二聚体(％)
					OXP006_2_S2	42.11	21.46	30.42	6.01
OXP006_2_S3	45.33	20.40	28.72	5.56
					OXP006_2_S4	47.23	20.38	27.25	5.14
OXP006_2_T194	49.62	19.92	26.06	4.40
					OXP006_2_S5	50.12	19.62	26.04	4.22
OXP006_2_S6	50.07	19.66	26.01	4.26
					OXP006_2_S7	50.05	19.73	26.15	4.07
OXP006_2_T201	49.86	19.75	26.10	4.29
					OXP006_2_T234	50.18	19.59	25.69	4.53

实施例3：人用高度浓缩的稳定的血红蛋白溶液的体外表征。

如实施例2中那样测试浓度在150g/L和200g/L之间的高度浓缩的稳定的血红蛋白溶液的效力、纯度、身份和成分分布。结果揭示了每个测试参数的可接受值。

实施例4：稳定的血红蛋白组合物在麻醉动物中的药代动力学。

动物：

在所有实验中使用雄性Wistar大鼠(300-400g体重)。动物购自Charles River(Margate,Kent UK)，并在抵达University College London时被证明是健康且无病原体的。实验前一周，将动物饲养在标准笼子中，每笼四只，光照/黑暗周期为12小时，随意进食和饮水。

外科手术：

所有动物都在室内空气中用异氟烷麻醉(Abbott,Maidenhead,Berks,UK)；5％用于诱导，2％用于外科手术，1.5％用于维持。将它们放在加热垫上(Harvard Apparatus，Cambridge，Cambs，UK)以将直肠温度保持在37℃。对于麻醉模型，左颈总动脉和右颈内静脉使用外径为0.96mm的PVC导管(Scientific Commodities Inc.,Lake Havasu City,AZ,USA)插管。动脉线连接到压力传感器(Powerlab；AD Instruments，Chalgrove，Oxon，UK)以连续监测平均动脉血压，静脉线用于施用乳酸盐林格溶液±稳定的血红蛋白组合物。气管被插管以吸引和保护这些自主呼吸动物的气道。通过钥匙孔剖腹手术(keyholelaparotomy)对膀胱插管以测量尿量和稳定的血红蛋白组合物的肾排泄。使用光纤探头和OxyliteTM系统(Oxford Optronix，Oxon，UK)测量肝脏中的组织氧分压(tPO₂)。选择这种组织床是因为它对血流动力学扰动和心肺挑战最灵敏。通过将传感器(通过钥匙孔剖腹手术)放置在两个肺叶之间的密封袋中来监测肝脏tPO₂。在这些非恢复性实验中，在实验结束时使用IV戊巴比妥钠进行安乐死。

麻醉剂量发现和药代动力学研究：

在手术和30分钟的稳定期后，动物接受稳定的血红蛋白组合物(n＝6)或等效体积的乳酸盐林格溶液(2.5ml/kg；n＝6)的递增IV输注，施用15分钟(图2)。稳定的血红蛋白成分补充乳酸盐林格溶液(通过Y形连接器)，使得总输注速率为10ml/kg/h。使用HarvardApparatus流体泵、21号针和(5ml)Terumo注射器，检查50、100和200mg/kg稳定血红蛋白组合物的输注，其中每30分钟增加一次剂量。在最高输注后，将动物维持三个小时。

如表3和图2中详述的，在基线(即，输注前)，进行一系列测量。另外进行尿液和血液采样以用于基线药代动力学测量。将全血(0.3ml)移入含有乙二胺四乙酸(EDTA)的注射器(最终浓度；2.5mM)并离心(1300x g)。然后将血浆级分冷冻在液氮中用于随后的分光光度分析，或者在可用时立即使用Hemocue装置进行处理。

在每次稳定的血红蛋白组合物输注的开始和结束时和在最高输注后长达三小时的频繁间隔采集血液用于药代动力学。动脉血气分析、生命体征和心血管性能测量在基线、每次输注结束时进行，然后每小时进行一次。在基线、最高输注结束时收集尿液，然后每小时收集一次。为了确定肾排泄分数，将使用质量平衡方法。这是通过计算尿液中排泄的稳定的血红蛋白组合物的摩尔数来实现的，表示为相对于注射摩尔数的分数。

表3：在麻醉动物研究中测量血浆和尿液中的心肺状态、组织氧张力和药代动力学。

在表3中，采用以下缩写：Ca2+，钙离子；Cl-，氯离子；Hb，血红蛋白；HCO3-，碳酸氢盐；K+，钾离子；PaO₂和PaCO₂，分别是二氧化碳和氧气的动脉分压。Oxy-Hb和met-Hb分别表示氧合血红蛋白和高铁血红蛋白。请注意，“血流速度”是收缩期血流速度峰值，是心脏收缩性标记。在对应于血浆药物水平的时间呈现组织氧张力。T＝时间，以分钟为单位。

