CN110168367A - 包含氧化还原调节蛋白的生物硫醇检测组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含氧化还原调节蛋白的生物硫醇检测组合物、使用其检测生物硫醇的方法，以及用于检测生物硫醇的生物传感器/试剂盒。本发明提供了快速测量体液中游离生物硫醇的效果。此外，可以实时检测体液中总生物硫醇和游离生物硫醇之间的相对含量比及变化，这允许生物硫醇作为疾病的主要指标，通过其可以对各种疾病预测和警告。此外，由于通过生物硫醇的变化可以解释与主要疾病相关的各种氧化还原应激变化，因此本发明可以在将来为发病机制的调查研究和疾病的诊断提供重要的技术、经济和社会价值。

Description

包含氧化还原调节蛋白的生物硫醇检测组合物
技术领域
本发明涉及包含氧化还原调节蛋白的生物硫醇检测组合物、使用该组合物的生物硫醇检测方法以及用于检测生物硫醇的生物传感器/试剂盒。
背景技术
生物硫醇例如蛋白质中存在的半胱氨酸是不同于硫醇的低分子量(LMW)硫醇，并且在所有生物体(从细菌到人类)中对体内氧化应激的抗性和生理活性的调节起重要作用。这种生物硫醇对氧化还原反应非常敏感，被诸如SOH、SO2H、SNO或S-S的官能团修饰，并因此用作生物分子活性的调节开关。生物硫醇不仅在细胞中丰富，而且是在诸如血液、尿液、汗液和泪液的主要人体体液中被广泛检测到。存在于体液中的生物硫醇包括半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、半胱胺(CA)、γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-GluCys)、半胱氨酰甘氨酸(CysGly)、N-乙酰半胱氨酸(N-AC)、辅酶A(CoA)、辅酶B(CoB)、辅酶M(CoM)、芽孢杆菌硫醇(bacillithiol)(BacT)、放线硫醇(mycothiol)(MyT)、麦角硫因(ErT)和锥虫硫酮(trypanothione)(TrT)。据报道，这些生物硫醇中的特别是Cys、Hcy和GSH的浓度的体内变化与各种类型的疾病密切相关，并且所有浓度范围彼此不同[非专利文献1和2]。在实际血浆中，虽然Hcy、Cys和GSH的总浓度(总氧化和还原量)分别在6至20μM、150至350μM和4至10μM的范围内，但是由于血浆中的高氧化条件，几乎所有的Hcy和Cys都以氧化形式存在，因此游离形式以非常少的量存在，例如，在Hcy的情况下约为0.2μM或更小，在Cys的情况下约为10μM或更小。类似地，GSH在细胞中也过量(>5mM)存在，但在血浆中通过γ-谷氨酰转移酶等快速转化，因此游离形式仅以2μM或更少的浓度存在。这些生物硫醇的总浓度和游离形式浓度的相对变化主要与包括心血管疾病、神经退行性疾病、癌症、肾功能障碍、糖尿病以及细菌和病毒感染的重大疾病相关[非专利文献3至7]。然而，尽管作为疾病的常见生物标志物的这些主要生物硫醇可用作指示物，可以检测能够早期检测生物体异常反应的指示物，但是由于快速的氧化还原过程，没有有效检测LMW生物硫醇浓度的方法。因此，迄今为止，LMW生物硫醇不能广泛使用。
用于测量LMW生物硫醇水平的大多数常规标准分析方法依赖于高效液相色谱(HPLC)、气相色谱-质谱(GC-MS)或毛细管电泳(CE)。然而，在这样的分析方法中，存在技术挑战，其中必须还原LMW生物硫醇以仅测量总量，因为体液样品的预处理需要过量时间消耗，和成本问题。虽然多种文献已经公开了在血液样品预处理期间通过添加抗氧化剂和金属离子螯合剂来测量游离LMW生物硫醇[非专利文献8和9]，但即使在这种环境中，也难以精确测量游离LMW生物硫醇的量，因为对于长的分析时间来说游离LMW生物硫醇的氧化非常快。
作为测量LMW生物硫醇的另一种方法，已经广泛使用市售的基于抗体的免疫分析试剂盒，但是本文使用的所有抗体均不直接识别游离的LMW生物硫醇，而是识别氧化的生物硫醇与蛋白质(例如，在血液的情况下，为血清白蛋白)结合的形式。因此，存在一个限制，即不能检测到游离LMW生物硫醇和总LMW生物硫醇的动态变化。
在目前报道的方法中，荧光染料的各种变体，例如罗丹明、荧光素、BODIPY、花青、黄酮或香豆素，已被用作化学探针，用于基于荧光变化检测游离LMW生物硫醇[非专利文献8]。使用这些方法，难以测量通过二硫键形式与蛋白质结合的氧化LMW生物硫醇，因为这些化学物质与游离硫醇快速反应并诱导上述荧光变化。此外，包括苯环变体的合成化学品具有非常低的溶解度，易受pH变化的影响，并且能够与蛋白质中存在的游离Cys反应。因此，专门测量游离LMW生物硫醇存在很大的局限性。最重要的是，当将化学探针直接应用于体液样品时，由大范围的自发荧光引起的干扰显著限制了重复性和准确性，因此通过该方法检测游离LMW生物硫醇主要限于细胞内荧光成像。
因此，迫切需要开发一种新技术来解决上述问题，并快速准确地测量体液中作为疾病指标的游离LMW生物硫醇和总LMW生物硫醇的含量。
[非专利文献]
(非专利文献1)Persichilli,S.,Gervasoni,J.,Castagnola,M.,Zuppi,C.&Zappacosta,B.A Reversed-Phase HPLC Fluorimetric Method for SimultaneousDetermination of Homocysteine-Related Thiols in Different BodyFluids.Labmedicine 42,657-662(2011)
(非专利文献2)Fiskerstrand,T.,Refsum,H.,Kvalheim,G.&Ueland,P.M.Homocysteine and Other Thiols in Plasma and Urine-Automated-Determinationand Sample Stability.Clin Chem 39,263-271(1993))
(非专利文献3)Seshadri,S.等人.Plasma homocysteine as a risk factor fordementia and Alzheimer's disease.New Engl J Med 346,476-483,(2002)
(非专利文献4)Refsum,H.,Ueland,P.M.,Nygard,O.&Vollset,S.E.Homocysteineand cardiovascular disease.Annu Rev Med 49,31-62(1998)
(非专利文献5)Herzenberg,L.A.等人.Glutathione deficiency is associatedwith impaired survival in HIV disease.P Natl Acad Sci USA 94,1967-1972(1997)
(非专利文献6)El-Khairy,L.,Ueland,P.M.,Refsum,H.,Graham,I.M.&Vollset,S.E.in Circulation Vol.103 2544-2549(2001)
(非专利文献7)Andersson,A.,Lindgren,A.,Arnadottir,M.,Prytz,H.&Hultberg,B.Thiols as a measure of plasma redox status in healthy subjects andin patients with renal or liver failure.Clin Chem 45,1084-1086(1999)
