CN102124346B - 凝血酶底物和测定样本中生物活性凝血酶水平的测定法 - Google Patents

凝血酶底物和测定样本中生物活性凝血酶水平的测定法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及凝血酶底物和测定样本中生物活性凝血酶水平的测定法。所述底物具有以下通式：A-X-Z-A’，其中A或A’之一包括发光螯合物，例如镧系元素螯合物。A或A’的另一个包括结合配对的第一配偶体，例如生物素和任选间隔基。X形成三或四肽，例如X’-Phe-Aze-Arg、X’-Phe-Pip-Arg和X’-Phe-Pro-Arg，其中X不存在或选自Lys、Ahx、Ile和Val。Z包括连接基，例如二胺连接基。

Description

凝血酶底物和测定样本中生物活性凝血酶水平的测定法
本发明涉及新颖的凝血酶底物和测定样本中生物活性凝血酶水平的测定法。
凝血酶由活化的因子X(Xa)酶切凝血酶原上的两个位点产生。
凝血酶将纤维蛋白原转化为活化形式，其组装为纤维蛋白。凝血酶还激活因子XI、因子V和因子VIII。该正反馈加速凝血酶的产生。
因子XIII也可由凝血酶激活。因子XIIIa为转谷氨酰胺酶，其催化纤维蛋白中的赖氨酸和谷氨酰胺残基之间形成共价键。该共价键增加纤维蛋白凝块的稳定性。
除了其在凝血级联中的活性，凝血酶还经过激活血小板上蛋白酶活化的受体促进血小板的激活。
在临床实践中，凝血酶原时间(PT)的测量，即血液变为凝块所花的时间，以活化部分凝血激酶时间(APTT)和活化凝血时间(ACT)的方式，广泛用于筛选凝血途径的缺陷以及监测抗凝血治疗。
为了标准化凝血测试的结果，设计了国际标准化比率(INR)的概念。各组织因子(tissue factor)的生产商为其生产的任何组织因子给出ISI(国际敏感指数，International Sensitivity Index)。所述ISI值指示特定批次的组织因子与国际标准化样本之间的比较。INR为患者的凝血酶原时间与对照样本的凝血酶原时间的比值，再运算所用促凝血酶原激酶试剂的ISI值的乘方。
INR=(PT测试/PT标准)ISI
对于PT的测量现有两种可用的测定法。
一种测定法为凝血计量法(coagulometric)，其根据由纤维蛋白原至纤维蛋白转化的凝块形成的终点。然而，该测定的结果是可变的，并特别地受患者中纤维蛋白原/纤维蛋白转化的干扰所影响。另一种测定为非凝血计量法(non-coagulometric)，其根据使用合成的、适合凝血酶裂解的底物。第二种测定的结果可变性较小并且不受纤维蛋白原水平的影响。
US4,061,625公开了以下通式的发色凝血酶底物：
D-Phe-环状亚氨基酸-Arg-pNA
其中环状亚氨基酸选自2-氮杂环丁烷羧酸、脯氨酸、2-哌啶羧酸，且pNA为p-硝基酰基苯胺(p-nitroanilide)。所述底物描述为适合定量测定凝血酶或适合其中凝血酶形成、抑制或消耗的反应的研究，或适合测定发挥影响的或参与该反应的因子，例如适合测定抗-凝血酶、凝血酶原和肝素。
当使用发色底物时，在大约405nm检测反应。在该波长下不可分析全血，因为全血自身有吸收。因此当所用样本类型为全血时发色底物不适用。
使用螯合物如镧系元素螯合物的时间分辨发光光谱已经在免疫测定和DNA杂交测定中应用多年。由于全血的吸收性质，与发色底物相比，该螯合物检测技术适用于当样本为全血时，因为该技术可在615nm测量吸光度，而在该波长，全血吸收较低。
该螯合物描述在US7,018,851B1中，其公开了适合时间分辨荧光计(TRF)应用的改进的荧光镧系元素螯合物。所述螯合物用于基于特异性生物亲和性的结合测定，例如免疫测定。
TRF为非常适合要求高灵敏度和广泛动力学范围的测定的检测技术。在使用常规荧光检测的免疫测定技术中，由光散射导致的高强度非-特异性背景例如来自样本的生物成分严重限制了测定的灵敏度。
所述荧光镧系元素螯合物传统上已经用于其中检测原理为基于捕捉和检测该螯合物的免疫测定中。相反，其尚未用于其中检测原理为基于裂解螯合物底物和检测测定中剩余的捕捉底物(未裂解的底物)的酶测定中。
该系统的主要特征为提供一方面稳定的、另一方面可特异性地被凝血酶裂解的底物。
因此，尚存在对酶底物的需求，其可特异性地被凝血酶裂解并包括具有长寿命的内在的稳定发光成分，因此便于检测全血并产生较少干扰。
另外，尚存在对测定法的需求，其快速、简便并容易进行，可变性低，容易自动化且成本低。
已经惊人地发现通过使用一些连接基将可特异性地被凝血酶裂解的肽与发光螯合物连接起来，提供了当样本类型为全血时可以使用的具有长寿命的稳定的底物。
在第一方面中，本发明为具有以下通式的凝血酶底物：
A-X-Z-A’
其中
A或A’之一包括发光螯合物，以及
A或A’的另一个包括结合配对(binding pair)的第一配偶体(partner)，任选包括间隔基，并经肽键连接至底物的剩余部分，
X形成三-或四-肽，其选自X’-Phe-Aze-Arg、X’-Phe-Pip-Arg和X’-Phe-Pro-Arg，其中
X’不存在或选自Lys、Ahx、Ile和Val，
Z为NH-R-Z’，其中