结果：

根据前述描述进行研究。许多参数，包括血红蛋白、动脉PO₂、动脉PCO₂和氧合血红蛋白的水平，在整个实验过程中都保持在适当的范围内。

实施例5：稳定的血红蛋白组合物在清醒动物中的药代动力学研究。

外科手术：

对于恢复模型，如实施例4中详述的那样对动物进行麻醉。血管线(左颈总动脉和右颈内静脉)被插管并经皮下穿隧至颈背。它们连接到一个旋转系链系统，使动物在从麻醉中恢复后，可以在笼子周围畅通无阻地移动。丁丙诺啡(0.05mg/kg s.c.)用于镇痛，在手术开始时施用。

在清醒动物中的药代动力学研究：

在手术后30分钟的稳定期后评估生命体征、心脏性能和动脉血气分析。从动脉线中取出额外的血液用于药代动力学分析。在从麻醉中恢复后，在15分钟内给动物推注施用稳定的血红蛋白组合物(n＝6)或等体积的林格乳酸盐溶液(n＝6)，以达到0.3-0.4g/dl的稳定的血红蛋白组合物的血浆水平。根据实施例4的结果确定所需的剂量水平。在15分钟时再采集血样以确认血浆浓度。随后在24小时内连续输注以将血浆水平维持在0.3-0.4g/dl，并在3、6和24小时进行血液取样。在实验结束时(24小时)，重新麻醉动物；重新评估生命体征和心脏性能，并取出血液进行动脉血气和药代动力学测量。计划的测量也显示在表4和图3中。

药代动力学：

如果hemocue装置不可用，血浆和尿液样品的吸光度(λ577和635)将使用酶标仪和BioTek(Gen5)软件(Synergy 2,North Star Scientific,Sandy,Beds,UK)评估。在根据标准曲线推导后测量稳定的血红蛋白组合物的浓度(CMAX，TMAX)。典型组合物。根据实施例4的结果确定所需的剂量水平。在15分钟时再采集血样以确认血浆浓度。随后在24小时内连续输注以将血浆水平维持在0.3-0.4g/dl，并在3、6和24小时进行血液取样。在实验结束时(24小时)，重新麻醉动物；重新评估生命体征和心脏性能，并取出血液进行动脉血气和药代动力学测量。计划的测量也显示在表4和图3中。

药代动力学：

如果hemocue装置不可用，血浆和尿液样品的吸光度(λ577和635)将使用酶标仪和BioTek(Gen5)软件(Synergy 2,North Star Scientific,Sandy,Beds,UK)评估。在根据标准曲线推导后测量稳定的血红蛋白组合物的浓度(CMAX，TMAX)。典型的氧合血红蛋白吸收光谱在541nm和更显著的577nm处显示出明显的峰。氧化后，氧合血红蛋白(Fe2+)转化为高铁血红蛋白(Fe3+)；它在577nm处吸收较少，在635nm处有一个额外的吸收峰。如果在635nm处发现任何吸光度，表明存在高铁血红蛋白(在稳定的血红蛋白组合物或血浆/尿液样品中)，则采用Drabkin方法确保测量总血红蛋白。

如下进行Drabkin的方法(如果需要)：

(1)通过添加K-铁氰化物(0.6mM)将所有血红蛋白转化为高铁血红蛋白。

(2)添加氰化钾(0.77mM)以将所有高铁血红蛋白转化为氰化高铁血红蛋白。

(3)用分光光度法在540nm处测定氰化铁血红蛋白。

数据和统计：

动物被随机(抽签)分配以接受稳定的血红蛋白组合物(n＝6)或以充当对照(林格乳酸盐；n＝6)。数据表示为平均值±标准误差或中位数、四分位数和范围。预期的统计分析包括双向重复测量方差分析，然后是Bonferroni的事后检验。药代动力学数据(半衰期和暴露量的测定；AUC)使用一相或两相衰减曲线和最小二乘拟合法计算。所有统计分析都是双尾的，并使用Prism 7.0.1软件(GraphPad Software，San Diego，CA)进行。多重性调整的p值<0.05被认为具有统计学意义。

实施例4和5中描述的示例性体内研究也用浓度为150g/L-200g/L的高度浓缩和稳定的血红蛋白组合物进行。

表4：研究2中心肺状态和血浆药物水平的测量。

缩写按照表3。T＝时间，以小时为单位。

前述说明了实施本发明的一些可能性。深度指示器的许多其他实施方案和使用领域是可能的并且在本发明的范围和精神内。因此，旨在将前述描述视为说明性而非限制性的。

序列表

<110> 医疗技术协会第二股份有限公司

<120> 稳定的血红蛋白组合物及其药物制剂

<130> MTAI-001/00US 335776-2003

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 142

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 血红蛋白亚单位α

<400> 1

Met Val Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly

1 5 10 15

Lys Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg

20 25 30

Met Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp

35 40 45

Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Lys Lys Val Ala

50 55 60

Asp Ala Leu Thr Asn Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro Asn Ala

