DE69131206T2 - Lumineszierende lanthanidenchelate - Google Patents
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Description
- Die Erfindung bezieht sich auf neue lumineszierende Lanthanidenchelate, die drei ungesättigte heterocyclische Ringe, welche miteinander kovalent gekuppelt sind, und zusätzlich zwei chelatisierende Reste enthalten. Diese Struktur mit drei heterocyclischen Ringen wird aus einer oder zwei 2,6-Pyridylengruppen und fünfgliedrigen ungesättigten heterocyclischen Ringen gebildet.
- Die neuen Chelate unserer Erfindung werden auf den Gebieten angewandt, die für Lanthanidenchelate klassisch sind und im Stand der Technik bekannt sind. Darüber hinaus sind diese Verbindungen als Sonden in der zeitaufgelösten Fluoreszenzmikroskopie, der Cytometrie, den Mehrfachmarkierungstechniken und in Prozeßsteuerungen in der Industrie wertvoll.
- In Immunoassays und DNA-Hybridisierungsassays ist die zeitaufgelöste Lumineszenzspektroskopie unter Einsatz von Lanthanidenchelaten gut bekannt (z. B. I. A. Hemmilä, "Applications of Fluorescence in Immunoassays" in J. D. Winefordner und I. M. Kolthoff (Herausgeber), Chemical Analysis, Band 117, John Wiley & Sons, Inc., USA, 1991, und die dortigen Zitate). Stabile lumineszierende Lanthanidenchelate finden auch andere Anwendungen, z. B. in der Fluoreszenzmikroskopie und der Cytometrie. Wegen ihrer paramagnetischen Eigenschaften sind diese Lanthanidenchelate als empfindliche Sonden für die Bilderzeugung bei der magnetischen Resonanz (MRI) nützlich. Die radioaktiven Isotopen der Metalle, wie des Indiums, und stabile chelatisierende Liganden an den Makromolekülen bieten die Möglichkeit, die Liganden dieser Erfindung bei der Behandlung von Krankheiten, wie Krebs, einzusetzen.
- Lumineszierende Lanthanidenchelate wurden früher vorgeschlagen [Makropolycyclen: FR-A-2 570 703 (1986) und EP-B- 321 353 (1988); Phenole: US-A-4 670 572 (1987); Cumarine: US- A-4 801 722 (1989) und US-A-4 794 191 (1988); Polypyridine: US-A-4 873 169 (1989), US-A-4 859 777 (1989), WO 90/08263 und WO 90/00550; Arylpyridine: US-A-4 761 481 (1988) und WO 89/04826; Ethinylpyridine: US-A-4 920 195 (1990); Phenanthroline: US-A-4 772 563 (1988); Salicylate: M. P. Bailey, B. F. Rocks und C. Riley, Analyst, Band 109 (1984), Seite 1449].
- Stabile lumineszierende Lanthanidenchelate, deren energieabsorbierende Gruppe entweder eine 2,6-Pyridylengruppe und zwei fünfgliedrige ungesättigte heterocyclische Ringe enthält oder zwei 2,6-Pyridylengruppen und einen fünfgliedrigen ungesättigten heterocyclischen Ring aufweist, die miteinander über eine kovalente Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen gekuppelt sind, sind nicht bekannt. Es wurden einige Grundstrukturen synthetisiert, die drei miteinander kovalent gekuppelte heterocyclische Ringe (einschließlich eines oder zweier Pyridinringe) aufweisen (siehe z. B. V. Nair und K. H. Kim, J. Heterocyclic Chem., Band 13 (1976), Seite 873; S. Kubota und H. Ohtsuka, Tokushima Daigaku Yakugaku Kenkyu Nempo, Band 9 (1963), Seite 15, C. A.8 : 2449a; J. F. Geldhard und F. Lions, J. Org. Chem., Band 30 (1965), Seite 318; R. Menasse, G. Klein und H. Erlenmeyer, Helv. Chim. Acta, Band 38 (1955), Seite 1289; H. A. Goodwin, Aust. J. Chem., Band 17 (1964), Seite 1366; R. J. Clark und J. Walker, J. Chem. Soc. C, Band 6 (1966), Seite 1354; S. Gronowitz und D. Peters, Heterocycles, Band 30 (1) (1990), Seite 645, und A. T. Parker, P. Singh und V. Vignevich, Aust. J. Chem., Band 44 (1991), Seite 1041). Diese Verbindungen sind als solche für einen Einsatz mit Lanthanidenionen in wäßriger Lösung nicht stabil genug. Es wurde ein Lanthanidenchelat synthetisiert, das eine 2,6-Pyridylengruppe und zwei 1,3-Pyrazolylengruppen mit einer kovalenten Bindung zwischen dem Kohlenstoff- und dem Stickstoffatom enthält (M. Alanso, J. de Mendoza, M. Remuinan, H. Roman und J. C. Rodriguez-Ubis, 2nd Conference on Methods and Applications of Fluorescence Spectroscopy, Graz, Österreich, 14.-17.10.1991, P 1/25). Die Lumineszenzeigenschaften dieses Chelats wurde nicht veröffentlicht. Das Chelat weist keine Gruppe zum Kuppeln mit biologisch aktivem Material auf und kann als solches nicht für die im Rahmen der Erfindung genannten Anwendungen eingesetzt werden.
- Die Verbindungen dieser Erfindung sind Lanthanidenchelate, die drei miteinander kovalent gekuppelte heterocyclische Ringe aufweisen (entweder eine 2,6-Pyridylengruppe und zwei fünfgliedrige ungesättigte heterocyclische Ringe oder zwei 2,6-Pyridylenringe und einen fünfgliedrigen ungesättigten heterocyclischen Ring) sowie zwei chelatisierende Gruppen, die derart angeordnet sind, daß sie zusammen das gleiche Lanthanidenion chelatisieren, und zwar sogar in wäßrigen Lösungen. Gegebenenfalls enthalten diese Lanthanidenchelate auch eine reaktionsfähige Gruppe zum Kuppeln mit biologisch aktiven Molekülen.
- Die Verbindungen der Erfindung sind Lanthanidenchelate, die aus einem Lanthanidenion und einem Chelator mit der gemeinsamen Struktur, die in der Formel I gezeigt wird, bestehen: Formel I
- Die Säure, normale Salze und Esterformen der Formel I sind gleichfalls neu und wichtig.
- In der Formel I bedeuten das Symbol - eine kovalente Bindung zwischen zwei Kohlenstoffatomen und das Symbol - eine kovalente Bindung.
- E bedeutet Methylen (CH&sub2;) oder Carbonyl (C=O).
- Einer oder zwei Reste [A&sub1;], [B] und [A&sub2;] in einer Struktur [A&sub1;]~[B]~[A&sub2;] bedeuten einen bivalenten fünfgliedrigen ungesättigten heterocyclischen Ring. Jeder der übrigen Reste [A&sub1;], [B] und [A&sub2;] ist eine 2,6-Pyridylengruppe. Vorzugsweise sind [A&sub1;] und [A&sub2;] oder [B] 2,6-Pyridylengruppen. Die Heteroatome in fünfgliedrigen ungesättigen heterocyclischen Ringen sind aus der Gruppe Stickstoff, Schwefel und Sauerstoff ausgewählt. Ein Heteroatom in jedem Ring ist mit dem gleichen Lanthanidenion koordinert, so daß zwei fünfgliedrige Ringe gebildet werden, in denen ein Glied das Lanthanidenion ist und zwei Glieder koordinierende Heteroatome verschiedener Ringe [A&sub1;], [B] und [A&sub2;] sind. Beispiele für bevorzugte fünfgliedrige ungesättigte heterocyclischen bivalente Gruppen sind beispielsweise:
- 2,5-furylen
- 2,4-thiazolylen
- 2,5-thiazolylen
- 2-thiazolin-2,4-ylen
- 3-thiazolin-2,4-ylen
- 2,4-oxazolylen
- 2-oxazolin-2,4-ylen
- 3-oxazolin-2,4-ylen
- 2,4-imidazolylen
- 2-imidazolin-2,4-ylen
- 3-imidazolin-2,4-ylen
- 1,2,4-triazpl-3,5-ylen
- 1,3,4-oxadiazol-2,5-ylen
- 1,2,4-oxadiazol-3,5-ylen
- 1,3-pyrazolylen
- und
- 2,5-pyrrolylen
- [0012] In den 2,6-Pyridylenen und in den fünfgliedrigen ungesättigten heterocyclischen bivalenten Ringen kann ein Wasserstoff durch den geeigneten Rest G&sub1;, G&sub2; und G&sub3; ersetzt sein.
