KR101333110B1 - 단백질 활성도 및 상호작용의 동시 측정방법 - Google Patents

단백질 활성도 및 상호작용의 동시 측정방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질 활성도 및 상호작용의 동시 측정방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 타겟 효소 단백질과 기질단백질 사이의 효소 활성도 및 단백질 상호작용을 서로 다른 두 종류의 형광물질을 표지함으로써 동시에 측정할 수 있는 신규한 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 타겟 효소 단백질과 기질단백질 사이의 활성도 및 상호작용은 형광물질로 표지된 효소 및 단백질 어레이를 이용하여 동시에 분석될 수 있다.

Description

단백질 활성도 및 상호작용의 동시 측정방법 {Simultaneous measuring methods of protein activity and protein interaction}
본 발명은 단백질 활성도 및 상호작용의 동시 측정방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 타겟 효소 단백질과 기질 또는 상호작용 단백질 사이의 효소 활성도 및 단백질 상호작용을 서로 다른 두 종류의 형광물질을 표지함으로써 동시에 측정할 수 있는 신규한 방법에 관한 것이다.
프로테오믹스(proteomics)는 생물학적 시스템의 연구를 위한 전체 단백질의 대규모 분석이다. 생성량-기반 프로테오믹스(abundance-based proteomics)는 단백질 발현 수준에 있어서 전 지구적 차이(Global differences)를 정량 분석함으로써 정상 및 병리학적 과정에서의 기능을 밝히는 것에 관한 것이다 (Sadaghiani, A. M. et al., (2007). Curr Opin Chem Biol 11, 20-8). 이러한 전통적 방식의 접근은 정상인과 병든 환자의 샘플을 비교함으로써 바이오마커를 찾는데 매우 유용하다. 그러나 이러한 생성량-기반 프로테오믹스는 단백질 기능에 관한 간접적인 정보만 제공하기 때문에 전체적인 단백질 기능 규명에는 한계가 있다 (Schmidinger, H. et al., (2006). Amino Acids 30, 333-50). 특히, 단백질 활성은 일련의 번역 후 변형(series of posttranslational modification)에 의해 주로 조절되기 때문에 단백질의 생성량은 단백질의 활성과 상관관계를 갖고 있다고 단정할 수 없다 (Sadaghiani, A. M. et al., (2007). Curr Opin Chem Biol 11, 20-8). 그러므로 활성도-기반 프로테오믹스(activity-based protein profiling, ABPP)는 중요한 생물학적 과정의 단백질 기능을 확정하는데 대안적 접근법으로서 고려되고 있다 (Nomura, D. K. et al., (2010). Nat Rev Cancer 10, 630-8). 이러한 접근법에서는, 단백질 활성을 검출하기 위한 특이적 활성도-기반 프로브는 대개 형광, 방사성 및 친화도 표지를 이용하여 디자인된다 (Fonovic, M. and Bogyo, M. (2008). Expert Rev Proteomics 5, 721-30; Gillet, L. C. et al., (2008). Mol Cell Proteomics 7, 1241-53; Schmidinger, H. et al., (2006). Amino Acids 30, 333-50). 이러한 ABPP는 정상 및 병에 걸린 세포와 조직 사이의 활성도 프로파일의 비교 분석을 통한 활성도 마커의 확인에 사용된다 (Nomura, D. K. et al., (2010). Nat Rev Cancer 10, 630-8; Viertler, M. et al., (2011). Bioorg Med Chem.; Viertler, M. et al., (2011). Bioorg Med Chem.). 또한 이러한 접근법은 효소 저해제의 프로파일링 및 치료제와 진단방법을 개발하는데도 사용된다 (Gillet, L. C. et al., (2008). Mol Cell Proteomics 7, 1241-53; Schmidinger, H. et al., (2006). Amino Acids 30, 333-50). 대규모 분석에 의한 다른 기능적 프로테오믹 접근은 상호작용체학(interactomics or interaction proteomics)인데, 이는 중요한 생물학적 과정에 있어서 단백질의 조절을 더 잘 이해하는데 유용한 방법이다 (Kool, J. et al., (2011). Anal Bioanal Chem 401, 1109-25). 단백질과 리간드의 생활성 단백질 상호작용을 밝혀내기 위해, 이스트 투-하이브리드(yeast two-hybrid), 친화도-질량 분석법(affinity purification-mass spectrometry), PCA(protein-fragment complementation assay), 발광-기반 상호작용체(luminescence-based mammalian interactome) 및 단백질 분석법(protein arrays)과 같은 다양한 기법들이 사용되고 있다 (Barrios-Rodiles, M. et al., (2005). Science 307, 1621-5; Kool, J. et al., (2011). Anal Bioanal Chem 401; Lievens, S. et al., (2010). Expert Rev Proteomics 7, 679-90; Ptacek, J. et al., (2005). Nature 438, 679-84; Ptacek, J. et al., (2005). Nature 438, 679-84). 정상인과 병에 걸린 인간 사이의 상호작용체학의 역학적 분석에 있어서 전 지구적 차이(Global differences)는 질병의 원인에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 따라서 상호작용체학적 접근은 바이오마커 확인 및 신약 개발에 적용될 수 있다 (Goehler, H. et al., (2004). Mol Cell 15, 853-65; Nibbe, R. K. et al., (2009). Mol Cell Proteomics 8, 827-45; Ruffner, H. et al., (2007). Drug Discov Today 12, 709-16). 따라서 생성량, 활성도 및 상호작용의 통합 분석은 단백질의 조절 매카니즘 및 기능을 밝히는데 커다란 가능성을 가질 수 있지만 아직은 제한적이다.
