KR100883547B1 - 양자점 기반의 바이오칩 및 이를 이용한 가수분해 단백질의활성 분석 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 양자점 기반의 바이오칩에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (A) 유리 또는 실리카로 이루어진 지지체; (B) 상기 지지체의 표면에 구성된 자기조립 단층막; (C) 양자점의 표면이 바이오틴과 특이 결합하는 생체분자로 코팅되어 있어, 상기 자기조립 단층막의 말단기와 양자점 표면의 생체분자 작용기와의 결합에 의해 자기자기조립 단충막 위에 형성된 양자점 단층막; 및 (D) 가수분해 단백질에 대한 기질의 일말단에는 바이오틴이 결합되어 있고 타말단에는 에너지 수용체가 결합되어, 기질 말단의 바이오틴과 상기 양자점 단층막 상에 노출된 생체분자와의 특이결합에 의해 양자점 단층막 위에 형성된 기질-에너지 수용체의 결합층;으로 이루어진 양자점 기반의 바이오칩에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 바이오칩에서 양자점과 에너지 수용체 간의 에너지 전이현상을 이용하여 다양한 기질에 대한 가수분해 단백질의 활성을 적은 양으로 신속히 측정할 수 있는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의하면, 칩 표면에서 양자점의 에너지 전이현상을 이용하여 가수분해 단백질 또는 관련 저해제의 활성을 초고속 대량 분석하는 것이 가능하다.

양자점, 나노입자, 에너지 전이, FRET, 가수분해 단백질, 펩타이드, 프로티아제, 칩

Description

양자점 기반의 바이오칩 및 이를 이용한 가수분해 단백질의 활성 분석 방법{Quantum dot-based biochip and method for assaying hydrolytic proteins using the same}

도 1은 본 발명에 의한 양자점 기반의 바이오칩을 이용한 가수분해 단백질의 활성 측정법을 보여주는 모식도.

도 2는 수용액에서 에너지 수용체로서 금나노입자 및 형광물질의 농도에 따른 양자점의 발광억제능력 비교 스펙트럼.

도 3은 본 발명에 의한 양자점 기반의 바이오칩에서 에너지 수용체로 사용된 금나노입자 및 형광물질의 농도에 따른 양자점의 발광억제능력 비교 스펙트럼.

도 4는 수용액에서 서로 다른 양자점 과 금나노입자를 이용한 가수분해 단백질 활성 스펙트럼.

도 5는 수용액에서 양자점-금나노입자를 이용하여 가수분해 단백질의 활성을 확인한 전자현미경 사진.

도 6은 본 발명에 의한 양자점 기반의 바이오칩과 금나노입자를 사용하여 가수분해 단백질의 활성을 측정한 형광분석이미지와 광학현미경사진.

도 7은 본 발명에 의한 양자점 기반의 바이오칩과 금나노입자를 사용한 가수 분해 단백질과 이의 저해 효과를 측정한 형광분석이미지.

본 발명은 양자점 기반의 바이오칩과 이를 이용한 가수분해 단백질의 분석법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 에너지 공여체인 양자점이 기질-에너지 수용체와 결합되어 고정된 바이오칩 및 상기 바이오칩에서 양자점과 에너지 수용체 간의 에너지 전이현상을 이용하여 다양한 기질에 대한 가수분해 단백질의 활성을 적은 양으로 신속히 측정할 수 있는 방법에 관한 것이다.

가수분해 단백질(혹은 효소)은 단백질, 펩타이드, DNA, RNA, 당, 지질 등을 가수분해하는 단백질의 총칭으로서 세포 내에서 신호전달(signal transduction), 증식(proliferation), 염증(inflammation), 자기사멸(apoptosis) 등과 관련하여 순기능과 역기능을 수행하는 중요한 생체분자이다. 따라서, 다양한 가수분해 단백질의 활성을 측정하거나 이 단백질에 대한 저해제를 탐색하고 선별하는 일은 생명현상 규명을 위한 기초연구와 함께 특정 질병의 진단 및 치료제 개발 분야에서 큰 관심을 끌고 있다.

일반적으로 가수분해 단백질의 활성을 측정하는 방법으로는 합성된 기질을 사용하여 가수분해 단백질에 의해 생성된 산물을 초고압액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography)로 측정하거나(Bjurlin, M. S. Bloomer, S. and Nelson, C. J. Biotechnol. Lett. 2002, 24, 191), 얇은막 전기영동(thin-layer electrophoresis)으로 측정하는 방법이 있다(Kotler, M. Katz, R. A. Danho, W. Leis, J. Skalka, A. M. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1988. 85, 4185). 그러나, 이 방법은 과정이 복잡하고 시간이 많이 소요될 뿐만 아니라 기질에 대한 정량분석이 어려운 단점이 있다. 이러한 문제점 때문에, 현재는 가수분해 단백질의 활성을 측정하기 위해 형광물질을 이용하는 방법이 주로 활용되고 있다. 예를 들어, 프로티아제(protease) 의 경우에는 형광발생 펩타이드(fluorogenic peptide)를 기질로 사용하거나(Harris, J. L. Backes, B. J. Leonetti, F. Mahrus, S. Ellman, J. A. and Craik, C. S. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000, 97, 7754), 펩타이드 기질에 형광물질 쌍이나 혹은 형광물질-형광억제제(quencher)의 쌍을 부착시켜 형광공명에너지 전이 (Forster resonance energy transfer, FRET)을 이용하는 방법이 널리 사용되고 있다(Matayoshi, E. D. Wang, G. T. Krafft, G. A. Erickson, J. Science, 1990, 247, 954; US Publication No. 20050014160). 특히, FRET에 의한 방법은 한 쌍으로 구성된 공여체(donor)와 수용체(acceptor)의 거리에 크게 의존하기 때문에 가수분해 단백질의 활성을 보다 정확하게 측정할 수 있는 방법으로 알려져 있다. FRET이란 형광물질인 공여체가 빛에너지를 흡수하여 여기(excitation)되면 형광으로 방출하는 대신, 10 nm이내에 근접해 있는 수용체에 공명현상을 통해 비 복사 에너지(non-radiative energy)가 전달됨으로써 수용체의 장파장 형광이 방출(emission)되는 원리이다. 수용체와 공여체가 10nm 이상의 거리에 있거나, 수용 체의 흡광 파장이 공여체의 발광 파장 영역과 중복(overlap)되지 않을 경우에는 공명에 의한 에너지 전이는 발생하지 않기 때문에 공여체의 여기가 수용체의 발광으로 이어지지 않는다. 그러나, 이러한 형광공명에너지 전이를 이용한 가수분해 단백질의 측정방법은 두 형광물질이 초기 외부 빛에너지에 의해 빠르게 감쇠(photobleaching)될 수 있기 때문에 장시간 측정이 어렵고, 적절한 공여체-수용체의 쌍은 극히 제한적으로 사용되고 있어서 하나의 광원으로 여러 종류의 가수분해 단백질을 동시에 측정하는 것은 불가능하다.

최근 양자점(quantum dot)은 이와 같은 문제를 해결해 줄 수 있는 대체 물질로서 크게 부각되고 있다. 즉, 외부 빛 에너지에 의한 감쇠효과가 적고 높은 양자효율(quantum yield)을 가지고 있어 측정 감도를 향상시킬 수 있다. 또한, 공통적인 하나의 흡수 파장에 의해서 크기가 다른 양자점들의 발광 파장 영역을 다르게 구분할 수 있기 때문에 동시분석에 쓰일 수 있다. 에너지 전이 측면에서도, 공여체로서 양자점은 표면 기능기를 도입하여 많은 수의 수용체와 결합할 수가 있어 FRET의 효율을 크게 높일 수 있는 장점이 있다. 실제로 양자점과 형광물질간의 FRET을 이용한 방법은 프로티아제 활성 측정(Medintz, I. L. Clapp, A. R. Brunel, F. M. Tiefenbrunn, T. Uyeda, H. T. Chang, E. L. Deschamps, J. R. Dawson, P. E. Mattoussi, H. Nat. Mater. 2006, 5, 581) 뿐만이 아니라, 상보적 DNA 결합(hybridization)(Zhang, C. Y. Yeh, H. C. Kuroki, M. T. Wang, T. H. Nat. Mater. 2005, 4, 826), 단백질 분석(Clapp, A. R. Medintz, I. L. Mauro, J. M. Fisher, B. R. Bawendi, M. G. Mattoussi, H. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 301) 등에 응용되고 있다. 한편, FRET에서 나타나는 쌍극자-쌍극자(dipole-dipole)간의 에너지 전이 현상과는 달리, 형광물질과 금속 나노입자 사이에서 발생하는 쌍극자-전자(dipole-electron)간의 표면 에너지 전이 현상(surface energy transfer, SET)은 공여체와 수용체간 거리가 20nm 이내에서도 일어날 수 있음이 보고되었다(Yun, C. S. Javier, A. Jennings, T. Fisher, M. Hira, S. Peterson, S. Hopkins, B. Reich, N. O. Strouse, G. F. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 3115). 이러한 표면 에너지 전이 현상과 유사한 방식으로, 형광물질과 금 나노입자를 사용하여 DNA 가수분해 단백질의 활성을 측정하거나(Ray, R. C. Fortner, A. Darbha, G. K. J. Phys. Chem B. 2006, 110, 20745), 양자점과 금 나노입자간의 에너지 전이현상에 기초하여 생체물질의 상호작용을 분석한 예도 있다(Oh, E. Lee, D. Kim, Y.-P. Cha, S. Y. Oh, D.-B. Kang, H. A. Kim, J. Kim, H. -S. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 7959; KR Application No. 10-2006-12213). 하지만, 상기에서 예시한 형광물질-형광물질, 양자점-형광물질, 형광물질-금속나노입자, 양자점-금속나노입자 간의 FRET 혹은 SET에 의한 에너지 전이현상은 모두 수용액 내에서 수행한 것으로서 수용액 내 환경에 따라 나노입자들(양자점 및 금속나노입자)이 쉽게 응집(aggregation)되어 측정이 어려운 단점이 있다. 또한, 1회 측정 시 최소 수십 μL~ 수 mL 이상의 반응액에 많은 양의 나노입자가 소요되므로 소량으로 동시에 빠른 분석을 수행하기는 매우 어렵다.