(非专利文献8)Jung,H.S.,Chen,X.Q.,Kim,J.S.&Yoon,J.Recent progress inluminescent and colorimetric chemosensors for detection of thiols.Chem SocRev 42,6019-6031,doi:Doi 10.1039/C3cs60024f(2013)
发明内容
技术问题
因此，作为发明人试图解决检测生物硫醇的常规方法的问题的结果，他们开发了使用氧化还原调节蛋白的生物硫醇检测组合物，其同时测量游离LMW生物硫醇和总LMW生物硫醇，并且以非常少的量执行检测，从而提高灵敏度并显示出优异的即时性和储存稳定性，从而完成了本发明。
因此，本发明涉及提供生物硫醇检测组合物，其包含氧化还原调节蛋白。
本发明还涉及提供使用该组合物检测LMW生物硫醇的方法。
本发明还涉及提供使用该组合物的生物传感器。
本发明还涉及提供使用该组合物的生物芯片。
技术解决方案
在一个方面，本发明提供了LWM生物硫醇检测组合物，其包含氧化还原调节蛋白。
在另一方面，本发明提供了使用该组合物检测生物硫醇的方法。
在另一方面，本发明提供了使用该组合物的生物传感器。
在另一方面，本发明提供了使用该组合物的生物芯片。
有益效果
根据本发明的生物硫醇检测组合物可以快速测量体液中游离形式的生物硫醇。此外，可以实时检测体液中总LMW生物硫醇和游离LMW生物硫醇之间的相对含量比及其含量变化，因此生物硫醇可以用作疾病的主要指标，从而允许对多种疾病预测和警告。此外，由于与主要疾病相关的氧化还原应激的变化可以通过LMW生物硫醇的变化来解释，因此它可以在将来为疾病的病理机制的鉴定和疾病的诊断提供重要的技术、经济和社会价值。
附图说明
图1是说明通过LMW生物硫醇从操纵基因dsDNA解离有机氢过氧化物调节剂(OhrR)的原理的示意图。
图2是通过使用荧光各向异性(FA)测量OhrR与半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)的实时结合而获得的结果。
图3是通过使用电泳确认OhrR蛋白与操纵基因dsDNA的结合而获得的实验结果。
图4是在光传感器表面上没有荧光标签的情况下，通过使用光折射率测量LMW生物硫醇从操纵基因dsDNA解离OhrR蛋白的过程而获得的实验结果。
图5是使用MALDI-TOF MS确认OhrR和LMW生物硫醇之间的关联是否被定量分析的结果。
图6是通过使用MALDI-TOF MS和OhrR分析小鼠血液样品和人血液样品中对照组和比较组中游离LMW生物硫醇的相对量而获得的实验结果。
图7是通过使用FA在还原条件下研究OhrR和Cys的实时反应以确认测量总LMW生物硫醇的可能性而获得的结果。
图8是通过使用MALDI-MS和OhrR在将半胱氨酸以不同浓度加入小鼠血液后检测游离半胱氨酸和总半胱氨酸而获得的结果。
图9是说明根据本发明的一个示例性实施方案检测LMW生物硫醇的方法的示意图。
图10是通过根据如图9所示的检测LMW生物硫醇的方法测量荧光而获得的结果。
图11是通过根据如图9所示的检测LMW生物硫醇的方法测量化学发光而获得的结果。
图12是说明DNA的信号放大的示意图。
图13A是通过测量化学发光以确认图12的DNA信号放大而获得的结果。
图13B是确认图12的DNA信号放大的电泳结果。
图14是用于测量OhrR和dsDNA之间的关联的生物芯片的配置的示意图。
图15是通过使用图14的生物芯片检测LMW生物硫醇而获得的结果。
图16是图9的条型(strip-type)生物传感器的示意图。
具体实施方式
根据本发明的示例性实施方案，提供了包含氧化还原调节蛋白的LMW生物硫醇检测组合物及使用其检测生物硫醇的方法。
根据本发明的示例性实施方案，提供了生物硫醇检测组合物，以及使用该组合物检测生物硫醇的方法，该组合物除了氧化还原调节蛋白外还包含与氧化还原调节蛋白结合的DNA。
本文使用的术语“氧化还原调节蛋白”是指其活性受氧化还原反应调节的所有蛋白质，并且代表性地包括的有机氢过氧化物调节剂(OhrR)和过氧化物调节剂(PerR)——其存在于如枯草芽孢杆菌的某些种的细菌中，以及存在于包括大肠杆菌的某些种的细菌中的氧调节剂(OxyR)。此外，可包括一种氧化还原调节蛋白，其通过对存在于不同类型生物体中的直系同源蛋白引入蛋白质工程或筛选，从而修饰氧化还原调节蛋白活化位点的氨基酸，从而更有选择性地与特定的生物硫醇反应。
氧化还原调节蛋白可包括能够调节生物硫醇和DNA之间的结合亲和力的变体，或蛋白标签缀合的蛋白。缀合物形式的实例可包括荧光蛋白-OhrR、发光蛋白-OhrR、FLAG-OhrR、His6-OhrR、GSH-OhrR和生物素-OhrR。
本文使用的术语“生物硫醇”是指分子量为10至1000Da(优选10至500Da)的LMW硫醇，并且具体地，可以是选自由半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、半胱胺(CA)、γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-GluCys)、半胱氨酰甘氨酸(CysGly)、N-乙酰半胱氨酸(N-AC)、辅酶A(CoA)、辅酶B(CoB)、辅酶M(CoM)、芽孢杆菌硫醇(BacT)、放线硫醇(MyT)、麦角硫因(ErT)和锥虫硫酮(TrT)组成的组的一种或多种，但本发明不限于此。
此外，生物硫醇是与心血管疾病、神经变性疾病、癌症、肾功能障碍、糖尿病以及细菌和病毒感染相关的多种疾病的生物标志物，以及能够早期检测生物体中的异常反应的指示物。
本发明包括包含氧化还原调节蛋白和与氧化还原调节蛋白结合的DNA的LMW生物硫醇检测组合物，以及使用该组合物检测生物硫醇的方法。
根据本发明的示例性实施方案，可以通过使用氧化还原调节蛋白与其操纵基因dsDNA之间的结合/解离原理来检测生物硫醇。
在一个实例中，所述DNA可以由以下实施例中使用的SEQ ID NO：1和/或SEQ IDNO：2，和与氧化还原调节蛋白结合的任意一种DNA表示。
检测LMW生物硫醇的原理在图1中以示例性实施方案示出。
作为氧化还原调节蛋白的代表性实例，OhrR是细菌中存在的有机氢过氧化物(ROOH)的检测因子，并且OhrR作为同源二聚体存在并且每个单体具有一个半胱氨酸残基。当半胱氨酸残基被还原时(-SH)，OhrR维持DNA结合形式(OhrR和DNA的复合物)，并且OhrR在有机氢过氧化物存在下被快速氧化(-SOH)。氧化的OhrR维持其与dsDNA的结合，并在LMW生物硫醇存在下与生物硫醇快速反应，导致与dsDNA的解离(通常当生物硫醇含量为10μM或更高时，t1/2～0.5min；t1/2表示蛋白质与DNA解离50％的时间)。解离速率根据LMW生物硫醇的浓度和类型而变化。同时，OhrR在不存在生物硫醇的情况下通过ROOH以相对低的速率形成亚磺酰胺(-S-N-)，并因此从dsDNA缓慢解离(t1/2～10min)。
与氧化还原调节蛋白结合的DNA可以通过缀合荧光因子或基于DNA的酶(DNA酶)来促进荧光、化学发光和吸光度检测，或者可以通过信号放大方法扩增DNA序列以提高反应灵敏度。
本发明中特定类型的荧光因子没有特别限制，并且可以是，例如，选自由罗丹明及其衍生物、荧光素及其衍生物、香豆素及其衍生物、吖啶及其衍生物、芘及其衍生物、赤藓红及其衍生物、曙红及其衍生物以及4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸基二苯乙烯-2,2'二磺酸组成的组的一种或多种。可用于本发明的荧光材料的更具体的实施例如下。