이러한 프로테오믹 방법들은 1차 및 2차 겔 전기영동, 1차 및 2차 액체 크로마토그래피 및 이중질량분석(tandem mass spectrometry), 표면 플라즈몬 공명 및 형광분석(fluorometric assay)을 포함한 다양한 검출방법들과 함께 수행되어 왔다 (Kool, J. et al., (2011). Anal Bioanal Chem 401; Lievens, S. et al., (2010). Expert Rev Proteomics 7, 679-90). 멀티-웰 플레이트를 이용한 비색분석 및 형광분석법은 특이적 프로브와 결합하여 다양한 목적 단백질의 생성량 및 활성도의 측정에 널리 사용되고 있다. 이러한 방법들은 단백질 활성도 변화의 실시간 측정 뿐만 아니라 단백질 생성량 및 활성도의 고속분석이 가능하게 하지만, 유효한 샘플의 양에 제한되기도 한다 (Liang, P. H. et al., (2007). J Am Chem Soc 129, 11177-84). 또한 비표지 방법으로서 표면 플라즈몬 공명은 단백질의 생성량, 활성도 및 결합 친화도의 분석에 사용되어 왔다 (Jung, J. W. et al., (2006). Proteomics 6, 1110-20; Jung, S. H. et al., (2010). Analyst 135, 1050-7; Mori, T. et al., (2008). Anal Biochem 375, 223-31). 형광 프로브와 결합된 마이크로어레이는 소량의 샘플만으로 다양하고 폭넓은 생분자 상호작용, 단백질 생성량 및 활성도를 신속하게 분석할 수 있는 유망한 기법 중 하나이다. 이러한 접근법은 인간 혈청의 생성량-기반 단백질 프로파일링에 의한 바이오마커의 혈청학적 진단 및 동정에 사용되어 왔다 (Han, M. K. et al., (2009). Proteomics 9, 5544-52; Jung, J. W. et al., (2009). Biosens Bioelectron 24, 1469-73; Shafer, M. W. et al., (2007). Prostate 67, 255-67). 이러한 접근법은 탄수화물-단백질 상호작용 (Liang, P. H. et al., (2007). J Am Chem Soc 129, 11177-84) 및 펩티드-단백질 상호작용 (Jones, R. B. et al., (2006). Nature 439, 168-74; Wolf-Yadlin, A. et al., (2009). Curr Opin Chem Biol 13, 398-405)을 포함한 생분자 상호작용의 연구에도 사용되었다. 또한, 이러한 기법은 효소 활성도의 고속 분석 및 효소의 기질 또는 저해제의 스크리닝에도 사용되었다 (Kong, D. H. et al., (2010). BioChip J 4, 210-216; Kwon, M. H. et al., (2009). Mol Cells 27, 337-43; Kwon, M. H. et al., (2011a). Anal Chem.; Kwon, M. H. et al., (2011b). Anal Chem 83, 2317-23; Mugherli, L. et al., (2009). Angew Chem Int Ed Engl 48, 7639-44; Salisbury, C. M. et al., (2002). J Am Chem Soc 124, 14868-70). 그러나, 아직까지 어레이 기법에 기초한 단백질 활성도 및 상호작용의 조합 프로파일링은 보고되어 있지 않다.
본 발명에서는 모델시스템으로서 트랜스글루타미나아제 2(transglutaminase 2, TG2)와 그와 관련된 16개 단백질을 이용하여, 단백질 어레이위에서 아민교환반응 활성도 및 상호작용의 동시 프로파일링을 위한 통합 프로테오믹스를 제안한다. 조직 트랜스글루타미나아제(tissue transglutaminase)로 알려진 TG2는 칼슘-의존성 글루타미나아제 패밀리의 일원으로, 그 활성도 및 상호작용은 다양하고 폭넓은 질환 및 세포내 과정(cellular events)과 관련되어 있다 (Park, D. et al., (2010). Amino Acids 39, 619-31). TG2는 복강스프루(celiac sprue)를 포함한 염증성 질환; 헌팅톤병, 알츠하이머병 및 파킨슨병을 포함한 퇴행성신경계 질환; 암, 심혈관질환 및 당뇨병과 같은 다양한 질환의 발병과 관련되어 있다 (Iismaa, S. E. et al., (2009). Physiol Rev 89, 991-1023; Park, D. et al., (2010). Amino Acids 39, 619-31; Reif, S. and Lerner, A. (2004). Autoimmun Rev 3, 40-5). 또한 TG2는 세포 사멸(cell death), 세포 분화, 세포 부착, 세포외기질 결합(extracellular matrix crosslinking) 및 아포토시스(apoptosis)를 포함한 다양한 세포내 과정과 관련되어 있다 (Ohtake, Y. et al., (2007). Life Sci 81, 577-84; Oliverio, S. et al., (1997). Mol Cell Biol 17, 6040-8; Park, D. et al., (2010). Amino Acids 39, 619-31).
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 타겟 단백질-관련 단백질들의 기능 및 조절 메카니즘을 규명하는데 사용될 수 있는 통합 프로테오믹 접근법으로서 두 종류의 형광물질로 표지함으로써 단백질 활성도 및 상호작용을 동시에 측정할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 두 종류의 형광물질로 표지함으로써 단백질 효소 활성도 및 단백질 상호작용을 동시에 측정할 수 있는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 단백질 효소 활성도 및 단백질 상호작용의 동시 측정을 위한 측정용 칩 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 단백질 효소 활성도 및 단백질 상호작용의 동시 측정방법을 제공한다:
a) 아미노 잔기 말단을 갖는 알콕시실란을 기판의 표면에 도입하는 단계;
b) 상기 기판의 표면에 소정의 간격으로 천공된 테이프를 부착하여 다수의 스폿(spot)이 형성된 어레이(array) 칩을 제조하는 단계;
c) 상기 스폿의 단부에 타겟 효소의 기질 또는 상호작용 단백질을 도입하는 단계;
d) 형광물질로 표지된 타겟 효소와 CaCl2, DTT 및 5-바이오틴아미도펜틸아민(5-biotinamidopentylamine)을 함유하는 반응용액을 상기 기질 또는 상호작용 단백질 상에 적하하여 기질 또는 상호작용 단백질과 5-바이오틴아미도펜틸아민의 아민교환반응(transamindation)시키는 단계;
e) 상기 아민교환반응 생성물의 말단부에 위치한 바이오틴에 상기 d)단계의 형광물질과 다른 종류의 형광물질로 표지된 스트렙트아비딘 또는 아비딘을 도입하는 단계; 및
f) 상기 d)와 e) 단계에서 표지된 두 종류의 형광물질을 분석함으로써 타겟 효소 활성도 및 상호작용을 동시에 측정하는 단계.
