KR101096668B1

KR101096668B1 - 혈액응고인자 13 활성도 측정용 칩 및 이를 이용한 혈액응고인자 13 활성도 측정방법

Info

Publication number: KR101096668B1
Application number: KR1020090018080A
Authority: KR
Inventors: 하권수; 권미혜
Original assignee: (주)대한임상의학센터; 강원대학교산학협력단
Priority date: 2009-03-03
Filing date: 2009-03-03
Publication date: 2011-12-22
Also published as: KR20100099533A

Abstract

본 발명은 간질환, 출혈, 혈관 내 응고, 백혈병 등 혈액 응고와 관련되어 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 알려진 혈액응고인자 13(FXIII)의 활성도 측정에 관한 것으로서, 특히 다수의 시료를 극소량만 사용하여 빠르고, 또한 고감도 분석을 할 수 있는 측정용 칩 개발과 분석방법에 관한 것이다.

기존에 FXIII의 활성도는 주로 ELISA를 통하여 이루어져 왔다. 그러나 이와 같은 방법은 활성도 측정에 시간이 많이 소요되고, 다량의 시료를 필요로 하고, 재현성이 떨어진다. 따라서 본 발명에서는 FXIII의 기질 중 하나인 피브리노겐을 어레이 형태로 제작하여 FXIII의 아미드전이반응(transamidation)을 유도시킴으로써 감도가 높은 형광으로 표지된 검출자를 이용해 형광값을 측정하여 세포나 혈액 내의 FXIII의 양을 측정한다. 따라서 본 발명은 극히 소량의 시료만으로 쉽고 빠르게 분석 가능 하며, 각종 질환 검사에 활용할 수 있다.

혈액응고인자 13, Factor XIII, FXIII, 피브리노겐

Description

혈액응고인자 13 활성도 측정용 칩 및 이를 이용한 혈액응고인자 13 활성도 측정방법 {Chip and methods for determining Factor XIII activity}

본 발명은 혈액응고인자 13의 활성도 측정용 칩 및 혈액응고인자 13의 활성도 측정방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 아미노 잔기를 갖는 알콕시실란이 도입된 기판의 표면에 소정의 간격으로 천공된 테이프를 부착하여 다수의 스폿을 형성하고, 상기 스폿의 단부에 혈액응고인자 13의 기질단백질을 도입하여 제조되는 혈액응고인자 13 활성도 측정용 칩 및 이를 이용한 혈액응고인자 13 활성도 측정방법에 관한 것이다.

혈액응고인자 13(Factor XIII, FXIII)은 혈액응고에서 마지막 단계에서 섬유소(fibrin)와 공유결합을 이루어 형성된 응혈을 안정화시킨다. FXIII는 아미드전이반응(transamidation)을 통해 공유교차결합(covalent crosslinks)을 유도하는데, 이는 단백질 분해를 방지하는 섬유소 응혈(fibrin clot)을 생성시킨다.

FXIII은 글루타민 잔기들의 γ-위치에 있는 아미드 암모니아(amide ammonia) 를 다른 아민, 보통은 적당한 라이신 잔기의 ε-아미노기로 치환하는 것을 촉매한다 (Folk, J. E. (1980) Annu. Rev. Biochem.49, 517-531). ε-(γ-글루타밀)라이신 이소펩티드 결합들(ε-(γ-glutamyl)lysine isopeptide bonds)의 형성은 단백질들의 분자내(intramolecular) 및 분자간(intermolecular) 교차-결합(cross-linking) 모두에 작용한다. FXIII의 많은 기능들 중에서, 1) 피브리노겐(fibrinogen) (Shainoff, J. R., and Page, I. H. (1962) J. Exp. Med.116, 687-707) 및 플라스민(plasmin) (Francis, C. W., and Marder, V. J. (1988) Blood 71, 1361-1365)에 의한 재용해(redissolution)에 대하여 응혈(clots)을 안정화시키는, 섬유소(fibrin)의 교차-결합, 2) 플라스민으로부터 추가적 보호를 위한 섬유소에 대한 α-2-플라스민 저해제의 결합 (Reed, G. L., Matsueda, G. R., and Haber, E. (1992) Thromb. Haemostasis 68, 315-320), 및 3) 상처 치유를 촉진하는 기질 단백질들, 그 중에서도, 섬유결합소(fibronectin), 콜라겐(collagen) 및 트롬보스폰딘(thrombospondin)의 교차-결합(Barry, E. L., and Mosher, D. F. (1988) J. Biol. Chem.263, 10464-10469)이 가장 잘 알려져 있다.