65 70 75 80

Leu Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro

85 90 95

Val Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala

100 105 110

His Leu Pro Ala Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys

115 120 125

Phe Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg

130 135 140

<210> 2

<211> 575

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 血红蛋白亚单位α

<400> 2

actcttctgg tccccacaga ctcagagaga acccaccatg gtgctgtctc ctgccgacaa 60

gaccaacgtc aaggccgcct ggggcaaggt tggcgcgcac gctggcgagt atggtgcgga 120

ggccctggag aggatgttcc tgtccttccc caccaccaag acctacttcc cgcacttcga 180

cctgagccac ggctctgccc aggttaaggg ccacggcaag aaggtggccg acgcgctgac 240

caacgccgtg gcgcacgtgg acgacatgcc caacgcgctg tccgccctga gcgacctgca 300

cgcgcacaag cttcgggtgg acccggtcaa cttcaagctc ctaagccact gcctgctggt 360

gaccctggcc gcccacctcc ccgccgagtt cacccctgcg gtgcacgcct ccctggacaa 420

gttcctggct tctgtgagca ccgtgctgac ctccaaatac cgttaagctg gagcctcggt 480

agcagttcct cctgccagat gggcctccca acgggccctc ctcccctcct tgcaccggcc 540

cttcctggtc tttgaataaa gtctgagtgg gcggc 575

<210> 3

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 血红蛋白亚单位β

<400> 3

Met Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp

1 5 10 15

Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu

20 25 30

Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp

35 40 45

Leu Ser Thr Pro Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His

50 55 60

Gly Lys Lys Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp

65 70 75 80

Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ala Thr Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys

85 90 95

Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val

100 105 110

Cys Val Leu Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln

115 120 125

Ala Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His

130 135 140

Lys Tyr His

145

<210> 4

<211> 628

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 血红蛋白亚单位β

<400> 4

acatttgctt ctgacacaac tgtgttcact agcaacctca aacagacacc atggtgcatc 60

tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac gtggatgaag 120

ttggtggtga ggccctgggc aggctgctgg tggtctaccc ttggacccag aggttctttg 180

agtcctttgg ggatctgtcc actcctgatg ctgttatggg caaccctaag gtgaaggctc 240

atggcaagaa agtgctcggt gcctttagtg atggcctggc tcacctggac aacctcaagg 300

gcacctttgc cacactgagt gagctgcact gtgacaagct gcacgtggat cctgagaact 360

tcaggctcct gggcaacgtg ctggtctgtg tgctggccca tcactttggc aaagaattca 420

ccccaccagt gcaggctgcc tatcagaaag tggtggctgg tgtggctaat gccctggccc 480

acaagtatca ctaagctcgc tttcttgctg tccaatttct attaaaggtt cctttgttcc 540

ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc ttgagcatct ggattctgcc 600

taataaaaaa catttatttt cattgcaa 628

<210> 5

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 血红蛋白亚单位γ

<400> 5

Met Gly His Phe Thr Glu Glu Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ser Leu Trp

1 5 10 15

Gly Lys Val Asn Val Glu Asp Ala Gly Gly Glu Thr Leu Gly Arg Leu

20 25 30

Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Asp Ser Phe Gly Asn

35 40 45

Leu Ser Ser Ala Ser Ala Ile Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His

50 55 60

Gly Lys Lys Val Leu Thr Ser Leu Gly Asp Ala Ile Lys His Leu Asp

65 70 75 80

Asp Leu Lys Gly Thr Phe Ala Gln Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys

85 90 95

Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Lys Leu Leu Gly Asn Val Leu Val

100 105 110

Thr Val Leu Ala Ile His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Glu Val Gln