R选自C1-6亚烷基、C1-6亚烷基氧基、-S-C1-6亚烷基(C1-6thioalkylene)、-S-C1-6亚烷基氧基(C1-6thioalkylenoxy)、羰基-C1-6亚烷基、羰基-C1-6亚烷基氧基、C1-6亚烷基-羰基、C1-6亚烷基氧基-羰基、C1-6亚烷基-亚芳基、C1-6亚烷基氧基-亚芳基、C1-6亚烷基-NH、C1-6亚烷基氧基-NH、C1-6亚烷基-NHCO、C1-6亚烷基氧基-NHCO、C1-6亚烷基-CONH、C1-6亚烷基氧基-CONH、C1-6亚烷基-COS、C1-6亚烷基氧基-COS、C1-6亚烷基-CONH-C1-6亚烷基-亚芳基、亚芳基、亚芳基-C1-6亚烷基、亚芳基-C1-6亚烷基氧基、R1 a-亚芳基-(NHCO-R2)b、R3 c-亚芳基-(CONH-R4)d、(R5-CONH)e-亚芳基-R6 f和(R7-NHCO)g-亚芳基-R8 h，其中各个R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8在每次出现时独立地选自C1-6亚烷基、C1-6亚烷基氧基、-S-C1-6亚烷基、-S-C1-6亚烷基氧基、羰基-C1-6亚烷基、羰基-C1-6亚烷基氧基、C1-6亚烷基-羰基、亚芳基或亚芳基-C1-6亚烷基，且各个a、b、c、d、e、f、g和h独立地选自0至6的整数，
其中亚芳基为亚苯基、亚联苯基或亚萘基，其中亚苯基、亚联苯基或亚萘基任选被一个或多个取代基单-、二-或三-取代，所述取代基选自卤素、OH、SH、CN、NO2、C1-6烷基、C1-6烷氧基或C1-6烷氧基羰基，
Z’包括N、S和羰基之一，其中，
当Z’包括N时，Z’选自硫脲(-NH-CS-NH-)、氨基乙酰胺(-NH-CO-CH2-NH-)、酰胺(-NH-CO-)、甲基酰胺(-NCH3-CO-)或取代的-三嗪-二胺(-NH-(R9C3N3)-NH-)，
当Z’包括S时，Z’选自硫醚(-S-)、硫基乙酰胺(-S-CH2-CO-NH-)、二硫化物(-S-S-)、(-S-CO-CH2-NH-)或(-S-(R9C3N3)-NH-)，或
当Z’包括羰基时，Z’选自酰胺(-CO-NH-，-CO-NCH3-)或酯(-CO-O-)，
其中R9选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷硫基、C1-6烷氧基、C1-6硫代烷氧基、芳基氧基和氨基，其中烷基、烷硫基、烷氧基、硫代烷氧基或芳基氧基任选被单-、二-或三-取代，且其中氨基任选被一个或多个取代基单-或二-取代，所述取代基选自卤素、OH、SH、CN、NO2、C1-6烷基、C1-6烷氧基或C1-6烷氧基羰基。
在本发明上下文中，C1-6烷基是指具有1-6个碳原子的直链或支链基团，包括但不局限于，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基和己基。甲基、乙基、丙基和异丙基为优选基团。
在本发明的上下文中，C1-6亚烷基是指具有1-6个碳原子的直链或支链二价基团，包括但不局限于，亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、亚丁基、亚异丁基、亚叔丁基(t-butylene)、亚戊基和亚己基。亚甲基、亚乙基、亚丙基和亚异丙基为优选二价基团。
在本发明上下文中，C1-6烷氧基是指连接至氧原子的具有1-6个碳原子的直链或支链基团，包括但不局限于，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、戊氧基和己氧基。甲氧基、乙氧基和丙氧基为优选基团。
在本发明上下文中，C1-6亚烷基氧基是指连接至氧原子的具有1-6个碳原子的直链或支链二价基团、包括但不局限于、亚甲基氧基、亚乙基氧基、亚丙基氧基、亚异丙基氧基、亚丁基氧基、亚异丁基氧基、亚叔丁基氧基(t-butylenoxy)、亚戊基氧基和亚己基氧基。亚甲基氧基、亚乙基氧基和亚丙基氧基为优选二价基团。
在本发明上下文中，氨基酸残基具有其常规的三字母缩写。因此Ahx表示2-氨基己酸(正亮氨酸)、Ala表示丙氨酸、Arg表示精氨酸、Asn表示天冬酰胺、Asp表示天冬氨酸、Aze表示氮杂环丁烷-2-羧酸、Cys表示半胱氨酸、Gln表示谷氨酰胺、Glu表示谷氨酸、Gly表示甘氨酸、His表示组氨酸、Ile表示异亮氨酸、Leu表示亮氨酸、Lys表示赖氨酸、Met表示蛋氨酸、Phe表示苯丙氨酸、Pip表示哌啶-2-羧酸、Pro表示脯氨酸、Ser表示丝氨酸、Thr表示苏氨酸、Trp表示色氨酸、Tyr表示酪氨酸和Val表示缬氨酸。
在本发明上下文中，卤素表示氟、氯、溴或碘。
为了分离裂解的和未裂解的/完整的底物，根据本发明的底物必须能够附着在固定基质上。因此根据本发明的底物一端以结合配对的第一配偶体为末端，其可进一步与结合配对的第二配偶体结合。所述结合配对的第二配偶体固定在固定基质上。
根据本发明的底物可被凝血酶迅速裂解，且具有优良的特异性。其中心部分为小肽，即三-或四-肽，其在位于Arg-部分和Z-部分之间的易裂键(scissile bond)处被凝血酶裂解。
当样本为血浆时可使用根据本发明的底物，且由于其适用于样本为全血的情况因此其特别有利，因为所述底物由于使用了螯合物技术而可在615nm检测。
在根据本发明的一个实施方式中，所述底物中X’不存在，Phe为D-Phe和Arg为L-Arg。
在本发明的一个实施方式中，X为D-Phe-L-2-Aze-L-Arg或D-Phe-L-2-Pip-L-Arg。
这些底物已经显示提供快速裂解动力学和/或其对凝血酶的高度特异性。
在本发明的一个实施方式中，Z’为N且R为亚芳基、C1-6亚烷基-亚芳基或R1 a-亚芳基-(NHCO-R2)b，其中R1和R2如上文定义且a和b为0、1或2。
因此其中Z在易裂键处包括芳香部分的底物已经显示提供了优良的和快速裂解动力学。
在本发明的一个实施方式中，Z’为6-取代的-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(NH-(R9C3N3)-NH)或(S-(R9C3N3)-NH)键，其中R9选自氯、氟、乙氧基、2-甲氧基乙氧基、2-氰基乙氧基、2,2,2-三氟乙氧基、硫苯氧基(thiophenoxy)和乙氧基羰基硫甲氧基(ethoxycarbonylthiomethoxy)。