- [0013] Die Substituenten G&sub1;, G&sub2; und G&sub3; können aus der Gruppe der Reste Hydroxy, Nitro, Amino oder niederalkylsubstituiertes Amino, niederarylsubstituiertes Amino oder niederacylsubstituiertes Amino, Alkyl, Aryl, Alkylaryl, Arylalkyl, Arylethinyl, wie Phenylethinyl, Alkoxy oder Aryloxy mit der Maßgabe, daß die Alkylreste 1-12 Kohlenstoffatome enthalten und die Arylreste aus den Gruppen Phenyl, Naphthyl und Pyridyl ausgewählt sind. G&sub1;, G&sub2; und G&sub3; können auch jeweils eine Gruppe sein, die einen Arylrest (ausgewählt aus Phenyl, Naphthyl und Pyridyl) und Alkylenteile mit 1-8 Kohlenstoffatomen sowie zusätzlich 0-4 andere Atome, wie. Sauerstoff, Schwefel, Stickstoff oder Phosphor, enthalten. Jede der oben erwähnten Gruppen enthält gegebenenfalls Amino-, Aminooxy-, Carboxyl-, Hydroxy-, Aldehyd-, oder Mercaptoreste oder eine daraus hergestellte aktivierte Form, z. B. eine Isothiocyanato-, Isocyanato-, Diazonium-, Bromacetamido-, Iodacetamidogruppe, reaktive Ester (wie N-Hydroxysuccinimid- 4-Nitrophenyl- und 2,4-Dinitrophenylester), die Pyridyl-2- dithio-, 4-Chlor-6-ethoxytriazon-2-ylamino- oder 4,6- Dichlortriazon-2-ylaminogruppe. Andere Beispiele für geeignete Reste, die beim Markieren von Verbindungen eingesetzt werden können, die eine biologische Affinität aufweisen, sind beispielsweise in R. F. Steiner und I. Weinryb (Herausgeber), "Excited States of Proteins und Nucleic Acids", Basingstibe Corp., London, 1971, angegeben. Einer oder zwei der Substituenten G&sub1;, G&sub2; und G&sub3; können auch an eine Verbindung gebunden sein, die eine biospezifische Affinität aufweist. Solche Moleküle sind beispielsweise Proteine (wie Enzyme), Antikörper, Antigene (Haptene), Oligo- und Polynucleotide, Lektine, Rezeptoren, Kohlenhydratstrukturen (wie Dextrane), Protein A, IgG, Arzneistoffe usw. Diese Art von biologisch aktiven Verbindungen wird oft als Targetsubstanzen (Targetmoleküle) bezeichnet. Die Bindung erfolgt in einer solchen Weise, daß diese Moleküle ihre biospezifische Affinität noch behalten.
- [0014] Ch&sub1; und Ch&sub2; stellen identische oder verschiedene chelatisierende Reste dar, die möglicherweise miteinander verbunden sind. Jeder dieser chelatisierenden Reste enthält mindestens zwei Heteroatome, die mit dem Lanthanidenion koordiniert und aus der Gruppe Sauerstoff und Stickstoff ausgewählt sind. Mindestens eines dieser koordinierenden Heteroatome in jedem der Reste Ch&sub1; und Ch&sub2; bildet zusammen mit dem Lanthanidenion und einem koordinierenden Heteroatom einen der Reste [A&sub1;], [B] und [A&sub2;] einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring. Der Abstand zwischen jedem Paar aus Heteroatomen, die sich an der Chelatisierung beteiligen und den gleichen fünf- oder sechsgliedrigen Ring bilden, beträgt jeweils zwei oder drei Atome.
- [0015] Beispiele für wirksame chelatisierende Heteroatome sind Aminostickstoffe (primäre, sekundäre und tertiäre Amine) und negativ geladenene Sauerstoffe (Carboxylatanionen, Enolatanionen, Phosphate und Phosphonate). In den meisten Fällen enthält die Brücke zwischen den chelatisierenden Heteroatomen ein, zwei oder drei gesättigte Kohlenstoffatome. Unter den besonders wichtigen Ch&sub1;- und Ch&sub2;-Strukturen sind N,N- Bis(carboxymethyl)amino [-N(CH&sub2;COO&supmin;)&sub2;], N,N-Bis(carboxyethyl) amino [-N(CH&sub2;CH&sub2;COO&supmin;)&sub2;], analoge Phosphate [z. B. -N(CH&sub2;- O-PO&sub3;²&supmin;)&sub2;] und Phosphonate (z. B. -N (CH&sub2;-PO&sub3;²&supmin;)&sub2;] und 2,6- Dicarboxypiperidin-1-yl. Alternativ können Ch&sub1; und Ch&sub2; eine oder zwei Brücken bilden, welche die zwei äußeren heterocyclischen Ringe ([A&sub1;] und [A&sub2;]) kovalent verbinden, wobei sich eine macrocyclische chelatisierende Verbindung ergibt. Die Brücke/Brücken besteht/bestehen aus gesättigten Kohlenstoff-, Sauerstoff- oder Stickstoffatomen. Die Stickstoffe und die Sauerstoffe sind aus sekundären oder tertiären Aminostick stoffen und Ethersauerstoffen ausgewählt. Vorzugsweise bildet eine solche Brücke zusammen mit dem System E-[A&sub1;]-[B]-[A&sub2;]-E eine carboxymethylierte Azakrone (die Brücke ist z. B. -NCH&sub2;COO&supmin;)- CH&sub2;CH&sub2;N(CR&sub2;COO&supmin;)- oder -N(CR&sub2;COO&supmin;)-], ein Kryptat [die Brücke ist z. B. -N(CH&sub2;CH&sub2;-O-CH&sub2;CH&sub2;-O-CH&sub2;CH&sub2;)&sub2;N-] oder ein Kronenether (die Brücke ist z. B. -O-CH&sub2;CH&sub2;-O-CH&sub2;CH&sub2;-O- oder -O-CH&sub2;CH&sub2;-O-).
- [0016] Bei einigen Verbindungen der Erfindung können die chelatisierenden Heteroatome (Stickstoff und Sauerstoff) als die entsprechenden protonierten Formen vorliegen und im Fall des Sauerstoffs auch als Esterformen, z. B. als C&sub1;&submin;&sub6;-Niederalkylbenzyl- oder t-Butylester.
- [0017] Vom Standpunkt der Spektrofluorometrie sind die interessierenden Chelatformen solche Moleküle, in denen Ch&sub1; und Ch&sub2; zusammen mit der Struktur E-[A&sub1;]-[B]-[A&sub2;]-E mit dem Lanthanidenion, vorzugsweise mit Eu³&spplus;, Tb³&spplus;, Dy³&spplus; oder Sm³&spplus;, ein Chelat bilden. Diese Liganden können auch zur Chelatbildung mit Metallionen, wie Ru²&spplus;, Os²&spplus;, Ir³&spplus; und Rh³&spplus;, geeignet sein. Als Verbindungen, die starke Chelate bilden, sind sie potentielle Chelatoren auch für radioaktive Isotope verschiedener Metalle, die auf Gebieten angewandt werden sollen, die für Radiotracer klassisch sind.
- [0018] Die neuen Chelate unserer Erfindung finden auf Gebieten Anwendung, die für Lanthanidenchelate klassisch sind. Darüber hinaus sind diese Verbindungen als Sonden in der zeitaufgelösten Fluoreszenzmikroskopie, der Cytometrie, dem Nucleinsäuresequenzing, dem Nucleinsäure- und Protein-Fingerprint, den Prüfungen homogener Hybridisierung zum Nucleinsäurenachweis, in homogenen fluorometrischen Immunoassays, in Mehrfachmarkierungstechniken und in Prozeßsteuerungen in der Industrie wertvoll.
- [0019] Im Gegensatz zu den vielen früher erwähnten Patenten kann die volle Koordinationszahl 9 mit den neuen Lanthaniden chelaten dieser Erfindung leicht erreicht werden. Dies schließt ein, daß mit dem Lanthanidenion keine Wassermoleküle koordiniert sind. Somit ist der Abschreckungseffekt des Wassers minimiert und die Abklingzeit der Lumineszenz liegt im Maximum. Deshalb kann die langlebige und sehr intensive Lumineszenz der Lanthanidenchelate, nachdem der kurlebige Hintergrund abgeklungen ist, wirksam bestimmt werden. Beispielsweise sind bei mikroskopischen Anwendungen und Prozeßssteuerungen in der Industrie sehr stabile (hinsichtlich der Fotostabilität sowie der thermodynamischen und kinetischen Stabilität) Chelate erforderlich. Verglichen mit den anderen bekannten Lanthanidenchelatstrukturen werden diese Stabilitätserfordernisse mit den erfindungsgemäßen Chelaten am besten erfüllt.
- [0020] Die kleinere Größe von ungesättigten fünfgliedrigen Heterocyclen, verglichen mit beispielsweise Pyridin und Phenol, macht die Liganden der vorliegenden Erfindung flexibler. Dies bedeutet, daß das Lanthanidenion und der Chelator enger zusammengedrängt sind sowie die pi-Elektronen der Reste [A&sub1;], [B] und [A&sub2;] und die freien Elektronenpaare ihrer Heteroatome besser über die Struktur [A&sub1;]~[B]~[A&sub2;] delokalisiert sind.
- [0021] Die Basizität einiger fünfgliedriger ungesättigter Heterocyclen (z. B. ist der pKa-Wert für Pyridin 5,25 und für Imidazol 6,953) macht sie zu besseren Chelatoren als Pyridin. Darüber hinaus ist bei einigen Chelaten die aromatische Struktur negativ geladen (z. B. bei Verbindungen, die den 1,2,4-Triazol-3,5-ylen-Rest enthalten). Abgesehen davon, daß dies Chelate stabilisiert, ändert es zusätzlich ihre Adsorptionseigenschaften, wodurch ein unspezifisches Binden an Säulenmaterialien und an Kunststoffe vermindert wird.
- [0022] Es ist bekannt, daß C-H-Reckungen des Liganden die Lumineszenzintensität der Lanthanidenchelate herabsetzt. Die Anzahl der C-H-Bindungen in den Chelaten der vorliegenden Erfindung wurde durch die fünfgliedrigen heterocyclischen Ringe im Vergleich zu Pyridinen und Phenolen reduziert.
- [0023] Im Vergleich zu den anderen Lanthanidenchelaten weisen diese neuen Strukturen der vorliegenden Erfindung einen größeren Extinktionskoeffizienten, längere Anregungswellenlängen und eine bessere Energieübertragung vom Liganden auf das Lanthanidenion auf, was zu Verbesserungen in der Nachweisempfindlichkeit der lumineszierenden Markierung führt.