본 발명은 효소 단백질과 그 관련 단백질 사이의 효소 활성도 및 상호작용을 동시에 측정하기 위한 모델 시스템을 제안하기 위해 개발되었다. 이러한 모델 시스템을 구현하기 위해 대표적인 효소 단백질로서 트랜스글루타미나아제 2 효소를 이용하였으며, 트랜스글루타미나아제 2 효소와 그 기질 또는 상호작용 단백질 사이의 효소 활성도 및 상호작용을 측정하는 방법을 제시함으로써 본 발명의 기술적 사상을 구현하고 있다.
본 발명에서 사용된 용어, ‘단백질 상호작용’은 TG2 효소의 활성부위(catalytic site)와 TG2-기질 단백질의 결합 또는 TG2 효소와 기질외 단백질의 결합을 의미한다. 또한, 용어 ‘효소 활성도’는 TG2 효소의 활성부위(catalytic site)와 TG2-기질 단백질의 결합 이후 아민교환반응의 활성도를 의미한다. 그러므로, TG2 효소와 밀접한 관련이 있는 기질 단백질이 결합하는 경우에는 단백질 상호작용 및 효소 활성도가 동시에 나타내게 되고, 기질 단백질이 TG2 효소의 활성부위에만 약하게 결합하는 경우에는 TG2의 활성도만 나타나고 단백질 상호작용은 나타나지 않게 되고, TG2 효소와 상호작용하는 기질외 단백질이 결합하는 경우에는 단백질 상호작용만 나타나고 효소 활성도는 나타나지 않게 되며, TG2와 큰 관련이 없는 단백질은 효소 활성도와 단백질 상호작용 모두 나타나지 않게 된다.
따라서 본 발명에서 효소 단백질과 결합하는 단백질은 효소-기질 결합(activity 측정)을 이루거나 단백질-단백질 결합(interaction 측정)을 이룰 수 있으므로, 본 발명에서 타겟 효소와 결합하는 단백질은 ‘기질단백질’ 또는 ‘상호작용 단백질’일 수 있으며, 본 명세서에서 사용된 ‘기질 또는 상호작용 단백질’은 이를 모두 포함하는 용어이다.
본 발명에서 사용된 타겟 효소인 트랜스글루타미나아제 2(transglutaminase 2, 이하 ‘TG2’라고 함)는, 조직 트랜스글루타미나아제(tissue transglutaminase)로서 칼슘-의존성 글루타미나아제 패밀리의 일원으로 그 활성도 및 상호작용은 다양하고 폭넓은 질환 및 세포내 과정(cellular events)에 관련되어 있다. 따라서 TG2의 활성도 및 단백질 상호작용을 측정하는 것은 TG2와 관련된 세포내 과정을 이해하는데 있어서 중요한 정보를 제공하게 된다.
본 발명에 따른 TG2 활성도 및 상호작용 동시 측정방법의 이해를 돕기 위해 그 계략적인 과정을 도 1에 도식화하였다. 도 1을 참고하여 살펴보면, 기판에 고정된 TG2-기질 또는 상호작용 단백질 상에 TG2가 결합하게 되는데, 이 때 1) TG2 효소의 활성부위(catalytic site)에 TG2-기질 단백질이 결합하게 되면 효소 활성도를 측정하기 위한 TG2-기질(enzyme-substrate)의 중간체가 완성되고, 2) TG2 효소의 활성부위가 아닌 부분에 TG2-기질 단백질 또는 TG2-기질외 단백질이 결합하게 되면 단백질 상호작용을 측정하기 위한 TG2-단백질(protein-protein)의 결합이 완성된다.
상기 1)의 TG2-기질의 중간체는 아민교환반응에 의해 형광 표지된 TG2가 떨어져 나가고 5-바이오틴아미도펜틸아민이 기질 단백질에 결합한 후 다른 종류의 형광물질(예컨대, Cy3)로 표지된 스트렙트아비딘 또는 아비딘을 도입시켜 형광물질의 분석을 통해 효소의 활성도를 측정할 수 있다. 또한 상기 2)의 TG2-기질 단백질 또는 TG2-기질외 단백질의 결합은 TG2에 표지된 형광물질(예컨대, Cy5)의 분석을 통해 단백질 상호작용을 측정할 수 있지만 이 결합은 아민교환반응이 유도되지 않기 때문에 효소 활성도는 측정되지 않는다.
요컨대, 상기 TG2에 결합하는 단백질이 기질 단백질이고 상호작용이 강한 경우는 Cy3와 Cy5의 형광강도가 강하게 나타나고, TG2에 결합하는 단백질이 기질 단백질이고 상호작용이 약한 경우는 Cy3의 형광강도가 강하게 나타나고, TG2에 결합하는 단백질이 기질외 단백질이고 상호작용이 강한 경우 Cy5의 형광강도가 강하게 나타나게 된다.
도 1에 도시된 바와 같이, TG2와 16개 단백질의 상호작용 및 아민교환반응 활성도는 Cy5-표지된 TG2 및 단백질 어레이를 이용하여 동시에 분석되었다. 이러한 대규모 분석법을 이용하여, 본 발명자들은 TG2-관련 단백질들에 대한 TG2의 특성을 쉽게 예측하기 위한 정량적 네트워크를 구축하였다. 따라서 이러한 통합 프로테오믹 접근법은 타겟 효소 단백질-기질 단백질들의 기능 및 조절 메커니즘을 규명하는데 사용될 수 있다.