115 120 125

Ala Ser Trp Gln Lys Met Val Thr Gly Val Ala Ser Ala Leu Ser Ser

130 135 140

Arg Tyr His

145

<210> 6

<211> 586

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 血红蛋白亚单位γ

<400> 6

acactcgctt ctggaacgtc tgaggttatc aataagctcc tagtccagac gccatgggtc 60

atttcacaga ggaggacaag gctactatca caagcctgtg gggcaaggtg aatgtggaag 120

atgctggagg agaaaccctg ggaaggctcc tggttgtcta cccatggacc cagaggttct 180

ttgacagctt tggcaacctg tcctctgcct ctgccatcat gggcaacccc aaagtcaagg 240

cacatggcaa gaaggtgctg acttccttgg gagatgccat aaagcacctg gatgatctca 300

agggcacctt tgcccagctg agtgaactgc actgtgacaa gctgcatgtg gatcctgaga 360

acttcaagct cctgggaaat gtgctggtga ccgttttggc aatccatttc ggcaaagaat 420

tcacccctga ggtgcaggct tcctggcaga agatggtgac tggagtggcc agtgccctgt 480

cctccagata ccactgagct cactgcccat gatgcagagc tttcaaggat aggctttatt 540

ctgcaagcaa tcaaataata aatctattct gctaagagat cacaca 586

<210> 7

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 血红蛋白亚单位γ

<400> 7

Met Gly His Phe Thr Glu Glu Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ser Leu Trp

1 5 10 15

Gly Lys Val Asn Val Glu Asp Ala Gly Gly Glu Thr Leu Gly Arg Leu

20 25 30

Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Asp Ser Phe Gly Asn

35 40 45

Leu Ser Ser Ala Ser Ala Ile Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His

50 55 60

Gly Lys Lys Val Leu Thr Ser Leu Gly Asp Ala Thr Lys His Leu Asp

65 70 75 80

Asp Leu Lys Gly Thr Phe Ala Gln Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys

85 90 95

Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Lys Leu Leu Gly Asn Val Leu Val

100 105 110

Thr Val Leu Ala Ile His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Glu Val Gln

115 120 125

Ala Ser Trp Gln Lys Met Val Thr Ala Val Ala Ser Ala Leu Ser Ser

130 135 140

Arg Tyr His

145

<210> 8

<211> 584

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 血红蛋白亚单位γ

<400> 8

acactcgctt ctggaacgtc tgaggttatc aataagctcc tagtccagac gccatgggtc 60

atttcacaga ggaggacaag gctactatca caagcctgtg gggcaaggtg aatgtggaag 120

atgctggagg agaaaccctg ggaaggctcc tggttgtcta cccatggacc cagaggttct 180

ttgacagctt tggcaacctg tcctctgcct ctgccatcat gggcaacccc aaagtcaagg 240

cacatggcaa gaaggtgctg acttccttgg gagatgccac aaagcacctg gatgatctca 300

agggcacctt tgcccagctg agtgaactgc actgtgacaa gctgcatgtg gatcctgaga 360

acttcaagct cctgggaaat gtgctggtga ccgttttggc aatccatttc ggcaaagaat 420

tcacccctga ggtgcaggct tcctggcaga agatggtgac tgcagtggcc agtgccctgt 480

cctccagata ccactgagct cactgcccat gattcagagc tttcaaggat aggctttatt 540

ctgcaagcaa tacaaataat aaatctattc tgctgagaga tcac 584

Claims (106)

1.组合物，其包含：浓度介于150克(g)/升(L)(g/L)和200g/L之间并且包括端点的稳定的血红蛋白，其中所述组合物包含小于0.02毫克/毫升(mg/mL)的溶解氧。

2.组合物，其包含稳定的血红蛋白，其中所述稳定的血红蛋白包括：

总血红蛋白的20-35％为四聚体形式；

总血红蛋白的15-20％为八聚体形式；

总血红蛋白的40-55％为多于八聚体形式；

总血红蛋白的小于5％为二聚体形式；或

其任何组合。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物包含小于0.02mg/mL的溶解氧。

4.根据权利要求2或3所述的组合物，其中所述稳定的血红蛋白浓度介于70和200克/升(g/L)之间并且包括端点。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述稳定的血红蛋白浓度介于150和200g/L之间并且包括端点。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述稳定的血红蛋白通过与选自以下的至少一种稳定剂接触而稳定：戊二醛、丁二醛、聚氧乙烯和葡聚糖的活化形式、α-羟基醛、乙醇醛、N-马来酰亚胺-6-氨基己酰基-(2'-硝基,4'-磺酸)-苯基酯、间马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯、磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯、琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯、磺基琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N,N'-苯二马来酰亚胺、双亚胺化合物、酰基二叠氮化合物、芳基二卤化物及其组合。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述组合物在选自以下的温度下是稳定的：环境温度、冷藏、高于至少4℃的温度或低于30℃的温度。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中大于约80％的稳定的化血红蛋白具有68千道尔顿至500千道尔顿的分子量分布。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含制剂缓冲剂，所述制剂缓冲剂包含硼酸盐、抗氧化剂和电解质中的一种或多种。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述硼酸盐是还原的。

11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述抗氧化剂包含N-乙酰-L-半胱氨酸。

12.根据权利要求9所述的组合物，其中所述电解质包含Na、Cl和/或K。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含小于0.05个内毒素单位(EU)/毫升(mL)(EU/mL)。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中所述血红蛋白包括从人、人细胞或人细胞系分离或衍生的血红蛋白。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述血红蛋白是从不超过100个可变来源中分离或衍生的。