- [0024] Die Strukturen und die im experimentellen Teil angewandten Synthesewege werden in den Reaktionsschemata 1-14 dargestellt. Die Verbindungen 42 (Schema 7), 57a und 57b (Schema 9), 68 (Schema 10) und 80 sind Beispiele von Verbindungen, die biologisch aktive Moleküle binden können. Die anderen Schemata zeigen die Synthese von potentiellen Strukturen, die mit bekannten Methoden leicht zu solchen Verbindungen modifiziert werden können. Beispielsweise können die Verbindungen 32, das entsprechende 2,6-Dicyanopyridinderivat und analoge Verbindungen mit einer längeren Kette zwischen dem Pyridin- und dem Benzolring als vielseitige Ausgangsstoffe für Chelate verwendet werden, die mit Verbindungen gekuppelt werden können, welche eine biologische Affinität aufweisen. Im Beispiel 84 wurde die Verbindung 68 zum Markieren eines Antikörpers benutzt. Im Beispiel 86 wurde ein mit Terbium(III) markierter Antikörper für ein Immunoassay mit zeitaufgelöster Fluoreszenz und die Mikroskopie eingesetzt.
- [0025] Anstelle eines unsubstituierten Iminodiessigsäureesters kann auch ein modifizierter Iminodiessigsäureester verwendet werden, wie in der WO 90/00550 angegeben ist.
- [0026] Allgemeine Methoden zum Herstellen von ungesättigten fünfgliedrigen Heterocyclen sind Stand der Technik (siehe den Abschnitt "Stand der Technik" und beispielsweise A. R. Katritzky, "Handbook of Heterocyclic Chemistry", Pergamon Press, Großbritannien, 1986).
- [0027] Die Synthese von Phosphonsäuren kann unter Einsatz von Methoden durchgeführt werden, die in der Literatur beschrieben sind, siehe z. B. E. K. Fields, J. Am. Chem. Soc., Band 74 (1952), Seite 1525; G. R. Newkome, G. E. Kiefer, N.
- [0028] Matsumura und W. E. Puckett, J. Org. Chem., Band 50 (1985), Seite 3807.
- [0029] Die neuen Chelate unserer Erfindung können in Immunoassays mit zeitaufgelöster Fluoreszenz, DNA-Hybridisierungsassays und der Mikroskopie analog den Verfahren verwendet werden, die in der Literatur beschrieben sind, vgl. z. B. I. A. Hemmilä, "Applicaitons of Fluorescence in Immunoassays" in J. D. Winefordner und I. M. Kolthoff (Herausgeber), Chemical Analysis, Band 117, John Wiley & Sons, Inc., USA, 1991, und die dortigen Verweise.
- [0030] Das Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe umfaßt drei Stufen: (a) Kontaktieren der Probe mit einem Reaktionspartner, der gegenüber dem Analyten eine biospezifische Affinität zur Bildung eines Komplexes aufweist, der diesen Analyten und jenen Reaktionspartner enthält, wobei der Zustand und die Mengen der Reaktionspartner derart ausgewählt werden, daß die Menge des gebildeten Komplexes eine Funktion der Menge des Analyten in der Probe ist; (b) quantitatives oder qualitatives Bestimmen der Menge des Komplexes, der unter Einsatz eines Reaktionspartners gebildet worden ist, welcher bezüglich des Komplexes eine biospezifische Affinität aufweist und mit einer analytisch nachweisbaren Gruppe markiert ist; und (c) Herstellen einer Beziehung zwischen der gemessenen Menge des Komplexes und der Menge des Analyten in der Probe. Der Reaktionspartner, welcher mit der analytisch nachweisbaren Gruppe markiert ist, wird durch ein Lanthanidenchelat gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt.
- Beispiel 1. Die Synthese von 2,6-Bis{5'-(N,N-bis- (methoxycarbonylmethyl)aminomethyl)-2'furyl}-4-(2",4",6"- trimethoxyphenyl)-pyridin (1)
- [0031] Ein Gemisch aus 2,6-Bis(2'-furyl)-4-(2",4",6"- trimethoxyphenyl)-pyridin (0,050 g; 0,13 mmol), Dimethyliminodiacetat (0,050 g; 0,32 mmol), 37%iges Formalin (24 ul; 0,32 mmol) und Essigsäure (1 ml) wurden fünf Stunden bei 110ºC gerührt. Nach dem Eindampfen wurde der Rückstand in Dichlormethan gelöst, mit Wasser extrahiert und über Natriumsulfat getrocknet. Das Produkt wurde durch Flash- Chromatographie (Siliciumdioxid, Chloroform) gereinigt. Die Ausbeute betrug 11 mg (12%).
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 3,60 (8 H, s); 3,67 (12 H, s); 3,74 (6 H, s); 3,88 (3 H, s); 4,03 (4 H, s); 6,24 (2 H, s); 6,39 (2 H, d; J = 3 Hz); 7,06 (2 H, d; J = 3 Hz); 7,50 (2 H, s) UV (λmax in Ethanol): 331 und 284 nm. Schema 1: Die Synthese der Verbindung 2
- Beispiel 2. Die Synthese von 2,6-Bis{5'-[N,N-bis- (carboxymethyl)aminomethyl]-2'furyl}-4-(2",4",6"-trimethoxyphenyl)-pyridin (2)
- [0032] Ein Gemisch aus der Verbindung 1 (11 mg, 15 umol) und 0,5 m Kaliumhydroxid in Ethanol (1 ml) wurde zwei Stunden gerührt. Die Lösung wurde mit 1 m Salzsäure neutralisiert und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Wasser (0,5 ml) gelöst.
- UV (λmax in Wasser als freier Ligand): 331 und 283 nm UV (λmax in Wasser als Europiumchelat): 338, 300 und 290 nm.
- [0033] L-Cystein (0,66 g; 5,4 mmol) wurde in Wasser (5 ml) gelöst, und die Lösung wurde mit Natriumbicarbonat neutralisiert. Zu der Lösung des L-Cysteins wurde ein Gemisch aus 2,6-Dicyanopyridin (0,24 g; 1,9 mmol) in Ethanol (5 ml) gegeben. Nach dem Verdampfen des Methanols wurde das kristallisierte Produkt filtriert und mit Aceton gewaschen. Die Ausbeute betrug 0,35 g (55%).
- ¹H NMR (60 MHz, D&sub2;O): 3,23-3,85 (4 H, m); 5,20 (2 H, t; J = 9 Hz); 8,05-8,35 (3 H, m).
- UV (λmax in Wasser als freier Ligand): 288 nm
- UV (λmax in Wasser als Europium(III) -chelat): 295 und 240 nm. Beispiel 4. Die Synthese von 2,6-Bis{4'-[N,N-bis(t- butoxycarbonylmethyl)aminocarbonyl]-2'-thiazolyl}pyridin (4) Schema 2: Die Synthese der Verbindung 5
- [0034] Ein Gemisch aus der Verbindung 3 (0,35 g; 1,0 mmol) und Thionylchlorid (5 ml) wurde eine Stunde unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Eindampfen zur Trockene wurde der Rückstand in trockenem Pyridin (6 ml) gelöst und mit Di-t- butyliminodiacetat (0,65 g; 2,6 mmol) versetzt. Die Lösung wurde zwei Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die Lösung wurde eingedampft, in Chloroform gelöst und filtriert. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid, Chloroform) gereinigt.
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 1,45 (18 H, s); 1,51 (18 H, s); 4,26 (4 H, s); 7,86-8,27 (3 H, m); 8,33 (2 H, s);
- UV (λmax in Ethanol): 326 und 289 nm; Molekulargewicht (MS): 787 (M&spplus;).
- [0035] Eine Lösung der Verbindung 4 in Trifluoressigsäure wurde über Nacht bei Raumtemperatur gehalten. Nach dem Eindampfen wurde der Rückstand mit Diethylether trituriert und filtriert.
- ¹H NMR (60 MHz, DMSO-d&sub6;): 4,21 (4 H, s); 4,57 (4 H, s); 8,10- 8,30 (3 H, m); 8,50 (2 H, s).
- UV (λmax in Wasser als freier Ligand): 325 und 278 nm;
- UV (λmax in Wasser als Europium(III)-chelat): 325 und 278 nm;
- [0036] Ein Gemisch aus 2,6-Pyridindithiodicarboxamid (0,76 g; 3,9 mmol), 2 Brom-1-phenyl-1-propanon (1,8 g; 8,4 mmol), Ethanol (14 ml) und N,N-Dimethylformamid (5 ml) wurde während 8,5 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die festen Stoffe wurden abfiltriert und mit Ethanol gewaschen. Die Suspension des Bromwasserstoffsalzes des Produkts in heißem Wasser (40 ml) wurde mit 20%iger Natriumbicarbonatlösung alkalisch eingestellt. Das Produkt wurde filtriert und mit Wasser gewaschen. Die Ausbeute betrug 1,35 g (81%). F. 273ºC.
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 2,67 (6H, s); 7,36-7,40 (2H, m); 7,47-7,50 (4H, m); 7,47-7,76 (4H, m); 7,86 (1H t; J = 7,7 Hz); 8,21 (2H, d; J = 7,7Hz).
- UV (λmax in Acetonitril) 342 und 238 nm Schema 3: Die Synthese der Verbindung 9
- [0037] Ein Gemisch aus der Verbindung 6 (0,50 g; 1,2 mmol), N- Bromsuccinimid (0,42 g; 2,4 mmol), α,α'-Azoisobutyronitril (21 mg; 0,13 mmol) und Benzol (140 ml) wurde sechs Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde eingedampft, und das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid, Dichlormethan) gereinigt. Die Ausbeute betrug 0,10 g (15%). F. 223ºC.
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 4,88 (4H, s): 7,47-7,48 (2H, m); 7,52-7,56 (4H, m); 7,82-7,85 (4H, m); 7,91 (1H, t; J = 7,8 Hz); 8,29 (2H, d; J = 7,8 Hz)
- UV (λmax in Ethanol): 340, 316 und 243 nm.