기존의 활성도를 측정방법과 상호작용 측정법은 여러 단백질이 고정된 기판위에서, 각각 TG2 활성에 의해 아민교환반응(transamidation) 된 BAPA의 양을 측정하고, 결합한 TG2의 양을 측정하는 방법이었다. 반면 본 발명에 따른 동시 측정방법은 여러 단백질이 고정된 기판 위에서 TG2와 여러 단백질 사이의 중간체 (catalytic site에 결합한 경우) 또는 단순 결합체 (non-catalytic site에 결합한 경우)가 생성된 후에 아민 도너(amine donor)인 BAPA를 처리하여 중간체로부터 TG2를 떼어내고 그 대신 BAPA가 결합하게 하여 활성도를 측정하고 단순결합체의 양을 측정하여 상호작용을 측정한 방법이다.
기존의 활성도 및 상호작용 측정법으로 단순 조합을 할 경우에는 생체 내에서 타겟단백질이 타겟단백질과 관련된 단백질을 어떻게 조절할 수 있는지 예측할 수 없다. 예를 들면, 단순 조합법에서 활성도와 상호작용이 동시에 높게 나온 경우, 그 단백질은 기질단백질이라 할 수 있고 상호작용도 강하다고 할 수 있지만, 효소의 활성으로 조절되는지 상호작용에 의해 조절되는지 알 수 없다. 그러나 동시분석에서 활성도와 상호작용이 모두 높게 나오면 두 가지 요소 모두 중요하다고 할 수 있고, 만약 활성도는 높고 상호작용이 낮게 나오면, 그 단백질은 기질단백질이고 주로 효소의 활성부위에 결합한다는 것까지 예측할 수 있어 상호작용보다는 활성도에 의한 amine donor 단백질과의 cross-linking이 조절과정에서 더 중요하다는 것을 예측할 수 있다.
본 발명의 단백질 효소 활성도 및 단백질 상호작용의 동시 측정방법에서, 상기 a) 단계의 기판은 단백질 칩에 사용될 수 있는 어떤 기판도 사용될 수 있으나, 바람직하게는 알콕시실란과 밀착성이 우수한 유리, 실리카, 또는 실리콘웨이퍼 기판을 사용할 수 있다.
본 발명의 단백질 효소 활성도 및 단백질 상호작용의 동시 측정방법에서, 상기 a) 단계의 아미노 잔기 말단을 갖는 알콜시실란은 한쪽 말단에 기질 또는 상호작용 단백질과 결합할 수 있는 아미노 잔기와 다른 쪽 말단에 기판과 결합할 수 있는 알콕시기를 갖는 어떤 알콕시실란도 사용될 수 있으며, 바람직하게는 아미노알킬트리알콕시실란(aminoalkyltrialkoxysilane)이다.
상기 아미노알킬트리알콕시실란은 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-amonopropyltrimethoxysilane), 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-amonopropyltriethoxysilane), 또는 3-[2-(2-아미노에틸아미노)에틸아미노]프로필-트리메톡시실란(3-[2-(2-aminoethylamino)ethylamino]propyl-trimethoxysilane)에서 선택된 것을 사용할 수 있다.
상기 아미노 잔기 말단을 갖는 알콕시실란은 다양한 공지된 방법을 적용하여 기판의 표면에 도입할 수 있는데, 본 발명에서는 에탄올과 같은 통상의 알코올류 용매에 알콕시실란을 용해시킨 다음 이 용액에 기판을 침적하여 기판의 표면에 말단에 작용기를 갖는 알콕시실란이 도입되도록 하였다. 이때 작업의 편의성을 고려하여 에탄올에 아미노 잔기 말단을 갖는 알콕시실란은 1 내지 2 중량%가 함유되도록 용해하였으나, 그 농도를 반드시 한정할 필요는 없다.
기판의 침적시간은 적어도 2시간 실시하면 충분하며, 2시간 정도 경과한 후에는 기판을 에탄올과 증류수 등으로 세척한 후 건조하게 되면 기판의 표면에 아미노 잔기 말단을 갖는 알콕시실란이 도입되게 된다.
이때, 기판은 당해분야에서 널리 사용되는 금속 기판이나 슬라이드 글라스 기판이 사용될 수 있으며, 상기 기판은 사용 전에 충분히 세정한 후 사용하면 된다. 세정은 당해분야에서 일반적으로 사용되는 방법이 적용될 수 있으며, 본 발명에서는 증류수 100 중량부에 대하여 과산화수소 10 내지 40 중량부와 암모니아수 10 내지 40 중량부를 혼합한 세정액에 적어도 10 분간 침적하여 세정한 슬라이드 글라스를 사용하였다.
기판의 표면에 아미노 잔기 말단을 갖는 알콕시실란이 도입되면, 그 표면에 소정의 간격으로 천공된 테이프를 부착하여 다수의 스폿(spot)이 형성된 어레이(array) 칩을 제조하는 단계를 거치게 된다. 스폿의 수는 임의 선택이 가능하며, 테이프는 반응성이 적은 테플론 테이프 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 단백질 효소 활성도 및 단백질 상호작용의 동시 측정방법에서, 상기 c) 단계의 타겟 효소는 트랜스글루타마나아제 2(TG2)이고, 기질 또는 상호작용 단백질은 피브리노겐(fibrinogen), 피브로넥틴(fibronectin), α-시누클레인(α-synuclein), 레티노블라스토마(retinoblastoma), 알돌라아제 A(aldolase A), 그랜칼신(grancalcin), S100A7(S100 calcium binding protein A7), 오스테오폰틴(osteopontin), Bcl-2(B-cell lymphoma 2), SMAD2(Sma- and Mad-related protein 2), 아넥신 A1 (annexin A1), Rac1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1), GST(glutathione S-transferase), E-카드헤린(E-cadherin), G-액틴(G-actin), HSA(human serum albumin) 등과 같이 TG2와 관련이 있다고 알려진 단백질들이 사용될 수 있다. 필요에 따라서는 상기 단백질 이외에 TG2의 기질로 이용될 수 있는 물질 또는 TG2와 상호작용하는 물질이 사용될 수 있으며, 반드시 단백질에 제한을 둘 필요는 없다.