罗丹明及其衍生物可包括6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸酯、磺酰罗丹明B、磺酰罗丹明101、磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红(Texas Red))、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四甲基罗丹明、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)、核黄素、玫瑰酸、铽螯合物衍生物、Alexa衍生物、Alexa-350、Alexa-488、Alexa-547和Alexa-647；
荧光素及其衍生物可包括5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(6-FAM)、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、QFITC(XRITC)、荧光胺、IR144、IR1446、孔雀石绿异硫氰酸酯、4-甲基伞形酮、邻甲酚酞、硝基酪氨酸、对-乙二胺、酚红、B-藻红蛋白和邻苯二甲醛；
香豆素及其衍生物可包括香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)、四氯四溴荧光素(cyanosine)、4'-6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)、5',5”-溴邻苯三酚-磺酰酞(溴邻苯三酚红)、7-二乙氨基-3-(4'-异硫氰酸基苯基)-4-甲基香豆素二亚乙基三胺五乙酸酯、4-(4'-二异硫氰酸二氢芪-2,2'-二磺酸、4,4'-二异硫氰酸基二苯乙烯-2,2'-二磺酸、5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)、4-(4'-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)和4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)；
吖啶及其衍生物可包括吖啶、吖啶异硫氰酸酯、5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3,5-二磺酸盐(LuciferYellowVS)、N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺、邻氨基苯甲酰胺和亮黄(Brilliant Yellow)；
芘及其衍生物可包括芘、芘丁酸酯(pyrene butyrate)、琥珀酰亚胺基1-芘丁酸酯(succinimidyl 1-pyrenebutyrate)和活性红4(Brilliant Red 3B-A)；
赤藓红及其衍生物可包括赤藓红B、赤藓红异硫氰酸酯和乙锭；
曙红及其衍生物可包括曙红和曙红异硫氰酸酯；以及
包括4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸基芪-2,2'二磺酸。
所述基于DNA的酶在多种基于DNA的酶中可具有选自由以下组成的组的一种或多种序列：具有过氧化物酶特征的模拟过氧化物酶的DNA酶[Wang Li等人Insight into G-quadruplex-hemin DNAzyme/RNAzyme:adjacent adenine as the intramolecularspecies for remarkable enhancement of enzymatic activity.Nucleic AcidsResearch 44(15)；7373-7384(2016)]和切割RNA的DNA酶[Meng Liu,Dingran Chang,andYingfu Li.Discovery and Biosensing Applications of Diverse RNA-CleavingDNAzymes,Accounts of Chemical Research,50；2273-2283(2017)]，但本发明不限于此。
根据信号放大方法，通过以下方法扩增DNA序列，而无需PCR：在氧化还原调节蛋白结合DNA的一端结合一条短DNA序列(组合能够DNA扩增的单链DNA模板)并另外使发夹1(HP1)和发夹2(HP2)反应。DNA的序列和长度以及发夹类型不限于以下实施例(表1)中所述。
此外，通过将标签(包括生物素基团、炔基、叠氮基、硫醇基和胺基)与DNA序列的5'或3'末端结合，可以仅将DNA分离或结合到珠(bead)、纳米颗粒或芯片的表面上。
术语“生物硫醇检测”是指使用氧化还原调节的生物硫醇测量。
生物硫醇测量通过选自由凝胶电泳、荧光各向异性、基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、表面等离子体共振(SPR)、干涉测量和珠测量方法组成的组的一种或多种进行。
特别地，通过使用电泳，可以在没有特定设备的情况下容易地确认蛋白质和DNA的结合。
此外，通过使用MALDI-TOF MS，可以根据LMW生物硫醇的类型定量分析氧化还原调节蛋白和生物硫醇之间的结合，并且可以分析游离或总LMW生物硫醇水平。
另外，通过使用如图9所示的珠测量方法，可以通过将荧光标签或基于DNA的酶与氧化还原调节蛋白结合DNA连接，从而通过荧光或化学发光检测生物硫醇。这里，FLAG标签、His6标签、GSH标签或生物素标签可以与氧化还原调节蛋白结合，并且与其结合的蛋白质使用标签和亲和珠(FLAG亲和珠、NTA-珠、谷胱甘肽珠或基于抗生物素蛋白的珠)检测生物硫醇。
根据本发明的生物硫醇检测组合物可以独立地或同时地检测游离LMW生物硫醇和总LMW生物硫醇中的每一种。
根据本发明的示例性实施方案，当检测总生物硫醇时，还要向组合物中加入还原剂。由于OhrR仅与还原的游离LMW生物硫醇结合，因此为了检测样品中的总LMW生物硫醇，通过在样品中使用还原剂快速还原氧化的生物硫醇，可以通过OhrR检测总生物硫醇。具体地，还原剂为选自由二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇和三(2-羧乙基)膦(TCEP)组成的组的一种或多种，但本发明不限于此。
本发明还包括用于检测LMW生物硫醇的生物芯片，其包括所述组合物。
根据如图14所示的本发明的示例性实施方案，生物芯片与DNA固定化板上的氧化还原调节蛋白反应，以与能够结合氧化还原调节蛋白的DNA形成复合物。这里，由于使用与亲和标签结合的氧化还原调节蛋白将氧化还原调节蛋白与附着于生物芯片表面的DNA解离，而不是标记到DNA，因此在LMW生物硫醇存在下使用检测信号减少的原理来测量生物硫醇。
本发明包括用于检测LMW生物硫醇的生物传感器，其包括所述组合物。
根据本发明的示例性实施方案，包括用于检测LMW生物硫醇的条型生物传感器。
根据本发明的示例性实施方案，用于检测LMW生物硫醇的生物传感器包括三个部分：
样品引入部分，其包括能够与氧化还原调节蛋白和与蛋白结合的DNA的复合物结合的固定部分，并引入样品和复合物的混合物；
反应部分，其与样品引入部分线性间隔预定距离，并且其中DNA在复合物氧化后解离；以及
测量部分，其形成是为了通过转移解离的DNA以测量LMW生物硫醇。
固定部分可以与抗体(例如，FLAG标签-OhrR、抗FLAG抗体或抗His6抗体)或受体(例如，His6标签-OhrR、NTA或生物素-OhrR、或链霉亲和素(包括亲和素和中性亲和素))组合。
例如，用于检测生物硫醇的这种条型生物传感器显示在图16中。
可以相对地测量血液中存在的LMW生物硫醇的氧化/还原量。在样品引入部分中，当抗体(例如，抗FLAG抗体或抗His6抗体)或亲和受体(例如，亲和素系列或NTA)被固定到能够与OhrR-dsDNA复合物结合的固定部分时，将OhrR-dsDNA混合物滴入样品(例如血浆)中，混合溶液由于色谱原理流向右侧并通过固定部分，然后OhrR-dsDNA不再移动并与固定部分结合。此处，在样品中存在生物硫醇的情况下，与OhrR结合的dsDNA快速解离，使得仅dsDNA移动到右侧，并通过测量部分中dsDNA中存在的DNA酶与基质反应。生物硫醇可以通过化学发光检测。