이와 같은 문제점을 해결하기 위해, 가수분해 단백질의 활성을 칩에서 측정한 예로서, 형광발생 (fluorogenic) 펩타이드 칩을 이용하여 프로티아제의 활성을 측정한 보고가 있으나(Salisbury, C. M. Maly, D. J. Ellman, J. A. J. Am. Chem. Soc. 2002. 124, 14868) 이는 양자점을 이용한 에너지 전이 현상에 의한 방법에 해당되지 않아 안정성이 떨어질 수 있으며 다양한 형광물질을 적용시키는데 어려움이 있다. 칩 표면에서 상보 DNA 결합에 양자점과 금 나노입자간의 에너지 전이현상을 사용한 경우도 있으나(Dyadyusha, L. Yin, H. Jaiswal, S. Brown, T. Baumberg, J. J. Booy, F. P. Melvin, T. Chem. Commun. 2005, 25, 3201) 이는 가수분해 단백질의 활성 측정을 위해 일반적으로 적용할 수 있는 방법이 아니며 공여체와 반응하는 수용체의 개수가 제한되어(1:1로만 반응) 에너지 전달을 증폭시키는데 한계가 있고 효과적인 정량분석을 기대하기가 어렵다. 현재까지, 칩 표면에서 양자점을 고정하여 FRET 혹은 SET을 포함한 에너지 전이현상에 기초한 가수분해 단백질의 활성을 측정한 사례는 없다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 에너지 전이 현상을 이용하여 소량의 용액만으로도 가수분해 단백질의 활성을 신속하게 측정할 수 있는 양자점 기반의 바이오칩 및 이를 이용한 가수분해 단백질의 빠른 검색 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 다양한 양자점을 이용하여 다양한 종류의 가수분해 단백질의 활성을 동시에 분석할 수 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 가수분해 단백질의 저해제를 빠르게 선별하여 단백질 활성을 저해하는 신약 후보 물질을 초고속 대량으로 선별할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 양자점 기반의 바이오칩은 (A) 유리 또는 실리카로 이루어진 지지체; (B) 상기 지지체의 표면에 구성된 자기조립 단층막; (C) 양자점의 표면이 바이오틴과 특이 결합하는 생체분자로 코팅되어 있어, 상기 자기조립 단층막의 말단기와 양자점 표면의 생체분자 작용기와의 결합에 의해 자기자기조립 단충막 위에 형성된 양자점 단층막; 및 (D) 가수분해 단백질에 대한 기질의 일말단에는 바이오틴이 결합되어 있고 타말단에는 에너지 수용체가 결합되어, 기질 말단의 바이오틴과 상기 양자점 단층막 상에 노출된 생체분자와의 특이결합에 의해 양자점 단층막 위에 형성된 기질-에너지 수용체의 결합층;으로 이루어진 것을 특징으로 한다.

상기 지지체는 유리 또는 실리카의 재질로 이루어진 것이 바람직하며, 금, 은, 알루미늄, 티타늄과 같은 금속성 기판을 사용할 경우 양자점의 형광이 심각하게 저해될 수 있으므로 사용하지 않는 것이 좋다.

상기 자기조립 단층막(Self-assembled monolayers, SAMs)은 지지체의 표면에 입혀진 규칙적으로 정렬된 유기 분자 박막으로서 지지체와 이온결합을 이루는 알칸 산(alkanoic acid)이나, 순수한 공유결합을 이루는 유기규소(organosilicon) 화합물을 사용하여 제조할 수 있다. 자기조립 단층막을 형성하는 화합물의 구체적인 예로는 n-alkanoic acid와 alkyl silane으로서 alkylchlorosilanes, alkylalkoxysilanes, alkylaminosilanes 등의 화합물 등을 들 수 있으며, 이 때 각 화합물에서 탄소의 수는 3-25개인 것이 바람직하다.

통상적으로 자기조립 단층막을 이루는 화합물들은 기질과 결합하는 머리부분의 반응기와 규칙적인 분자 막 형성을 가능하게 하는 몸통부분의 긴 알칸사슬, 분자막의 기능을 좌우하는 말단부분의 작용기로 구성되어 있다. 상기 말단부분의 작용기로서, 가장 간단한 작용기로는 알킬기를 예로 들 수 있으며, 아민, 티올, 카르복실기, 알데하이드, 에폭시, 말레이마이드, NHS(N-hydroxyl succinimide), 바이오틴(biotin) 중 하나 혹은 두개 이상의 혼합형태로 사용하는 것이 바람직하다. 이들 작용기의 선택시에는 양자점이 여기되는 영역(420~460nm)에서 형광을 내는 기능기를 사용하는 경우 양자점의 발광 신호가 심하게 저해 받을 수 있으므로 유의하여야 한다.

자기조립 단층막은 상기 화합물을 대개는 2mM~10mM 농도 범위에서 제조한 후 상기 지지체를 용액속에 담그는 방법으로 행하여 진다. 이때, 지지체 표면의 산화층을 먼저 제거하는 것이 바람직하며, 자기조립 단층막을 형성하는 과정에서도 반응 중 산소에 의한 산화반응을 차단시키기 위해 질소분위기 하에서 반응하는 것이 바람직하다. 지지체 상의 산화층은 지지체를 황산/과산화수소의 피라나(Pirana)용액으로 5~10분간 처리하는 것에 의해 제거될 수 있다. 상기 자기조립 단층막 구성 을 위한 화합물의 반응 과정은 상온에서 2~24시간 반응시키는 것이 바람직하나 반응시간이 24시간을 넘는다고 하여도 자기조립 단층막 형성에 문제가 발생하는 것은 아니다. 보다 빠른 반응을 유도하기 위해서는 30~40℃에서 2시간만 반응시켜도 무방하다.

본 실시예에서 사용한 NHS-하이드로젤(N-hydroxyl succinimide hydrogel)이 처리된 유리기판(Nexterion^TM Slide H, Schott, Germany)처럼 상용화된 자기조립 단층막이 형성된 유리기판을 사용할 수도 있다.

본 발명의 실시예에서는 생체분자가 코팅된 양자점으로 스트립렙트아비딘(streptavidin)이 코팅된 반도체 나노입자인 카드뮬-셀레니엄/황화아연 (CdSe/ZnS) 계열의 양자점(streptavidin-coated quantum dot, 이하 QD-SA, Invitrogen)을 사용하였다. QD-SA를 사용할 경우에는 첫째, 스트렙트아비딘이 단백질이기 때문에 양자점을 표면에 부착시키기가 용이하고, 둘째는 스트렙트아비딘-바이오틴 결합에 의해 양자점 표면에 기질-에너지 수용체를 많은 수로 강하게 결합시킨 후 세척과정에 의해 비특이적 결합을 줄일 수 있으며, 셋째는 스트렙트아비딘-바이오틴 결합에 의해 기질이 양자점위에서 일정한 간격을 유지함으로써 가수분해 단백질이 기질에 효과적으로 접근하여 분해할 수 있는 공간을 제공해 줄 수 있다는 이점이 있으나(도 1), 본 발명의 양자점이 이에 한정되지 않음은 당연하다. 양자점 표면을 코팅하는 생체분자로서는 스트렙트아비딘 이외에 아비딘 (avidin), 뉴트 라비딘(neutravidin) 또는 캡트아비딘 (captavidin)을 사용할 수 있다.

상기 양자점의 단층막은 자기조립 단층막의 구성 후 양자점을 표면위에 단층막으로 결합시키는 것에 의해 형성된다. 자기조립 단층막과 양자점의 결합은 자기조립 단층막의 말단기와 양자점에 코팅된 생체분자의 표면 작용기간의 공유결합에 의해 이루어진다. 양자점 단층막의 구성을 위하여 지지체에 양자점의 용액을 자기조립 단층막 표면위에 떨어뜨리거나 뿌려서 이루어진다.

상기 양자점의 단층막은 자기조립 단층막 상의 전 영역에 형성되어 질 수도 있으나, 상용화된 양자점을 이용시에는 가격이 비싸기때문에 일부 영역에 소량으로 국한하여 형성하는 것이 바람직하다. 양자점의 단층막을 자기조립 단층막 상의 일부 영역에 국한하여 형성시킬 경우, 양자점의 고정은 소량의 양자점 용액을 자기조립 단층막 표면위에 피펫팅하거나 마이크로어레이법으로 이루어질 수 있다. 반응은 통상 상온에서 30분~2시간 반응시킨 후 표면을 증류수로 씻어내는 것에 의해 이루어지나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 양자점(QD-SA)은 이미 다양한 크기가 상품화(Invitrogen 혹은 Evident Technologies)되어 있으며 최대 발광 파장이 500~900nm 범위에 있는 양자점을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 양자점이 부착된 지지체에서 양자점주위에 반응하지 않은 자기조립 단층막이 존재할 경우 추후 이차반응에서 자기조립 단층막과 기질 사이의 비특이적인 흡착을 야기할 수 있다. 즉, 자기조립 단층막의 말단 부분을 구성하는 알데하이 드, 에폭시, NHS, 바이오틴과 같은 작용기가 양자점과 결합하지 않은 채 노출되어 있는 경우 기질의 흡착이 일어날 수 있으므로 양자점 주위의 공간을 메워 비특이적 결합을 방지하는 것이 바람직하다. 상기 비특이적 결합억제자로서는 화학적 폴리머로서 에틸렌글리콜아민, 에틸렌글리콜티올, NHS(N-hydroxysuccinimide)-에틸렌글리콜, 말레이미드-에틸렌글리콜 등의 에틸렌글리콜 계열의 화합물과 폴리에틸렌글리콜 아민, 폴리에틸렌글리콜 티올, (NHS)-폴리에틸렌글리콜, 말레이미드-폴리에틸렌글리콜 등의 폴리에틸렌글리콜 계열의 화합물, 혹은 생물학적 화합물로서 카르보하이드레이트 단위체 결합에 기초한 폴리머, 단백질 disulfide isomerase, bovine serum albumin(BSA)으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 화합물로 충진되는 것이 바람직하다. 상기 양자점 주위의 충진은 양자점의 단층막을 구성한 후 상기 화합물의 용액을 뿌려주거나 침지하거나 흘려주는 것에 의해 이루어진다. 상기 화합물의 반응성 및 용해도에 따라 사용되는 용매, pH, 완충용액 등은 다르게 결정될 수 있으나 표면에 부착된 양자점에 영향을 주지 않는 범위내에서 유기용매보다는 pH 5~9 범위의 완충용액이 적절하며 화합물의 농도는 0.1 mM~10mM의 조건을 유지하는 것이 바람직하다.