종래 주로 사용되던 FXIII의 활성도 측정 방법은 크게 암모니아 생성을 측정하는 방법 및 아민기를 혼입시켜 측정하는 방법이 있다. 암모니아 생성을 측정하는 방법은 아미드전이반응의 첫 단계에서 생성되는 암모니아를 측정하는 방법으로, FXIII 결핍 환자에서 비정상적으로 높게 측정되고 암모니아를 검출해야 하므로 비싼 장치가 필요하다는 단점을 가지고 있으며, 아민기를 혼입시켜 측정하는 방법은 방사선, 형광 또는 바이오틴과 결합된 아민기질을 FXIIIa에 부착하여 결합시키고 결합형과 유리형 아민을 분리하여 결합된 아민을 측정하는 방법으로, 측정시간이 오래 걸리고 재현성이 적고 표준화가 어렵다. 또한 96웰 플레이트를 사용하기 때문에 다수의 시료를 분석하기 어렵고 다량의 시료를 필요로 한다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 혈액응고인자 13의 기질인 피브리노겐을 어레이 칩으로 제작하여 시료 내 혈액응고인자 13의 활성도를 측정하는 경우, 소량의 시료로 다수의 시료를 동시에 분석할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 혈액응고인자 13의 활성도를 측정하기 위하여 어레이 칩을 제작하고, 이를 이용하여 혈액응고인자 13의 활성도를 측정할 수 있도록 함으로써, 다수의 시료를 동시에 분석가능하며 특히 소량의 시료만으로 고감도 측정이 가능하고, 최종분석까지 걸리는 시간을 획기적으로 단축할 수 있는 혈액응고인자 13의 활성도를 측정하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 혈액응고인자 13의 활성도 측정방법을 제공한다:

a) 다수의 스폿(spot) 상에 혈액응고인자 13(Factor XIII)의 기질인 피브리노겐(fibrinogen)이 고정된 어레이(array) 칩을 준비하는 단계;

b) 활성도 측정용 혈액응고인자 13 함유 시료와 트롬빈(trombin), Ca²⁺ 및 5-(바이오틴아미도)펜틸아민(5-(biotinamido)pentylamine)을 함유하는 반응용액을 상기 피브리노겐 상에 적하하여 피브리노겐의 글루타민과 5-(바이오틴아미도)펜틸아민의 사이의 아미드전이반응(transamidation)을 시키는 단계; 및

c) 상기 아미드전이반응 생성물의 말단부에 위치한 바이오틴에 분석용 표지물질을 도입한 다음 이의 분석을 통해 혈액응고인자 13의 활성도를 측정하는 단계.

본 발명의 활성도 측정방법은, 상기 a)단계에서 피브리노겐을 칩의 기판에 도입하기 위하여 말단에 작용기를 갖는 알콕시실란을 기판의 표면에 도입하는 단계 및 상기 기판의 표면에 소정의 간격으로 천공된 테이프를 부착하여 다수의 스폿이 형성된 어레이 칩을 제조하는 단계를 먼저 수행할 수 있다.

여기서 말단에 작용기를 갖는 알콕시실란은 아미노알킬트리알콕시실란(aminoalkyltrialkoxysilane), 머캅토알킬트리알콕시실란(Mercaptoalkyltrialkoxysilane) 또는 에폭시알킬트리알콕시실란(epoxyalkyltrialkoxysilane)에서 선택된 것을 사용할 수 있다.

아미노알킬트리알콕시실란은 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-amonopropyltrimethoxysilane), 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-amonopropyltriethoxysilane), 3-2-2-아미노에틸아미노에틸아미노프로필트리메톡시실란 (3-[2-(2-aminoethylamino)ethylamino]propyl-trimethoxysilane)에서 선택된 것을 사용할 수 있으며, 머캅토알킬트리알콕시실란으로는 3-머캅토프로필트리메톡시실란(3-Mercaptopropyltrimethoxysilane)을 사용할 수 있고, 에폭시알킬트리알콕시실란은 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane)을 사용할 수 있다.

이러한 말단에 작용기를 갖는 알콕시실란은 다양한 공지된 방법을 적용하여 기판의 표면에 도입할 수 있는데, 본 발명에서는 에탄올과 같은 통상의 알코올류 용매에 알콕시실란을 용해시킨 다음 이 용액에 기판을 침적하여 기판의 표면에 말 단에 작용기를 갖는 알콕시실란이 도입되도록 하였다. 이때 작업의 편의성을 고려하여 에탄올에 말단에 작용기를 갖는 알콕시실란은 1 내지 2중량%가 함유되도록 용해하였으나, 그 농도를 반드시 한정할 필요는 없다.