根据本发明的该实施方式的底物尤其对凝血酶特异。
在根据本发明的一个实施方式中，所述发光螯合物为荧光镧系元素螯合物。例如如US7,018,851B2所公开，该发光镧系元素螯合物提供了以下特点因此非常适合本发明：在合适的波长处的强吸收率、在相同配体结构中的几个分开的UV吸收部分、从UV吸收部分向镧系元素离子的有效能量转移、产生热力学稳定性和高动力学稳定性的强螯合部分、以及允许有效偶联螯合物以用作结合试剂、却不破坏其结合性质的功能基。
在根据本发明的一个优选的实施方式中，所述镧系元素螯合物A或A’选自：
Figure GDA0000363844390000061
和
Figure GDA0000363844390000062
而且，该螯合物可包括例如稳定的螯合物(包括吡啶的衍生物；联吡啶类、三联吡啶类或各种酚类化合物)作为能量传递(energy mediating)基团，以及多元羧酸作为螯合部分。另外，各种二羧酸根衍生物、大环笼状多醚(cryptates)、杯芳烃(calixarenes)、DTPA2-羟喹啉124(DTPA carbostril124)结合物以及大环希夫碱(Schiff’s base)已经公开在专利申请和/或专利中。
在本发明的一个实施方式中，所述结合配对选自生物素作为第一配偶体和链亲和素作为第二配偶体(生物素/链亲和素)、生物素/亲和素、生物素/生物素受体肽，和链亲和素衍生物/受体肽。
上述列出的结合配对是非穷尽的，并且包括任何能够固定本发明的底物至固定基质的结合配对。可市售获得的结合配对的实例包括但不限于，Strep-tag或Strep-tagII/Strep-Tactin或生物素/生物素受体肽。
在一个优选的实施方式中，所述第一配偶体为生物素。
在一个优选的实施方式中，所述第二配偶体为链亲和素。
固定基质为本领域熟练技术人员所知且包括大孔、微粒如珠，例如由例如聚苯乙烯或聚丙烯的塑料材料或玻璃制成。
在根据本发明的一个实施方式中，所述结合配对的第一配偶体经间隔基连接至底物的剩余部分。所述间隔基改善所述底物的溶解度，其特别有用于具有空间位阻的情况。因此间隔基的作用为溶解底物的肽/连接基/螯合物部分，以便降低会影响凝血酶的空间位阻。
在根据本发明的一个实施方式中，所述间隔基为式NH-R10-CONH-R11-CO-(NH-R12-NH)i，其中各个R10、R11和R12独立地选自C1-6亚烷基、C1-6亚烷基氧基、-S-C1-6亚烷基、-S-C1-6亚烷基氧基、羰基-C1-6亚烷基、羰基-C1-6亚烷基氧基、C1-6亚烷基-羰基、亚芳基或亚芳基-C1-6亚烷基，其中亚芳基为亚苯基、亚联苯基或亚萘基，其中亚苯基、亚联苯基或亚萘基任选被一个或多个取代基单-、二-或三-取代，所述取代基选自卤素、OH、SH、CN、NO2、C1-6烷基、C1-6烷氧基或C1-6烷氧基羰基，且i为0至6的整数，
在根据本发明的一个实施方式中，R10、R11和R12为相同的或不同的直链C1-6亚烷基、亚芳基或亚芳基-C1-6亚烷基，且i为0或1。
或者，所述间隔基为W个氨基酸组成的(W-mer)肽，其中W为1至40的整数。
在一个优选的实施方式中，根据本发明的底物选自：
Figure GDA0000363844390000081
Figure GDA0000363844390000091
Figure GDA0000363844390000101
Figure GDA0000363844390000111
Figure GDA0000363844390000121
Figure GDA0000363844390000131
根据本发明的底物可用于快速、简便并容易进行、可变性低、容易自动化且成本低的测定中。
与现有测定技术相比，本发明的底物提供了快速且精确的测定，本发明的测定不需要为使吸光度达到确定值所需要的时间。相反，与现有测定技术相比，测定时间可为较短时间，且使用时间分辨发光计测量发光信号。在一个优选的实施方式中，所述发光计为荧光计。甚至在较短时间仍可获得更精确的结果。终点可参考以下时间，即在标准品中，在活化剂的存在下，达到大约80%的底物分子被凝血酶裂解的状态所必需的时间。
或者，终点可参考以下时间，即在标准品中，达到凝血酶的裂解反应的稳态所必需的时间。
因此，在第二方面，本发明涉及用于确定测试样本中生物活性凝血酶的浓度的一步测定方法，其包括以下步骤：
a)依次、同时或基本同时混合根据本发明的底物、活化剂和所述测试样本，
b)孵育所得的反应混合物，以释放凝血酶-裂解的、含螯合物的底物片段，并在固定基质上固定含结合配偶体的底物片段和凝血酶-未裂解的完整底物，
c)洗掉任何存在的未固定的、凝血酶-裂解的、含螯合物的底物片段和未固定的、凝血酶-未裂解的底物，
d)测量来自固定的完整底物的发射光水平，以及
e)与不含凝血酶的标准品相比，从发射光强度的降低计算凝血酶活性。
因此通过洗掉未固定的、凝血酶-裂解的、含螯合物的底物片段和未固定的、凝血酶-未裂解的底物(当固定基质的结合容量低于底物分子的数量时出现后者)，使得与不含凝血酶的标准品的发光相比，样本中发射光的降低(裂解百分率)与样本中的凝血酶活性直接关联成为可能。
或者，将底物固定在固定基质如大孔或微粒的表面。依次、同时或基本同时将测试样本如全血或血浆以及活化剂加入固定基质中。孵育所得反应混合物，使得凝血酶作用至底物上，导致释放凝血酶-裂解的、含螯合物的底物片段，并保留仍残留在固定基质上的含结合配偶体的底物片段和凝血酶-未裂解的完整底物。
所用的活化剂取决于待测参数PR、APTT或ACT。待使用的活化剂的非限制性实例包括促凝血酶原激酶、部分促凝血酶原激酶试剂如磷脂和接触活化剂如二氧化硅、高岭土、硅藻土、鞣花酸(ellagic acid)等。