상기 에너지 수용체는 양자점과 근접하여 있는 경우, 양자점으로부터 에너지 전이에 의해 양자점의 발광을 억제시킬 수 있는 것이면 어느 것이어도 무방하다. 본 명세서에서 에너지 전이(energy transfer)는 형광공명 에너지전이(FRET)와 표면에너지 전이(SET)을 포괄한 의미로서 사용하였음을 명시한다.

본 실시예에서는 에너지 수용체로서 Cy^TM-5와 표면 작용기의 부착이 쉽고 크기 조절이 간단하여 널리 사용되고 있는 금 나노입자(gold nanoparticle, AuNP)만을 예시하였으나, 이에 한정되는 것은 아니며 TAMRA (carboxytetramethylrhodamine), Alexa^TM, Cy^TM 등의 형광물질(fluorescent dye)이나, 금, 백금, 은 등의 나노입자 또는 QSY^TM, BHQ^TM, DABCYL^TM 등의 형광 억제자(fluorescent quencher)를 사용할 수 있다.

상기 에너지 수용체는 일말단에 바이오틴이 결합된 가수분해 단백질의 기질의 타말단에 부착되어 있어, 기질에 부착된 바이오틴과 양자점에 코팅된 생체분자와의 특이결합에 의해 양자점의 단층막 위에 기질-에너지 수용체의 결합층을 형성하게 된다.

본 발명 단계에서는 가수분해 단백질의 기질로서 펩타이드만을 예시하였으나, 이에 한정되지 않은 것은 당연하며 일말단에 바이오틴을 부착시킬 수 있고 타말단이 에너지 수용체와 결합할 수 있도록 구성된 기질이라면 어떤 것이든 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 실시예에서 사용한 펩타이드 CRPLALWRSK-biotin은 C-말단의 라이신에 의해 바이오틴이 부착되고, N말단의 시스테인에 의해 단분자 말레이미드 금 나노입자 (monomaleimide nanogold^ㄾ, Nanoprobe) 와 특이적으로 결합하는 일이 가능하다. 또한 금 나노입자 대신, 시스테인이 없는 아르기닌(arginine, R)의 N말단 끝에 형광물질(fluorescent dye)인 Cy^TM-5를 직접 아마이드 결합에 의해 부착시킬 수도 있다. 이러한 기질로서는 일말단에 양자점 표면의 생체분자와 결합되는 바이오틴 기를 도입할 수 있고 타말단은 에너지 수용체와 결합할 수 있는 티올 (-SH), 아민기 (NH₂), 카르복실기 (-COOH), 하이드록실기 (-OH)를 가지고 있는 것으로서, 펩타이드 및 DNA, RNA, PNA, 앱타머(aptamer), 당류, 지질을 예로 들 수 있다.

기질의 길이는 효과적인 에너지 전이를 위하여 결합되는 에너지 수용체의 종류 및 형태에 따라 소정 길이 이하가 되어야 한다. 즉, 에너지 수용체로서 금 나노입자를 사용하는 경우에는 양자점의 반지름(7.5~10 nm)를 고려하여 기질의 이론적 길이가 1-15nm 이하가 되도록 하는 것이 적당하며, 에너지 수용체로서 형광물질을 이용하는 경우에는 1-5nm이하가 되도록 하는 것이 적당하나 예시한 거리 조건 내에서 짧은 기질을 사용할수록 효과적인 에너지 전이를 기대할 수 있다. 그러나 기질이 너무 짧은 경우와 기질이 길더라도 기질 내 가수분해 되는 위치가 양자점 쪽에 치우쳐서 위치해 있을 경우에는 가수분해 단백질이 접근이 어려워 반응 효율이 낮아질 수 있으므로 이를 충분히 감안해야 한다. 기질로서 펩타이드를 사용하는 경우, 금 나노입자를 에너지 수용체로 사용 시에는 펩타이드의 서열이 20개 이하, 형광물질을 에너지 수용체로 사용 시에는 펩타이드 서열이 10개 이하인 것이 바람직하다. 펩타이드 길이가 상기 개수보다 많은 경우, 양자점과 수용체간의 거리가 늘어나 효과적인 에너지 전이가 발생하지 않을 수가 있다. 단, 펩타이드 중 α-helix 구조를 형성하는 것으로 알려진 서열 (예, achiral alpha-amino isobutyric residue (Aib))을 포함시키거나 상기 언급한 개수 이상의 펩타이드 서열에서 2차 혹은 3차 구조를 형성한다면 충분히 거리가 줄어들 수 있으므로 보다 많은 수의 펩타이드 서열을 사용할 수 있다.

기질-에너지 수용체 결합층의 구성을 위하여 기질이 결합된 에너지 수용체의 용액을 상기 양자점 단층막 표면 위에 뿌리거나, 떨어뜨리는 방법으로 이루어진다. 반응은 통상 상온에서 30분~2시간 반응시킨 후 표면을 증류수로 씻어내는 것에 의해 이루어지나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 의한 양자점 기반의 바이오칩은 전술한 바와 같이 자기조립 단층막이 형성된 지지체에 양자점 단층막과 기질-에너지 수용체 결합층을 단계적으로 형성하는 것에 의해 구성될 수도 있으나, 양자점과 기질-에너지 수용체를 먼저 결합시킨 후 자기조립 단층막과 결합시켜 양자점 단층막과 기질-에너지 수용체 결합층을 동시에 형성시키는 것에 의해 제조될 수도 있다. 이때 양자점과 기질-에너지 수용체는 양자점 단층막과 기질-에너지 수용체 결합층을 단계적으로 형성할 때와 마찬가지로 양자점에 코팅된 생체분자와 기질의 일말단에 결합된 바이오틴의 특이결합에 의해 결합된다.

또한 본 발명에 의한 양자점 기반의 바이오칩에서 상기 양자점 단층막은 2~5종의 양자점의 혼합물로 이루어져 있고, 기질-에너지 수용체 결합층은 서로 다른 기질-에너지 수용체가 서로 다른 양자점에 특이적으로 부착되어 구성될 수 있다. 이론적으로는 양자점을 5종류이상 사용할 수 있으나, 최대 발광파장의 간격, 에너지 수용체와의 조합을 고려하면, 5개 이하인 것이 바람직하다. 이때, 에너지 수용체는 형광물질을 사용할 경우에는 기질에 따라 서로 다른 종류를 사용할 수 있으나, 형광 억제자 혹은 금속 나노입자를 사용할 경우에는 한 가지 종류만을 사용할 수 있다.

상기 다수종의 양자점-기질-에너지 수용체 조합을 갖는 본 발명에 의한 양자점 기반의 바이오칩은, 여러 종류의 양자점에 각각 다른 기질-에너지 수용체를 결합시킨 후 상기 서로 다른 조합의 양자점과 기질-에너지 수용체의 혼합물을 사용하여 자기조립 단층막이 형성된 지지체에 양자점을 고정하는 것에 의해 제조된다.

본 발명의 다른 일 양태는 본 발명에 의한 양자점 기반의 바이오칩을 사용하여 기질에 대한 가수분해 단백질의 활성을 측정하는 방법에 관한 것이다. 상기 가수분해 단백질의 선별 방법은 (A) 상기 양자점 기반의 바이오칩과 활성을 측정하고자 하는 가수분해 단백질을 반응시키는 단계; (B) 상기 반응이 완료된 양자점 기반의 바이오칩을 세척한 후 양자점의 발광을 측정하는 단계; 및 (C) 가수분해 단백질과 반응하지 않은 양자점 기반의 바이오칩의 발광과 상기 (B)단계에서 측정된 양자점의 발광의 변화를 비교하여 단백질의 기질에 대한 가수분해 활성을 확인하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

상기 기질에 대한 가수분해 단백질의 선별 방법은 에너지 공여체인 양자점과 에너지 수용체가 기질을 사이에 두고 연결된 조건에서는 양자점과 인접한 에너지 수용체 사이의 에너지 전이에 의해 발광신호가 감소하게 되지만, 기질에 대한 가수분해 활성을 갖는 단백질에 의해 기질의 특정 부분이 절단될 경우 양자점과 에너지 수용체가 분리되어 에너지 전이가 일어나지 않음으로 인해 공여체의 발광신호가 다시 회복되는 원리를 이용한 것이다(도 1). 즉, 칩 표면을 기질에 대한 가수분해 활성을 검증하고자 하는 단백질로 처리하기 전과 후의 표면의 발광능력을 측정, 비교하여 단백질 처리 후 발광회복(Photofluorescence(PL) recovery)이 관찰된다면 상기 단백질은 기질에 대한 가수분해 활성을 갖는 것임을 알 수 있다.

상기 가수분해 단백질로서는 프로테아제(protease), 펩티다이제(peptidase), 뉴클레오시다아제(Nucleosidase), 디옥시뉴클레아제(DNase), 포스파타아제(phosphatase), 글루코시다아제(glucosidase), 갈락토시다아제 (galactosidase), 리파아제(lipase), 에스테라아제(esterase)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 가수분해 단백질인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시예에서는 프로테아제인 메트릭스 메탈로프로티아제(MMP-7)만을 예시하였으나 기질로 사용되는 펩타이드의 서열만 바꿈으로써 다른 프로테아제(예, collagenase, caspase, thrombin, HIV protease, cathepsins 등)의 활성을 측정할 수 있음은 당연하다.