기판의 침적시간은 적어도 2시간 실시하면 충분하며, 2시간 정도 경과한 후에는 기판을 에탄올과 증류수 등으로 세척한 후 건조하게 되면 기판의 표면에 말단에 작용기를 갖는 알콕시실란이 도입되게 된다.

이때, 기판은 당해분야에서 널리 사용되는 금속 기판이나 슬라이드 글라스 기판이 사용될 수 있으며, 상기 기판은 사용 전에 충분히 세정한 후 사용하면 된다. 세정은 당해분야에서 일반적으로 사용되는 방법이 적용될 수 있으며, 본 발명에서는 증류수 100중량부에 대하여 과산화수소 10 내지 40중량부와 암모니아수 10 내지 40중량부를 혼합한 세정액에 적어도 10분간 침적하여 세정한 슬라이드 글라스를 사용하였다.

기판의 표면에 말단에 작용기를 갖는 알콕시실란이 도입되면, 그 표면에 소정의 간격으로 천공된 테이프를 부착하여 다수의 스폿이 형성된 어레이 칩을 제조하는 단계를 거치게 된다. 스폿의 수는 임의 선택이 가능하며, 테이프는 반응성이 적은 테플론 테이프 등이 사용될 수 있다.

이 후 상기 스폿 상에 혈액응고인자 13의 기질단백질인 피브리노겐을 도입하는 상기 a)단계를 수행할 수 있다.

기질단백질을 도입하는 방법은 다양한 방법이 적용될 수 있는데, 본 발명에서는 기질 단백질을 용해시켜 제조한 기질 단백질 함유용액을 스폿에 적하하여 반 응시키는 방법으로 기질 단백질을 도입하였다. 여기서, 반응은 말단에 작용기를 갖는 알콕시실란의 작용기와 기질단백질이 서로 반응하여 이루어지는데, 반응은 기질 단백질 함유 용액을 적하한 후 적어도 2시간 반응시키면 된다. 두 시간 정도 경과하여 반응이 완료되면 PBST나 증류수 등으로 세척한 후 건조하게 되면 기질 단백질이 도입되게 된다.

기질 단백질을 용해시키기 위한 용액으로는 대표적으로 완충용액을 사용할 수 있는데, 필요에 따라서는 다양한 용액이 적용될 수 있다. 본 발명에서는 pH 4∼9의 범위내로 제조된 인산완충용액이나 Tris-HCl 완충용액을 사용하였으나, 이는 필요에 따라 다양하게 변형이 가능한 것이며, 기질 단백질의 농도 역시 제한할 필요는 없으나, 본 발명에서는 0.001∼0.01중량% 함유되도록 용해시킨 것을 사용하였다.

또한 본 발명의 활성도 측정방법은, 상기 a)단계에서 피브리노겐을 고정한 후 피브리노겐이 결합되지 않은 스폿의 빈 부분을 블로킹(blocking) 용액으로 처리하여 블로킹시키는 것을 더 포함할 수 있다.

상기 블로킹은 분석용 칩 제작 시 일반적으로 실시하는 것으로서, BSA(Bovine serum albumin), 표준혈청(normal serum) 또는 탈지유(skim milk) 등과 같은 통상의 블로킹 물질을 함유하는 용액을 적하하면 된다. 적하 후 한 시간 정도 경과하여 반응이 완료된 후 PBST나 증류수 등으로 세척한 다음 건조하게 되면 기질 단백질이 도입되지 않은 빈부분에 블로킹 물질이 도입되게 된다. 이러한 블로킹 물 질은 후술하는 단계에서 비특이적 반응을 억제해서 측정치의 정확도를 높이는데 기여하게 된다.

상술한 바와 같이 실시하여 기질 단백질이 도입된 어레이 타입의 칩은 후술하는 단계를 통해 혈액응고인자 13의 활성도 측정방법에 유용하게 사용될 수 있으며, 사용자는 하기 단계를 통하여 간단하게 혈액응고인자 13의 활성도를 측정할 수 있게 된다.