상기 기질 또는 상호작용 단백질을 도입하는 방법은 다양한 방법이 적용될 수 있는데, 본 발명에서는 단백질을 용해시켜 제조한 단백질 함유 용액을 스폿에 적하하여 반응시키는 방법으로 기질 또는 상호작용 단백질을 도입하였다. 여기서, 반응은 알콕시실란 말단의 아미노기와 기질 또는 상호작용 단백질이 서로 반응하여 이루어지는데, 반응은 기질 또는 상호작용 단백질 함유 용액을 적하한 후 적어도 2시간 반응시키면 된다. 두 시간 정도 경과하여 반응이 완료되면 PBST나 증류수 등으로 세척한 후 건조하게 되면 기질 또는 상호작용 단백질이 도입된다.
본 발명의 단백질 효소 활성도 및 단백질 상호작용의 동시 측정방법에서, 상기 c) 단계에서 기질 또는 상호작용 단백질을 도입한 후 단백질이 결합하지 않은 스폿의 빈 부분을 블로킹(blocking) 용액으로 처리하여 블로킹시키는 것을 더 포함할 수 있다.
상기 블로킹은 분석용 칩 제작 시 일반적으로 실시하는 것으로서, BSA(Bovine serum albumin), 표준혈청(normal serum), 탈지유(skim milk) 등과 같은 통상의 블로킹 물질을 함유하는 용액을 적하하면 된다. 적하 후 30분 내지 1시간 정도 경과하여 반응이 완료된 후 PBST나 증류수 등으로 세척한 다음 건조하게 되면 기질 또는 상호작용 단백질이 도입되지 않은 빈부분에 블로킹 물질이 도입된다.
본 발명의 단백질 효소 활성도 및 단백질 상호작용의 동시 측정방법에서, 상기 d) 및 e) 단계의 형광물질은 싸이3(Cy3), 싸이5(Cy5), 알렉사(Alexa), 보디피(BODIPY), 로다민(Rhodamine) 및 큐도트(Q-dot)로 구성된 군에서 선택되며, 서로 다른 종류를 사용함으로써 두 가지 종류의 형광채널을 통해 형광분석을 수행하는 것을 특징으로 한다. 예들 들어, 상기 d) 단계의 형광물질로 Cy5를 사용하는 경우, 상기 e) 단계의 형광물질은 Cy3를 사용하는 것이 바람직하다. Cy3 및 Cy5는 반응성 수용성 형광 염료로서 단백질과 화학적으로 결합가능한 반응기를 갖도록 합성될 수 있다.
또한 본 발명의 단백질 효소 활성도 및 단백질 상호작용의 동시 측정방법에서, 상기 e) 단계의 타겟 효소는 활성도 및 상호작용을 측정하고자 하는 타겟 효소 함유 시료로 대체될 수 있다. 예컨대, 효소 활성도 및 단백질 상호작용 측정용 타겟 효소 함유 시료는, 각종 세포에서 분리된 것이나 혈액시료를 포함하여 활성도 및 상호작용을 측정하고자 하는 것을 의미한다.
본 발명의 단백질 효소 활성도 및 단백질 상호작용의 동시 측정방법에서, 상기 d) 단계의 5-바이오틴아미도펜틸아민은 타겟 효소에 의해 활성화되어 기질 또는 상호작용 단백질과 아민교환반응을 일으켜 기질 또는 상호작용 단백질 말단에 바이오틴이 위치하도록 하게 만든다. CaCl2와 DTT는 타겟 효소(예컨대, 트랜스글루타미나아제 2)의 활성을 돕기 위하여 첨가되는 것이며 측정 목적에 따라 Triton X-100 등과 같은 물질을 반응용액에 추가할 수 있다.
이때 기질 또는 상호작용 단백질과 5-바이오틴아미도펜틸아민의 아민교환반응에 의해 기질 또는 상호작용 단백질 말단에 위치하게 되는 바이오틴은 분석용 표지물질인 스트렙타비딘(streptavidin) 또는 아비딘(avidin)과 강하게 결합하는 물질로 이의 분석을 통해 효소의 활성도를 측정할 수 있게 된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 단백질 효소 활성도 및 단백질 상호작용의 동시 측정용 칩의 제조방법을 제공한다: a) 아미노 잔기를 갖는 알콕시실란을 기판의 표면에 도입하는 단계; b) 상기 기판의 표면에 소정의 간격으로 천공된 테이프를 부착하여 다수의 스폿이 형성된 어레이 칩을 제조하는 단계; 및 c) 상기 스폿의 단부에 타겟 효소의 기질 또는 상호작용 단백질을 도입하는 단계.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 아미노 잔기를 갖는 알콕시실란이 도입된 기판의 표면에 소정의 간격으로 천공된 테이프를 부착하여 다수의 스폿을 형성하고 상기 스폿의 단부에 타겟 효소의 기질 또는 상호작용 단백질을 도입하여 제조된 단백질 효소 활성도 및 단백질 상호작용의 동시 측정용 칩을 제공한다.