16.根据权利要求14或15所述的组合物，其中所述血红蛋白是在收获后15天内从收获的红细胞中分离或衍生的。

17.根据权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中所述血红蛋白包括从非人动物、非人细胞或非人细胞系中分离或衍生的血红蛋白。

18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述血红蛋白是在收获后10天内从收获的红细胞中分离或衍生的。

19.根据权利要求17所述的组合物，其中所述非人动物是非人脊椎动物、非人灵长类动物、鲸类动物、哺乳动物、爬行动物、鸟类、两栖动物或鱼类。

20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述非人动物是牛种。

21.根据权利要求19所述的组合物，其中所述非人动物是羊种。

22.根据权利要求19所述的组合物，其中所述非人动物是鼬科动物、圈养鼬科动物、啮齿动物、圈养啮齿动物、猛禽或圈养鸟类。

23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述圈养鸟类属于鹦形目、雀形目或鸽形目。

24.根据权利要求19-23中任一项所述的组合物，其中所述非人动物不是为食用而饲养的雏鸟。

25.根据权利要求1-24中任一项所述的组合物，其中所述血红蛋白包含：

(a)亚单位阿尔法(α)，其中所述亚单位α包含以下的氨基酸序列

1 MVLSPADKTN VKAAWGKVGA HAGEYGAEAL ERMFLSFPTT KTYFPHFDLS HGSAQVKGHG

61 KKVADALTNA VAHVDDMPNA LSALSDLHAH KLRVDPVNFK LLSHCLLVTL AAHLPAEFTP

121 AVHASLDKFL ASVSTVLTSK YR(SEQ ID NO:1),

或与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％同一性的序列，

或其中所述亚单位α由以下的核酸序列编码

1 actcttctgg tccccacaga ctcagagaga acccaccatg gtgctgtctc ctgccgacaa

61 gaccaacgtc aaggccgcct ggggcaaggt tggcgcgcac gctggcgagt atggtgcgga

121 ggccctggag aggatgttcc tgtccttccc caccaccaag acctacttcc cgcacttcga

181 cctgagccac ggctctgccc aggttaaggg ccacggcaag aaggtggccg acgcgctgac

241 caacgccgtg gcgcacgtgg acgacatgcc caacgcgctg tccgccctga gcgacctgca

301 cgcgcacaag cttcgggtgg acccggtcaa cttcaagctc ctaagccact gcctgctggt

361 gaccctggcc gcccacctcc ccgccgagtt cacccctgcg gtgcacgcct ccctggacaa

421 gttcctggct tctgtgagca ccgtgctgac ctccaaatac cgttaagctg gagcctcggt

481 agcagttcct cctgccagat gggcctccca acgggccctc ctcccctcct tgcaccggcc

541 cttcctggtc tttgaataaa gtctgagtgg gcggc(SEQ ID NO:2),

或与SEQ ID NO:2的序列具有至少90％同一性的序列；或

(b)亚单位贝塔(β)，其中所述亚单位β包含以下的氨基酸序列

1 MVHLTPEEKS AVTALWGKVN VDEVGGEALG RLLVVYPWTQ RFFESFGDLS TPDAVMGNPK

61 VKAHGKKVLG AFSDGLAHLD NLKGTFATLS ELHCDKLHVD PENFRLLGNV LVCVLAHHFG

121 KEFTPPVQAA YQKVVAGVAN ALAHKYH(SEQ ID NO:3),

或与SEQ ID NO:3的序列具有至少90％同一性的序列，

或其中所述亚单位β由以下的核酸序列编码

1 acatttgctt ctgacacaac tgtgttcact agcaacctca aacagacacc atggtgcatc

61 tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac gtggatgaag

121 ttggtggtga ggccctgggc aggctgctgg tggtctaccc ttggacccag aggttctttg

181 agtcctttgg ggatctgtcc actcctgatg ctgttatggg caaccctaag gtgaaggctc

241 atggcaagaa agtgctcggt gcctttagtg atggcctggc tcacctggac aacctcaagg

301 gcacctttgc cacactgagt gagctgcact gtgacaagct gcacgtggat cctgagaact

361 tcaggctcct gggcaacgtg ctggtctgtg tgctggccca tcactttggc aaagaattca

421 ccccaccagt gcaggctgcc tatcagaaag tggtggctgg tgtggctaat gccctggccc

481 acaagtatca ctaagctcgc tttcttgctg tccaatttct attaaaggtt cctttgttcc

541 ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc ttgagcatct ggattctgcc

601 taataaaaaa catttatttt cattgcaa(SEQ ID NO:4),

或与SEQ ID NO:4的序列具有至少90％同一性的序列；