특히 기질 단백질이 도입된 칩의 경우 다수의 시료 측정이 동시에 가능한 어레이 형태를 가짐에 따라 혈액응고인자 13의 활성도 분석 시간이 획기적으로 단축되고, 분석 시 필요한 시료의 양이 극히 적게 소모되며, 민감도가 높기 때문에 세포내에서 일어나는 기전을 규명할 수 있는 분석 방법에도 활용이 가능할 뿐만 아니라, 혈액 등과 같은 체액을 이용한 각종 질환 검사에 활용이 가능하다는 장점이 있다.

활성도 측정을 위해서 먼저 활성도 측정용 혈액응고인자 13 함유 시료와 5-(바이오틴아미도)펜틸아민(5-(biotinamido)pentylamine), 트롬빈(thrombin) 및 Ca²⁺를 함유하는 측정액을 상기 기질 단백질 상에 적하하여 기질 단백질과 5-(바이오틴아미도)펜틸아민의 아미드전이반응(transamidation) 단계를 거치게 된다.

여기서 활성도 측정용 혈액응고인자 13 함유 시료는 각종 세포에서 분리된 것이나 혈액 또는 혈액으로부터 분리된 혈장시료를 포함하여 활성도를 측정하고자 하는 것의 총칭이다. 5-(바이오틴아미도)펜틸아민은 혈액응고인자 13에 의해 활성화되어 기질 단백질과 아민교환반응을 일으켜 기질 단백질 말단에 바이오틴이 위치하도록 하게 만든다. Ca²⁺와 트롬빈은 혈액응고인자 13의 활성을 돕기 위하여 첨가되는 것이며 측정 목적에 따라 Triton X-100 등과 같은 물질(cofactor)을 측정액에 추가할 수 있다. 완충용액은 전술한 바와 같이 단백질칩 당해에서 일반적으로 사용되는 것을 사용하면 된다.

이때 기질 단백질과 5-(바이오틴아미도)펜틸아민의 아미드전이반응에 의해 기질 단백질 말단에 위치하게 되는 바이오틴은 주지된 바와 같이 분석용 표지물질인 스트렙타비딘(streptavidin) 또는 아비딘(avidin)과 강하게 결합하는 물질로 이의 분석을 통해 혈액응고인자 13의 활성도를 측정할 수 있게 된다. 즉, 혈액응고인자 13의 활성에 따라 아미드전이반응의 정도가 결정되게 되며, 그에 따라 기질 단백질 말단에 위치하는 바이오틴의 량이 결정되게 된다. 결국 바이오틴에 표지물질로 널리 사용되고 있는 스트렙타비딘이나 아비딘을 결합시키고 이를 분석하게 되면 트랜스글루타미나아제의 활성도를 측정할 수 있게 되는 것이다.

혈액응고인자 13의 활성도 측정에 사용되는 시료의 함량과 성분은 필요에 따라 임의 변경이 가능하나, 본 발명에서는 활성도 측정용 혈액응고인자 13 함유 시료 1중량부당 5-(바이오틴아미도)펜틸아민 2~4중량부, Ca²⁺ 2~4중량부, 트롬빈 0.04~0.05중량부, DTT 0.36~0.5중량부, 완충용액 23~30중량부, NaCl 39~50중량부로 혼합하여 사용하였다. 그러나 이러한 함량은 분석조건이나 분석상황에 따라 다양하 게 변형이 가능하다.

이러한 비율의 혼합용액을 기질 단백질 상에 적하하여 30분 동안 반응시키면 기질 단백질과 5-(바이오틴아미도)펜틸아민의 아미드전이반응이 일어나게 되는데, 이후 PBST나 증류수 등으로 세척한 후 건조하게 되면 단부에 바이오틴이 위치하게 된다.

상기한 바와 같이 아미드전이반응에 의해 단부에 위치하게 되면 바이오틴에 분석용 표지물질을 도입한 다음 이의 분석을 통해 혈액응고인자 13의 활성도를 측정하는 단계를 거치게 된다.

본 발명의 활성도 측정방법은, 상기 c)단계에서 형광물질이 표지된 스트렙타비딘 또는 아비딘을 이용하는 것이 바람직하며, 이 때 상기 형광물질은 Cy3, Cy5, Alexa, BODIPY. Phodamine 또는 Q-dot에서 선택된 형광물질을 사용하고, 형광분석을 통해 혈액응고인자 13의 활성도를 측정하는 것이 바람직하다.