当使用根据本发明的氧化还原调节蛋白检测生物硫醇时，与常规的生物硫醇检测方法相比，本发明的方法具有如下独特性和优异性。
首先，可以显著提高灵敏度，因此可以将用于测量的样品的量减少到最小。由于OhrR单体以1：1(摩尔比)与生物硫醇结合，因此可以测量与生物硫醇反应的大分子蛋白质(例如，OhrR)，从而提高反应灵敏度(例如，OhrR和OhrR+LMW生物硫醇的质谱分析)。此外，当该方法被设计为向与蛋白质结合的DNA位点引入信号因子和扩增因子，并通过蛋白质的结合或解离来调节DNA信号时，与常规测量方法(色谱、免疫分析或基于化学传感器的分析)相比可以获得更高的灵敏度。另外，目前，当使用OhrR蛋白时，可以仅用约1至2μL血液测量游离生物硫醇以及总生物硫醇，从而将用于分析的样品量减少至最小。
其次，稳定性非常好。氧化还原调节蛋白OhrR可以大量表达，并且虽然其为蛋白质，但由于相对小的尺寸(17kD)，它在室温下不易降解，因此可以长期储存。通常，与过氧化物传感器蛋白不同，由于OhrR与有机氢过氧化物具有特定反应，因此难以在体液中的氧化条件下(例如，在氧和氢过氧化物的存在下)容易地修饰，从而表现出优异的稳定性，并且由于比一般的转录促进因子具有高得多的DNA结合强度(Kd＝10-9M或更低)而在正常条件下难以解离。由于这些原因，当利用蛋白质-DNA结合强度时，背景信号可以保持非常低。
第三，高反应特异性高。氧化还原调节蛋白OhrR在有机氧化物存在下仅与LMW生物硫醇反应，并且不与大分子蛋白中存在的硫醇基反应，因此，能够特异性地仅检测LMW生物硫醇。
第四，游离LMW生物硫醇和总LMW生物硫醇可以同时测量。由于氧化还原调节蛋白OhrR即使在高浓度还原剂存在下也能与生物硫醇稳定地形成混合二硫键，并且与游离LMW生物硫醇具有快速反应性，因此当样品用高浓度的还原剂处理时，可以使用氧化还原调节蛋白快速检测还原的生物硫醇的总量。
第五，可以显著减少反应时间。在氧化还原调节蛋白OhrR中存在一个Cys残基，并且Cys残基与过氧化物之间的二级反应速率为约104至105M-1s-1。该速率比一般蛋白质中存在的Cys残基与游离LMW生物硫醇的过氧化物之间的反应速率(约1M-1s-1)快几万倍或几十万倍，并且生物硫醇和氧化还原调节蛋白之间的二级反应速率约为103M-1s-1，这也比用化学探针(10-2-101M-1s-1)快几千倍。另外，由于感应生物硫醇的氧化还原调节蛋白立即与DNA解离(50％解离时间，t1/2<0.5min)，因此它可以在几分钟内与样品反应，从而迅速诱导产生的信号。
最后，由于氧化还原调节蛋白可以简单地由在大肠杆菌中容易大量表达的蛋白质和短的寡核苷酸序列组成，因此对于低价芯片或生物传感器的构成非常有效。
在下文中，将参照实施例详细描述本发明。提供以下实施例仅用于解释本发明，因此本发明的范围不限于以下实施例。提供实施例是为了使本发明的公开内容完整和本领域普通技术人员完全理解本发明的范围，并且本发明仅由所附权利要求限定。
实施例
实施例1：确认OhrR蛋白与Cys、Hyc或GSH之间的反应性
使用荧光各向异性(FA)测量OhrR的实时DNA结合活性。
<实验条件>
缓冲液：20mM Tris(pH 8.0)150mM NaCl，5％甘油(体积/体积)
DNA浓度：50nM
OhrR浓度：300nM
CHP浓度：3μM
测量时间：每10s测量一次
测量条件：ex 492nm；狭缝宽度15nm，em 520nm；狭缝宽度20nm，积分时间1s
DNA序列：
模板DNA：5’-TAC AAT TTA ATT GTA TAC AAT TTA ATT GTA-3’(SEQ ID NO：1)
互补DNA：5'-TAC AAT TTA ATT GTA TAC AAT TTA ATT GTA-3'(SEQ ID NO：2)
OhrR序列：直接克隆到枯草芽孢杆菌菌株中。
<实验过程>
在实验条件下以3mL缓冲液溶解后，使用LS55发光光谱仪(PerkinElmer)每10秒测量OhrR和荧光(6FAM，6-羧基荧光素)标记的OhrR结合DNA之间的结合活性。当OhrR与DNA结合时，各向异性值(Anis)增加。然而，当OhrR与DNA解离时，各向异性值降低。在每个实验中，以多种浓度(0、1、2、4、8、16、32和64μM)的三种代表性生物硫醇处理，例如半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)。虽然OhrR在仅有游离生物硫醇存在下与DNA结合，但通过用一种代表性的有机氢过氧化物，即氢过氧化枯烯(CHP)处理(在300秒处理)，测量了OhrR与DNA解离的实时解离速率。
<实验结果>
参考图2，证实生物硫醇的浓度越高，OhrR与DNA的解离速率越快。图2的条形图表示当OhrR根据生物硫醇的浓度与DNA解离时各向异性值减半的时间(OhrR的一半从DNA解离的时间)。
实施例2：使用电泳确认OhrR蛋白和靶DNA之间的结合
将荧光探针(FAM)-结合的双链(ds)DNA(200nM)[SEQ ID NO：1和2]与图3中所示浓度的OhrR混合并在室温下反应30分钟，然后通过使用聚丙烯酰胺凝胶(7％)电泳(25mA，30min)用荧光光谱仪(KIF-300，Korea Lab Tech，韩国)检测dsDNA带。可以看出，dsDNA的荧光带从约1.6μM的OhrR浓度(浓度为DNA浓度的约8倍)向上移动。
与实施例1中描述的FA测量方法不同，PAGE电泳不能获得实时测量蛋白质-DNA结合的结果，并且需要大量蛋白质来结合OhrR和DNA(因此，不能通过这种方法测量实际结合常数)，但是这种方法可以用作在没有特定设备的情况下容易地识别结合的方法。
实施例3：使用光折射率在没有荧光标签的情况下测量解离DNA和OhrR蛋白之间结合的过程的实验
使用用于生物层干涉的仪器(Blitz，Fortebio，美国)测量光传感器(光纤)表面上的DNA和蛋白质之间的结合度。
<实验条件>
结合缓冲液，洗涤缓冲液：TBS(Tris 20mM，NaCl 150mM)
DNA结合时间，OhrR结合时间：2分钟
洗涤时间：30秒
DNA浓度：2.5μM
OhrR浓度：50μM
CHP浓度：100μM
<实验过程>
首先，将生物素结合dsDNA[SEQ ID NO：1和2]以上述浓度溶解于TBS缓冲液中，通过使所得混合物流动120秒，使生物素结合dsDNA与链霉亲和素包覆的光传感器(光纤)结合，并用缓冲液洗涤，然后通过使溶解在TBS缓冲液中的OhrR蛋白以上述浓度再流动120秒，使OhrR蛋白与和光传感器结合的dsDNA相关联(关联)。关联完成后，通过仅使缓冲液再流动120秒，确认DNA-OhrR复合物的解离过程(解离)。
<实验结果>
在生物层干涉测量中，当生物材料(DNA或OhrR)结合到光传感器的表面时，必然伴随光传感器的表面折射率的变化(折射率与生物材料的浓度正相关)，并且应用了将折射率的变化转换成厚度的原理。OhrR与dsDNA强力结合并保持约4.3nm的结合厚度(OhrR的解离平衡值减去dsDNA结合平衡)。类似地，即使当CHP和生物硫醇中的任何一个仅与OhrR蛋白混合，然后使所得混合物在DNA上流动时，可以看出OhrR有效地与DNA结合。相反，在CHP和生物硫醇都存在的情况下，伴随生物硫醇对OhrR蛋白的DNA结合位点的氧化过程，从而证实与DNA的结合强度迅速降低(厚度约1nm)。换句话说，可以证实，通过使用COhrR和DNA的关联，可以在CHP存在下容易地预测生物硫醇的浓度。
该方法可用作有效地比较对各种类型的生物硫醇的反应性及其浓度的方法，而无需在光电传感器表面上用荧光团特异性标记dsDNA或OhrR。