(c)亚单位伽马(γ)，其中所述亚单位γ包含以下的氨基酸序列

1 MGHFTEEDKA TITSLWGKVN VEDAGGETLG RLLVVYPWTQ RFFDSFGNLS SASAIMGNPK

61 VKAHGKKVLT SLGDAIKHLD DLKGTFAQLS ELHCDKLHVD PENFKLLGNV LVTVLAIHFG

121 KEFTPEVQAS WQKMVTGVAS ALSSRYH(SEQ ID NO:5),

或与SEQ ID NO:5的序列具有至少90％同一性的序列，或

其中所述亚单位γ由以下的核酸序列编码

1 acactcgctt ctggaacgtc tgaggttatc aataagctcc tagtccagac gccatgggtc

61 atttcacaga ggaggacaag gctactatca caagcctgtg gggcaaggtg aatgtggaag

121 atgctggagg agaaaccctg ggaaggctcc tggttgtcta cccatggacc cagaggttct

181 ttgacagctt tggcaacctg tcctctgcct ctgccatcat gggcaacccc aaagtcaagg

241 cacatggcaa gaaggtgctg acttccttgg gagatgccat aaagcacctg gatgatctca

301 agggcacctt tgcccagctg agtgaactgc actgtgacaa gctgcatgtg gatcctgaga

361 acttcaagct cctgggaaat gtgctggtga ccgttttggc aatccatttc ggcaaagaat

421 tcacccctga ggtgcaggct tcctggcaga agatggtgac tggagtggcc agtgccctgt

481 cctccagata ccactgagct cactgcccat gatgcagagc tttcaaggat aggctttatt

541 ctgcaagcaa tcaaataata aatctattct gctaagagat cacaca(SEQ ID NO:6),

或与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％同一性的序列；或

(d)亚单位伽马(γ)，其中所述亚单位γ包含以下的氨基酸序列

1 MGHFTEEDKA TITSLWGKVN VEDAGGETLG RLLVVYPWTQ RFFDSFGNLS SASAIMGNPK

61 VKAHGKKVLT SLGDATKHLD DLKGTFAQLS ELHCDKLHVD PENFKLLGNV LVTVLAIHFG

121 KEFTPEVQAS WQKMVTAVAS ALSSRYH(SEQ ID NO:7),

或与SEQ ID NO:7的序列具有至少90％同一性的序列，或

其中所述亚单位γ由以下的核酸序列编码

1 acactcgctt ctggaacgtc tgaggttatc aataagctcc tagtccagac gccatgggtc

61 atttcacaga ggaggacaag gctactatca caagcctgtg gggcaaggtg aatgtggaag

121 atgctggagg agaaaccctg ggaaggctcc tggttgtcta cccatggacc cagaggttct

181 ttgacagctt tggcaacctg tcctctgcct ctgccatcat gggcaacccc aaagtcaagg

241 cacatggcaa gaaggtgctg acttccttgg gagatgccac aaagcacctg gatgatctca

301 agggcacctt tgcccagctg agtgaactgc actgtgacaa gctgcatgtg gatcctgaga

361 acttcaagct cctgggaaat gtgctggtga ccgttttggc aatccatttc ggcaaagaat

421 tcacccctga ggtgcaggct tcctggcaga agatggtgac tgcagtggcc agtgccctgt

481 cctccagata ccactgagct cactgcccat gattcagagc tttcaaggat aggctttatt

541 ctgcaagcaa tacaaataat aaatctattc tgctgagaga tcac(SEQ ID NO:8),

或与SEQ ID NO:8的序列具有至少90％同一性的序列。

26.根据权利要求1-25中任一项所述的组合物，其中所述组合物在环境温度下是稳定的。

27.根据权利要求1-26中任一项所述的组合物，其中所述组合物在冷藏温度下是稳定的。

28.根据权利要求1-27中任一项所述的组合物，其中所述组合物在高于至少4℃的温度下是稳定的。

29.根据权利要求1-28中任一项所述的组合物，其中所述组合物在低于30℃的温度下是稳定的。

30.根据权利要求13-29中任一项所述的组合物，其中所述内毒素包括细胞脂质、细胞脂质层或脂多糖。

31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述细胞脂质、细胞脂质层或脂多糖来自人细胞。

32.根据权利要求30所述的组合物，其中所述细胞脂质、细胞脂质层或脂多糖来自非人脊椎动物细胞。

33.根据权利要求30所述的组合物，其中所述细胞脂质、细胞脂质层或脂多糖来自微生物。

34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述细胞脂质、细胞脂质层或脂多糖来自细菌。

35.根据权利要求1-34中任一项所述的组合物，其中所述稳定的血红蛋白是非天然存在的。

36.根据权利要求1-35中任一项所述的组合物，其中所述稳定的血红蛋白是聚合的。

37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述稳定的血红蛋白与醛交联形成聚戊二醛血红蛋白(hemoglobin glutamer)。