구체적으로, 전술한 바와 같이 바이오틴에 널리 사용되고 있는 표지물질로는 스트렙타비딘(streptavidin)이나 아비딘(avidin)을 사용할 수 있는데, 특히 상기 분석용 표지물질로 Cy3, Cy5, Alexa, BODIPY, Rhodamine 또는 Q-dot에서 선택된 형광표지물질이 결합된 스트렙타비딘 또는 아비딘을 사용함으로서 형광분석을 통해 혈액응고인자 13의 활성도를 측정할 수 있도록 하는 것이 좋다. 이외에도 상기 분석용 표지물질로 알칼라인 포스파타아제(Alkaline phosphatase), 호스라디쉬 퍼옥시다아제(Horseradish peroxidase) 또는 루시퍼라제(luciperase)에서 선택된 효 소(enzyme)가 표지된 스트렙타비딘 또는 아비딘을 사용하고, 이를 크로모제닉 기질(Chromogenic substrate)과 반응시켜 트랜스글루타미나아제의 활성도를 측정할 수도 있다. 이외에도 필요 에 따라서는 다양한 공지된 분석용 표지물질이 사용될 수 있다.

전술한 바와 같은 방법에 따라 혈액응고인자 13의 활성을 측정하게 되면 종래 일반적으로 사용되는 방법들 (예컨대, ELISA 분석방법을 이용하여 FXIII의 활성도를 분석하는 방법)에 비하여 분석 시간을 현저하게 단축시킬 수 있으며, 소량의 시료를 사용하면서도 높은 감도로 측정이 가능할 뿐만 아니라 다수의 시료를 동시에 분석할 수 있게 된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 혈액응고인자 13의 활성도 측정용 칩의 제조방법을 제공한다.

a) 아미노 잔기를 갖는 3-아미노프로필-트리메톡시실란을 기판의 표면에 도입하는 단계;

b) 상기 기판의 표면에 소정의 간격으로 천공된 테이프를 부착하여 다수의 스폿이 형성된 어레이 칩을 제조하는 단계; 및

c) 상기 스폿 상에 혈액응고인자 13의 기질단백질을 도입하는 단계.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 아미노 잔기를 갖는 3-아미노프로필-트리메톡시실란이 도입된 기판의 표면에 소정의 간격으로 천공된 테이프를 부착 하여 다수의 스폿을 형성하고, 상기 스폿의 단부에 혈액응고인자 13의 기질단백질을 도입하여 제조되는 혈액응고인자 13 활성도 측정용 칩을 제공한다.

이하, 본 발명의 혈액응고인자 13의 활성도 측정방법을 단계별로 보다 구체적으로 설명한다.

먼저, 슬라이드 글라스 표면에 3-아미노프로필-트리메톡시실란을 이용하여 아민 잔기를 갖도록 제작한 후, 피브리노겐을 고정시켜 어레이를 제작한다. 그 위에서 FXIII이 포함된 혈액을 트롬빈, Ca²⁺, 5-(바이오틴아미도)펜틸아민, DTT (dithiothreitol)이 포함된 반응용액과 함께 반응시키고, 기질과 반응이 일어난 5-(바이오틴아미도)펜틸아민을 Cy3 형광이 표지된 스트렙타비딘으로 분석함으로써 혈액이나 세포내의 FXIII의 활성도를 분석한다.

구체적으로, 본 발명에서는 슬라이드 글라스 표면에 1.5 중량%의 3-아미노프로필-트리메톡시실란을 이용하여 아민 잔기를 갖도록 제작한 후, 그 표면에 소정의 간격으로 천공된 테이프를 부착하여 다수의 스팟이 형성된 어레이 칩을 제작하였다. FXIII의 기질인 50 μg/ml의 피브리노겐을 고정시킨 후, 기질 단백질이 결합되지 않은 스팟의 빈 부분을 3% BSA in PBST (0.1% Tween 20) 용액으로 블로킹시킨다. 그 위에 Tris-HCl (pH 8.3) 40 mM (4.84 mg/ml), NaCl 140 mM (8.18 mg/ml), thrombin 100 unit/ml (0.0083 mg/ml), Ca²⁺2 mM (0.3 mg/ml), BAPA 1 mM (0.328 mg/ml), DTT 0.5 mM (0.77 mg/ml), 400배 희석된 혈장 (0.16~0.2 mg/ml)이 포함된 반응 용액을 올려 반응시킨다. 그 후, 기질과 반응이 일어난 5-(바이오틴아미도)펜틸아민을 Cy3 형광이 표지된, 바이오틴과 결합력이 우수하다고 알려져 있는 스트렙타비틴(10 μg/ml)으로 분석함으로써 혈액이나 세포내의 FXIII의 활성도를 분석하였다. 형광 강도가 높아지는 것은 FXIII 활성도가 높아진다는 의미이다.