이하, 실시예에서 사용한 양자점 기반의 바이오칩과 가수분해 단백질을 예로들어 본 발명의 가수분해 단백질의 선별 방법을 상세히 설명한다.

기질로서는 N말단 부위에 시스테인이 부착되고 C말단 부위에 바이오틴(biotin)이 부착된 펩타이드 RPLALWRSK-biotin를 사용하였으며 이는 프로테아제중 매트릭스 메탈로프로테이네이즈-7(Matrix metalloproteinase-7)에 특이적으로 반응하는 펩타이드 기질이다.

본 발명에 의한 양자점 기반의 바이오칩을 이용한 단백질의 기질에 대한 활성을 측정하기 전에 먼저 QD605-SA와 Cy5-RPLALWRSK-biotin(pep-Cy5) 또는 AuNP-CRPALWRSK-biotin(pep-AuNP)를 이용하여 수용액 중에서 양자점의 에너지전이에 의한 발광신호 감소율을 측정하였다.

QD-SA 하나의 양자점 주위에는 SA가 5~10개로서 존재하며, 양자점 표면에 무작위결합(random immobilization)된 하나의 SA에는 2~4개의 유효한(effective) 결합부위(binding site)가 존재한다. 따라서 바이오틴이 부착 가능한 결합부위의 수는 10~40개 정도로 유추할 수 있고, 칩 표면에서는 노출된 SA의 수가 줄어들 수 있으므로 40개 미만의 예측 가능한 바이오틴 결합부위가 존재하게 된다. 이로 인하여, 표면에 부착시킨 QD-SA의 농도와 반응시킬 수용체의 Pep-AuNP의 농도를 달리함으로써 공여체 : 수용체의 비율을 적절히 조절 하는 것이 가능하다.

먼저 에너지 전이에 의한 공여체의 발광억제(quenching)를 수용액에서 검정해 본 결과, 에너지 수용체의 양자점에 대한 상대적인 양이 많아질수록 공여체 QD-SA의 발광 능력이 효과적으로 억제될 수 있었다. Pep-AuNP의 경우에는 상기에서 예측한 바이오틴의 결합수와 일치하게 양자점:pep-AuNP의 농도가 1:40인 경우 발광 신호의 감소가 포화되어 에너지 수용체의 농도가 더 높아져도 발광신호의 세기는 더 이상 감소하지 않았다. 공여체와 수용체가 1:40의 농도비로 존재할 경우 pep-AuNP는 최대 82.1%, Pep-Cy5는 최대 55.5%의 발광억제를 보여 에너지 수용체로서 형광물질(Cy^TM-5)를 사용하는 것보다 금나노입자를 사용하였을 때 우수한 발광억제 능력을 보여주었다.

일반적인 형광공명에너지 전이현상 (FRET)의 원리에 의거해서, 두 수용체에서 나타난 발광신호 감소율(Q _E) 차이를 보다 명확하게 비교하였다. 우선, 공여체에 결합한 수용체의 개수를 고려하여 FRET에 의한 Q _E는 수식 1로 표현할 수 있다.

(수식 1)

즉, Q _E는 공여체 존재 시 형광세기(F _D)에 대한 공여체-수용체 존재시 형광세기 (F _DA)의 감소비로서 Q _E가 클수록 공여체의 형광세기가 수용체에 의해 감소함을 의미한다. 또한 이 값은 순수 공여체-수용체에서 나타나는 Fㆆrster 거리(R ₀, 공여체와 수용체가 펩타이드 없이 밀착하여 반응하였을 경우, 최대 Q _E의 1/2이 되는 지점의 거리)와 공여체와 결합한 수용체의 개수(n) 및 펩타이드에 의해 이격된 공여체 수용체간의 실제 거리(r)에 의존한다. R ₀는 공여체-수용체의 광학적 특성에 의 해 계산될 수 있는 것으로서, 수식 2로 표현할 수 있다.

(수식 2)

κ ² 은 공여체 수용체간의 쌍극자-쌍극자 위치를 의미하는 것으로 본 실시예의 경우 약 2/3의 값을 갖는다. n _D는 수용액의 굴절률(refractive index)로서 본 실시예의 경우 1.4의 값을 갖는다. NA는 아보가드로 수(Avogadro number)이고, Q _D는 공여체의 양자효율(quantum yield)로서 본 실시예에서 사용한 QD605의 경우 Q _D는 약 0.55였다(Invitrogen에서 측정값 제공). J(λ)는 공여체의 발광스펙트럼과 수용체의 흡광스펙트럼이 중복되는 지역의 크기를 적분한 값으로 QD605-AuNP의 경우 4.53ㅧ10^-15 cm³M^-1, QD605-Cy5의 경우에는 8.19ㅧ10^-15 cm³M^-1로 측정되었다 (결과미도시). 따라서, 수식1에 의해 QD605-AuNP와 QD605-Cy5의 R ₀ 값은 각각 5.8nm와 6.4nm로 계산되었다.

실제 공여체-수용체간 거리(r)는 수식 1로부터 유도 가능하고, 알려진 측정값 (R _0, Q _E와 n)으로부터 수식 3와 같이 계산될 수 있다.

(수식 3)

도 2에서 알 수 있듯이 QD605-AuNP의 경우 Q _E는 0.82, n은 약 40이고, QD605-Cy5의 경우 Q _E는 0.55, n은 약 40으로 측정되었으므로, 수식 3에 의해 측정한 실제 공여체-수용체간 거리(r)는 QD605-AuNP가 약 8.3nm, QD605-Cy5가 약 11.4nm였다.

QD-SA의 반지름이 7.5~10nm (Invitrogen에서 제공)이고, 펩타이드의 이론적인 최대거리는 3.8nm(아미노산과 아미노산 간의 거리 (3.8 Å)ㅧ아미노산 개수)로 예상할 수 있으므로 양자점 중심부위에서 수용체까지의 이론적인 예상거리 (r _theory)는 약 11.3~13.8nm(QD-AuNP)와 10.9~13.4nm(QD-Cy5)로서 예측될 수 있다. 따라서 FRET에 의한 측정거리 r과 예상거리 r _theory를 비교해 볼 때, QD605-Cy5에서는 잘 일치하고 있음을 알 수 있었으나, QD605-Au의 경우 r _theory값과 r값이 일치하지 않아 일반적인 FRET 반응식을 따르지 않았다. QD605-Au의 경우는 r값이 r _theory값보다 작게 측정되어 FRET에 의한 메카니즘보다 더 효과적으로 에너지 전이에 의해 발광신호를 억제하고 있는 것으로 예측되었다. 이를 표 1에 도식화하였다.

이러한 결과는 AuNP는 FRET보다 확장된 거리(최대 20nm 까지)에서 효과적으로 표면 에너지 전이현상 (surface energy transfer, SET)을 일으킬 수 있어 우수한 발광억제(quenching) 능력을 가지고 있드는 기존의 보고(Yun, C. S. et al. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 3115)와 같이 10 nm 이상의 거리에서도 효과적인 것을 의미한다. 따라서, 상기 결과로부터 본 발명에서 사용되는 공여체 중심부(core)에서 수용체까지의 거리는 대략 11~13nm임에 반해, QD-AuNP의 경우가 QD-Cy5보다 펩타이드에 의해 10nm이상까지 이격된 거리일지라도 발광신호를 충분히 억제할 수 있어 양자점-형광물질보다는 양자점-금나노입자가 프로티아제 활성 측정에 보다 효과적으로 사용할 수 있음을 알 수 있다.

FRET mechanism을 따르고 있는 QD-Cy5의 경우, 일반적으로 10nm를 초과한 거리에서는 FRET이 발생하지 않아 공여체의 발광신호가 감소되지 않지만, 상기 QD-Cy5의 경우 분리된 거리(r=11.4 nm)는 2R ₀ 이내의 범위로서(2R ₀ ?? 12.8 nm), 공여체(양자점)에 결합한 수용체(Cy^TM-5)의 양이 많기 때문에(약 40개) 최고 55%까지 발광신호가 억제될 수 있었다. 이것은 단순히 공여체와 수용체가 1:1로만 결합한 경우에는 일어나지 않으며, 양자점만이 가질 수 있는 장점이기도 하다.

본 실시예에서는 자세히 언급하지 않았으나 에너지 수용체로서 나노입자를 사용하였을 경우 그 직경크기에 따라 에너지 전이현상에 의한 Q _E가 달라질 수 있다. 양자점은 1-100 nm의 범위에서 적절한 크기를 선택해서 사용할 수 있으나 입자의 크기가 클수록 가수분해 단백질에 의한 접근성(accessibility)이 제한되어 발광신호의 회복력이 떨어질 수 있으므로 이를 고려하여야 한다.

에너지 수용체에 의한 양자점의 발광억제를 칩 상에서 확인한 결과(도 3), 수용액과 마찬가지로 에너지 수용체인 Pep-AuNP 양이 많아질수록 공여체 QD-SA의 발광 능력이 효과적으로 억제되었다. 그러나 수용액에서와는 달리 양자점:pep-AuNP=1:40의 경우에도 양자점의 발광신호 감소가 포화되지 않고 1:100의 농도비에서도 양자점의 발광신호가 계속 감소되어 최고 90%까지 양자점의 발광이 억제되었다.