实施例4：使用MALDI-TOF MS确认OhrR-生物硫醇结合
使用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF质谱仪；MALDI-TOF MS)确认是否可以定量分析OhrR和生物硫醇的结合。
将1mL含300nM OhrR的缓冲液(20mM Tris(pH 8.0)，100mM NaCl，5％甘油)以每种浓度(0、1、2、4、8、16、32或64μM)与生物硫醇(Cys、Hcy或GSH)混合。在3μM CHP与每种所得混合物反应2分钟后，用110μL 100％TCA处理以使氧化反应停止，并使OhrR沉淀。为了使沉淀的OhrR烷基化，用50mM碘乙酰胺处理，从而阻断还原的OhrR的半胱氨酸残基。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，然后切出对应于OhrR的条带并用胰蛋白酶(37℃，12小时或更长时间)处理，然后从凝胶中提取。用0.5μLα-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)(在50％乙腈，1％TFA中)处理0.5μL提取的肽并脱水，然后进行MALDI-TOF分析。使用4700蛋白质组学分析仪(Applied Biosystems)进行MADI-TOF分析。
如图5所示，随着Cys、Hcy和GSH浓度的增加，检测到对应于[OhrR+LMW生物硫醇]的m/z值的增加，尽管根据LMW生物硫醇的质量检测能力存在轻微差异，但是证实了当Cys、Hcy和GSH浓度大约为1μM或更高时，MALDI-TOFMS的检测是可能的，并且Cys在测量的LMW生物硫醇中显示出最高的检测信号水平。
实施例5：使用MALDI-TOF MS和OhrR在小鼠/人血液样品中进行游离LMW生物硫醇分析的实验
通过MALDI-TOF MS分析证实，可以使用OhrR分析小鼠模型(正常小鼠和动脉硬化小鼠模型(ΔLDLR小鼠)和人血液样品(25岁的非吸烟男性(人类1)的血液和45岁的吸烟男性(人类2)的血液)之间的游离LMW生物硫醇水平的差异。
使25μM OhrR和50μM CHP与从小鼠或人获得的2μL血浆反应10分钟(总共2.5μL反应)。反应后，用1mL 10％TCA处理以使含有OhrR的蛋白质沉淀。为了防止沉淀的OhrR的还原半胱氨酸进一步氧化，用50mM的烷基化剂即碘乙酰胺处理并与还原的半胱氨酸反应。通过SDS-PAGE分离蛋白质后，切出对应于OhrR的蛋白质条带，然后用0.2μg胰蛋白酶在37℃下处理12小时以上。通过离心从凝胶中提取被胰蛋白酶切割的肽。在用0.5μL CHCA(在50％乙腈，1％TFA中)处理0.5μL提取的肽并进行脱水后，进行MALDI-TOF分析。使用4700蛋白质组学分析仪(Applied Biosystems)进行MADI-TOF分析。
参考图6，可以显示，与正常小鼠的血液相比，在动脉硬化模型小鼠的血液中OhrR-Cys的质量信号值降低，并且与25岁的非吸烟者的血液相比，在45岁的男性吸烟者的血液中OhrR-Cys的质量信号值降低。换句话说，考虑到当OhrR与游离LMW生物硫醇快速反应时，在小鼠动脉硬化模型和吸烟者模型中血液中存在的游离LMW生物硫醇(特别是游离半胱氨酸)的浓度相对降低。因此，证实了，如上所述仅以具有各种疾病的患者组的少量血液，即可通过OhrR的质谱法有效地比较和分析游离生物硫醇的量。
实施例6：总LMW生物硫醇的测量的确认
1)FA测量的确认
为了证实测量总LMW生物硫醇的可能性，在还原剂(二硫苏糖醇，DTT)的处理下研究了OhrR和半胱氨酸之间的反应性。除了使用0或1mM的Cys浓度和30μM的CHP浓度之外，FA测量以如实施例1的实验过程中所述的相同的方式进行。
当用DTT处理时，将所有类型的氧化LMW生物硫醇的二硫键还原，从而形成游离形式。之后，当用氧化物CHP处理时，使氧化的OhrR再次与还原的LMW生物硫醇快速反应，从而加速OhrR与DNA的解离速率，并允许测量总LMW生物硫醇的量(由于DTT硫醇分子之间内部结合引起的后续环化，DTT不参与LMW生物硫醇的额外还原，也不与OhrR反应)[见图7的左图]。
2)通过MALDI-TOF分析确认
<实验条件(小鼠血浆LMW生物硫醇检测分析)>
OhrR浓度：25μM
CHP浓度：50μM
血浆量：2μL(购自Norma Mouse血清，Jackson ImmunoResearch)
DTT浓度：-/+1mM(预处理1小时后进行实验)
<实验过程(小鼠血浆LMW生物硫醇检测分析)>
从小鼠获得的血浆与-/+1mM DTT在室温(室温；23-25℃)下反应1小时。然后，使2μL血浆与25μM OhrR和50μM CHP反应10分钟(总共2.5μL反应)。反应后，用1mL 10％TCA处理以使含有OhrR的蛋白质沉淀。为了防止沉淀的OhrR的还原半胱氨酸进一步氧化，使50mM烷化剂即碘乙酰胺与还原的半胱氨酸反应。通过SDS-PAGE分离蛋白质，并切下对应于OhrR的蛋白质条带，并用0.2μg胰蛋白酶在37℃处理12小时。通过离心从凝胶中提取被胰蛋白酶切割的肽。用0.5μLCHCA(在50％乙腈，1％TFA中)处理0.5μL提取的肽并脱水，然后进行MALDI-TOF分析。
<实验结果>
从上述实验可以看出，在约1mM DTT存在下还原的LMW生物硫醇在CHP存在下(在约5分钟内)与OhrR快速反应，并且此后，LMW生物硫醇可以通过DTT随时间从OhrR解离。因此，为了检测DTT处理后的总LMW生物硫醇的量，可以在OhrR和CHP的处理后约5分钟内进行处理。作为通过MALDI-TOFMS分析上述条件的结果，已经证实，当未用DTT处理小鼠血浆时，可以测量游离半胱氨酸的量，并且当用DTT处理时，可以测量总半胱氨酸的量(参见图7的右图)。
实施例7：同时检测游离LMW生物硫醇和总LMW生物硫醇的确认
在向小鼠血液中加入多种浓度的半胱氨酸后，使用MALDI-TOF MS和OhrR检测游离半胱氨酸和总半胱氨酸。换句话说，当用DTT处理小鼠血清以还原氧化的LMW生物硫醇时，通过MALDI-TOF MS分析证实了随着OhrR增加对LMW生物硫醇的量的分析。
<实验条件(小鼠血浆生物硫醇检测分析)>
OhrR浓度：25μM
CHP浓度：50μM
Cys浓度：0/10/100μM
血浆量：2μL(购自Norma Mouse血清，Jackson ImmunoResearch)
DTT浓度：-/+1mM(在预处理1小时后进行实验)
<实验过程(小鼠血浆生物硫醇检测分析)>
除了使用0/10/100μM游离半胱氨酸之外，以与实施例6的小鼠血浆生物硫醇检测分析相同的方式进行实验。
<实验结果>
不使用DTT的正常小鼠血浆的游离半胱氨酸分析的结果示于图8的左图中，并且使用DTT后的总半胱氨酸分析的结果示于图8的右图中。图8显示了对游离半胱氨酸的OhrR+cys(T3-Cys)质量分析的比较。与未经DTT处理的实验组相比，DTT处理的实验组中的总半胱氨酸增加，并且OhrR-Cys信号相对较高。此外，可以看出，当随机添加半胱氨酸时，发现OhrR+Cys的质量信号值与添加的半胱氨酸的浓度成比例。
实施例8：使用珠测量方法确认LMW生物硫醇检测
该实验是使用OhrR和DNA测量LMW生物硫醇的实例，以在实验室测试水平上实现用于LMW生物硫醇的快速且简单的测量方法，并且以下实施例9(用荧光团标记标记dsDNA)和实施例10(用ssDNA酶标记dsDNA)是其中本实验过程通常应用的仅应用不同的测量方法的实例。