본 발명은 ELISA 분석방법을 이용하여 FXIII의 활성도를 분석하는 기존의 방법 대신 어레이 형태로 칩을 제작하고, 이를 이용하여 혈액이나 세포 내의 FXIII의 활성도를 분석함에 따라 아래와 같은 효과를 얻을 수 있다.

1. 다수의 혈액이나 세포에서 FXIII의 활성도를 동시에 분석할 수 있어 효율적이고 FXIII의 활성도를 정량분석 할 수 있다.

2. 종래의 방법은, 시료의 양이 많이 필요하고, 최종분석까지 걸리는 시간이 오래 걸린다. 그러나 본 발명은 단시간 내에 분석이 가능하고 극히 소량의 시료로 분석하므로 경제적이다.

3. 종래의 방법으로 FXIII의 활성도 분석 시 일정농도 이상에서만 활성도 분석이 가능했으나 본 발명은 감도가 높은 형광을 이용하기 때문에 고감도로 분석이 가능하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의 해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 혈액응고인자 13의 (Factor XIII, FXIII) 활성도 측정을 위한 단백질 칩의 제작

슬라이드 글라스(slide glass)를 70℃의 세정액(H₂O₂ : NH₄OH : dH₂O = 1 : 1 : 5)에서 10분 동안 세정한 다음, 에탄올 용액에 3-아미노프로필-트리메톡시실란(3-aminoproply-trimethoxysilane)이 1.5 중량% 함유되도록 용해시켜 제조한 용액에 상기 슬라이드 글라스를 2시간 동안 침적한 후, 에탄올과 증류수로 세척하고, 110℃의 오븐(oven)에서 1시간 동안 건조하여 슬라이드 글라스 표면에 3-아미노프로필트리메톡시실란을 도입하였다.

상기 3-아미노프로필트리메톡시실란이 도입된 슬라이드 글라스 표면에 펀치를 이용하여 직경 1.5 mm의 스폿을 형성한 테플론 테이프를 부착하여 다수의 스폿을 갖는 어레이 칩을 제조하였다. 그런 다음, 인산완충용액(pH 7.4)에 FXIII의 기질인 피브리노겐(fibrinogen)을 50 μg/ml의 농도로 만들어 적하하고, 1시간 동안 37℃의 인큐베이터에서 반응시켰다. 이후 0.1 중량% Tween 20 포함된 PBS로 10분 동안 세척해준 다음 다시 5분간 증류수로 세척해주고, 공기로 건조하여 3-아미노프로필트리메톡시실란이 부착된 어레이 칩에 피브리노겐을 도입하였다.

PBST(8.1 mM Na₂HPO₄, 1.2 mM KH₂PO₄, pH 7.4, 2.7 mM KCl, 138 mM NaCl, 0.1% Tween 20)에 BSA(bovine serum albumin)를 3 중량%가 되도록 첨가한 블로킹 용액을 상기 피브리노겐이 도입된 스폿 상에 적하하고 1시간 동안 37℃의 인큐베이터에서 방치하였다. 이후 0.1 중량% Tween 20 포함된 PBS로 10분 동안 세척해 준 다음, 다시 5분간 증류수로 세척해주고 공기로 건조하여 어레이 타입의 FXIII 활성도 측정용 칩을 제조하였다.

상기에서 제조한 FXIII 활성도 측정용 칩의 피브리노겐 상에 Tris-HCl (pH 8.3) 40 mM (4.84 mg/ml), NaCl 140 mM (8.18 mg/ml), thrombin 100 unit/ml (0.0083 mg/ml), Ca²⁺2 mM (0.3 mg/ml), BAPA 1 mM (0.328 mg/ml), DTT 0.5 mM (0.77 mg/ml), 400배 희석된 혈장 (0.16~0.2 mg/ml)이 포함된 반응 용액을 1.2 μl적하하였다.

30분 동안 37℃의 인큐베이터에서 방치한 후, 0.1 중량% Tween 20 포함된 PBS로 10분 동안 세척해준 다음 다시 5분간 증류수로 세척해주고 공기를 불어주면서 건조하였다. 그런 다음, 형광물질 Cy3이 표지된 스트렙타비딘(streptavidin)을 적하하여 바이오틴(biotin)과 결합하도록 한 후 형광 스캐너(Scan Array Lite)로 스캐닝하여 세기를 측정하였다. 형광강도가 높아지는 것은 FXIII 활성도가 높아진다는 의미이다. 도 1은 혈액이나 세포내의 FXIII 활성도 측정을 위한 칩의 제조과정을 나타낸 모식도이다.