未知样本中生物活性凝血酶，即未结合至任何抑制剂(例如抗凝血酶)的并因此具有蛋白水解活性的凝血酶的量，可通过生物活性凝血酶的裂解百分率(与总发光强度相比的发光强度的降低)的标准曲线测定。因此，生物活性凝血酶水平可表示为来自标准品组(n≥20)的生物活性凝血酶与未知样本的生物活性凝血酶的比率。所述比率等价于凝血酶原时间比(PR)(当所用活化剂为促凝血酶原激酶时)，或者活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)比(当所用活化剂为部分促凝血酶原激酶试剂(例如磷脂)和接触活化剂(例如二氧化硅、高岭土、硅藻土、鞣花酸)时)，或者活化凝块时间(ACT)比(当所用活化剂为接触活化剂且样本类型为天然全血时)。
在本发明的一个实施方式中，测试样本和活化剂的加入与底物向固定基质中的加入同时或基本同时进行。
在图1中例示了不预先固定底物的一步测定方法。图1详细描述如下。
当被固定在固定基质上时所检测的底物不易裂解，但在液相中可被凝血酶裂解时，即当底物在液相中的裂解动力学快于或至少等于结合配偶体的结合动力学时，这种方法是特别有用的。因此，底物与凝血酶分子之间的裂解反应，以及固定的结合配偶体与裂解的以及完整的底物分子之间的结合反应在以下孵育步骤中同时发生。
在本发明的另一个实施方式中，测试样本的加入在将底物固定在固定基质后进行。在图2中例示了预先固定底物的一步测定方法。图2详细描述如下。
该测定法具有许多优点，例如简便、快速和耐用。然而，对于该实施方式的前提是，当固定在固定基质时底物应是可裂解的。
然后，洗掉未固定的、凝血酶-裂解的含螯合物的底物片段。测量来自固定的完整底物的发射光，并将其与来自不含凝血酶的标准品的发光相比。样本中发光强度降低的百分率(裂解百分率)与样本中凝血酶活性直接相关。
本发明的第三方面涉及用于确定测试样本中生物活性凝血酶的浓度的两步测定方法，其包括以下步骤：
a)在液相中将所述样本和活化剂加入根据本发明的底物中，
b)孵育所得的反应混合物以释放凝血酶-裂解的、含螯合物的底物片段，
c)将反应混合物加入固定基质中，
d)洗掉任何存在的未固定的、凝血酶-裂解的、含螯合物的底物片段和未固定的、凝血酶-未裂解的底物，
e)测量来自固定的完整底物的发射光的水平，以及
f)与不含凝血酶的标准品相比，从发射光强度的降低计算凝血酶活性。
所述两步测定法可有利地用于当所检测底物仅在液相表现良好时。在图3中例示了所述的两步测定法。图3详细描述如下。
在该实施方式中，将包括测试样本如血浆或全血、活化剂和底物的反应混合物在液相中反应。然后，将部分或全部所述反应混合物转移至固定基质，然后发生凝血酶-裂解的底物片段和凝血酶-未裂解的完整凝血酶的固定。洗掉凝血酶-裂解的、含螯合物的底物片段和未固定的、凝血酶-未裂解的底物后，如上所述测量来自固定的完整底物的发光水平。
选择何种类型的测定法(一步或两步测定法)主要取决于同时将底物、活化剂和样本加入固定基质的难度程度。如果困难，则优选两步测定法。如果不困难，则使用一步测定法。此外，两步测定法具有优于一步测定法的优势，即应用的底物量可非常高，只要底物溶解度允许。
本发明的第四方面提供根据本发明的底物在测定样本中生物活性凝血酶水平中的用途。因此，根据本发明的底物展示对于凝血酶的优良特异性，并可被凝血酶迅速裂解，因此允许在测定中使用所述底物，所述测定易于进行、可自动化并在短时间内提供可靠的结果。
本发明的第五方面提供用于测定样本中生物活性凝血酶水平的测试试剂盒，其包括：
a)如上所述的发光底物，以及
b)固体固定基质。
即使本发明底物采取对凝血酶特异性的情况，其也可以应用于不同的酶。因此，申请人已经意识到三-或四-肽(X)与从属连接基(Z)的组合也可容易被其它酶裂解。
因此，根据本发明的底物可通过稍微修饰所述底物特别通过选择所述的肽而适合所需应用。
可以测定不同的凝血因子，例如FII、FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII的活化和非活化形式，以及C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9的活化和非活化形式、其片段及其组合。也可测定以下酶：髓过氧化物酶(MPO)、丙氨酸氨基转移酶(ALAT)、天冬氨酸氨基转移酶(ASAT)、Caspase-1和谷胱甘肽过氧化物酶-1(GPx-1)。
因此，本发明的第六方面提供具有以下通式的酶底物：
A-X-Z-A’
其中
A或A’之一包括发光螯合物，以及
A或A’的另一个包括结合配对的第一配偶体，任选包括间隔基，并经肽键连接至底物的剩余部分，
X形成三-或四-肽，
Z为NH-R-Z’，其中
R选自C1-6亚烷基、C1-6亚烷基氧基、-S-C1-6亚烷基、-S-C1-6亚烷基氧基、羰基-C1-6亚烷基、羰基-C1-6亚烷基氧基、C1-6亚烷基-羰基、C1-6亚烷基氧基-羰基、C1-6亚烷基-亚芳基、C1-6亚烷基氧基-亚芳基、C1-6亚烷基-NH、C1-6亚烷基氧基-NH、C1-6亚烷基-NHCO、C1-6亚烷基氧基-NHCO、C1-6亚烷基-CONH、C1-6亚烷基氧基-CONH、C1-6亚烷基-COS、C1-6亚烷基氧基-COS、C1-6亚烷基-CONH-C1-6亚烷基-亚芳基、亚芳基、亚芳基-C1-6亚烷基、亚芳基-C1-6亚烷基氧基、R1 a-亚芳基-(NHCO-R2)b、R3 c-亚芳基-(CONH-R4)d、(R5-CONH)e-亚芳基-R6 f和(R7-NHCO)g-亚芳基-R8 h，其中各个R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8在每次出现时独立地选自C1-6亚烷基、C1-6亚烷基氧基、-S-C1-6亚烷基、-S-C1-6亚烷基氧基、羰基-C1-6亚烷基、羰基-C1-6亚烷基氧基、C1-6亚烷基-羰基、亚芳基或亚芳基-C1-6亚烷基和各个a、b、c、d、e、f、g和h独立地选自0至6的整数，