首先，将30μL的M2FLAG亲和珠(Sigma，A2220)加入到对应于样品数的各个管中，并将FLAG标记的OhrR(2μM)与其结合1小时以达到200μL的总体积(当OhrR与His6标签结合时，也可以使用NTA-珠)。为了除去未结合的OhrR，在旋转沉降后，除去上清液，使荧光团或DNA酶结合的OhrR结合dsDNA(100nM，SEQ ID NO：1和2)与OhrR结合的珠结合30分钟。通过旋转沉降除去未结合的dsDNA后，依次向每个管中加入160μL缓冲液(Tris缓冲盐水，TBS)->20μLLMW生物硫醇(通过浓缩)->20μL CHP(500μM)，然后振荡5分钟。然后，将通过旋转沉降获得的200μL上清液转移至96孔板，并测量荧光或化学发光。未经还原剂(DTT)处理的样品可用于测量游离的LMW生物硫醇，并且还原剂处理的样品可用于测量总LMW生物硫醇[图9]。
实施例9：使用荧光标记的dsDNA的荧光测量
使OhrR结合dsDNA与荧光因子FAM结合，将200μL最终上清液转移到96孔板中，然后使用多板读数器(Variokan，Thermo Scientific)进行荧光测量。在荧光测量中，在480nm的激发波长下获得525nm发射波长下的荧光信号值，并使用仅含有缓冲液不含荧光因子的孔作为参考值校正每个孔的荧光值，然后比较这些值。
使FAM标记的dsDNA[SEQ ID NO：1和2]与OhrR结合，当用CHP和各种浓度的LMW生物硫醇处理时，测量从OhrR分离的荧光标记的dsDNA的信号。与相同时间的单独的CHP处理(对照组)相比，证实了荧光信号根据CHP/LMW生物硫醇的浓度定量增加。
作为通过添加图10中所示的任意LMW生物硫醇的浓度获得的检测结果，尽管不能期望根据生物硫醇的类型的检测量，但是通过本实施例，可以显示可以有效地检测LMW生物硫醇的总量(不经DTT处理时游离的LMW生物硫醇的量，和当用DTT处理时氧化的LMW生物硫醇的量)。
实施例10：使用DNA酶-缀合的dsDNA测量化学发光
<实验条件>
缓冲液：TBS(Tris 20mM，NaCl 150mM)
OhrR浓度：5μM
DNA浓度：100nM
CHP、硫醇反应时间：5min
dsDNA序列(由美国IDT合成)
模板DNA序列：5'-GG GTT GGG CGG GAT GGG TTT TTT TTT TAC AAT TAA ATT GTATAC AAT TAA ATT GTA-3'[SEQ ID NO：4](斜体/粗体部分代表DNA酶，斜体部分代表T9接头)
互补DNA序列：5'-生物素-TAC AAT TTA ATT GTA TAC AAT TTA ATT GTA-3'[SEQID NO：5]
<实验过程>
从上清液中回收200μL的结合了DNA酶(5'-GG GTT GGG CGG GAT GGG-3'[SEQ IDNO：6]，由IDT合成)的OhrR结合dsDNA，并且向其中加入20μL包覆的珠(Thermo Scientific，美国)的悬浮液，然后在室温下振荡30分钟。然后，用TBS(20mM Tris，150mM NaCl，pH7.4)缓冲液洗涤四次。为了诱导DNA酶活性，将180μL TBS缓冲液与20μL 1μM氯高铁血红素(Hemin)(Calbiochem，美国)(在TBS中)溶液混合以达到200μL的最终体积，将珠沉淀，然后将得到的溶液在室温下在黑暗条件下放置15分钟或更长时间。然后，将200μL含有珠的混合溶液放入管中并安装到发光计(商品名：Glo-Max 20/20，Promega，美国)中，并向其中加入100μL ECL反应溶液(GHealthcare，美国)A(发光胺+H2O2溶液，50μL)和B(增强剂，50μL)的混合物，然后立即测量化学发光强度。
通过T9接头[SEQ ID NO：4]将ssDNA酶(具有辣根过氧化物酶性质的DNA酶)序列与OhrR结合dsDNA序列的一条链的末端连接，并将生物素引入另一条链的末端，从而构建DNA探针[SEQ ID NO：5]。在结合Flag肽(DYKDDDDK，制备重组DNA并在菌株中直接表达)[SEQ IDNO：7]并在大肠杆菌中表达/纯化后，将OhrR蛋白用于实验中。如实施例8中所述，使用抗Flag抗体结合的琼脂糖珠捕获OhrR蛋白并与DNA探针相互作用，然后当将CHP和半胱氨酸加入样品中时，DNA探针部分快速解离。解离的DNA探针存在于通过离心获得的上清液中，将该上清液再次与亲和素结合的珠反应，洗涤并与存在于含珠的溶液中的dsDNA和氯高铁血红素反应，然后通过发光胺反应诱导强化学发光。
<实验结果>
结果证实，在半胱氨酸反应后20分钟，在其中存在抗Flag Ab珠的上清液中有效地检测到化学发光信号(图11)。至于抗Flag Ab珠，相反，在未经半胱氨酸处理的条件下，以比荧光更高的信号检测到过量的化学信号，从而证实Flag-OhrR蛋白和DNA探针在半胱氨酸存在下有效解离。
换句话说，证实了仅在溶液中存在半胱氨酸的情况下才与DNA酶特异性结合的DNA与OhrR蛋白质解离，从而表现出DNA酶信号(DNA探针和OhrR和半胱氨酸的最终浓度分别为1μM、1μM和20nM，在加入半胱氨酸后20分钟测量化学发光)。
实施例11：DNA信号放大的方法和确认
1)信号放大
OhrR+F(模板正向DNA)和OhrR+R(互补反向DNA)是构成OhrR结合DNA的dsDNA，并且修饰的OhrR-F是dsDNA，向其中另外引入短DNA序列用于扩增(表1)。当将发夹1和发夹2加入到最终反应产物中时，通过各种方法(电泳、荧光测量和发光测量)扩增和检测DNA序列[图12]。
[表1]
添加2.5μM模板和40μM发夹1或2的DNA(其在TBS中稀释)各2μL，并用TBS缓冲液将最终体积调节至20μL。随后，使每个样品在室温下反应30分钟或更久，将10μL样品转移到新管中，然后向其中添加10μL的1μM氯高铁血红素以及80μL的TBS以调节最终体积至100μL。然后，在黑暗条件下，使所得产物在室温下反应30分钟。另外，为了比较相对信号大小，另外制备仅以氯高铁血红素和TBS制备的样品。然后，通过与实施例10中所述相同的方法，使用Glo-Max 20/20单管发光计(Promega)测量DNA酶活性。测量结果以基于通过仅使氯高铁血红素与ECL溶液反应获得的值的相对值表示。
与如实施例10中所述在dsDNA一端使用仅一种DNA酶序列的情况相比，作为在结合任意ssDNA序列后加入HP1和HP2的结果，可以证实DNA酶被有效地产生，从而放大化学发光和比色信号，比氯高铁血红素的背景信号高约16.5倍或更高，并且比参考DNA酶直接结合的模板高约2.6倍或更高[图13A]。
2)信号放大的确认
<实验条件>
DNA模板(修饰的OhrR_F+OhrR_R)浓度：500nM
H1、H2浓度：各2μM
反应时间、电泳时间：各30分钟
<实验过程>
本文使用的所有DNA寡聚体均由IDT定制。将100μM经修饰的OhrR_F和OhrR-R各20μL混合，在95℃加热10分钟，并在室温下缓慢冷却，从而制备结合OhrR的双链序列。使用该dsDNA作为模板，使用2μL的5μM模板以及20μM发夹1和20μM发夹2各2μL，并在室温下反应30分钟，使得总体积调节至20μL。然后，使用各扩增样品8μL，进行琼脂糖凝胶电泳，然后通过UV目视确认长度增加的DNA条带。
<实验结果>
如电泳结果所示，在单链形式中观察到HP1和HP2条带低于50bp，并且无模板时没有发生链式反应(DNA凝胶上条带位置没有变化)。然而，在模板存在下，H1首先与模板结合，H1的发夹结构松散，并且打开的H1序列由此与H2序列结合，这导致获得H2的开放结构。如模板和单独的H1之间的反应结果所示，观察到比模板DNA和H1DNA的每个条带尺寸更大的尺寸，并且以比模板DNA相对更大的量存在，因此，可以看出，未结合的H1仍然保持在下方。然而，当模板DNA与单独的H2反应时，它们不相互结合，并因此可以证实模板和H2的条带尺寸均没有变化。此外，证实了在模板DNA、H1和H2的存在下，由于H1/H2结合模板DNA链，DNA条带尺寸被有效扩增[图13B]。由于DNA酶包含在扩增的DNA序列中，如图13A所示，观察到DNA酶活性高。通过使用上述方法，DNA酶活性通过DNA-OhrR相互作用被LMW生物硫醇扩增，因此可以有效地测量低浓度的LMW生物硫醇。