실시예 2. 트롬빈의 농도에 따른 FXIII 활성도 측정 결과

FXIII은 트롬빈과 Ca²⁺의 작용으로 활성을 갖는 FXIIIa의 형태가 된다. 이 실험은 적절한 트롬빈의 농도를 결정하기 위한 것이다. 실험방법은 도 1에서 설명한 방법과 동일하고, 그 중 트롬빈의 농도만을 블랭크(blank, 배경의 형광강도를 확인하기 위해 혈장 대신 혈장을 희석한 TBS용액만을 사용하고, 트롬빈 농도는 0.5 unit을 사용), 0, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1 unit으로 하였다. 그리고 0.13 M 트리소디움 시트레이트(trisodium citrate)가 들어있는 튜브로 채취한 혈장을 사용하였다.

측정결과, 도 2에서와 같이 트롬빈이 없을 때는 FXIIIa 활성도가 나타나지 않지만 트롬빈의 농도가 높아짐에 따라 FXIIIa 활성도가 높아지는 결과를 얻었으며, 여기서 나타난 형광강도가 FXIII의 활성도라는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 FXIII 활성도 측정용 칩을 이용한 FXIII 활성도 측정이 가능함을 보여준다.

실시예 3. Ca ²⁺ 농도에 따른 FXIII 활성도 측정 결과

FXIII은 트롬빈과 Ca²⁺의 작용으로 활성을 가지는 FXIIIa의 형태가 되고, FXIIIa는 Ca²⁺에 의해 단백질 사이의 공유교차결합을 촉진시킨다. 이 실험은 적절한 Ca²⁺의 농도를 결정하였다. 실험 방법은 도 1에서 설명한 방법과 동일하고, 그 중 Ca²⁺ 농도만을 다르게 하였다. Ca²⁺의 최종 농도를 블랭크(배경의 형광강도를 확인하 기 위해 혈장 대신 혈장을 희석한 TBS용액만을 사용하고, Ca²⁺ 농도는 2 mM 사용), 0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20 mM이 되도록 하여 FXIII 활성도를 확인하였다. 그리고 0.13 M 트리소디움 시트레이트가 들어있는 튜브로 채취한 혈장을 사용하였다.

측정결과, 도 3에 나타난 바와 같이 Ca²⁺의 농도가 증가함에 따라 FXIII의 활성도도 증가하는 것을 확인함으로써 Ca²⁺에 의해 공유교차결합 반응이 유도됨을 확인할 수 있다.

실시예 4. FXIII 활성도 저해제에 따른 FXIII의 활성도 억제 결과

MDC(monodansylcadaverine)는 혈액응고인자 13의 활성도 저해제로 알려져 있으며 BAPA와의 경쟁반응을 통하여 FXIII의 활성도를 저해한다. 이 실험은 FXIII의 활성도가 저해제에 의해서 억제되는지를 확인하고자 한 것이다. 실험 방법은 도 1에서 설명한 방법과 동일하고, 그 중 반응 용액에서 MDC의 농도를 다르게 하였다. 최종 농도를 블랭크(배경의 형광 강도를 확인하기 위해 혈장 대신 혈장을 희석한 TBS용액만을 사용, 저해제는 넣지 않음) 0, 0.001, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1 mM가 되도록 하여 MDC를 이용한 FXIII 활성도의 억제를 확인하였다. 그리고 0.13 M 트리소디움 시트레이트가 들어있는 튜브로 채취한 혈장을 사용하였다.

측정결과, 도 4에 나타난 바와 같이 MDC의 농도에 따라 FXIII 활성도가 감소하는 것을 확인하였다. 이로써 얻어진 형광강도가 FXIII 활성도라는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5. FXIII 활성도 측정용 칩을 이용한 사람 혈장 내에서의 FXIII 활성도 측정

FXIII 활성도 측정용 칩을 이용하여 상기 실시예들에서 확인한 조건들을 바탕으로 실제 사람의 혈장 내에서 FXIII 활성도를 측정하였다. 실험방법은 도 1에서 설명한 방법과 동일하고, 0.13 M 트리소디움 시트레이트(trisodium citrate)가 들어있는 튜브로 채취한 혈장 총 40개를 분석하였다.