其中亚芳基为亚苯基、亚联苯基或亚萘基，其中亚苯基、亚联苯基或亚萘基任选被一个或多个取代基单-、二-或三-取代，所述取代基选自卤素、OH、SH、CN、NO2、C1-6烷基、C1-6烷氧基或C1-6烷氧基羰基，
Z’包括N、S和羰基之一，其中，
当Z’包括N时，Z’选自硫脲(-NH-CS-NH-)、氨基乙酰胺(-NH-CO-CH2-NH-)、酰胺(-NH-CO-)、甲基酰胺(-NCH3-CO-)或取代的-三嗪-二胺(-NH-(R9C3N3)-NH-)，
当Z’包括S时，Z’选自硫醚(-S-)、硫代乙酰胺(-S-CH2-CO-NH-)、二硫化物(-S-S-)、(-S-CO-CH2-NH-)或(-S-(R9C3N3)-NH-)，或
当Z’包括羰基时，Z’选自酰胺(-CO-NH-，-CO-NCH3-)或酯(-CO-O-)，
其中R9选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷硫基、C1-6烷氧基、C1-6硫代烷氧基、芳基氧基和氨基，其中烷基、烷硫基、烷氧基、硫代烷氧基或芳基氧基任选被一个或多个取代基单-、二-或三-取代，且氨基任选被一个或多个取代基单-或二-取代，所述取代基选自卤素、OH、SH、CN、NO2、C1-6烷基、C1-6烷氧基或C1-6烷氧基羰基。
本发明参考以下附图进行公开，其中
图1显示不预先固定底物的一步测定方法的示意图，
图2显示预先固定底物的一步测定方法的示意图，
图3显示两步测定方法的示意图，
图4显示合成根据本发明的底物S1V6c的反应方案，
图5显示合成根据本发明的另一个底物S1V12a的反应方案，以及
图6显示根据本发明的S1V6c和S1v9b的标准曲线。
在图1中，例示了不预先固定底物的一步测定法。根据本发明，所用底物1包括4部分((1a、1b、1c和1d)(A-X-Z-A’))，1a表示结合配对的第一配偶体且1a任选包括间隔基，1b表示三-或四-肽，1c表示连接基以及1d表示发光螯合物。2表示结合在固定基质3的表面的结合配对的第二配偶体。4表示测试样本中存在凝血酶(A具有高水平的和B具有低水平的凝血酶)，且5表示测试样本中不存在凝血酶(C)。
在代表高水平凝血酶的A中，所述底物1与测试样本4反应。得到裂解的底物。所述裂解的底物包括两部分；第一部分(1a、1b)和第二部分(1c、1d)。(1a、1b)固定在固定基质上，而底物的第二部分(1c、1d)被洗掉。然后测量来自固定的完整底物(1a、1b)的发射光，并将其与不含凝血酶的样本5(C)的发射光进行比较。图1中未示出清洗和测量步骤。
图1还例示了具有低凝血酶水平(示于B)和零凝血酶水平(示于C)的一步测定法。C用作对照。
图2例示了如上所述的一步测定法，但其中测试样本4或5的加入在将根据本发明的底物1固定在固定基质3后进行。
图3例示了两步测定法。第一步I显示底物1与测试样本4(含凝血酶(A))或5(不含凝血酶(B))反应。得到凝血酶裂解的底物(A)或完整底物(B)。在步骤II中，将部分或全部所述反应混合物转移至固定基质，然后发生凝血酶-裂解的底物片段(1a、1b)(A)和凝血酶-未裂解的完整凝血酶底物1(1a、1b、1c和1d)(B)的固定。洗掉凝血酶-裂解的、含螯合物的底物片段(1c、1d)后，按照一步测定法测量来自固定的完整底物1的发射光。图3未显示清洗和测量步骤。
因此对于(A)，测得低水平的螯合物(发光/荧光)，其表示高水平的凝血酶。相反，对于(B)，测得高水平的螯合物(发光/荧光)，其反应不含凝血酶。
在以下非限制性具体实施例中更详细地描述本发明。
对于以下实施例，使用了以下原料和仪器。
原料
磺基-n-羟基琥珀酰亚胺-LC-LC-生物素购自Pierce，p-亚苯基二胺购自Acros，(7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基磷
Figure GDA0000363844390000201
六氟磷酸盐(PyAOP)购自Aldrich，且N-乙基二异丙基胺(DIPEA)购自Fluka。三氟乙酸(TFA)购自Riedel-de 
Figure GDA0000363844390000202
且三乙基铵乙酸缓冲液(TEAA)购自Fluka。所用乙腈(MeCN)为HPLC级，其购自J.T.Baker。DMF购自Lab-Scan且经分子筛
Figure GDA0000363844390000203
干燥。所有其它所用化学试剂为分析级。
H-Phe(D)-Pip-Arg购自KJ Ross-Petersen ApS。N-末端含生物素化的长肽D-phe-L-Aze-Arg-OH如生物素-(Ser-(Gly)2)7D-phe-L-Aze-Arg-OH购自Invitrogen。Innovin购自Dade-Behring，Siemens。牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma。
9-齿的铕-螯合物(2,2’,2’’,2’’’-{[2-(4-异硫氰酸基苯基)-乙基亚氨基]-双(亚甲基)双{4-{[4-(a-吡喃半乳糖基)苯基]乙炔基}-吡啶-6,2-二基}双(亚甲基三价氮基)}四(乙酸根合)铕(III))，清洗溶液和用链亲和素包被的独立杯(singlecups)购自Innotrac Diagnostics(Finland)。
低-荧光的12-孔Maxisorp微滴定条(microtitration strips)和独立Maxisorp微滴定孔(紫外线淬灭的)购自Nunc(Denmark)。