- [0038] Ein Gemisch aus Verbindung 7 (90 mg; 0,15 mmol), Di-t- butyliminodiacetat (76 mg; 0,31 mmol), trockenes Kaliumcarbonat (0,21 g; 1,5 mmol) und trockenes Acetonitril (30 ml) wurde sechs Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, und das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Chlorofom (5 ml) gelöst, mit Wasser (2 · 2 ml) gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Beim Eindampfen hinterblieb ein reines Produkt. Die Ausbeute betrug 0,14 g (100%). F. 121-123ºC.
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 1,43 (36H, s); 3,54 (8H, s); 4,30 (4H, s); 7,35-7,39 (2H, m); 7,44-7,47 (4H, m): 7,72-7,74 (4H, m); 7,86 (1H., t; J = 7,8 Hz); 8,26 (2H, d; J = 7,8 Hz).
- UV (λmax in Ethanol): 340, 312 und 239 nm.
- [0039] Eine Lösung der Verbindung 8 (100 mg; 0,11 mmol) in Trifluoressigsäure (2 ml) wurde 1,5 Stunden auf Raumtemperatur gehalten. Nach dem Eindampfen wurde der Rückstand mit Diethylether trituriert und filtriert. Die Ausbeute betrug 30 mg (40%). F. 185ºC (Zers.).
- ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d&sub6;): 3,56 (8H, s); 4,29 (4H, s); 7,42- 7,45 (2H, m); 7,49-7,53 (4H, m); 7,72-7,74 (4H, m); 8,13 (1H, t; J = 7,9 Hz); 8,26 (2H, d; J = 7,9 Hz).
- UV (λmax in Wasser als freier Ligand): 340, 305 und 237 nm.
- UV (λmax in Wasser als Europium(III)-chelat): 350, 310 und 240 nm. Schema 4: Die Synthese der Verbindungen 14 und 16
- [0040] Zwei Amino-1-phenyl-1-propanonhydrochlorid (1,93 g; 10,3 mmol) wurde in kleinen Portionen zu einem Gemisch aus 2,6-Pyridindicarbonyldichlorid (1,05 g; 5,20 mmol) und Pyridin 25 ml) gegeben. Nach 15-minütigem Erhitzen unter Rückfluß wurde das Reaktionsgemisch zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Chloroform (50 ml) gelöst, mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung (20 ml) gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Das Produkt wurde durch Flash- Chromatographie (Siliciumdioxid, Petrolether/Ethylacetat 1/1) gereinigt. Die Ausbeute betrug 1,60 g (72%). F. 71ºC.
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 1,65 (3H, d; J = 7,3 Hz); 1,66 (3H, d; J = 7,3 Hz); 5,79 (1H, Quintett; J = 7,3 Hz); 5,80 (1H, Quintett; J = 7,3 Hz); 7,55 (4H, t; J = 7,4 Hz); 7,65 (2H, t; J = 7,4 Hz); 8,06 (1H, t; J = 7,8 Hz); 8,11-8,14 (4H, m); 8,39 (1H, d; J = 7,8 Hz); 8,39 (1H, d; J = 7,8 Hz); 8,94 (1H, d; J = 7,3 Hz); 9,02 (1H, d; J = 7,3 Hz).
- UV (λmax in Ethanol): 244 nm.
- [0041] Ein Gemisch aus der Verbindung 10 (1,56 g; 3,65 mmol) und Phosphoroxychlorid (55 ml) wurde 23 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Eindampfen zur Trockene wurde der Rückstand mit Wasser behandelt, und das Gemisch wurde mit 1 m Natriumhydroxid neutralisiert. Das Rohprodukt wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und schließlich durch Flash- Chromatographie (Siliciumdioxid, 5% Methanol in Chloroform) gereinigt. Die Ausbeute betrug 1,26 g (88%). F. 161-163ºC.
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 2,56 (6H, s); 7,37 (2H, t; J = 7,6 Hz); 7,49 (4H, t; J = 7,6 Hz); 7,80 (4H, d; J = 7,6 Hz); 7,95 (1H, t; J = 8,0 Hz); 8,20 (2H, d; J = 8,0 Hz).
- UV (λmax in Ethanol): 350, 295, 260 und 220 (Sch) nm.
- [0042] Ein Gemisch aus der Verbindung 11 (0,63 g; 1,6 mmol), N-Bromsuccinimid (0,57 g; 3,2 mmol), α,α'-Azoisobutyronitril (29 mg; 0,18 mmol) und Tetrachlorkohlenstoff (10 ml) wurde drei Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Eindampfen wurden die Feststoffe mehrmals mit einem Gemisch aus Petrolether und Ethylacetat (5/3) gewaschen. Die Ausbeute betrug 0,44 g (50%). F. 234-237ºC.
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 4,71 (4H, s); 7,46 (2H, t; J = 7,3 Hz); 7,55 (4H, t; J 7,3 Hz); 7,88 (4H, d; J = 7,3 Hz); 8,00 (1H, t; J = 7,9 Hz); 8,28 (2H, d; J = 7,9 Hz).
- UV (λmax in Ethanol): 353, 293 und 262 nm.
- [0043] Ein Gemisch aus der Verbindung 12 (0,28 g; 0, 50 mmol), Di-t-butyliminoacetat (0,25 g; 1,0 mmol), trockenem Kaliumcarbonat (0,69 g; 5,0 mmol) und trockenem Acetonitril (50 ml) wurde über Nacht unter Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Chloroform (15 ml) gelöst, mit Wasser (2 · 5 ml) gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid; Petrolether/Ethylacetat, zuerst 5/1, dann 5/2) gereinigt. Die Ausbeute eines öligen Produkts betrug 0,21 g (61%).
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 1,43 (36H, s); 3,58 (8H, s); 4,21 (4H, s); 7,38 (2H, t; J = 7,6 Hz); 7,49 (4H, t; J = 7,6 Hz); 7,94 (1H, t; J = 7,8 Hz); 8,01 (4H, d; J = 7,6 Hz); 8,28 (2H, d; J = 7,8 Hz).
- UV (λmax in Ethanol): 335 (Sch), 301 und 262 nm.
- [0044] eine Lösung der Verbindung 13 (0,21 g; 0,24 mmol) in Trifluoressigsäure (6,5 ml) wurde 1,5 Stunden auf Raumtemperatur gehalten. Nach dem Eindampfen wurde der Rückstand mit Diethylether trituriert und filtriert. Die Ausbeute betrug 0,13 g (81%). F. 173ºC (Zers.).
- ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d&sub6;): 3,65 (8H, s); 4,18 (4H, s); 7,47 (2H, t; J = 7,8 Hz); 7,56 (4H, t; J = 7,8 Hz); 8,01 (4H, d; J = 7,8 Hz), 8,19-8,23 (1H, m); 8,28-8,30 (2H, m)
- UV (λmax in Wasser als freier Ligand): 332, 310 und 259 nm
- UV (λmax in Wasser als Europium(III)-chelat): 350 und 243 nm.
- [0045] ein Gemisch aus 2,6-Dicyanopyridin (7,0 g; 54 mmol), Natriummethoxid (0,59 g; 11 mmol) und Methanol (50 ml) wurde 2,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es wurde Ammoniumchlorid (5,9 g; 110 mmol) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 3 Tage gerührt. Das Produkt wurde filtriert und mit Diethylether gewaschen. Die Ausbeute betrug 12,0 g (94%). F. > 310ºC (Zers.).
- ¹H NMR (400 MHz, D&sub2;O): 8,32-8,49 (3H, m)
- UV (λmax in Wasser): 273 und 224 nm.
- [0046] 0,5 m Kaliumhydroxid (17 ml) wurde zu einem Gemisch aus der Verbindung 15 (0,50 g; 2,1 mmol), 2-Brom-1-phenyl-1- propanon (0,89 g; 4,2 mmol), N,N-Diisopropylethylamin (1,1 g; 8,4 mmol) und Chloroform (10 ml) gegeben. Nach eintägigem Erhitzen unter Rückfluß wurden die Feststoffe abfiltriert und mit Chloroform gewaschen. Das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid; zuerst Chloroform, dann 5% Methanol in Chloroform) gereinigt. Die Ausbeute eines öligen Produkts betrug 0,17 g (21%).
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 2,28 (6H, s); 7,21 (2H, t; J = 7,3 Hz); 7,30 (4H, t; J = 7,3 Hz); 7,49-7,52 (4H, m); 7,67 (1 H, t; J = 7,8 Hz); 8,05 (2H, d; J = 7,8 Hz)
- UV (λmax in Ethanol): 353, 306 und 266 nm; Molekulargewicht (MS): 391 (M&spplus;). Schema 5: Die Synthese der Verbindung 18
- [0047] Ein Gemisch aus 37%igem Formalin (0,81 g; 10 mmol), Methanol (40 ml) und Dimethyliminodiacetat (1,6 g; 10 mmol) wurde zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Methanol (40 ml) gelöst und wieder eingedampft. Es wurde 2,6- Bis(3'-pyrazolyl)pyridin (1,1 g; 5,0 mmol) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden bei 110ºC gerührt. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid; Triethylamin/Petrolether/Ethylacetat 1/5/3) gereinigt. Die Ausbeute betrug 1,54 g (55%).
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 3,67 (12H, s); 3,67 (8H, s); 5,20 (4 H, s); 7,06 (2H, d; J = 2 Hz); 7,61 (2H, d; J = 2 Hz); 7,74-8,02 (3H, m)
- Molekulargewicht (MS): 557 (M&spplus;)
- UV (λmax in Ethanol): 301 und 251 nm.
- [0048] Ein Gemisch aus der Verbindung 17 (1,0 g; 1,8 mmol) und 0,5 m Kaliumhydroxid in Ethanol (50 ml) wurde 3 Stunden gerührt und dann mit Wasser (0,5 ml) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde eine Stunde gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wurde in Wasser (2 ml) gelöst. Die Lösung wurde mit 2 m Salzsäure angesäuert und mit Ethanol trituriert. Die Feststoffe wurden abfiltriert und mit Ethanol gewaschen. Das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid; Acetonitril/Wasser 4/1) gereinigt. Nach dem Eindampfen wurde das Produkt aus Wasser auskristallisiert. Die Ausbeute betrug 0,19 g (21%).