상기 결과는 칩 표면이 수용액에서와는 달리, 표면에 반응하는 에너지 수용체의 농도가 진하면 진할수록 표면에서 비특이적으로 결합할 수 있는 양이 상대적으로 커질 수 있고, 건조과정 중에 이러한 비특이적 흡착은 공여체와 수용체 사이의 에너지 전달에 크게 영향을 주기 때문이라고 추정된다. 따라서, 이러한 비특이적 결합을 방지하기 위해서는 에너지 수용체를 고농도로 반응시키는 것은 좋지 않으며 공여체 : 에너지 수용체의 농도비율이 1 : 1~100 (mol/mol)의 범위내에서 결정하는 것이 바람직하다. 실시예에서는 구체적으로 데이터를 기술하지는 않았으나, 공여체에 대한 에너지수용체의 농도 비율을 1:100으로 할 경우에는 가수분해 단백질의 처리 시 비특이적 흡착으로 인하여 발광신호의 회복이 약 32%로 높지 않았다(결과미도시). 그러나 칩 표면에서 공여체에 대한 에너지 수용체의 농도비를 1:30 ~ 1:50(mol/mol)으로 유지할 경우 가수분해 단백질의 활성을 측정하는 데는 크게 문제가 되지 않아 더욱 바람직하였다. 그러나 상기 최적 농도 비율은 다양한 조건 특히, 기질의 길이에 따라 변경될 수 있으므로 1:1~100인 것이 바람직하다.

마찬가지로 칩상에서 단백질의 기질에 대한 가수분해 활성을 검정하기 전에 수용액에서 그 실효를 확인하였다. 효과적인 비교를 위하여 기질에 대해 가수분해 활성을 갖는 MMP-7과 함께 기질에 대해 가수분해 활성이 없는 MMP-2에 의한 발광신호 회복을 함께 측정하여 비교하였다. MMP-7은 펩타이드의 서열 중 알라닌(Alanine)과 루신(Leucine)간의 결합을 특이적으로 가수분해하여 공여체의 발광신호를 회복하게 한다.

수식 4에 의해 공여체(양자점) 발광신호의 회복율(PL recovery)을 계산한 결과, MMP-7의 경우 초기 발광신호에 대비 약 50%까지 회복되었으나 더 이상은 증가하지 않았다. 이에 비해 MMP-2에 의해서는 양자점의 발광신호가 거의 증가하지 않았다.

(수식 4)

I _DA : 공여체와 수용체가 결합되었을 때의 발광 신호크기

I _D : 수용체 없이 공여체만 있을 때 가수분해 단백질 처리 후 발광 신호크기

I _E : 공여체와 수용체가 결합되었을 때 가수분해 단백질 처리 후 발광 신호크기

발광 회복정도가 100%면 가수분해 단백질에 의해 공여체에 결합된 모든 펩타이드 기질이 완전히 가수분해 되어 수여체가 공여체 근처에 존재하지 않음을 의미한다. 기본적으로 공여체에 결합된 모든 펩타이드는 인접한 펩타이드와의 공간적 제한(steric hindrance)으로 인하여 가수분해 단백질이 모든 펩타이드에 충분히 접근(access)할 수 없으므로 100%의 효율을 나타내지 못하는 것으로 예측된다. 그러나, 가수분해 단백질 종류와 크기, 기질과의 특이성, 가수분해되는 특정부위의 위치, 공여체와 수용체의 거리, 공여체의 크기, 수용체의 발광신호 저해 능력 등에 따라 양자점의 발광신호의 회복정도가 다를 수 있으므로 항시 동일한 측정 조건에서 발광신호의 회복정도를 비교하여 판단하여야 한다.

본 실시예에서는 언급하지 않았으나, 프로티아제 효소가 없는 완충용액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂ pH 7.4)만 있는 조건에서는 양자점의 발광 신호는 전혀 회복되지 않았으며, 사용한 프로티아제(MMP-7)의 반응 시간은 상기농도조건에서 37 ℃에서 1시간 이상 반응시킬 경우 발광신호의 회복정도가 포화되어 프로티아제 반응시 적정 시간으로 사용하였다. 또한 MMP-7의 농도에 따라서 발광신호의 회복율은 증가하였으나 MMP-7 농도 100nM에서 포화되었고 최소 1nM의 농도에서는 약 6%의 PL recovery만을 보여주었다(결과미도시). 상기 실시예는 프로티아제 MMP-7에만 한정된 것일 뿐, 가수분해 단백질의 종류에 따라 사용되는 버퍼의 조성, 반응시간에 따라 달리 적용될 수 있으므로 PL recovery의 값은 다르게 나타날 수 있다.

본 발명에 의한 양자점 기반의 바이오칩을 이용하여 가수분해 단백질의 활성을 측정할 경우, 칩 위에서 기질과 가수분해 단백질과의 반응은 측정하고자하는 단백질의 용액을 양자점 기반의 바이오칩에 떨어뜨려 반응시킴으로써 수행된다. 반응은 통상 30~37 ℃에서 30분~3시간 반응시킨 후 표면을 증류수로 씻어내는 것에 의해 이루어지나, 반응 온도나 시간은 가수분해 단백질과 기질의 특성에 따라 조절되는 것이 바람직하며 이에 한정되는 것은 아니다. 특히, 상기 단백질 용액을 양자점 기반의 바이오칩 위에 떨어뜨려 반응을 시키는 경우 단백질의 용액이 흐르는 것을 방지하기 위하여 얇은(1~5 mm) 실리콘막으로 만들어진 챔버를 칩 표면에 덮은 후 반응하는 것이 바람직하다. 다수의 well을 갖는 챔버를 사용하는 경우, 각 well마다 다른 단백질 용액을 반응시켜 각 well 부위의 발광신호 회복율을 측정하는 것에 의해 기질에 대한 여러 가지 단백질의 가수분해 활성을 양자점 기반의 바이오칩위에서 동시에 측정하는 것이 가능하다.

본 발명에 의한 양자점 기반의 바이오칩을 사용하여 단백질의 가수분해 활성을 측정한 결과, 기질 특이적으로 양자점의 발광신호가 약 60%까지 회복되었으며, 은 염색(silver staining) 확인결과 발광신호가 회복된 샘플에서는 양자점에 부착된 금나노입자가 떨어져 나간 것을 확인하여 발광신호의 회복이 기질의 가수분해에 의해 양자점과 금나노입자가 분리되어 나타난 것을 알 수 있었다. 이로서 본 발명에 의한 양자점 기반의 바이오칩을 사용하여 기질에 대한 가수분해 단백질을 효과적으로 선별할 수 있음을 확인하였다.

또한 실시예에는 기재하지 않았으나, 본 발명의 양자점 기반의 바이오칩을 이용하여 가수분해 단백질을 선별할 경우 동일한 가수분해 단백질이 농도가 증가할수록 기질이 분해되어 발생하는 양자점의 발광 회복신호가 증가하므로 가수분해 단백질 농도를 확인하는 정량분석에 효과적으로 사용될 수 있다. 즉 가수분해 단백질의 농도에 따른 양자점의 발광신호 회복 정도에 대해 표준 곡선(standard curve)을 작성한 후 미지 농도의 가수분해 단백질의 발광신호 회복 정도를 측정하고 표준 곡선과 비교하는 것에 의해 가수분해 단백질의 농도를 정량할 수 있다.

또한 전술한 다수의 양자점-기질-에너지 수용체 조합으로 이루어진 양자점 단층막과 기질-에너지 수용체 결합층을 갖는 본 발명의 양자점 기반의 바이오칩을 사용하는 경우, 가수분해 단백질과의 반응에 의해 가수분해 단백질이 활성을 나타내는 기질에 결합된 양자점의 발광신호만이 회복되어 증가하므로 여러 기질에 대한 단백질의 가수분해 활성을 한번에 분석하는 것이 가능하다.

본 발명은 또 다른 일 양태로서, (A) 상기 양자점 기반의 바이오칩과 가수분해 단백질을 반응시키는 단계; (B) 상기 양자점 기반의 바이오칩과 가수분해 단백질 및 가수분해 저해제의 혼합액을 반응시키는 단계; (C) 상기 반응이 완료된 (A)와 (B)의 양자점 기반의 바이오칩을 각각 세척한 후 양자점의 발광을 측정하는 단계; 및 (D) (C) 단계에서 측정한 (A)와 (B) 칩의 양자점의 발광의 변화를 측정하여 저해제의 가수분해 단백질에 대한 저해능을 확인하는 단계;로 이루어지는 것을 특징으로 하는 가수분해 단백질에 대한 저해제의 선별 방법을 제공한다.

상기의 가수분해 단백질에 대한 저해제의 선별 방법은 가수분해 단백질에 특이적인 저해제(inhibitor)가 존재할 경우에는 가수분해가 일어나지 않으므로 양자점의 발광신호가 회복되지 않는 것을 이용하는 것이다. 상기 가수분해 단백질의 저해제의 선별방법에 이용되는 효소의 특성은 전술한 가수분해 단백질의 선별방법에서 설명한 바와 동일하다.

상기 저해제 선별의 예로서, 펩타이드를 선택적으로 가수분해(cleavage)하는 프로티아제에 대해서 저해제(inhibitor)의 후보로 알려져 있는 다양한 종류의 합성 화합물, 천연물, 폴리펩타이드, 호르몬 등과 섞어 반응시킴으로써 가수분해 단백질의 활성을 저해하는 저해제를 신약후보물질로 탐색(screening)할 수 있다.