본 발명의 단백질 효소 활성도 및 단백질 상호작용의 동시 측정용 칩은, 본 발명에 따른 단백질 효소 활성도 및 단백질 상호작용의 동시 측정을 위해 사용되는 것으로서, 상술한 바와 같이, 타겟 효소와 관련된 세포내 과정을 이해하는데 있어서 중요한 정보를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 특히, TG2-관련 단백질이 도입된 칩을 이용하여 다수의 시료 측정이 동시에 가능한 어레이 형태를 가짐에 따라 TG2 활성도 및 상호작용을 동시에 분석할 수 있는 만큼, 획기적으로 분석 시간을 단축시킬 수 있고 TG2와 관련된 세포내 신호전달 과정을 이해하는데 유용하게 사용될 수 있다.
TG2는 많은 질병 및 세포내 신호전달 과정과 관련이 되어있고, 그 과정에서 많은 단백질이나 펩타이드 또는 저분자(small molecule) 들과도 밀접한 관련이 있기 때문에 최근에도 연구가 활발히 진행되고 있는 효소 중 하나이다. 따라서 다수의 시료측정이 가능한 어레이 형태의 TG2 활성도 및 상호작용의 동시측정을 통해 여러 가지 단백질들의 TG2-관련 활성도 및 상호작용의 라이브러리(library)를 만든다면 TG2의 활성도 또는 상호작용과 관련된 단백질들을 쉽게 찾아낼 수 있고, 신호전달과정 및 질병의 발병과정도 규명할 수 있으며, 나아가 TG2와 관련된 신호전달 과정을 억제하거나 촉진함으로써 질병의 치료제 개발에도 기여할 수 있을 것이다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 TG2와 16개 단백질의 효소 활성도 및 결합 친화도는 형광물질로 표지된 TG2 및 단백질 어레이를 이용하여 동시에 분석될 수 있다. 이러한 대규모 분석법을 이용하여, 본 발명자들은 TG2-관련 단백질들에 대한 TG2의 특성을 쉽게 예측하기 위한 정량적 네트워크를 구축하였다. 따라서 이러한 통합 프로테오믹 접근법은 타겟 단백질-관련 단백질들의 기능 및 조절 메카니즘을 규명하는데 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 단백질 효소 활성도 및 단백질 상호작용의 동시 측정과정을 도식화한 것이다.
도 2는 TG2 관련 단백질로 선택된 16개의 단백질들을 농도별로 적하한 어레이 칩을 도식화한 것이다.
도 3a 내지 3p는 TG2 관련 단백질로 선택된 16개 단백질들의 농도에 따른 TG2 활성도를 측정한 그래프이다.
도 4a 내지 4p는 TG2 관련 단백질로 선택된 16개 단백질들의 농도에 따른 TG2 상호작용을 측정한 그래프이다.
도 5는 16개의 단백질에 대한 TG2의 정량적 활성도 및 상호작용에 대한 통합 프로테오믹 지도(integrative proteomic map)이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
화학제 및 시약
3-아미노프로필트리메톡시실란(3-aminopropyltrimethoxysilane), 1,4-디티오트레이톨(1,4-dithiothreitol), 트롬빈(thrombin), Cy3-결합 스트렙트아비틴(Cy3-conjugated streptavidin), HSA(human serum albumin), 피브리노겐(fibrinogen) 및 피브로넥틴(fibronectin)(from human plasma), α-시누클레인(α-synuclein)(human recombinant), 레티노블라스토마(retinoblastoma)(human recombinant), E-카드헤린(E-cadherin)(human recombinant), 및 G-액틴(G-actin)은 Sigma (St. Louis, MO)로부터 입수하였다. 5-(바이오틴아미도) 펜틸아민( 5-(Biotinamido) pentylamine)은 Pierce Science (Rockford, IL)로부터 입수하였다. 기니피그(guinea pig) 간 유래 TG2(transglutaminase 2)는 innovative research (Novi, Michigan)로부터 구입하였다. 인간 재조합 알돌라아제 A (Human recombinant aldolase A), 그랜칼신(grancalcin), S100A7(S100 calcium binding protein A7), 오스테오폰틴(osteopontin), Bcl-2(B-cell lymphoma 2), SMAD2(Sma- and Mad-related protein 2), 및 아넥신 A1 (annexin A1)은 ATGen (Seongnam, Korea)로부터 구입하였다. Cy5 모노 NHS 에스터(Cy5 mono NHS ester) 및 바이오-스핀 칼럼(Bio-spin columns)은 Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) 및 Bio-Rad (Hercules, CA)으로부터 각각 구입하였다. GST(Human recombinant gluatathione) 및 Rac1(GST-free)은 Jung 등(Jung, J. W. et al., (2009). Biosens Bioelectron 24, 1469-73)이 보고한 방법에 따라 제조하였다.
실시예 1. 아민 어레이(amine arrays)의 제조
아민-변형 슬라이드 글라스(Amine-modified glass slides)는 Jung 등(Jung, J. W. et al., (2009). Biosens Bioelectron 24, 1469-73)의 방법에 따라 제조하였다. 간단히 설명하면, 슬라이드 글라스를 NH4OH : H2O2 : dH2O(1:1:5, v/v)의 세정액으로 70℃에서 10분간 세정하였다. 95% 에탄올에 3-아미노프로필-트리메톡시실란이 1.5% 함유하도록 만든 용액(v/v)에 상기 세정된 슬라이드 글라스를 2시간 동안 반응시킨 후 에탄올과 증류수로 세척하고 110℃의 드라이 오븐에서 2시간 동안 건조하였다. 펀치를 이용하여 직경 2.0 mm의 스폿(spot)들이 배열된 테플론 테이프(teflon tapes)를 3-아미노프로필-트리메톡시실란이 반응된 슬라이드 글라스에 붙여 128개(16*8)의 스팟을 갖는 어레이 칩을 제조하였다.