- ¹H NMR (60 MHz, DMSO-d&sub6;): 3,64 (8H, s); 5,46 (4H, s); 6,97- 7,05 (2H, m); 7,75-7,92 (5H, m);
- UV (λmax in Wasser als freier Ligand): 301 und 234 nm.
- UV (λmax in Wasser als Europium (III)-chelat): 313, 263, 254 und 234 nm. Schema 6: Die Synthese der Verbindungen 23, 30 und 39
- [0049] m-Chlorperbenzoesäure (50-55%; 25,9 g; etwa 75 mmol) wurde während 24 Stunden in kleinen Portionen zu einem Gemisch aus 2,4-Di-(2'-pyridyl)-thiazol (2,39 g; 10,0 mmol) und Dichlormethan (400 ml) gegeben. Nach 24-stündigem Rühren wurde das Reaktionsgemisch mit 10%igem Natriumcarbonat (3 · 150 ml) und Wasser (150 ml) gewaschen. Die vereinigten Wasserfraktionen wurden mit Chloroform (150 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Fraktionen wurden mit Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft. Die Ausbeute betrug 2,71 g (100%).
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 7,18-7,66 (4H, m); 7,87-8,04 (1H, m); 8,35-8,76 (3H, m); 9,53 (1H, s)
- Molekulargewicht (MS): 271 (M&spplus;)
- UV (λmax in Ethanol): 324 und 249 nm.
- [0050] Trimethylsilylcyanid (20 ml; 150 mmol) wurde während 5 Minuten zu einem Gemisch aus der Verbindung 19 (2,71 g; 10, 0 mmol) und Dichlormethan (110 ml) gegeben. Nach fünfminütigem Rühren wurde Benzoylchlorid (7,2 ml; 60 mmol) hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde 9 Tage gerührt. Nach dem Konzentrieren auf die Hälfte des ursprünglichen Volumens wurde eine 10%ige Kaliumcarbonatlösung (300 ml) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde eine halbe Stunde gerührt. Das Produkt wurde filtriert sowie mit Wasser und kaltem Dichlormethan gewaschen. Die Ausbeute betrug 1,84 g (64%).
- Molekulargewicht (MS): 289 (M&spplus;).
- UV (λmax in Ethanol): 301, 271 und 252 nm.
- [0051] 1 m Boran in Tetrahydrofuran (52 ml; 52 mmol) wurde während 10 Minuten zu einem Gemisch aus der Verbindung 20 (1,16 g; 4,00 mmol) und trockenem Tetrahydrofuran (50 ml) gegeben. Nach 24-stündigem Rühren wurde das überschüssige Boran durch Zugabe von Methanol zerstört. Das Gemisch wurde zur Trockene eingedampft und mit Methanol (70 ml) versetzt, das mit Chlorwasserstoff gesättigt war. Nach einstündigem Rühren wurde das Produkt filtriert und mit kaltem Methanol gewaschen. Die Ausbeute betrug 0,80 g (42%).
- ¹H NMR (60 MHz, D&sub2;O): 4,56 (2H, s); 4,57 (2H, s); 7,55-7,72 (2H, m); 8,00-8,47 (4H, m); 8,56 (1H, s)
- UV (λmax in Wasser): 320 (Sch), 292 und 244 nm.
- [0052] Ein Gemisch aus der Verbindung 21 (0,48 g; 1,0 mmol), N,N-Diisopropylethylamin (2,6 ml; 15 mmol), t-Butylbromacetat (0,78 g; 4,0 mmol) und Acetonitril (20 ml) wurde 23 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Eindampfen wurde der Rückstand in Chloroform (50 ml) gelöst, mit Wasser (3 · 20 ml) gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid; Petrolether/Ethylacetat 5/3) gereinigt. Die Ausbeute betrug 0,47 g (63%).
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 1,48 (18H, s); 1,48 (18H, s); 3,55 (8H, s); 4,11 (2H, s); 4,12 (2H, s); 7, 59 (1H, d; J = 7, 6 Hz); 7,71 (1H, d; J = 7,6 Hz); 7,79 (1H, t; J = 7,6 Hz); 7,81 (1H, t; J = 7,6 Hz); 8,13 (1H, d; J = 7,6 Hz); 8,18 (1 H d; J = 7,6 Hz); 8,20 (1H, s).
- Molekulargewicht (MS): 753 (M&spplus;).
- [0053] Diese Verbindung 23 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 9 beschriebenen Synthese analog ist. Die Ausbeute betrug 100%.
- ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d&sub6;): 3,63 (4H, s); 3,72 (4H, s); 4,12 (2H,s); 4,21 (2H, 2); 7,56 (1H, d; J = 7,6 Hz); 7,69 (1 H, d; J = 7,6 Hz); 7,99 (1H, t; J = 7,6 Hz); 8,03 (1H, t; J = 7,6 Hz); 8,14 (1H, d; J = 7,6 Hz); 8,18 (1H, d; J = 7,6 Hz); 8,39 (1H, s)
- UV (λmax in Wasser als freier Ligand): 325 (Sch), 294 und 247 nm.
- UV (λmax in Wasser als Europium(III)-chelat): 331, 295, und 243 nm.
- [0054] Absolutes Ethanol (10 ml), das mit Ammoniak gesättigt war, wurde zu einer kalten Lösung aus 2-Cyano-4-phenylpyridin (1,8 g; 10 mmol) und absolutem Ethanol (30 ml) gegeben. Das Gemisch wurde mit Schwefelwasserstoff gesättigt. Nach dem Rühren über Nacht wurde die Lösung auf 10 ml konzentriert. Das kalte Gemisch wurde filtriert und mit kaltem Ethanol gewaschen. Die Ausbeute betrug 1,69 g (79%).
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 7,69-7,94 (6H, m); 8,83 (1H, d; J = 5 Hz); 9,24 (1H, d; J = 2 Hz);
- UV (λmax in Ethanol): 322 und 241 nm.
- [0055] Ein Gemisch aus der Verbindung 24 (1,07 g; 5, 00 mmol), 2-(Bromacetyl)-pyridin (1,00 g; 5,00 mmol) und Ethanol (20 ml) wurde drei Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das kalte Gemisch wurde filtriert und mit kaltem Ethanol gewaschen. Die Suspension des Bromwasserstoffsalzes des Produkts in Wasser (40 ml) wurde mit festem Natriumcarbonat alkalisch eingestellt. Das Produkt wurde filtriert und mit kaltem Wasser gewaschen. Die Ausbeute betrug 1,25 g (79%).
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 7,25-7,29 (1H, m); 7,47-7,51 (1H, m); 7,52-7,58 (3H, m); 7,76-7,79 (2H, m); 7,80-7,85 (1H, dt; J = 2 und 8 Hz); 8,23 (1H, s); 8,30 (1H, d; J = 8 Hz); 8,57 (1H, d); 8,65-8,69 (2H, m).
- UV (λmax in Ethanol): 320, 282 (Sch) und 249 nm.
- [0056] Diese Verbindung 26 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 19 beschriebenen Synthese analog ist. Die Ausbeute betrug 93%.
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 7,23-7,27 (1H, m); 7,41-7,46 (1H, m); 7,48-7,52 (1H, m); 7,55-7,60 (3H, m); 7,74-7,77 (2H, m); 8,41 (1H, d); 8,45 (1H, d); 8,69 (1H, dd); 8,90 (1H, d); 9,58 (1H, s)
- [0057] Diese Verbindung 27 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 20 beschriebenen Synthese analog ist. Die Ausbeute betrug 65%.
- ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d&sub6;): 7,50 (1H, t; J = 8 Hz); 7,58-7,67 (2H, m); 7,95 (1H, d; J = 8 Hz); 8,04-8,08 (2H, m); 8,24 (1H, t; J = 8 Hz); 8,60 (1H, d; J = 1 Hz); 8,67 (1H, d; J = 8 Hz), 8,70 (1H, s); 8,83 (1H, d; J = 1 Hz).
- [0058] Diese Verbindung 28 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 21 beschriebenen Synthese analog ist. Die Ausbeute betrug 71%.
- UV (λmax in Ethanol): 318 und 251 nm.
- [0059] Diese Verbindung 29 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 22 beschriebenen Synthese analog ist. Die Ausbeute betrug 89%.
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 1,47 (36H, s); 3,54 (4H, s); 3,58 (4 H, s); 3,95 (2H, s); 4,18 (2H, s); 7,42-7,94 (8H, m); 8,11 (1H, d; J = 2 Hz); 8,20 (1H, s); 8,43 (1H, d; J = 2 Hz)
- [0060] Diese Verbindung 30 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 9 beschriebenen Synthese analog ist. Die Ausbeute betrug 91%.
- ¹H NMR (60 MHz, DMSO-d&sub6;): 3,67 (4H, s); 3,73 (4H, s); 4,21 (4H, s); 7,47-7,72 (4H, m); 7,77-8,25 (5H, m); 8,40-8,49 (2H, m).
- UV (λmax in Wasser als freier Ligand): 331 und 252 nm. UV (λmax in Wasser als Europium (III)-chelat): 334, 288, und 251 nm.
- [0061] m-Chlorperbenoesäure (50-55%; 74,7 g; etwa 190 mmol) wurde zu einem kalten Gemisch aus 4-(p-Nitrobenzyl)-pyridin (21,4 g; 100 mmol) und Dichlormethan (250 ml) gegeben. Nach zweistündigem Rühren wurde Wasser (200 ml) hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde mit festem Natriumcarbonat alkalisch eingestellt. Die Fraktionen wurden getrennt, und die Wasserfraktion wurde mit einem Gemisch aus Ethanol und Chloroform (4 · 150; 1/2) extrahiert. Die vereinigten organischen Fraktionen wurden mit Natriumsulfat getrocknet. Die Ausbeute betrug 19,1 g (83%).