본 발명에서는 기질과 결합된 에너지 수용체가 양자점과 결합된 칩 상에서 가수분해 단백질 또는 가수분해 단백질과 저해제의 혼합액을 처리하여 가수분해 단백질을 선별하는 방법에 한정하였으나, 기질 결합된 에너지 수용체의 제조한 후 양자점과 결합하기 전에 가수분해 단백질 혹은 가수분해 단백질과 저해제의 혼합액과 먼저 반응시킨 후 양자점에 부착시키고 양자점의 발광 정도를 측정하여 가수분해 단백질 또는 저해제를 선별하는 것도 가능하다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 예시적인 목적일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 바이오틴이 부착된 펩타이드-금나노입자(pep-AuNP)의 제조

표면이 단분자말레이미드로 구성된 1.4nm 크기의 금나노입자인 Monomaleimide Nanogold^ㄾ(Nanoprobe) 6 nmol을 100μL의 디메틸설폭사이드 (dimetylsulfoxide, DMSO)에 녹인 후 900μL의 증류수를 추가로 넣어 5분간 볼텍스(vortex)로 흔들어 주었다. N-말단과 C-말단에 시스테인과 바이오틴이 각각 부착된 펩타이드 CRPLALWRSK-biotin(Peptron)을 증류수 1 mL에 금나노입자 농도의 5~10배(30~60nmol)에 해당하는 50 nmol/mL의 농도로 녹인 후, 상기 금 나노입자가 용해된 용액 6 nmo/1mL와 섞어서 4 ℃에서 16~18시간동안 방치하였다. 반응 시에는 교반과정을 수반할 경우 반응용액 내 용존 산소가 증가하여 말레이미드 반응에 저해가 될 수 있으므로 단순히 방치시켰다. 말레이마이드는 펩타이드 N말단에 위치한 시스테인의 티올기(thi0l group)와 특이적으로 공유결합할 수 있기 때문에 금나노입자를 펩타이드와 1:1로 결합시키는 것이 가능하다.

결합에 참여하지 않은 펩타이드를 제거하기 위해 마이크로센트리콘 (microcentricon YM-10, 10 kDa cut-off)을 이용하여 10,000g에서 30~40분간 원심분리 하고, 증류수를 약 500 μL씩 넣어 동일한 원심분리 조건에서 2~3회 세척하였다.

금나노입자는 약 15kDa이고 펩타이드는 대략 1.5kDa이므로 마이크로센트리콘을 사용하면 펩타이드만 쉽게 여과시킬 수 있고, 여과 후에는 펩타이드 결합된 금나노입자만이 마이크로센트리콘 표면위에 존재하였다. 마이크로센트리콘 표면위에 남아있는 펩타이드가 결합된 금 나노입자 AuNP-CRPLALWRSK-biotin(pep-AuNP)는 증류수 혹은 사용하고자 하는 완충용액에 희석하여 다음 실험에서 사용하였다. 희석한 용액 중 pep-AuNP의 농도는 금나노입자의 흡광계수를 이용하여 계측하였다. 420 nm에서 금 나노입자의 흡광계수는 1.1ㅧ10⁵ M^-1cm^-1이므로, 희석한 용액의 흡광도를 UV-분광기(UV-2550, Shimadzu)로 측정하여 흡광도를 구한 후 상기 흡광계수로 나누어서 그 농도를 산정하였다. 금 나노입자와 펩타이드는 1:1로 결합되었으므로 구한 금 나노입자의 농도는 pep-AuNP의 농도와 동일하다.

실시예 2 : 용액 내에서의 수용체 농도에 따른 공여체의 발광 측정

금나노입자 또는 형광물질의 양자점과의 에너지 전이에 의한 양자점 발광억제(quenching) 현상을 비교하기 위하여, 칩 표면에서의 반응 전에 먼저 용액 내에서 양자점-금나노입자와 양자점-형광물질(dye)의 발광세기를 금나노입자 또는 형광물질의 농도비에 따라 비교 분석하였다.

에너지 공여체로 작용하는 양자점은 전체 지름이 15~20nm이고, 양자점 하나 당 5~10개의 스트렙트아비딘(SA)가 표면에 부착된 QD605-SA(Invitrogen)을 사용하였다. QD605-SA는 605nm에서 발광하는 특성이 있다.

에너지 수용체로는 금나노입자는 실시예 1에서 제조한 pep-AuNP를, 형광물질은 실시예 1의 펩타이드에서 N-말단의 시스테인 대신 Cy^TM-5가 부착된 Cy5-RPLALWRSK-biotin(AnyGen)(pep-Cy5)을 사용하였다. Pep-Cy5의 농도는649nm에서 Cy^TM-5의 흡광계수 2.5ㅧ10⁵ M^-1cm^-1)를 이용하여 정량하였다.

에너지 공여체 용액은 증류수로 QD605-SA를 20nM의 농도로 희석시켜 1 mL를 제조하였다. 에너지 수용체로서 Pep-AuNP 혹은 Pep-Cy5를 농도가 각각 20, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000nM이 되도록 증류수에 희석하여 각각 50μL씩 제조하였다. 각 농도의 에너지 수용체 용액 50μL에 동일 부피의 상기 QD605-SA 용액을 섞어준 후 상온에서 30분간 반응시켰다. 96-well plate에 최종 반응시킨 용액 100 μL씩을 각 well에 나누어 넣고 형광 플래이트 리더기(plate reader M-200, TECAN, Austria GmBH)를 통해 QD605-SA의 형광세기를 측정하여 도 2에 도시하였다. 도 2에서 QD는 QD605-SA를, Au는 Pep-AuNP를, Cy5는 Pep-Cy5를 각각 나타낸다.

도 2에서 확인할 수 있듯이 공여체인 QD605-SA에 대한 수용체의 농도비가 증가할수록 공여체의 형광세기는 감소하였으며, 특히 Pep-AuNP(도 2의 a))가 Pep-Cy5(도 2의 b))보다 효과적으로 공여체의 발광신호를 억제하였다. Pep-AuNP의 경우 공여체보다 40배의 농도비(mol/mol)에서 발광신호의 감소는 포화상태였고, 도면에 예시하지는 않았으나 Pep-AuNP의 농도를 더 높인 100 Au/QD에서도 공여체의 신호세기는 더 이상 감소되지 않았다. 발광신호의 감소정도(quenching efficiency, Q _E)를 총 3회에 걸친 반복실험을 통해 계산하여 비교한 결과, 공여체와 수용체가 1:40의 농도비로 존재할 경우, Pep-AuNP는 최대 82.1% (평균오차 7.3%), Pep-Cy5는 최대 55.5% (평균오차 4.9%)의 Q _E를 보여주었다 (도 2의 c)).

실시예 3 : 칩 표면위에서 수용체 농도에 따른 공여체의 발광 측정

1) 칩 표면에 에너지 공여체인 양자점의 고정

실시예 2에서 사용한 QD605-SA를 2% BSA가 첨가된 완충용액(50 mM borate buffer, pH 8.5)에 최종 10 nM이 되도록 희석한 후, 96-well plate에 20 μL을 넣고 bubble을 제거하기 위해 500 rpm에서 1분간 원심분리를 수행하였다.

양자점을 부착시키기 위한 기판으로는, NHS-하이드로젤(N-hydroxyl succinimide hydrogel)이 처리된 유리기판(Nexterion^TM Slide H, Schott, Germany)을 사용하였다. 자동화된 마이크로어레이(Robotic Microarray System, Microsys, Cartesian Techonologies, USA)와 spotting 핀(CMP3 spotting pin, Telechem International, Sunnyvale, USA)을 이용하여 기판의 지정된 위치에 QD605-SA 용액을 spotting시켰다. spot 하나에 해당하는 QD605-SA용액의 양은 약 1nL정도이고 spot 하나의 크기는 지름이 약 150~200μm로서 총 4개(2x2)의 spot을 4 mm 간격으로 spotting하였다. 상온 및 70% 습도가 유지되는 챔버(chamber)에서 상기 기판을 약 1시간 정도 방치한 후 spot 내부 혹은 주위에 남아있는 NHS기를 blocking하기 위해 2% BSA가 함유된 완충용액(50 mM borate buffer, pH 8.5)을 상기 기판 상에 2x2로 구성된 각 spot위에 약 3 μL씩 피펫으로 떨어뜨린 후 건조되지 않도록 유리 기판을 보관하며 상온에서 1시간 동안 방치시켰다. 이후, 증류수로 유리 기판을 3회 세척 후에 질소가스로 천천히 건조시켰다.

2) 칩 상에서 에너지 수용체와 양자점의 결합

1)에서 제조된 칩의 표면에 부착된 양자점에 에너지 수용체로서 실시예 1에서 제조한 Pep-AuNP 또는 Pep-Cy5를 결합시켰다. 즉, 기판상에 2ㅧ2로 구성된 QD605-SA의 spot 지역에 실시예 1과 2에서 예시한 방법대로 Pep-AuNP 혹은 Pep-Cy5 수용액을 제조하여 각기 3μL를 피펫으로 떨어뜨린 후 건조되지 않도록 밀봉한 상태에서 상온에서 30분간 방치시켰다. 이와 같은 방식으로, 농도에 따른 Pep-AuNP를 각각 100, 200, 300, 400, 1000 nM의 농도별로 QD605-SA spot 위에 동일하게 떨어뜨려 반응시켰다. 이후, 반응용액을 제거하고 증류수로 기판을 3회 세척한 후에 질소가스로 천천히 건조시켰다. Pep-Cy5의 경우에도 Pep-AuNP와 동일한 방식으로 칩 표면에 부착된 양자점과 결합시켰다.

3) 칩 상에서의 공여체의 발광강도 측정

상기 2) 단계에서 제조된 칩 상에 부착된 Pep-AuNP 또는 Pep-Cy5와 결합된 양자점의 발광강도를 에너지 수용체가 없는 조건의 spot(QD control)을 기준으로 서로 다른 에너지 공여체가 일정 농도 비율 (QD:acceptor = 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:100, mol/mol)로 증가함에 따라서 나타나는 공여체의 발광 이미지로 측정하였다. 발광 이미지는 슬라이드 칩 스캐너(ArrayWoRx^e, Applied Precision, USA)를 이용하여 형광스캔 후 분석하고 그 사진을 도 3의 a)에 도시하였다. 이때, 형광필터는 흡광 460nm/발광 605nm (Chroma)의 조합을 사용하여 측정하였다.

스캐닝하여 얻은 형광이미지는 어레이 분석용 소프트웨어(GenePix Pro 4.0, Axon)를 사용하여 동일한 조건에서 반응한 4개(2ㅧ2)의 spot에 대한 신호세기의 중앙값(median)과 표준편차 (standard deviation)를 측정하였고, 각 측정값은 엑셀 (Microsoft excel 2003)을 이용하여 수식 2에 의해 Q _E를 계산하였다(도 3의 b)).