实施例12：生物芯片的制造
生物芯片方法是使用OhrR的His6标签而不是通过用荧光或DNA酶标记来测量DNA，其根据在LMW生物硫醇存在下OhrR从附着于生物芯片表面的dsDNA分离，从而降低检测信号的原理。
将150μL用包覆缓冲液(100mM Na2HPO4，50mM柠檬酸)稀释的5mg/mL(Thermo Scientific，美国)放入透明96孔板的各孔中，在37℃下反应4到5小时，然后用TBS洗涤未结合的残余物四次。洗涤后，将300μL Seablock封闭缓冲液(ThermoScientific，美国)放入每个孔中并在室温下振荡2小时以进行封闭(包覆未结合NeutrAvidin的表面以防止非特异性反应的过程)，然后用TBS再洗涤四次。将用TBS缓冲液稀释至1μM的100μL生物素-DNA溶液加入到封闭完成的微孔板的每个孔中，并在室温下反应1小时，然后用TBS洗涤四次。然后，加入100μL 5μM his6-标签缀合的OhrR，用于在室温下与DNA结合1小时，并用TBS洗涤所得产物4次，从而制备用于测量LMW生物硫醇的生物芯片。
将50μLCHP(最终5μM)和LMW生物硫醇(L-半胱氨酸、高半胱氨酸和GSH的每一种最终100μM)中的一种同时放入每个孔中，该孔使用了生物素-dsDNA和His6-标签OhrR被固定在NeutrAvidin包覆的板上的生物芯片，在室温下反应10分钟，用TBS洗涤4次。然后，加入100μL的His探针-辣根过氧化物酶缀合物(His探针-HRP，Thermo Scientific，美国；HRP是辣根过氧化物酶)溶液并在室温下结合1小时，用TBS洗涤四次，然后用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶液处理。5分钟后，加入2M硫酸以终止反应，并在450nm处测量吸光度。然后，比较结果[图14]。
在不存在LMW生物硫醇的孔中，由于OhrR与固定在孔中的dsDNA结合，因此与结合有靶向OhrR的His-标签的His探针-HRP的HRP反应的TMB的吸光度信号最高。然而，在存在LMW生物硫醇和CHP的情况下，OhrR从固定在生物芯片表面的dsDNA解离，并通过洗涤除去。因此，通过结合His探针-HRP，与HRP反应的TMB的吸光度信号降低。如实施例9中所示，观察到在相同浓度条件下，一类LMW生物硫醇如L-半胱氨酸表现出比另一类LMW生物硫醇如高半胱氨酸或GSH更高的吸光度信号降低效果[图15]。
实施例13：条型生物传感器的制造
图16中所示的条传感器可以由三个主要部分(样品引入部分、反应部分和测量部分)组成，作为用于制造条传感器的膜，可以使用纤维素膜、硝化纤维素膜或玻璃纤维膜。各部分的结构和特征如下。
每个部分由不同的膜组成，每个膜以重叠方式固定在通用OHP膜(0.4cm×5.5cm)上。将反应部分的垫放置在最下部区域上以恒定地保持整个条传感器的毛细现象，并固定以连接到样品引入部分和测量部分，并且将样品引入部分放置在最上部区域以促进吸收。
样品引入部分(对应于图16的上图的传感器的左侧黑色部分，其中引入样品)：将10μL含有1μM FLAG标记的OhrR和dsDNA(SEQ ID NO：1和2)-结合复合物的溶液(TBS缓冲液)和10μL含LMW生物硫醇的样品溶液(缓冲液、血液或尿液)混合，使20μL混合液与20μL包含CHP溶液(2μM)的缓冲液反应，并将总共40μL溶液滴在纤维素膜(0.4cm×1.5cm)上并吸附，使得溶解在样品中的物质根据色谱原理迁移到传感器反应部分。
反应部分(对应于图16的上图的传感器的中心灰色部分，其中用箭头绘制DNA迁移)：由硝酸纤维素膜(约0.4cm×2.5cm)组成，将约1μL抗FLAG抗体溶液(1mg/mL，磷酸盐缓冲溶液)从样品引入部分向右方约1cm处滴下，并通过在37℃下放置1小时固定化。在样品引入部分中反应的Flag-OhrR-dsDNA复合物已迁移至该部分并且被固定于其表面的FLAG抗体结合。当样品中存在LMW生物硫醇时，dsDNA与OhrR解离并保持在膜上向右迁移，并且当不存在LMW生物硫醇时，dsDNA类似OhrR被抗体固定，并且迁移停止。
测量部分(对应于图16的上图所示的传感器的右侧黑色部分，用于确认是否检测到LMW生物硫醇)：测量部分是用于测量从结合部分和分离部分解离并迁移的dsDNA的部分，并用于诱导附着于dsDNA末端的DNA酶的信号。换句话说，预先分配氯高铁血红素溶液以保留在玻璃纤维膜(0.4cm×0.5cm)上，并且滴下最终的TMB溶液或ECL溶液，从而确认信号响应。通过向缓冲液(40mMTris、200mM NaCl、50mM KCl和20mM MgCl2)溶液中加入5％酪蛋白溶液制备氯高铁血红素，并且玻璃纤维膜充分吸收100μL氯高铁血红素并在55℃下干燥30分钟。在反应部分中解离的dsDNA充分迁移后，为了进行最终信号分析，加入ECL溶液和TMB反应溶液各10μL以诱导反应。在添加到反应溶液后立即使用化学发光分析仪对ECL溶液进行成像和分析，并且可以在添加溶液后约30分钟在安装有移动电话或数码相机的工作站上分析TMB反应结果。
将一个样品分成两个具有相同体积的样品，并且一个样品用DTT处理1小时或更长时间并与DNA-OhrR复合物反应，另一个样品与DNA-OhrR复合物反应而不添加DTT。换句话说，可以从两个相等分析的结果确定以下参数。
样品1：未添加DTT，测量游离LMW生物硫醇
样品2：添加DTT，测量总LMW生物硫醇
分析样品1和2的反应结果，并根据每个样品的特征、疾病类型、疾病阶段、年龄和性别进行比较。
序列表
<110> 汉阳大学校产学协力团
<120> 包含氧化还原调节蛋白的生物硫醇检测组合物
<130> G19U10C0156P/US
<140> PCT/KR2017/012344
<141> 2017-11-02
<150> KR 10-2016-0146831
<151> 2016-11-04
<150> KR 10-2017-0144833
<151> 2017-11-01
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 模板DNA
<400> 1
tacaattaaa ttgtatacaa ttaaattgta 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 互补DNA
<400> 2
tacaatttaa ttgtatacaa tttaattgta 30
<210> 3
<211> 147
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 3
Met Glu Asn Lys Phe Asp His Met Lys Leu Glu Asn Gln Leu Cys Phe
1 5 10 15
Leu Leu Tyr Ala Ser Ser Arg Glu Met Thr Lys Gln Tyr Lys Pro Leu
20 25 30
Leu Asp Lys Leu Asn Ile Thr Tyr Pro Gln Tyr Leu Ala Leu Leu Leu
35 40 45
Leu Trp Glu His Glu Thr Leu Thr Val Lys Lys Met Gly Glu Gln Leu
50 55 60