仪器
质谱(MS)在购自Perseptive Biosystems的Voyager DE-PRO(MALDI TOF)上操作，使用a-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质。当进行手动测定时，使用购自Wallac Oy，Perkin-Elmer life Sciences的1420多标记计数器(Victor)测量在615nm的时间分辨荧光；当进行半自动测定时，使用购自Innotrac Diagnostics的Aio免疫分析仪测量在615nm的时间分辨荧光。
实施例1
S1V6c的合成
S1V6c的合成包括三步，以使用包括H-Phe(D)-Pip-Arg-OH的三肽开始，如图4所示。首先，将具有线状间隔基的生物素基团连接至所述三肽的N-末端α-氨基。然后，将二胺连接基，即4-亚苯基-二胺，连接至三肽的C-末端羧基。最后，将9-齿的铕螯合物结合至所引入的连接基分子的芳香氨基。
合成操作
i)生物素化
将H-Phe(D)-Pip-Arg-OH(5.0mg，11.6μmol)溶于PBS-缓冲液(pH7.0，1ml)。加入磺基-n-羟基琥珀酰亚胺-LC-LC-生物素(12.0mg，17.3μmol)，并将混合物在室温搅拌过夜。使用HPLC纯化反应混合物。产率:5.5mg(54%)。MS：实测值885.67，计算值885.15。
ii)二胺-连接基的偶合
将来自i)的生物素化产物(2.4mg，2.7μmol)溶于无水DMF(0.5ml)，加入4-亚苯基-二胺(1.2mg，10.84μmol)、PyAOP(1.7mg，3.3μmol)和DIPEA(0.6μl，3.3μmol)，并将混合物在室温搅拌过夜。蒸发DMF并在Thermo ODSHypersil的HPLC柱(尺寸：150x10mm)上纯化反应混合物。使用A(0.1%TFA)和B(MeCN)组成的在20分钟内由5%B至50%B的线性梯度，以2.5ml/min的流速洗脱。
产率为2.4mg(92%)。MS实测值(975.83)准确符合MS计算值(975.28)。
iii)标记
将来自ii)的产物(2.0mg，2.1μmol)溶于50mM碳酸盐缓冲液(pH9.8，0.5ml)。加入9-齿的铕-螯合物(2,2’,2’’,2’’’-{[2-(4-异硫氰酸基苯基)-乙基氨基]-双(亚甲基)双{4-{[4-(a-吡喃半乳糖基)苯基]乙炔基}-吡啶-6,2-二基}双(亚甲基三价氮基)}四(乙酸根合)铕(III))(3.3mg，2.5μmol)，并将反应在室温搅拌过夜。在Phenomenex C18的HPLC柱(尺寸：250x10mm)上纯化反应混合物。使用A(20mM TEAA)和B(20mM TEAA+50%MeCN)组成的在30分钟内由5%B至100%B的线性梯度，以3ml/min的流速洗脱。产率为1.3mg(27%)。
实施例2
S1V12a的合成
S1V12a的合成仅包括两步(见图5)，因为起始原料已经包含了生物素基团和氨基酸构成的间隔基。在将相同二胺连接基，即4-亚苯基-二胺结合至三肽的C-末端羧基后，将9-齿的铕螯合物结合至所引入的二胺连接基分子的芳香氨基。用于合成S1V12a的实验条件与用于合成S1V6c的相关步骤相同。
实施例3
构建了用于随后的凝血酶测定的3条不同的对照标准曲线。
标准曲线A表示浓度为200nM的S1V6c，标准曲线B表示浓度为10nM的S1V9b，且标准曲线C表示浓度为25mM的S1V9b。所述底物根据实施例1所述条件制备。
重组促凝血酶原激酶(Innovin)用作活化剂。测定缓冲液为常规的HEPES缓冲液。
应用了浓度为0至11.9IU/ml的凝血酶标准品。
测定仪两步测定法进行。在步骤I中，将不同的凝血酶浓度的含凝血酶的标准品以及活化剂和底物加入测定缓冲液中。将试剂混合充分并在37℃孵育数分钟。
在步骤II中，将部分反应混合物转移至其中发生捕捉的微孔。在37℃允许底物固定/捕捉至微孔达大约3分钟，然后清洗和干燥。洗掉未捕捉的底物以及含螯合物的裂解的底物，然后干燥微孔。最后，使用荧光计数器测量来自干燥微孔的荧光计数。
将测得的荧光计数与不含凝血酶的对照样品比较，且为了构建标准曲线，计算与参照(不含凝血酶)相比信号的降低。
结果如图6所示，证明了S1V6c和S1V9b浓度的升高导致信号降低的加剧。这证明了底物S1V6c和S1V9b均为非常有效的凝血酶底物。与S1V6b相比，S1V9b在较低凝血酶浓度导致了更高的信号降低。然而，两种底物均为非常合适的凝血酶底物，并可因此用于测定样本中凝血酶水平。
实施例4
为了测量全血，实施例3中的标准曲线可经全血红细胞压积值校正后应用。来自两名健康女性受试者的全血样本以及血浆样本用于测试根据本发明的凝血酶。
来自受试者1的血浆样本的四次独立测量显示，与对照信号相比，所测信号降低了87.7%+0.5%。对于第二名受试者，降低为91.5%+0.1%。
使用全血样本获得了相似结果，受试者1和2分别为80.7%+0.9%和86.3%+0.2%。
结果证明根据本发明的底物和测定法在测量全血以及血浆样本中凝血酶的能力及其稳定性。

Claims (27)

1.具有以下通式的凝血酶的底物：
                       A-X-Z-A’
其中
A或A’之一包括发光螯合物，以及
A或A’的另一个包括结合配对的第一配偶体和任选包括间隔基，并经肽键连接至底物的剩余部分，
X形成三-或四-肽，其选自X’-Phe-Aze-Arg、X’-Phe-Pip-Arg和X’-Phe-Pro-Arg，其中
X’不存在或选自Lys、Ahx、Ile和Val，
Z为NH-R-Z’，其中