38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述醛是戊二醛。

39.根据权利要求1-38中任一项所述的组合物，其中所述稳定的血红蛋白具有70-200千道尔顿(kDa)的平均分子量。

40.根据权利要求1-39中任一项所述的组合物，其中所述稳定的血红蛋白在500kDa上具有小于15％的分子量分布。

41.根据权利要求1-40中任一项所述的组合物，其中所述稳定的血红蛋白在用稳定剂稳定之前已经基本上脱氧。

42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述稳定包括聚合。

43.根据权利要求41或42所述的组合物，其中所述稳定包括还原所述稳定剂。

44.根据权利要求1-43中任一项所述的组合物，其中通过过滤和/或用电解质溶液渗滤来浓缩所述稳定的血红蛋白。

45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述电解质溶液是生理电解质溶液。

46.根据权利要求44或45所述的组合物，其中所述过滤是超滤。

47.根据权利要求45所述的组合物，其中所述电解质溶液使高铁血红蛋白(MetHb)的形成最小化。

48.根据权利要求44-47中任一项所述的组合物，其中所述电解质溶液包含N-乙酰基-L-半胱氨酸。

49.根据权利要求1-48中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含：

(a)小于10％的MetHb，任选地小于6％的MetHb；和/或

(b)小于10％的血红蛋白二聚体，任选地小于6％的血红蛋白二聚体。

50.根据权利要求49所述的组合物，其中通过一氧化碳测氧法测量所述MetHb的水平。

51.根据权利要求49所述的组合物，其中通过尺寸分离技术测量血红蛋白二聚体的水平。

52.根据权利要求1-51中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少20％的稳定的活性四聚体血红蛋白，任选地25％至35％的稳定的活性四聚体血红蛋白。

53.根据权利要求1-52中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少60％的大于四聚体分子量的血红蛋白低聚物，任选地至少70％的大于四聚体分子量的血红蛋白低聚物。

54.根据权利要求1-53中任一项所述的组合物，其中所述稳定的血红蛋白具有比非稳定的血红蛋白或含氧血红蛋白更长的半衰期并且使四聚体血红蛋白分解成引起肾毒性的二聚体最小化。

55.根据权利要求1-54中任一项所述的组合物，其中所述稳定的血红蛋白包含体外合成的至少一种亚单位。

56.根据权利要求55所述的组合物，其中所述至少一个亚单位包括伽马(γ)亚单位。

57.根据权利要求1-56中任一项所述的组合物，其中所述稳定的血红蛋白不是从人胎儿中分离的。

58.药物制剂，其包含根据权利要求1-57中任一项所述的组合物，其中所述药物制剂还包含药学上可接受的赋形剂、药学上可接受的溶剂或药学上可接受的载体。

59.根据权利要求58所述的药物制剂，其中所述组合物被配制用于静脉内注射。

60.根据权利要求58所述的药物制剂，其中所述组合物被配制用于骨内注射。

61.注射装置，其包含根据权利要求1-57中任一项所述的组合物。

62.注射装置，其包含根据权利要求58-60中任一项所述的药物制剂。

63.根据权利要求61或62所述的注射装置，其中所述装置包括针、注射笔、静脉内(IV)线、中心IV线、注射器、导管和血液交换和/或过滤装置中的一种或多种。

64.根据权利要求61-63中任一项所述的注射装置，其中所述装置旨在供非医学专业人员的个体施用。

65.根据权利要求64所述的注射装置，其中所述装置包括预加载的自注射装置。

66.根据权利要求62-65中任一项所述的注射装置，其中所述装置包含一种或多种治疗有效剂量的药物制剂。

67.根据权利要求62-65中任一项所述的注射装置，其中所述装置包含一个或多个单位剂量的药物制剂。

68.根据权利要求67所述的注射装置，其中所述一个或多个单位剂量包括介于10mL和30mL之间并且包括端点的体积。

69.根据权利要求68所述的注射装置，其中所述一个或多个单位剂量包括介于18mL和25mL之间并且包括端点的体积。

70.根据权利要求61-69中任一项所述的注射装置，其中所述注射装置包括计量装置。

71.根据权利要求61-70中任一项所述的注射装置，其中所述注射装置可操作地连接到计量装置。

72.根据权利要求61-71中任一项所述的注射装置，其中所述注射装置可以连接到计量装置。

73.根据权利要求61-72中任一项所述的注射装置，其中所述注射装置包含滴定剂量。

74.根据权利要求61-73中任一项所述的注射装置，其中所述注射装置包括一个或多个隔室，每个隔室能够维持预加载体积的根据权利要求1-57中任一项所述的组合物，并且每个隔室能够将不同体积的组合物递送至受试者，其中每个隔室中的组合物体积可以同时或依次递送。