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 4,07 (2H, s); 7,08 (2H, d; J = 7 Hz); 7,35 (2H, d; J = 9 Hz); 8,17 (2H, d; J = 7 Hz); 8,22 (2H, d; J = 9 Hz).
- UV (λmax in Ethanol): 273 nm.
- [0062] Trimethylsilylcyanid (50 ml; 400 mmol) wurde zu einem Gemisch aus der Verbindung 31 (18,2 g; 79,0 mmol) und Dichlormethan (160 ml) gegeben. Nach fünfminütigem Rühren wurde Benzoylchlorid (20 ml; 160 mmol) hinzugefügt und das Reaktionsgemisch wurde eine halbe Stunde gerührt. Es wurden Wasser (160 ml) und festes Kaliumcarbonat (50 g) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde eine halbe Stunde gerührt. Die Fraktionen wurden getrennt, und die Wasserfraktion wurde mit Dichlormethan (2 · 100 ml) extrahiert. Die organischen Fraktionen wurden mit Natriumsulfat getrocknet, und das Produkt wurde aus Toluol auskristallisiert. Die Ausbeute betrug 10,0 g (53%).
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 4,14 (2H, s); 7,32 (1H, d; J = 5 Hz); 7,33 (2H, d; J = 9 Hz); 7,48 (1H, s); 8,23 (2H, d; J = 9 Hz); 8,64 (1H, d; J = 5 Hz).
- UV (λmax in in Ethanol): 266 nm.
- [0063] Absolutes Ethanol (20 ml), das mit Ammoniak gesättigt war, wurde zu einem kalten Gemisch aus der Verbindung 32 (4,8 g; 20 mmol), absolutem Ethanol (100 ml) und Dichlormethan (80 ml) gegeben. Das Gemisch wurde mit Schwefelwasserstoff gesättigt. Nach dem Rühren über Nacht wurde die Lösung konzentriert. Das kalte Gemisch wurde filtriert und mit kaltem Ethanol gewaschen. Eine Suspension der Feststoffe in Chloroform (100 ml) wurde filtriert und mit Chloroform gewaschen. Das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft. Die Ausbeute betrug 3,3 g (60%).
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 4,17 (2H, s); 7,19 (1H, dd; J = 1 und 5 Hz); 7,35 (2H, d; J = 8 Hz); 8,19 (2H, d; J = 8 Hz); 8,44 (2H, d; J = 5 Hz); 8,60 (1H, d; J = 1 Hz)
- Molekulargewicht (MS): 273 (M&spplus;)
- UV (λmax in Ethanol): 317 und 271 nm.
- [0064] Diese Verbindung 34 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 25 beschriebenen Synthese analog ist. Die Ausbeute betrug 61% nach einer Kristallisation aus Methanol.
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 4,20 (2H, s); 7,11-7,50 (4H, m); 7,69-8,31 (6H, m); 8,55-8,71 (2H, m)
- UV (λmax in Ethanol): 315 (Sch), 285 und 246 nm.
- [0065] Diese Verbindung 35 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 19 beschriebenen Synthese analog ist. Die Ausbeute betrug 82%.
- ¹H NMR (60 Mhz, DMSO-d&sub6;): 4,32 (2H, s); 7,33-7,55 (4H, m); 7,72-7,89 (4H, m); 8,13-8,69 (4H, m)
- UV (λmax in Ethanol): 326 und 253 nm.
- [0066] Diese Verbindung 36 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 20 beschriebenen Synthese analog ist. Nach der Zugabe von 10% Kaliumcarbonat wurde das Gemisch mehrere Male mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten organischen Fraktionen wurden mit Natriumsulfat getrocknet. Die Ausbeute betrug 69%.
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 4,21 (2H, s); 7,27-7,60 (5H, m); 7,81-8,20 (4H, m); 8,33 (1H, s).
- [0067] Diese Verbindung 37 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 21 beschriebenen Synthese analog ist. Nach der Zugabe von Methanol, das mit Chlorwasserstoff gesättigt war, und einstündigem Rühren wurde die Lösung zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde mit kaltem Tetrahydrofuran trituriert und filtriert. Die Ausbeute betrug 63%.
- UV (λmax in Wasser): 315 (Sch), 284 und 242 nm.
- [0068] Diese Verbindung 38 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 22 beschriebenen Synthese analog war. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid; Petrolether/Ethylacetat 5/2) gereinigt. Die Ausbeute betrug 24%.
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 1,46 (36H, s); 3,52 (8H, s); 3,80 (2 H, s); 3,95 (2H, s); 4,08 (2H, s); 7,17-8,17 (10H, m).
- [0069] Diese Verbindung 39 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 9 beschriebenen Synthese analog war. Die Ausbeute betrug 100%.
- ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d&sub6;): 3,55 (4H, s); 3,60 (4H, s); 3,99 (2H, s); 4,06 (2H, s); 4,10 (2H, s); 7,52-7,65 (7H, m); 8,09-8,22 (3H, m).
- UV (λmax in Wasser als freier Ligand): 285, 265 und 245 nm.
- UV (λmax in Wasser als Europium(III)-chelat): 320 (Sch) und 285 nm. Schema 7: Die Synthese der Verbindung 42
- [0070] Ein Gemisch aus der Verbindung 38 (150 mg; 0, 17 mmol), 10% Palladium auf Kohlenstoff (10 mg) und Methanol (30 ml) wurde unter einer Wasserstoffatmosphäre (690 kPa) fünf Stunden gerührt. Nach dem Filtrieren und dem Eindampfen des Filtrats würde das Produkt durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid; Petrolether/Ethylacetat 5/3) gereinigt. Die Ausbeute betrug 40 mg (27%).
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;). 1,45 (36H, s); 3,51 (8H, s); 3,77 (2 H, s); 3,92 (2H, s); 4,06 (2H, s); 6,64-8,03 (9H, m); 8,15 (1H, s).
- [0071] Diese Verbindung 41 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 9 beschriebenen Synthese analog ist. Die Ausbeute betrug 100%.
- UV (λmax in Wasser als freier Ligand): 315 und 290 nm.
- UV (λmax in Wasser als Europium(III)-chelat): 325 und 290 nm.
- [0072] Die Verbindung 41 (25 mg; 40 umol) wurde in Wasser (700 ul) gelöst, und der pH-Wert wurde mit festem Natriumbicarbonat auf 6,5 eingestellt. Während 15 Minuten wurde Europium(III)-chlorid (22 mg; 50 umol) in Wasser (200 ul) zugegeben, und der pH-Wert wurde bei 5-7 gehalten. Nach dem Rühren während 1,5 Stunden wurde der pH-Wert mit 1 m Natriumhydroxid auf 8,5 erhöht, und der Niederschlag wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde mit Aceton trituriert, der Niederschlag wurde abfiltriert und mit Aceton gewaschen. Ein Gemisch aus 2,4,6-Trichlortriazin (2 mg; 10 umol), Aceton (100 ul) und Wasser (100 ul) wurde zu einer Lösung des Europium(III)-chelats (8 mg, 10 ul) und 0,1 m Natriumacetat (150 ul; pH 4,9) gegeben. Nach fünfzehnminütigem Rühren wurde das Reaktionsgemisch mit Aceton trituriert. Der Niederschlag wurde abfiltriert sowie mit Aceton gewaschen und im Exikkator getrocknet.
- UV (λmax in Wasser): 331, 287 und 250 nm. Schema 8: Die Synthese der Verbindungen 49 und 56
- [0073] Ein Gemisch aus 3,5-Di(2'-pyridyl)-1,2,4-triazol (1,12 g; 5,00 mmol), Kaliumcarbonat (1,38 g; 10,0 mmol), Benzylchlorid (0,63 g; 5,0 mmol) und Acetonitril (65 ml) wurde während 2,5 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, und das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft. Das Produkt wurde durch Flash- Chromatographie (Siliciumdioxid, 1% Methanol in Dichlormethan) gereinigt. Die Ausbeute betrug 1,05 g (67%).
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 6,20 (2H, s); 6,93-7,38 (6H, m); 7,58-7,93 (3H, m); 8,15-8,79 (4H, m).
- [0074] Diese Verbindung 44 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 19 beschriebenen Synthese analog ist. Die Reaktionszeit betrug elf Tage bei Raumtemperatur. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid; 2, 5 und 10% Methanol in Chloroform) gereinigt. Die Ausbeute lag bei 62%.
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 5,76 (2H, s); 7,14-7,41 (9H, m); 7,97-8,45 (4H, m).
- [0075] Diese Verbindung 45 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 36 beschriebenen Synthese analog ist. Die Ausbeute betrug 71%
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 6,15 (2H, s); 7,26 (1H, t; J = 7 Hz); 7,32 (2H, t; J = 7 Hz); 7,42 (2H, d; J = 7 Hz); 7,75- 7,78 (2H, m); 7,79 (1H, t; J = 8 Hz); 8,01 (1H, t; J = 8 Hz); 8,47 (1H, dd; J = 1 und 8 Hz); 8,64 (1H, dd; J = 1 und 8 Hz).
- [0076] Diese Verbindung 46 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 37 beschriebenen Synthese analaog ist. Die Ausbeute betrug 100%.
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 4,26 (2H, s); 4,28 (2H, s); 5,87 (2 H, s); 7,03-7,50 (m, 7H); 7,88-8,03 (4H, m).
- [0077] Diese Verbindung 47 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 22 beschriebenen Synthese analog ist. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid; Petrolether/Ethylacetat 1/1) gereinigt. Die Ausbeute betrug 39%.