Tyr Leu Asp Ser Gly Thr Leu Thr Pro Met Leu Lys Arg Met Glu Gln
65 70 75 80
Gln Gly Leu Ile Thr Arg Lys Arg Ser Glu Glu Asp Glu Arg Ser Val
85 90 95
Leu Ile Ser Leu Thr Glu Asp Gly Ala Leu Leu Lys Glu Lys Ala Val
100 105 110
Asp Ile Pro Gly Thr Ile Leu Gly Leu Ser Lys Gln Ser Gly Glu Asp
115 120 125
Leu Lys Gln Leu Lys Ser Ala Leu Tyr Thr Leu Leu Glu Thr Leu His
130 135 140
Gln Lys Asn
145
<210> 4
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 目标DNA结合DNA酶
<400> 4
gggttgggcg ggatgggttt tttttttaca attaaattgt atacaattaa attgta 56
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 互补DNA
<400> 5
tacaatttaa ttgtatacaa tttaattgta 30
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA酶
<400> 6
gggttgggcg ggatggg 17
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Flag肽
<400> 7
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OhrR_F
<400> 8
tacaattaaa ttgtatacaa ttaaattgta 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OhrR_R
<400> 9
tacaatttaa ttgtatacaa tttaattgta 30
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 修饰的OhrR_F
<400> 10
tacaattaaa ttgtatacaa ttaaattgta accacccacc gg 42
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 发夹1
<400> 11
accacccacc gggggtgggt cgtctgccgg tgggtggtta caatt 45
<210> 12
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 发夹2
<400> 12
cagacgaccc acccccggtg ggtggtaatt gtaaccaccc accgggggtg ggtgggtggg 60
t 61

Claims (22)

1.一种LMW生物硫醇检测组合物，其包含氧化还原调节蛋白。
2.根据权利要求1所述的生物硫醇检测组合物，其中所述氧化还原调节蛋白是选自由有机氢过氧化物调节蛋白(OhrR)、过氧化物调节剂(PerR)和氧调节剂(OxyR)组成的组的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的LMW生物硫醇检测组合物，其中所述氧化还原调节蛋白包括能够调节游离LMW生物硫醇和操纵基因dsDNA之间的结合亲和力的其突变体，或亲和标记的氧化还原调节蛋白。
4.根据权利要求1所述的LMW生物硫醇检测组合物，其还包括：与氧化还原调节蛋白结合的DNA。
5.根据权利要求4所述的LMW生物硫醇检测组合物，其中所述DNA与荧光因子或基于DNA的酶(DNA酶)结合，或由通过信号放大方法扩增DNA序列而制备。
6.根据权利要求5所述的LMW生物硫醇检测组合物，其中所述荧光因子是选自由罗丹明及其衍生物、荧光素及其衍生物、香豆素及其衍生物、吖啶及其衍生物、芘及其衍生物、赤藓红及其衍生物、曙红及其衍生物和4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸基二苯乙烯-2,2'-二磺酸组成的组一种或多种。
7.根据权利要求5所述的LMW生物硫醇检测组合物，其中所述基于DNA的酶具有选自由模拟过氧化物酶的DNA酶和切割RNA的DNA酶组成的组的一种或多种序列。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中单独或同时检测游离LMW生物硫醇和总LMW生物硫醇。
9.根据权利要求8所述的LMW生物硫醇检测组合物，其还包括当检测总LMW生物硫醇时的还原剂。
10.根据权利要求9所述的LMW生物硫醇检测组合物，其中所述还原剂选自由二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇和三(2-羧乙基)膦(TCET)组成的组的一种或多种。
11.根据权利要求1所述的LMW生物硫醇检测组合物，其中所述生物硫醇的分子量为10至1000Da。
12.根据权利要求1所述的LMW生物硫醇检测组合物，其中所述生物硫醇是选自由半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、半胱胺(CA)、γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-GluCys)、半胱氨酰甘氨酸(CysGly)、N-乙酰半胱氨酸(N-AC)、辅酶A(CoA)、辅酶B(CoB)、辅酶M(CoM)、芽孢杆菌硫醇(BacT)、放线硫醇(MyT)、麦角硫因(ErT)和锥虫硫酮(TrT)组成的组的一种或多种。
13.根据权利要求1所述的LMW生物硫醇检测组合物，其中所述生物硫醇与包括心血管疾病、神经退行性疾病、癌症、肾功能障碍、糖尿病以及细菌和病毒感染的重大疾病有关。
14.一种使用权利要求1的生物硫醇检测组合物检测LMW生物硫醇的方法。
15.根据权利要求14所述的方法，其中使用了选自由凝胶电泳、荧光各向异性、基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、表面等离子体共振(SPR)、干涉测量和珠测量方法组成的组的一种或多种。
16.一种用于检测LMW生物硫醇的生物传感器，其包括权利要求1的生物硫醇检测组合物。
17.根据权利要求16所述的生物传感器，其为条型。
18.一种用于检测LMW生物硫醇的生物芯片，其包括权利要求1的生物硫醇检测组合物。
19.根据权利要求18所述的生物芯片，其中LMW生物硫醇检测组合物中的氧化还原调节蛋白具有亲和标签。
20.根据权利要求18所述的生物芯片，其中LMW生物硫醇检测组合物中的氧化还原调节蛋白与平板上的DNA形成蛋白质复合物，所述平板上固定有能够与蛋白质结合的DNA。
21.一种用于检测生物硫醇的条型生物传感器，其包括：
样品引入部分，其包括能够与氧化还原调节蛋白和与蛋白质结合的DNA的复合物结合的固定部分，并引入样品和复合物的混合物；
反应部分，其与样品引入部分线性间隔预定距离，并且在其中DNA在复合物氧化后分离；
测量部分，其形成是为了通过转移解离的DNA以测量LMW生物硫醇。
22.根据权利要求21所述的生物传感器，其中所述固定部分结合了能够识别氧化还原调节蛋白部分的抗体或受体。
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