실시예 1과 동일하게 Pep-Cy5보다 Pep-AuNP가 보다 효과적으로 양자점의 발광을 억제하는 것을 관찰할 수 있었으나, 수용액에과는 달리 수용체의 농도가 증가함에 따라서 최고 90%까지 양자점의 발광이 억제되었다. 즉, 수용체로서 금나노입자를 사용한 경우, 1:40 (공여체:수용체, mol/mol)의 농도비에서도 공여체의 발광신호 감소가 포화(saturation)되지 않고, 최고 1:100까지 공여체의 발광신호가 계속 감소하였다.

상기 실험결과로부터 칩 표면에서 양자점과 수용체 의한 에너지 전이를 효과적으로 분석하는 일이 가능하였고, 수용체로서 금나노입자를 사용하였을 때 형광물질보다 양자점의 발광을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.

실시예 4 : 용액 중 단백질의 가수분해 활성 측정

1) 양자점의 발광 측정

본 실시예에서는 수용체로서 우수한 발광억제 능력을 확인한 Pep-AuNPs만을 이용하여 용액 내에서 효과적으로 가수분해 단백질의 활성을 측정할 수 있는지를 검정하였다. 또한, Pep-AuNP가 서로 다른 양자점에 대해 동일한 효과를 나타내는지를 동시에 확인하기 위해 QD605-SA와 함께 525nm에서 발광하는 특성을 갖는 QD525-SA(Invitrogen)를 에너지 공여체로 사용하여 그 발광세기를 측정하여 도 4에 도시하였다.

양자점 QD525-SA와 QD605-SA를 완충용액(10 mM HEPES buffer, pH 7.4)에 20 nM의 농도로 각각 녹인 후 각 양자점 당 4개의 eppendorf tube에 50μL씩 각각 분주하였다. (1) QD525-SA와 QD605-SA 각 1개의 tube에는 완충용액(10 mM HEPES buffer, pH 7.4)으로 희석된 1 μM 농도의 Pep-AuNP 50 μL를 각각 넣어서 섞어 준 후 상온에서 30분간 동일하게 방치시켜 반응하였다. 이후, 가수분해 단백질의 반응을 유도하기 위해 메트릭스 메탈로프로티아제-7(MMP-7, Calbiochem)를 완충용액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂ pH 7.4)에 녹인 후, 상기 각 tube에 0.5 μL씩 첨가하여 MMP-7의 최종농도를 100 nM가 되도록 하여 37 ℃에서 1시간동안 반응시키고 양자점의 발광을 측정하였다(+MMP-7). (2) 또 다른 QD525-SA와 QD605-SA 각 1개의 tube에는 완충용액(10 mM HEPES buffer, pH 7.4)으로 희석된 1 μM 농도의 Pep-AuNP 50 μL를 각각 넣어서 섞어 준 후 상온에서 30분간 동일하게 방치시켰다. 이후 MMP-7이 없는 완충용액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂ pH 7.4)을 상기 각 tube에 0.5 μL씩 첨가하여 37 ℃에서 1시간동안 동일하게 반응시키고 Pep-AuNP에 의해 억제된 양자점의 발광을 측정하기 위하여 사용하였다(QD-AuNP). (3) 기질-수용체가 없는 대조군으로서, QD525-SA와 QD605-SA의 각 1개의 tube에는 상기 완충용액 50 μL를 추가로 넣고 희석한 다음 MMP-7이 첨가된 완충용액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂ pH 7.4)을 상기 각 tube에 0.5 μL씩 첨가하여 (최종 MMP-7농도 100 nM) 37 ℃에서 1시간동안 동일하게 반응시켰다. (QD only). (4) MMP-7대신 MMP-2(Sigma)를 사용한 것을 제외하고는 (1)과 동일한 방법으로 샘플을 제조하여 양자점의 발광을 측정하였다(+MMP-2).

도 4에 도시된 바와 같이, Pep-AuNP에 의해 QD525-SA와 QD605-SA는 모두 효과적으로 발광억제(quenching)되었으며 MMP-7 프로티아제에 의해서만 특이적으로 발광신호가 회복되었다. 이로부터 가수분해 단백질의 특이적 반응에 의해 양자점과 금나노입자간에 연결된 펩타이드가 가수분해 되어 양자점의 발광신호가 회복되었음을 확인할 수 있었다.

2) 전계 방사 투과전자현미경에 의한 검정

1)의 단백질에 의한 가수분해를 보다 구체적으로 증명하기 위해, 전계 방사 투과전자현미경(Field Emission Transmission Electron Microscope, FE-TEM, 모델명: Tecnai F30 S-Twin, FEI, Netherlands)을 사용하여 프로티아제의 반응 전후의 양자점과 금나노입자의 형태를 찍어 도 5에 도시하였다. 1.4 nm 크기의 금나노입자가 포함된 시료는 전자현미경용 그리드(ultrathin carbon grid supported by holey carbon, Ted Pella)위에 흡착시킨 후 측정하였다. QD605-SA와 Pep-AuNP의 결합체에 프로티아제 MMP-7을 처리한 측정 시료는 마이크로센트리콘 (microcentricon YM-50, 50 kDa cut-off)으로 10,000g에서 15분간 필터링하여 잘려진 부분은 버리고 양자점을 포함한 상등액만을 그리드에 흡착시켜 측정하였다.

도 5의 a)와 b) 및 보다 확대된 c), d)에서 확인할 수 있는 것과 같이, 양자점 표면에 결합한 금나노입자가 가수분해 단백질을 처리한 후에는 현저히 줄어들었다. 이로부터, 가수분해 단백질의 활성에 의해 펩타이드가 특이적으로 가수분해(cleavage)되어 양자점과 금나노입자 간의 결합이 끊어지고, 이로 인하여 양자점의 발광신호가 회복되었음을 알 수 있었다.

실시예 5 : 바이오칩 표면위에서 단백질의 가수분해 활성 및 저해효과 측정

1) 기질 특이성에 의한 발광신호의 회복

실시예 3에서 확인한 칩 표면에서 양자점과 수용체의 에너지 전이를 이용하여 가수분해 단백질의 활성을 측정하였다.

실시예 3과 동일한 방법에 의해 (1) QD605-SA가 부착된 칩과 (2) 칩 표면에 부착된 QD605-SA에 Pep-AuNP가 1:50의 농도비(mol/mol)로 결합된 칩 및 (3) (2)의 칩에 MMP-7를 처리한 칩의 605nm에서의 발광이미지를 측정하여 도 6의 a)에 도시하였다. 한편, MMP-7은 펩타이드의 서열 중에서 알라닌Alanine, A)과 루신(Leucine, L) 사이를 가수분해에 의해 특이적으로 절단하므로, 비특이적인 펩타이드 기질과의 비교를 위하여 Pep_RGD-AuNP를 제조하여 Pep-AuNP와 동일한 세가지 칩을 제조한 후 발광이미지를 측정하여 도 6의 b)에 도시하고 가수분해 단백질의 특이성을 검정하였다. Pep_RGD-AuNP는 펩타이드로서 CALNNRGDK-biotin(Pep_RGD, Peptron, Co. Ltd.)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다. 각 spot에 대한 형광이미지로부터 어레이 분석용 소프트웨어(GenePix Pro 4.0, Axon)를 사용하여 평균 신호세기 및 표준편차를 측정하여 도 6의 c)에 나타내었다.

양자점 및 금나노입자가 결합된 칩에 MMP-7을 처리하는 구체적인 방법은 다음과 같다. MMP-7(Calbiochem)은 완충 용액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂ pH 7.4)에 반응하기 직전에 100 nM의 농도로 녹인 후 각 spot에 떨어뜨린 후 반응시켰다. MMP-7 용액이 흐르는 것을 방지하기 위해 양자점 및 금나노입자가 결합된 유리 기판위에 2ㅧ2 spot이 하나의 well에 들어가도록 간격을 갖는 multiwell 실리콘 챔버(높이 1 mm ㅧ 지름 3 mm, Simga)를 덮은 후에 spot 당 MMP-7 용액 10 μL를 떨어뜨렸다. 이후, 유리기판을 페트리 접시에 넣고 밀봉을 한 상태에서 37℃에서 1시간 동안 반응하였다.

도 6에서 확인할 수 있듯이, Pep-AuNP는 양자점과 결합 후 효과적으로 발광신호를 억제하였고(a2) 가수분해 효소인 MMP-7을 처리한 후에는 양자점의 발광신호가 ~60%까지 회복됨을 확인할 수 있었다(a3). 반면, Pep_RGD-AuNP에서는 양자점과 결합 후 발광신호는 효과적으로 억제하였으나(b2) 프로티아제 처리 후에는 상대적으로 신호의 회복이 미약하였다(b3).

이를 보다 구체적으로 증명하기 위해, 금나노입자가 상기 프로티아제 반응에 의해 실제로 절단되어 소실되었는지를 확인하고자 은염색(silver staining)을 실시하였다. 상기 염색방법은 금나노입자의 양에 비례하여 은색으로 발색이 되므로 금나노입자의 존재여부를 확인할 수 있는 방법이다. 은염색은 은염용액(silver salt solution)과 개시제 용액(initiator solution)을 1:1 (v/v)로 섞은 직후 칩 표면의 spotting부분에 각각 3 μL씩 떨어뜨려 반응하였다. 1-2분간 반응 직후 바로 증류수로 세척하고 광학현미경으로 관찰하여 그 사진을 도 6의 각 형광이미지의 옆에 도시하였다. 도 6의 광학현미경 사진에서 보는 바와 같이 Pep-AuNP 혹은 Pep_RGD-AuNP 결합되어 있는 부분에서는 진하게 염색된 것을 확인할 수 있었고(a2, b2), MMP-7의 처리에 의해서 Pep-AuNP에서만 금나노입자의 감소로 염색의 진하기가 감소됨을 알 수 있었다(a3, b3). 상기 결과로부터 MMP-7은 기질 특이적으로 반응하여 양자점의 신호회복에 기여하고 있음을 확인할 수 있었다.