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 1,45 (36H, s); 3,47 (4H, s); 3,52 (4 H, s); 4,08 (2H, s); 4,21 (2H, s); 6,20 (2H, s); 7,13-7,30 (5H, m); 7,54-7,83 (4H, m); 7,95-8,33 (2H, m),
- [0078] Ein Gemisch aus der Verbindung 47 (0,44 g; 0,53 mmol), 10% Palladium auf Kohlenstoff (0,25 g), Ammoniumformiat (etwa 1,0 g; 15 mmol) und Methanol (10 ml) wurde unter einer Stickstoffatmosphäre mehrere Tage bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, und das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Chlorofom (50 ml) gelöst, mit Wasser (20 ml) gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Die Ausbeute betrug 0,34 g (87%).
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 1,46 (36H, s); 3,35 (4H, s); 3,52 (4 H, s); 4,12 (2H, s); 4,17 (2H, s); 7,57-8,25 (6H, m).
- [0079] Diese Verbindung 49 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 9 beschriebenen Synthese analog ist. Die Ausbeute betrug 100%.
- UV (λmax in Wasser als freier Ligand): 284 und 232 nm.
- UV (λmax in Wasser als Europium(III)chelat): 288 und 233 nm.
- [0080] Diese Verbindung 50 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 43 beschriebenen Methode analog ist. Die Ausbeute betrug 78%.
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 6,27 (2H, s); 7,20-7,86 (6H, m); 7,91-8,52 (4H, m); 8,62-8,80 (2H, m).
- [0081] Diese Verbindung 51 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 44 beschriebenen Synthese analog ist. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid; 3, 7 und 10% Methanol in Chloroform) gereinigt. Die Ausbeute betrug 51%.
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 5,80 (2H, s); 7,05-8,05 (10H, m); 8,32-8,53 (1H, m); 9,29 (1H, m)
- Molekulargewicht (MS): 390 (M&spplus;).
- [0082] Diese Verbindung 52 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 36 beschriebenen Synthese analog ist. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid, Ethylacetat) gereinigt. Die Ausbeute betrug 55%.
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 6,24 (2H, s); 7,52-8,24 (8H, m); 8,48 (1H, dd); 8,70 (1H, dd)
- UV (λmax in Ethanol): 287 (Sch) und 254 nm
- Molekulargewicht (MS): 408 (M&spplus;).
- [0083] Diese Verbindung 53 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 37 beschriebenen Synthese analog ist. Die Ausbeute betrug 82%.
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 4,25 (4H, s); 5,97 (2H, s); 7,20- 8,05 (10H, m).
- [0084] Diese Verbindung 54 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 22 beschriebenen Synthese analog ist. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid; Petrolether/Ethylacetat 1/1) gereinigt. Die Ausbeute betrug 42%.
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 1,44 (18H, s); 1,45 (18H, s); 3,47 (4H, s); 3,52 (4H, s); 4,10 (2H, s); 4,22 (2H, s); 6,32 (2H, s); 7,30-8,39 (10, m)
- UV (λmax in Ethanol): 283 und 237 nm.
- Beispiel 55. Die Synthese von 1-(m-Aminobenzyl)-3,5-bis{6'- bis-[N,N-bis(t-butoxycarbonylmethyl)aminomethyl]-2'-pyridyl}- 1,2,4-triazol (55)
- [0085] Diese Verbindung 55 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 40 beschriebenen Synthese analog ist. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid; 5% Methanol in Chloroform) gereinigt. Die Ausbeute betrug 85%.
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 1,45 (36H, s); 3,48 (4H, s); 3,52 (4 H, s); 4,10 (2H, s); 4,22 (2H, s); 6,10 (2H, s); 6,41-7,01 (4H, m); 7,70-8,33 (6H, m).
- Beispiel 56. Die Synthese von 1-(m-Aminobenzyl)-3,5-bis{6'- bis-[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl]-2'-pyridyl}-1,2,4- triazol (56)
- [0086] Diese Verbindung 56 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 9 beschriebenen Synthese analog ist. Die Ausbeute betrug 100%.
- ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d&sub6;): 3,54 (4H, s); 3,62 (4H, s); 4,09 (2H, s); 4,14 (2H, s); 6,10 (2H, s); 6,80-6,88 (2H, m); 6,96-7,02 (1H, m); 7,19-7,23 (1H, m); 7,69 (1H, d); 7,73 (1H, d); 7,97 (1H, t); 8,04 (1H, t); 8,05 (1H, d); 8,17 (1H, d)
- UV (λmax in Wasser als freier Ligand): 282 und 234 nm.
- UV (λmax in Wasser als Europium(III)-chelat): 293, 282 und 236 nm. Schema 9: Die Synthese der Verbindungen 57a und 57b
- [0087] Diese Verbindung 57a wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 42 beschriebenen Synthese analog ist.
- UV (λmax in Wasser): 295 (Sch), 282 und 236 nm.
- [0088] Diese Verbindung 57b wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 42 beschriebenen Synthese analog ist.
- UV (λmax in Wasser): 295 (Sch), 282 und 237 nm. Schema 10: Die Synthese der Verbindung 68
- [0089] Hydrazinhydrat (17, 5 ml; 500 mmol) in Ethanol (50 ml) wurde zu einer Lösung aus 2-Pyridincarbonsäureethylester (7,53 g; 50,0 mmol) und Ethanol (25 ml) gegeben. Nach dem Eindampfen und Coverdampfen mit Toluol wurde dass Produkt aus Toluol auskristallisiert. Die Ausbeute betrug 6,1 g (86%).
- ¹H NMR (60 MHz, DMSO-d&sub6;): 4,49 (3H, bs); 7,44-7,74 (1H, m); 7,94-8,04 (2H, m); 8,56-8,68 (1H, m).
- UV (λmax in Ethanol): 265 und 216 nm.
- [0090] Ein Gemisch aus den Verbindungen 32 (4, 80 g; 20,0 mmol) und 58 (2, 74 g; 20,0 mmol) wurde 24 Stunden bei 160ºC gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mehrmals mit heißem Toluol behandelt, und die vereinigten Toluolfraktionen wurden zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Chloroform mit 10% Methanol gelöst und über eine kurze Siliciumdioxidkolonne filtriert. Das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft. Die Ausbeute betrug 5,6 g (78%).
- ¹H NMR (&sup4;&sup0;0 MHz, CDCl&sub3;): 4,17 (2H, s); 7,20 (1H, d; J = 4,7 Hz); 7,33-7,39 (1H, m); 7,39 (2H, d; J = 8,4 Hz); 7,85-7,90 (1H, m); 8,18 (2H, d; J = 8,4 Hz); 8,25 (1H, s); 8,35 (1 H, d; J = 8,1 Hz); 8,72 (1H, d; J = 5,0 Hz); 8,78 (1H, d; J = 4,7 Hz)
- UV (λmax in Ethanol): 275 nm.
- [0091] Diese Verbindung 60 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 43 beschriebenen Synthese analog ist. Die Ausbeute betrug 76%.
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 4,12 (2H, s); 6,19 (2H, s); 6,86- 8,73 (16H, m).
- UV (λmax in Ethanol): 279 nm.
- [0092] Diese Verbindung 61 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 44 beschriebenen Synthese analog ist. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid; 2, 5 und 10% Methanol in Chloroform) gereinigt. Die Ausbeute betrug 50%.
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;, aliphatischer Bereich, Isomer 1): 3,96 (2H, s); 5, 79 (2H, s) ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;, aliphatischer Bereich, Isomer 2): 4,10 (2H, s); 5,75 (2H, s)
- [0093] Diese Verbindung 62 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 36 beschriebenen Synthese analog ist. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid; Petrolether/Ethylacetat 5/3, 1/1 und 0/1) gereinigt. Die Ausbeute betrug 51%.
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;, Isomer 1): 4,24 (2H, s); 6,13 (2H, s); 7,27 (1H, t; J = 7 Hz); 7,31 (2H, t; J = 7 Hz); 7,39 (2 H, d; J = 7 Hz); 7,41 (2H, d; J = 9 Hz); 7,54 (1H, s); 7,76 (1H, d; J = 8 Hz); 8,00 (1H, d; J = 8 Hz); 8,24 (2H, d; J = 9 Hz); 8,29 (1H, s); 8,60 (1H, d; J = 8 Hz)
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;, Isomer 2): 4,20 (2H, s); 6,13 (2H, s); 7,26 (1H, t; J = 7 Hz); 7,31 (2H, t; J = 7 Hz); 7,37 (2 H, d; J = 9 Hz); 7,40 (2H, d; J = 7 Hz); 7,50 (1H, s); 7,77 (1H, d; J = 8 Hz); 7,99 (1H, t; J = 8 Hz); 8,22 (2H, d; J = 9 Hz); 8,45 (1H, d; J = 8 Hz); 8,54 (1H, s)
- UV (λmax in Ethanol): 263 nm.
- [0094] Diese Verbindung 63 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 37 beschriebenen Synthese analog ist. Die Ausbeute betrug 88%.
- UV (λmax in Wasser): 280 und 235 (Sch)
- [0095] Diese Verbindung 64 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 22 beschriebenen Synthese analog ist. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid; Petrolether/Ethylacetat 1/1) gereinigt. Die Ausbeute betrug 44%.
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;, Isomer 1, aliphatischer Bereich): 1,45 (36H, s); 3,46 (4H, s); 3,48 (4H, s); 4,06 (2H, s); 4,15 (2H, s); 4,19 (2H, s); 6,19 (2H, s) ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;, Isomer 2, aliphatischer Bereich): 1,45 (36H, s); 3,44 (4H, s); 3,51 (4H, s); 4,05 (2H, s); 4,12 (2H, s); 4,20 (2H, s); 6,19 (2H, s)
- UV (λmax in Ethanol): 283 und 250 nm.