R选自C1-6亚烷基、C1-6亚烷基氧基、-S-C1-6亚烷基、-S-C1-6亚烷基氧基、羰基-C1-6亚烷基、羰基-C1-6亚烷基氧基、C1-6亚烷基-羰基、C1-6亚烷基氧基-羰基、C1-6亚烷基-亚芳基、C1-6亚烷基氧基-亚芳基、C1-6亚烷基-NH、C1-6亚烷基氧基-NH、C1-6亚烷基-NHCO、C1-6亚烷基氧基-NHCO、C1-6亚烷基-CONH、C1-6亚烷基氧基-CONH、C1-6亚烷基-COS、C1-6亚烷基氧基-COS、C1-6亚烷基-CONH-C1-6亚烷基-亚芳基、亚芳基、亚芳基-C1-6亚烷基、亚芳基-C1-6亚烷基氧基、R1 a-亚芳基-(NHCO-R2)b、R3 c-亚芳基-(CONH-R4)d、(R5-CONH)e-亚芳基-R6 f和(R7-NHCO)g-亚芳基-R8 h，其中各个R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8在每次出现时独立地选自C1-6亚烷基、C1-6亚烷基氧基、-S-C1-6亚烷基、-S-C1-6亚烷基氧基、羰基-C1-6亚烷基、羰基-C1-6亚烷基氧基、C1-6亚烷基-羰基、亚芳基或亚芳基-C1-6亚烷基，且各个a、b、c、d、e、f、g和h独立地选自0至6的整数，
其中亚芳基为亚苯基、亚联苯基或亚萘基，其中亚苯基、亚联苯基或亚萘基任选被一个或多个取代基单-、二-或三-取代，所述取代基选自卤素、OH、SH、CN、NO2、C1-6烷基、C1-6烷氧基或C1-6烷氧基羰基,
Z’包括N、S和羰基之一，其中，
当Z’包括N时，Z’选自硫脲(-NH-CS-NH-)、氨基乙酰胺(-NH-CO-CH2-NH-)、酰胺(-NH-CO-)、甲基酰胺(-NCH3-CO-)或取代的-三嗪-二胺(-NH-(R9C3N3)-NH-)，
当Z’包括S时，Z’选自硫醚(-S-)、硫基乙酰胺(-S-CH2-CO-NH-)、二硫化物(-S-S-)、(-S-CO-CH2-NH-)或(-S-(R9C3N3)-NH-)，或
当Z’包括羰基时，Z’选自酰胺(-CO-NH-，-CO-NCH3-)或酯(-CO-O-)，
其中R9选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷硫基、C1-6烷氧基、C1-6硫代烷氧基、芳基氧基和氨基，其中烷基、烷硫基、烷氧基、硫代烷氧基或芳基氧基任选被一个或多个取代基单-、二-或三-取代，且氨基基团任选被一个或多个取代基单-或二-取代，所述取代基选自卤素、OH、SH、CN、NO2、C1-6烷基、C1-6烷氧基或C1-6烷氧基羰基。
2.根据权利要求1的底物，其中X为D-Phe-L-2-Aze-L-Arg或D-Phe-L-2-Pip-L-Arg。
3.根据权利要求1的底物，其中Z’为N且R为亚芳基、C1-6亚烷基-亚芳基或R1 a-亚芳基-(NHCO-R2)b，其中a和b为0、1或2。
4.根据权利要求2的底物，其中Z’为N且R为亚芳基、C1-6亚烷基-亚芳基或R1 a-亚芳基-(NHCO-R2)b，其中a和b为0、1或2。
5.根据权利要求1的底物，其中所述的发光螯合物为荧光镧系元素螯合物。
6.根据权利要求2的底物，其中所述的发光螯合物为荧光镧系元素螯合物。
7.根据权利要求3的底物，其中所述的发光螯合物为荧光镧系元素螯合物。
8.根据权利要求4的底物，其中所述的发光螯合物为荧光镧系元素螯合物。
9.根据权利要求5的底物，其中所述的镧系元素螯合物选自
Figure FDA0000373274430000031
10.根据权利要求6的底物，其中所述的镧系元素螯合物选自
11.根据权利要求7的底物，其中所述的镧系元素螯合物选自
Figure FDA0000373274430000041
12.根据权利要求8的底物，其中所述的镧系元素螯合物选自
Figure FDA0000373274430000042
Figure FDA0000373274430000051
13.根据权利要求1-12中任一项的底物，其中所述的结合配对的第一配偶体选自生物素/链亲和素、生物素/亲和素、生物素/生物素受体肽，和链亲和素衍生物/受体肽。
14.根据权利要求1-12中任一项的底物，其特征在于所述结合配对的第一配偶体经式NH-R10-CONH-R11-CO-(NH-R12-NH)i的间隔基与底物的剩余部分连接，其中各个R10、R11和R12独立地选自C1-6亚烷基、C1-6亚烷基氧基、-S-C1-6亚烷基、-S-C1-6亚烷基氧基、羰基-C1-6亚烷基、羰基-C1-6亚烷基氧基、C1-6亚烷基-羰基、亚芳基或亚芳基-C1-6亚烷基，其中亚芳基为亚苯基、亚联苯基或亚萘基，其中亚苯基、亚联苯基或亚萘基任选被一个或多个取代基单-、二-或三-取代，所述取代基选自卤素、OH、SH、CN、NO2、C1-6烷基、C1-6烷氧基或C1-6烷氧基羰基，且i为0至6的整数，或所述间隔基为W-个氨基酸组成的肽，其中W为1至40的整数。
15.根据权利要求13的底物，其特征在于所述结合配对的第一配偶体经式NH-R10-CONH-R11-CO-(NH-R12-NH)i的间隔基与底物的剩余部分连接，其中各个R10、R11和R12独立地选自C1-6亚烷基、C1-6亚烷基氧基、-S-C1-6亚烷基、-S-C1-6亚烷基氧基、羰基-C1-6亚烷基、羰基-C1-6亚烷基氧基、C1-6亚烷基-羰基、亚芳基或亚芳基-C1-6亚烷基，其中亚芳基为亚苯基、亚联苯基或亚萘基，其中亚苯基、亚联苯基或亚萘基任选被一个或多个取代基单-、二-或三-取代，所述取代基选自卤素、OH、SH、CN、NO2、C1-6烷基、C1-6烷氧基或C1-6烷氧基羰基，且i为0至6的整数，或所述间隔基为W-个氨基酸组成的肽，其中W为1至40的整数。