도 5는 실제 사람의 혈장 내에서의 FXIII 활성도를 측정한 결과를 보여준다. 실험결과를 통하여 FXIII 활성도 측정용 칩을 이용해 다수의 환자 혈장에서 FXIII 활성도를 초고속으로 측정할 수 있음을 확인하였다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 소량의 시료를 가지고 다수의 시료를 동시에 분석할 수 있기 때문에 분석 시간이 단축되고, 활성도의 정량분석이 가능할 뿐만 아니라, 경제적이기 때문에 혈액이나 세포 내의 FXIII의 기능 연구나 질병 진단에 크게 이용될 수 있을 것으로 생각된다. 현재의 단백질 분석 칩의 시장은 기하급수적으로 성장하고 있으며, 본 발명에 따른 어레이 형태의 활성도 분석 방법은 기존의 분석방법에 비하여 우수한 특성과 성능을 발휘하므로 이의 대체가 가능하여 경제성 및 시장성이 높을 것으로 사료된다.

도 1은 혈액이나 세포내의 FXIII 활성도 측정을 위한 칩의 제조과정을 나타낸 모식도이다.

도 2는 트롬빈의 농도에 따른 FXIII 활성도 측정 결과를 보여준다.

도 3은 Ca²⁺ 농도에 따른 FXIII 활성도 측정 결과를 보여준다.

도 4는 MDC의 농도에 따른 FXIII 활성도 측정 결과를 보여준다.

도 5는 실제 사람의 혈장 내에서의 FXIII 활성도를 측정한 결과를 보여준다.

Claims

하기 단계들을 포함하는 혈액응고인자 13의 활성도 측정방법:

a) 다수의 스폿(spot) 상에 혈액응고인자 13(Factor XIII)의 기질인 피브리노겐(fibrinogen)이 고정된 어레이(array) 칩을 준비하는 단계;

b) 활성도 측정용 혈액응고인자 13 함유 시료와 트롬빈(trombin), Ca²⁺ 및 5-(바이오틴아미도)펜틸아민(5-(biotinamido)pentylamine)을 함유하는 반응용액을 상기 피브리노겐 상에 적하하여 피브리노겐의 글루타민과 5-(바이오틴아미도)펜틸아민의 사이의 아미드전이반응(transamidation)을 시키는 단계; 및

c) 상기 아미드전이반응 생성물의 말단부에 위치한 바이오틴에 분석용 표지물질을 도입한 다음 이의 분석을 통해 혈액응고인자 13의 활성도를 측정하는 단계.
제 1항에 있어서, 상기 a)단계에서 피브리노겐을 고정한 후 피브리노겐이 결합되지 않은 스폿의 빈 부분을 블로킹(blocking) 용액으로 처리하여 블로킹시키는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액응고인자 13의 활성도 측정방법.
제 1항에 있어서, 상기 c)단계에서 형광물질이 표지된 스트렙타비딘 또는 아 비딘을 이용하는 것을 특징으로 하는 혈액응고인자 13의 활성도 측정방법.
제 3항에 있어서, 상기 형광물질은 싸이3(Cy3), 싸이5(Cy5), 알렉사(Alexa), 보디피(BODIPY), 로다민(Rhodamine) 또는 큐-도트(Q-dot)에서 선택된 형광물질을 사용하고, 형광분석을 통해 혈액응고인자 13의 활성도를 측정하는 것을 특징으로 하는 혈액응고인자 13의 활성도 측정방법.
하기 단계들을 포함하는 혈액응고인자 13의 활성도 측정용 칩의 제조방법:

a) 아미노 잔기를 갖는 3-아미노프로필-트리메톡시실란을 기판의 표면에 도입하는 단계;

b) 상기 기판의 표면에 소정의 간격으로 천공된 테이프를 부착하여 다수의 스폿이 형성된 어레이 칩을 제조하는 단계; 및

c) 상기 스폿 상에 글루타민을 포함하는 혈액응고인자 13의 기질단백질을 도입하는 단계.
아미노 잔기를 갖는 3-아미노프로필-트리메톡시실란이 도입된 기판의 표면에 소정의 간격으로 천공된 테이프를 부착하여 다수의 스폿을 형성하고, 상기 스폿의 단부에 글루타민을 포함하는 혈액응고인자 13의 기질단백질을 도입하여 제조되는 혈액응고인자 13 활성도 측정용 칩.