75.根据权利要求61-74中任一项所述的注射装置，其中所述注射装置包括一个或多个隔室，每个隔室能够包含不同量的所述制剂缓冲剂以选择性地将所述组合物稀释至每个隔室的预定最终浓度。

76.根据权利要求1-57中任一项所述的组合物用于治疗有需要的受试者的用途。

77.根据权利要求58-60中任一项所述的药物制剂用于治疗有需要的受试者的用途。

78.根据权利要求61-75中任一项所述的注射装置用于治疗有需要的受试者的用途。

79.根据权利要求76-78中任一项所述的用途，其中所述受试者是缺氧和/或贫血的。

80.根据权利要求76-79中任一项所述的用途，其中所述受试者经历了因受伤而失血、因医学干预而失血、溶血或造血减少。

81.根据权利要求76-80中任一项所述的用途，其中所述受试者是人。

82.根据权利要求76-80中任一项所述的用途，其中所述受试者是非人动物。

83.根据权利要求82所述的用途，其中所述非人动物是非人脊椎动物、非人灵长类动物、鲸类动物、哺乳动物、爬行动物、鸟类、两栖动物或鱼类。

84.根据权利要求82或83所述的用途，其中所述非人动物是牛。

85.根据权利要求82或83所述的用途，其中所述非人动物是鼬科动物、圈养鼬科动物、啮齿动物、圈养啮齿动物、猛禽或圈养鸟类。

86.根据权利要求85所述的用途，其中所述圈养鸟类属于鹦形目、雀形目或鸽形目。

87.治疗病症的方法，包括向有需要的受试者施用根据权利要求1-57中任一项所述的组合物。

88.根据权利要求87所述的方法，其中所述施用包括以一个或多个剂量向所述受试者提供治疗有效量的所述组合物。

89.治疗病症的方法，包括向有需要的受试者施用根据权利要求58-60中任一项所述的药物制剂。

90.根据权利要求89所述的方法，其中所述施用包括以一个或多个剂量向所述受试者提供治疗有效量的所述药物制剂。

91.治疗病症的方法，包括向有需要的受试者提供根据权利要求61-75中任一项所述的注射装置，其中所述装置将所述组合物注射到所述受试者中，从而治疗所述受试者。

92.根据权利要求91所述的方法，其中所述注射装置包含治疗有效量的所述组合物。

93.根据权利要求91或92所述的方法，其中所述注射装置包含一个或多个剂量的所述组合物。

94.根据权利要求91-93中任一项所述的方法，其中所述注射装置通过从所述一个或多个隔室中的每一个依次注射：

(a)分别增加或减少体积的根据权利要求1-57中任一项所述的组合物，或

(b)分别增加或减少浓度的根据权利要求1-57中任一项所述的组合物，

来提供递增或递减剂量方案。

95.根据权利要求91-94中任一项所述的方法，其中所述注射装置通过从所述一个或多个隔室中的每一个依次注射：

(a)分别增加或减少体积的根据权利要求51-53中任一项所述的药物制剂，或

(b)分别增加或减少浓度的根据权利要求51-53中任一项所述的药物制剂，

来提供递增或递减剂量方案。

96.根据权利要求87-95中任一项所述的方法，其中所述病症是缺氧和/或贫血。

97.根据权利要求87-96中任一项所述的方法，其中所述受试者是缺氧和/或贫血的。

98.根据权利要求97所述的方法，其中所述受试者经历了因受伤而失血、因医学干预而失血、溶血或造血减少。

99.根据权利要求87-98中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

100.根据权利要求87-98中任一项所述的方法，其中所述受试者是非人动物。

101.根据权利要求100所述的方法，其中所述非人动物是非人脊椎动物、非人灵长类动物、鲸类动物、哺乳动物、爬行动物、鸟类、两栖动物或鱼类。

102.根据权利要求100或101所述的方法，其中所述非人动物是牛。

103.根据权利要求100或101所述的方法，其中所述非人动物是鼬科动物、圈养鼬科动物、啮齿动物、圈养啮齿动物、猛禽或圈养鸟类。

104.根据权利要求103所述的方法，其中所述圈养鸟类属于鹦形目、雀形目或鸽形目。

105.根据权利要求87-104中任一项所述的方法，其中所述组合物、药物制剂或注射剂以重复的给药方案施用于所述受试者。

106.根据权利要求105所述的方法，其中施用重复剂量以实现和/或维持0.3-0.4g/dL的稳定的血红蛋白的血浆浓度。

Images