실시예 2. Cy5로 표지된 TG2의 제조
TG2(transglutaminase 2)는 Jung 등이 보고한 방법에 따라 Cy5 모노 NHS 에스터로 형광표지하였다. 100 mM 탄산수소나트륨 버퍼 (pH 7.3)를 이용하여 100 μl의 TG2 (100 μg/ml)를 DMSO(dimethyl sulfoxide)로 희석된 2 μl의 Cy5 모노 NHS 에스터 (1 mg/ml)와 얼음위에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응의 종결을 위해, 1 M Tris-HCl (pH 8.0) 5 μl를 첨가한 후 10분간 반응시켰다. 반응물 중 Cy5 표지된 TG2만을 분리하기 위해 1.5 ml 세파덱스 G-25 칼럼(Sephadex G-25 columns)에 반응물을 넣고 2500 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 얻어진 Cy5 표지된 TG2는 nanodrop(NanodropND-1000 UV-Vis spectrophotometer; NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)을 이용하여 Cy5와 TG2 각각의 농도를 측정하고 비율을 계산하였다.
실시예 3. TG2-관련 단백질들과 TG2의 아민교환반응 활성도 및 결합 동시 분석
TG2와 TG2-관련 단백질들의 아민교환반응 활성도(transamidating activities) 및 상호작용을 동시 측정하기 위하여, 문헌조사를 통해 TG2와 관련이 있다고 알려진 16개의 대표 단백질들(fibrinogen, fibronectin, α-synuclein, retinoblastoma, aldolase A, grancalcin, S100A7, osteopontin, Bcl-2, SMAD2, annexin A1, Rac1, GST, E-cadherin, G-actin, HSA)을 선택하였다 (Esposito, C et al., (2005) FEBS J 272, 615-31; Griffin, M. et al., (2002) Biochem J 368, 377-96; Kwon, M. H. et al., (2009) Mol Cells 27, 337-43).
도 2에 도시된 바와 같이, 선택된 16개의 단백질들을 0, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 nM의 농도로 희석하여 준비한 후, 상기 실시예 1에서 제조한 어레이 칩 상에 1 μl씩 적하(spotting)하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. PBST(0.1% Tween 20이 포함된 PBS buffer)에 2 BSA를 첨가하여 블로킹 용액(blocking solution)을 만들어 16종류의 단백질이 올려졌던 스폿에 올려 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 이후 PBST로 10분 동안 세척한 후 다시 5분 동안 증류수로 세척하고, 공기를 불어주면서 건조하였다.
완충용액인 Tris-HCl 용액(pH 7.5, 40 mM Tris-HCl, 140mM NaCl)에 2 mM CaCl2, 50 mM DTT(dithiothreitol), 5 mM BAPA(5-biotinamidopentylamine), 0.01% Triton X-100을 혼합한 반응 버퍼에 상기 실시예 2에서 얻은 10 μg/ml의 Cy5 표지된 TG2를 혼합하여 반응용액을 만들고 스폿 당 0.7 μl씩 스포팅(spotting)하여 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 이 후 PBST로 10분 동안 세척한 후 다시 5분 동안 증류수로 세척하고, 공기를 불어주면서 건조하였다.
그런 다음, 형광물질 Cy3가 표지된 스트렙트아비딘(streptavidin)을 10 mg/ml의 농도로 스폿에 올려 전 단계에 반응시킨 혼합물의 바이오틴(biotin)과 결합하도록 한 후에 두 가지의 형광채널(Cy3, Cy5)을 가진 형광스캐너(ScanArray Express, PerkinElmer Life and Analytical Sciences)로 스캐닝하여 세기를 측정하였다. 이 때 얻어진 Cy3 채널의 형광세기는 TG2 활성도를, Cy5 채널의 형광세기는 TG2와 TG2 관련단백질 사이의 상호작용의 크기를 의미한다.
본 발명에 따른 단백질 활성도 및 단백질 상호작용의 동시 측정과정은 도 1에 도식화하였다.
선택된 16개의 단백질들을 농도에 따라 TG2의 아민교환반응 활성도에 의한 형광강도를 측정하였으며 그 결과는 도 3에 그래프로 나타내었다.
또한, 선택된 16개의 단백질들을 농도에 따라 TG2와의 상호작용을 의미하는 형광강도를 측정하였으며 그 결과는 도 4에 그래프로 나타내었다.
실시예 4. 아민교환반응 활성도의 정량분석 및 해리상수의 결정
TG2의 TG2-관련 단백질들에 대한 아민교환반응 활성도(transamidating activity)는 TG2-관련 단백질들의 농도에 의존적으로 증가했고 약 1000 nM 농도에서 대부분 포화되었다. 따라서 TG2-관련 단백질 1000 nM 농도에서의 아민교환반응 활성도를 평균값으로 정규화(normalization)하여 TG2와 TG2-관련 단백질들의 아민교환반응을 정량분석하였다. 또한 해리 상수(dissociation constants, KD)를 결정함으로써 TG2와 TG2-관련 단백질들의 결합력(binding affinities)을 정량분석하였다.
KD 값은 하기 수식 1을 이용하여 계산하였다.
[수식 1]
Figure 112011088960872-pat00001
여기서 Fobs는 관찰된 형광강도, Fmax는 포화상태에서 최대치의 형광강도, [protein]은 단백질 칩 표면에 처리한 단백질의 농도, KD는 해리상수이다.
도 3에 나타난 바와 같이, TG2-관련 단백질들의 농도에 따라 TG2의 아민교환반응 활성도를 의미하는 형광강도가 증가하였고, 전체 단백질에 대한 아민교환반응 활성도의 평균값으로 정규화된 (normalized) 아민교환반응 활성도는 최소 0.01에서 최대 3.36을 가지는 것으로 나타났다.
또한 도 4에 나타난 바와 같이, osteopontin, SMAD2, E-cadherin, HSA의 4가지 단백질을 제외한 12개 단백질에서 TG2-관련 단백질의 농도에 따라 TG2와의 상호작용을 의미하는 형광강도가 증가하는 것을 확인할 수 있다. 또한 두 가지 단백질사이의 결합 친화도를 정량적으로 확인할 수 있는 해리상수는 최소 6.44 nM에서 최대 290.70 nM로 분포하는 것을 확인하였다.