2) 양자점의 크기에 따른 프로테아제 활성 측정

칩 표면위에서 금나노입자가 다양한 크기의 양자점에 효과적으로 사용될 수 있는지를 검정하기 위하여, 1)과 동일한 방법으로 QD605-SA와 함께 QD525-SA에서도 프로티아제의 활성을 측정하여 도 7에 도시하였다. 도 7에서 확인할 수 있듯이, QD605-SA뿐만 아니라 칩 표면에 고정된 QD525-SA도 MMP-7에 의해 효과적으로 발광신호가 회복되었다. 또한 MMP-7에 대한 저해제 NHDDPC (N-Hydroxy-1,3-di-(4-methoxybenzenefulfonyl)-5,5-dimethyl-[1,3]-piperazine-2-carboxamide, MMP Inhibior II, Calbiochem)를 완충용액(10 mM HEPES, pH 7.4)에 약 100 nM의 농도로 희석하여 MMP-7과 함께 섞어서 사용한 결과, 두 종류의 양자점 모두에서 펩타이드의 절단을 방해하여 양자점의 발광신호가 회복되지 않았다 (a4와 b4).

상기 실험에 의해, 가수분해된 단백질의 활성은 칩 표면에서 다양한 양자점과 금나노입자 사이의 에너지 전이를 이용하여 측정할 수 있으며, 저해제 판별에도 매우 효과적임을 알 수 있었다.

이상과 같이 본 발명에 의한 양자점 기반의 바이오칩에 의하면, 칩 표면에서 양자점의 에너지 전이현상을 이용하여 가수분해 단백질의 활성을 초고속 대량 분석하는 것이 가능하다.

또한 에너지 수용체로서 금나노입자를 사용하면 10 nm이상의 거리에서도 공여체와 수용체간 에너지 전이에 의한 측정이 가능하고, 서로 다른 크기의 양자점에 적용할 수 있어 다양한 가수분해 단백질 혹은 다양한 기질에 대한 동시분석이 가능하다. 특히, 혈액 내에 질병관련 표지물질(marker)로서 알려진 가수분해 단백질을 대량으로 진단하기 위한 목적에 효과적으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 관련 저해제의 초고속 스크리닝에도 유용하게 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Quantim dot-based biochip and method for assying hydrolytic protein using the same <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Substrate for hydrolytic protein <400> 1 Cys Arg Pro Leu Ala Leu Trp Arg Ser Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Substrate for hydrolytic protein <400> 2 Arg Pro Leu Ala Leu Trp Arg Ser Lys 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Substrate for hydrolytic protein <400> 3 Cys Ala Leu Asn Asn Arg Gly Asp Lys 1 5

Claims (16)

1. (A) 유리 또는 실리카로 이루어진 지지체;

   (B) 상기 지지체의 표면에 구성된 자기조립 단층막;

   (C) 양자점의 표면이 바이오틴과 특이 결합하는 생체분자로 코팅되어 있어, 상기 자기조립 단층막의 말단기와 양자점 표면의 생체분자 작용기와의 결합에 의해 자기자기조립 단충막 위에 형성된 양자점 단층막; 및

   (D) 가수분해 단백질에 대한 기질의 일말단에는 바이오틴이 결합되어 있고 타말단에는 에너지 수용체가 결합되어, 기질 말단의 바이오틴과 상기 양자점 단층막 상에 노출된 생체분자와의 특이결합에 의해 양자점 단층막 위에 형성된 기질-에너지 수용체의 결합층;

   을 포함하는 것을 특징으로 하는 양자점 기반의 바이오칩.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 자기조립 단층막의 말단기는 알데하이드(aldehyde), 에폭시(epoxy), NHS(N-hydroxyl succinimide) 및 바이오틴(biotin)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 작용기인 것을 특징으로 하는 양자점 기반의 바이오칩.
3. 제 1 항에 있어서,

   상기 생체분자는 스트렙트아비딘(streptavidin), 아비딘 (avidin), 뉴트라비딘(neutravidin) 및 캡트아비딘 (captavidin)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 생체분자인 것을 특징으로 하는 양자점 기반의 바이오칩.
4. 제 1 항에 있어서,

   상기 양자점은 최대 발광 파장 영역이 525nm~800nm인 것을 특징으로 하는 양자점 기반의 바이오칩.
5. 제 1 항에 있어서,

   상기 양자점의 단층막에서 양자점 간의 빈 공간이 에틸렌글리콜아민, 에틸렌글리콜티올, NHS(N-hydroxysuccinimide)-에틸렌글리콜, 말레이미드-에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 아민, 폴리에틸렌글리콜 티올, (NHS)-폴리에틸렌글리콜, 말레이미드-폴리에틸렌글리콜, 카르보하이드레이트 단위체 결합에 기초한 폴리머 및 단백질 disulfide isomerase, bovine serum albumin으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 화합물에 의해 충진된 것을 특징으로 하는 양자점 기반의 바이오칩.
6. 제 1 항에 있어서,

   상기 에너지 수용체는 금속나노입자, 형광물질(fluorescent dye) 또는 형광 억제자(fluorescent quencher)인 것을 특징으로 하는 양자점 기반의 바이오칩.
7. 제 6 항에 있어서,

   상기 금속나노입자는 1~100nm 크기의 금나노입자, 은나노입자 또는 백금나노입자인 것을 특징으로 하는 양자점 기반의 바이오칩.
8. 제 1항에 있어서,

   상기 기질은 펩타이드, DNA, RNA, PNA, 앱타머(aptamer), 당류 및 지질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 기질인 것을 특징으로 하는 양자점 기반의 바이오칩.
9. 제 8 항에 있어서,

   에너지 수용체가 금속 나노입자인 경우에는 기질의 길이가 1~15nm이고,

   에너지 수용체가 형광물질인 경우에는 기질의 길이가 1~5nm인 것을 특징으로 하는 양자점 기반의 바이오칩.
10. 제 1 항에 있어서,

    상기 양자점 단층막은 서로 다른 최대발광파장을 갖는 2~5종의 양자점의 혼합물로 이루어져 있고,

    상기 기질-에너지 수용체 결합층은 상기 양자점 단층막을 이루는 각종의 양자점과 각각 특이적으로 결합된 기질-에너지 수용체의 혼합물로 이루어 진 것을 특징으로 하는 양자점 기반의 바이오칩.
11. (A) 제 1 항에 의한 양자점 기반의 바이오칩과 활성을 측정하고자 하는 가수분해 단백질을 반응시키는 단계;

    (B) 상기 반응이 완료된 양자점 기반의 바이오칩을 세척한 후 양자점의 발광을 측정하는 단계; 및

    (C) 가수분해 단백질과 반응하지 않은 양자점 기반의 바이오칩의 양자점의 발광과 상기 (B)단계에서 측정된 양자점의 발광의 변화를 비교하여 단백질의 기질에 대한 가수분해 활성을 확인하는 단계;

    를 포함하는 것을 특징으로 하는 기질에 대한 가수분해 단백질의 활성 측정 방법.
12. 제 11 항에 있어서,

    상기 양자점 기반의 바이오칩에서 양자점과 에너지 수용체의 농도비는 1:1~1:100(mol/mol)인 것을 특징으로 하는 기질에 대한 가수분해 단백질의 활성 측정 방법.
13. 제 11 항에 있어서,

    상기 가수분해 단백질은 프로테아제(protease), 펩티다이제(peptidase), 뉴클레오시다아제(Nucleosidase), 디옥시뉴클레아제(DNase), 포스파타아제(phosphatase), 글루코시다아제(glucosidase), 갈락토시다아제 (galactosidase), 리파아제(lipase) 및 에스테라아제(esterase)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 가수분해 단백질인 것을 특징으로 하는 기질에 대한 가수분해 단백질의 활성 측정 방법.
14. (A) 제 1 항에 의한 양자점 기반의 바이오칩과 가수분해 단백질을 반응시키는 단계;

    (B) 상기 반응이 완료된 양자점 기반의 바이오칩을 세척한 후 양자점의 발광 을 측정하는 단계; 및

    (C) 상기 (B)단계에서 측정된 양자점의 발광 정도를 가수분해 단백질 농도에 따른 표준곡선과 비교하여 단백질의 농도를 정량하는 단계;

    를 포함하는 것을 특징으로 하는 기질에 대한 가수분해 단백질의 농도 정량 방법.
15. (A) 제 10 항에 의한 양자점 기반의 바이오칩과 활성을 측정하고자 하는 가수분해 단백질의 혼합물을 반응시키는 단계;

    (B) 상기 반응이 완료된 양자점 기반의 바이오칩을 세척한 후 각 양자점의 발광을 각각 측정하는 단계; 및

    (C) 가수분해 단백질과 반응하지 않은 양자점 기반의 바이오칩의 각 양자점의 발광과 상기 (B)단계에서 측정된 각 양자점의 발광의 변화를 측정하여 단백질의 각 기질에 대한 가수분해 활성을 확인하는 단계;

    를 포함하는 것을 특징으로 하는 기질에 대한 가수분해 단백질의 활성 측정 방법.
16. (A) 제 1 항 또는 제 10 항에 의한 양자점 기반의 바이오칩과 가수분해 단백질을 반응시키는 단계;

    (B) 제 1 항 또는 제 10 항에 의한 양자점 기반의 바이오칩과 가수분해 단백질 및 가수분해 저해제의 혼합액을 반응시키는 단계;

    (C) 상기 반응이 완료된 (A)와 (B)의 양자점 기반의 바이오칩을 각각 세척한 후 양자점의 발광을 측정하는 단계; 및

    (D) (C) 단계에서 측정한 (A)와 (B) 칩의 양자점의 발광의 변화를 측정하여 저해제의 가수분해 단백질에 대한 저해능을 확인하는 단계;

    를 포함하는 것을 특징으로 하는 가수분해 단백질에 대한 저해제의 선별 방법.

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