16.根据权利要求14的底物，其中R10、R11和R12为相同的或不同的直链C1-6亚烷基、亚芳基或亚芳基-C1-6亚烷基，且i为0或1。
17.根据权利要求15的底物，其中R10、R11和R12为相同的或不同的直链C1-6亚烷基、亚芳基或亚芳基-C1-6亚烷基，且i为0或1。
18.根据权利要求1的底物，其选自S1V6(a,b,c)、S1V8、S1V9(a,b)和S1V12(a,b,c)
Figure FDA0000373274430000061
Figure FDA0000373274430000071
Figure FDA0000373274430000111
Figure FDA0000373274430000121
19.用于测定测试样本中生物活性凝血酶的浓度的一步测定方法，其包括以下步骤：
a)依次、同时或基本同时混合根据上述权利要求中任一项的底物、活化剂和所述测试样本；
b)孵育所得的反应混合物以释放凝血酶-裂解的、含螯合物的底物片段，并在固定基质上固定含结合配偶体的底物片段和凝血酶-未裂解的完整底物；
c)洗掉任何存在的未固定的、凝血酶-裂解的、含螯合物的底物片段和未固定的、凝血酶-未裂解的底物；
d)测量来自固定的完整底物的发射光水平；以及
e)与不含凝血酶的标准品相比，从发射光强度的降低计算凝血酶活性。
20.根据权利要求19的测定方法，其中所述样本和活化剂的加入与底物向固定基质中的加入同时或基本同时进行。
21.根据权利要求19的测定方法，其中所述样本和活化剂的加入在将底物固定在固定基质后进行。
22.用于测定测试样本中生物活性凝血酶的浓度的两步测定方法，其包括以下步骤：
a)在液相中将所述样本和活化剂加入根据权利要求1-18中任一项的底物中，
b)孵育所得的反应混合物以释放凝血酶-裂解的、含螯合物的底物片段，
c)将反应混合物加入固定基质中，
d)洗掉任何存在的未固定的、凝血酶-裂解的、含螯合物的底物片段和未固定的、凝血酶-未裂解的底物，
e)测量来自固定的完整底物的发射光水平，和
f)与不含凝血酶的标准品相比，从发射光强度的降低计算凝血酶活性。
23.根据权利要求19-22中任一项的测定方法，其中所述的活化剂选自促凝血酶原激酶、部分促凝血酶原激酶试剂和接触活化剂。
24.根据权利要求23的测定方法，其中所述的部分促凝血酶原激酶试剂包括磷脂，且所述接触活化剂包括二氧化硅、高岭土、硅藻土、鞣花酸。
25.根据权利要求1-18中任一项的底物在测定样本中生物活性凝血酶的浓度的用途。
26.用于测定样本中生物活性凝血酶的浓度的试剂盒，其包括
a)根据权利要求1-18中任一项的发光底物，
b)固体固定基质。
27.具有以下通式的酶的底物：
                       A-X-Z-A’
其中
A或A’之一包括发光螯合物，和
A或A’的另一个包括结合配对的第一配偶体和任选包括间隔基，并经肽键连接至底物的剩余部分，
X形成三-或四-肽，
Z为NH-R-Z’，其中
R选自C1-6亚烷基、C1-6亚烷基氧基、-S-C1-6亚烷基、-S-C1-6亚烷基氧基、羰基-C1-6亚烷基、羰基-C1-6亚烷基氧基、C1-6亚烷基-羰基、C1-6亚烷基氧基-羰基、C1-6亚烷基-亚芳基、C1-6亚烷基氧基-亚芳基、C1-6亚烷基-NH、C1-6亚烷基氧基-NH、C1-6亚烷基-NHCO、C1-6亚烷基氧基-NHCO、C1-6亚烷基-CONH、C1-6亚烷基氧基-CONH、C1-6亚烷基-COS、C1-6亚烷基氧基-COS、C1-6亚烷基-CONH-C1-6亚烷基-亚芳基、亚芳基、亚芳基-C1-6亚烷基、亚芳基-C1-6亚烷基氧基、R1 a-亚芳基-(NHCO-R2)b、R3 c-亚芳基-(CONH-R4)d、(R5-CONH)e-亚芳基-R6 f和(R7-NHCO)g-亚芳基-R8 h，其中各个R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8在每次出现时独立地选自C1-6亚烷基、C1-6亚烷基氧基、-S-C1-6亚烷基、-S-C1-6亚烷基氧基、羰基-C1-6亚烷基、羰基-C1-6亚烷基氧基、C1-6亚烷基-羰基、亚芳基或亚芳基-C1-6亚烷基，且各个a、b、c、d、e、f、g和h独立地选自0至6的整数，
其中亚芳基为亚苯基、亚联苯基或亚萘基，其亚苯基、亚联苯基或亚萘基任选被一个或多个取代基单-、二-或三-取代，所述取代基选自卤素、OH、SH、CN、NO2、C1-6烷基、C1-6烷氧基或C1-6烷氧基羰基，
Z’包括N、S和羰基之一，其中，
当Z’包括N时，Z’选自硫脲(-NH-CS-NH-)、氨基乙酰胺(-NH-CO-CH2-NH-)、酰胺(-NH-CO-)、甲基酰胺(-NCH3-CO-)或取代的-三嗪-二胺(-NH-(R9C3N3)-NH-)，
当Z’包括S时，Z’选自硫醚(-S-)、硫基乙酰胺(-S-CH2-CO-NH-)、二硫化物(-S-S-)、(-S-CO-CH2-NH-)或(-S-(R9C3N3)-NH-)，或
当Z’包括羰基时，Z’选自酰胺(-CO-NH-，-CO-NCH3-)或酯(-CO-O-)，
其中R9选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷硫基、C1-6烷氧基、C1-6硫代烷氧基、芳基氧基和氨基，其烷基、烷硫基、烷氧基、硫代烷氧基或芳基氧基基团任选被一个或多个取代基单-、二-或三-取代，且其氨基基团任选被一个或多个取代基单-或二-取代，所述取代基选自卤素、OH、SH、CN、NO2、C1-6烷基、C1-6烷氧基或C1-6烷氧基羰基。
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