이상 설명한 바와 같이, 계산된 정규화된 아민교환반응 활성도(A)와 해리상수(Kd)의 평균값(mean)을 각각 계산하여 단백질을 분류할 수 있다. 즉, A < mean: 높은 아민교환반응 활성도, A > mean: 낮은 아민교환반응 활성도, KD < mean: 높은 결합친화도, KD > mean: 낮은 결합친화도, KD를 측정할 수 없는 경우에는 결합친화도가 없는 것으로 판단해서 분류할 수 있다. 이를 바탕으로 16개의 단백질을 6개의 그룹으로 분류할 수 있다: 기질친화도와 결합친화도 모두 높은 그룹(그룹 1), 기질친화도는 높으나 결합친화도가 낮은 그룹(그룹 2), 기질친화도는 높으나 결합친화도가 없는 그룹(그룹 3), 기질친화도는 낮지만 결합친화도는 높은 그룹(그룹 4), 기질친화도와 결합친화도 모두 낮은 그룹(그룹 5), 기질친화도가 낮고 결합친화도는 없는 그룹(그룹 6). 여기서, 기질친화도는 효소 활성도를, 결합친화도는 단백질 상호작용을 의미한다. 이를 바탕으로 두 단백질 사이에 기질친화도와 결합친화도 중 조금 더 중요한 요소를 예측할 수 있다.
도 5는 16개의 단백질에 대한 TG2의 정량적 활성도 및 상호작용에 대한 통합 프로테오믹 지도(integrative proteomic map)이다. 도 5에서, node의 부피는 아민교환반응 활성도를 나타내고 (특히 빨간색은 높은 활성도 파란색은 낮은 활성도), TG2에서부터 node까지의 거리는 KD 값을 나타낸다. 이와 같이, 본 발명에 따른 어레이 형태의 TG2 활성도 및 상호작용의 동시측정을 통해 여러 가지 단백질들의 TG2-관련 활성도 및 상호작용의 라이브러리(library)를 제작함으로써 TG2의 활성도 또는 상호작용과 관련된 단백질들을 쉽게 찾아낼 수 있을 것이다.
따라서 본 발명에 따른 단백질 효소 활성도 및 단백질 상호작용의 동시 측정 방법을 이용하여 타겟 단백질 및 그와 관련이 있다고 알려진 단백질 사이의 활성도 및 상호작용을 정량분석 함으로써, 세포 안에서 타겟 단백질과 관련된 신호전달 과정을 예측하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (9)

  1. 하기 단계들을 포함하는 단백질 효소 활성도 및 단백질 상호작용의 동시 측정방법:
    a) 아미노 잔기 말단을 갖는 알콕시실란을 기판의 표면에 도입하는 단계;
    b) 상기 기판의 표면에 천공된 테이프를 부착하여 다수의 스폿(spot)이 형성된 어레이(array) 칩을 제조하는 단계;
    c) 상기 스폿의 단부에 타겟 효소의 기질 또는 상호작용 단백질을 도입하는 단계;
    d) 형광물질로 표지된 타겟 효소와 CaCl2, DTT 및 5-바이오틴아미도펜틸아민(5-biotinamidopentylamine)을 함유하는 반응용액을 상기 기질 또는 상호작용 단백질 상에 적하하여 기질 또는 상호작용 단백질과 5-바이오틴아미도펜틸아민의 아민교환반응(transamindation)시키는 단계;
    e) 상기 아민교환반응 생성물의 말단부에 위치한 바이오틴에 상기 d)단계의 형광물질과 다른 종류의 형광물질로 표지된 스트렙트아비딘 또는 아비딘을 도입하는 단계; 및
    f) 상기 d)와 e) 단계에서 표지된 두 종류의 형광물질을 분석함으로써 타겟 효소 활성도 및 상호작용을 동시에 측정하는 단계.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 a) 단계의 알콜시실란은 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-aminopropyltrimethoxysilane)인 것을 특징으로 하는 단백질 효소 활성도 및 단백질 상호작용의 동시 측정방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 c) 단계의 타겟 효소는 트랜스글루타미나아제 2이고, 기질 또는 상호작용 단백질은 피브리노겐(fibrinogen), 피브로넥틴(fibronectin), α-시누클레인(α-synuclein), 레티노블라스토마(retinoblastoma), 알돌라아제 A(aldolase A), 그랜칼신(grancalcin), S100A7(S100 calcium binding protein A7), 오스테오폰틴(osteopontin), Bcl-2(B-cell lymphoma 2), SMAD2(Sma- and Mad-related protein 2), 아넥신 A1 (annexin A1), Rac1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1), GST(gluatathione S-transferase), E-카드헤린(E-cadherin), G-액틴(G-actin) 및 HSA(human serum albumin)으로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 단백질 효소 활성도 및 단백질 상호작용의 동시 측정방법.
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서, 상기 c) 단계에서 기질 또는 상호작용 단백질을 도입한 후 단백질이 결합하지 않은 스폿의 빈 부분을 블로킹(blocking) 용액으로 처리하여 블로킹시키는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 효소 활성도 및 단백질 상호작용의 동시 측정방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 d) 및 e) 단계의 형광물질은 싸이3(Cy3), 싸이5(Cy5), 알렉사(Alexa), 보디피(BODIPY), 로다민(Rhodamine) 및 큐도트(Q-dot)로 구성된 군에서 선택되며, 서로 다른 종류를 사용함으로써 두 가지 종류의 형광채널을 통해 형광분석을 수행하는 것을 특징으로 하는 단백질 효소 활성도 및 단백질 상호작용의 동시 측정방법.
  7. 삭제
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