- [0096] Diese Verbindung 65 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 40 beschriebenen Synthese analog ist. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid; 2 und 3% Methanol in Chloroform) gereinigt. Die Ausbeute betrug 36%.
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;, Isomer 1): 1,45 (36H, s); 3,46 (4H, s); 3,50 (4H, s); 3,93 (2H, s); 4,05 (2H, s); 4,19 (2H, s); 6,19 (2H, s), 6,62 (2H, d; J = 8 Hz); 7,01 (2H, d; J = Hz); 7,15-7,35 (5H, m); 7,65 (1H, s); 7,71 (1H, d; J = 8 Hz); 7,79 (1H, t; J = 8 Hz); 7,91 (1H, s); 8,23 (1H, d; J = 8 Hz) ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;, Isomer 2): 1,45 (36H, s); 3,45 (4H, s); 3,51 (2H, s); 3,90 (2H, s); 4,03 (2H, s); 4,21 (2H, s); 6,19 (2H, s), 6,61 (2H, d; J = 8 Hz); 6,98 (2H, d; J = Hz); 7,15-7,35 (5H, m); 7,50 (1H, s); 7,78 (1H, t; J = 8 Hz); 7,83 (1H, d; J = 8 Hz); 8,07 (1H, d; J = 8 Hz); 8,12 (1H, s).
- [0097] Diese Verbindung 66 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 48 beschriebenen Synthese analog ist. Die Ausbeute betrug 50%.
- ¹H NMR (60 MHz, CDCl&sub3;, aliphatischer Bereich): 1,45 (36H, s); 3,50 (8H, s); 3,91 (2H, s); 4,09 (2H, s); 4,16 (2H, s)
- [0098] Diese Verbindung 67 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 9 beschriebenen Synthese analog ist. Die Ausbeute betrug 100%.
- [0099] Beispiel 68. Die Synthese des Terbium(III)-chelats von 3-{6'-[N,N-Bis(carboxymethyl)aminomethyl]-4'-(p-isothiocyanatobenzyl)-2'-pyridyl}-5-{6"-[N,N-bis(carboxymethyl)- aminomethyl]-2"-pyridyl}-1,2,4-triazol (68)
- [0100] Die Verbindung 68 (50 mg; 0,08 mmol) wurde in Wasser (1,5 ml) gelöst und der pH-Wert wurde mit festem Natriumbicarbonat auf 6,5 eingestellt. Während 15 Minuten wurde Terbium(III)-chloride (35 mg; 0,090 mmol) in Wasser (0,5 ml) zugegeben, und der pH-Wert wurde auf 5-7 gehalten. Nach dem Rühren während 1,5 Stunden wurde der pH-Wert mit 1 m Natriumhydroxyd auf 8,5 erhöht, und der Niederschlag wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde mit Aceton trituriert. Der Niederschlag wurde abfiltriert und mit Aceton gewaschen. Eine wäßrige Lösung des Niederschlags (2,5 ml) wurde während 15 Minuten zu einem Gemisch aus Thiophosgen (25 ul; 0,32 mmol), Natriumbicarbonat (34 mg; 0,40 mmol) und Chloroform (2,5 ml) gegeben. Nach einstündigem Rühren wurden die Fraktionen ge trennt, und die Wasserfraktion wurde mit Chloroform (3 · 1,0 ml) gewaschen. Die wäßrige Lösung wurde mit Aceton trituriert. Der Niederschlag wurde abfiltriert und mit Aceton gewaschen. Die Ausbeute betrug 38 mg (55%). Schema 11: Die Synthese der Verbindung 72
- [0101] Ein Gemisch aus 2-Pyridincarboxamidinhydrochlorid (4,85 g; 31,0 mmol), 2-Bromacetylpyridin (5,00 g; 25,0 mmol), N,N- Diisopropylethylamin (8,8 ml; 50 mmol) und Chloroform (50 ml) wurde zwei Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 5%igem Natriumbicarbonat (20 ml) und Wasser (2 · 20 ml) gewaschen sowie mit Natriumsulfat getrocknet. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid; Ammoniak/5% Methanol in Chloroform, zuerst 0/1 und dann 1/49) gereinigt. Die Ausbeute betrug 2,28 g (41%). F. 145 ºC.
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 7,15-7,18 (1H, m); 7,27-7,30 (1H, m); 7,72 (2H, t); 7,80 (2H, t); 8,22 (1H, d); 8,58-8,59 (2 H, d).
- UV (λmax in Ethanol): 307, 260 und 227 nm.
- [0102] Ein Gemisch aus der Verbindung 69 (0,50 g; 2,3 mmol), Kaliumcarbonat (0,48; 3,4 mmol) und Brommethylacetat (1,03 g; 6,80 mmol) in Acetonitril (20 ml) wurde fünf Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Filtrieren wurde das Filtrat zur Trockene eingedampft. Das Produkt wurde durch Flash- Chromatographie (Siliciumdioxid; 2 und 5% Methanol in Chloroform) gereinigt. Die Ausbeute betrug 0,40 g (59%).
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 2,06 (3H, s); 6,69 (2H, s); 7,16- 7,19 (1H, m); 7,27-7,30 (1H, m); 7,75 (1H, dt; J = 1 und 8 Hz); 7,1 (1H, dt; J = 1 und 8 Hz); 7,92 (1H, s); 8,07 (1H, d; J = 8 Hz); 8,35 (1H, d; J = 8 Hz); 8,59-8,61 (2H, m)
- UV (λmax in Ethanol): 294, 257 und 223 nm.
- [0103] Diese Verbindung 71 wurde durch Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 44 beschriebenen Synthese analog ist. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid; 2, 5 und 10% Methanol in Chloroform) gereinigt. Die Ausbeute betrug (20%).
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 1,98 (3H, s); 6,14 (2H, s); 7,15 (1 H, dt); 7,32 (1H, t); 7,40-7,43 (2H, m); 7,72-7,75 (1H, m); 8,31-8,35 (3H, m); 8,92 (1H, s)
- UV (λmax in Ethanol): 289 (Sch), 254 und 220 nm.
- [0104] Diese Verbindung 72 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 36 beschriebenen Synthese analog ist. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid; Petrolether/Ethylacetat 5/3) gereinigt. Die Ausbeute betrug (52%).
- ' 1H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 2,11 (3H, s); 6,61 (2H, s); 7,57 (1 H, d; J = 8 Hz); 7,71 (1H, d; J = 8 Hz); 7,86 (1H, t; J = 8 Hz); 7,97 (1H, t; J = 8 Hz); 8,04 (1H, s); 8,25 (1H, d; J = 8 Hz); 8,57 (1H, d; J = 8 Hz)
- UV (λmax in Ethanol): 301 und 272 nm. Schema 12: Die Synthese der Verbindung 76
- [0105] Ein Gemisch aus 2,6-Pyridindithiodicarboxamid (0,74 g; 3,8 mmol), Chloraceton (0,70 ml; 8,7 mmol) und Ethanol (15 ml) wurde über Nacht unter Rückfluß erhitzt. Die Feststoffe wurden abfiltriert und mit Ethanol gewaschen. Die Suspension des Hydrochloridsalzes des Produkts in heißem Wasser (50 ml) wurde mit festem Natriumcarbonat alkalisch eingestellt. Das Produkt wurde filtriert und mit Wasser gewaschen. Die Ausbeute betrug 0,63 g (61%).
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 2,54 (6H, s); 7,03 (2H, s); 7,86 (1 H, t; J = 7,8 Hz); 8,15 (2H, d; J = 7,8 Hz)
- UV (λmax in Ethanol): 330, 306 und 232 nm.
- [0106] Ein Gemisch aus der Verbindung 73 (0,63 g; 2,3 mmol), N-Bromsuccinimid (0,90 g; 5,1 mmol), Dibenzoylperoxid (56 mg; 0,2 mmol) und Terachlorkohlenstoff (15 ml) wurde über Nacht unter Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid, 2% Methanol in Chloroform) gereinigt. Die Ausbeute betrug 82%.
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 4,65 (4H, s); 7,44 (2H, s); 7,93 (1 H, t; J = 9 Hz); 8,24 (2H, d; J = 9 Hz)
- UV (λmax in Ethanol): 328 und 302 nm.
- [0107] Diese Verbindung 75 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 8 beschriebenen Synthese analog ist. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Siliciumdioxid; Petrolether/Ethylacetat, zuerst 10/1 und dann 5/1) gereinigt. Die Ausbeute betrug 31%.
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 1,48 (36H, s); 3,53 (8H, s); 4,16 (4H, s); 7,42 (2H, s); 7,86 (1H, t; J = 8,0 Hz); 8,18 (2 H, d; J = 8,0 Hz)
- UV (λmax in Ethanol): 329 und 299 nm.
- [0108] Diese Verbindung 76 wurde unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 9 beschriebenen Synthese analog ist. Die Ausbeute betrug 75%.
- ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d&sub6;): 3,85 (8H, s); 4,33 (4H, s); 7,90 (2H, s); 8,18-8,22 (3H, m)
- UV (λmax in Wasser als freier Ligand: 323 und 287 nm
- UV (λmax in Wasser als Europium(III)-chelat: 341 und 278 nm. Schema 13: Die Synthese der Verbindung 78
- [0109] Ein Gemisch aus 2,6-Dicyanopyridin (8,03 g; 62,2 mmol), Hydroxylaminhydrochlorid (10,4 g; 150 mmol), Natriumacetat (13,8 g; 168 mmol) und Wasser/Ethanol (200 ml, 1/5) wurde 45 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Eindampfen zur Trockene wurde der Rückstand mit Wasser trituriert, filtriert und mit Wasser gewaschen. Die Ausbeute betrug 11,43 g (94%).
- ¹H NMR (60 MHz, DMSO-d&sub6;): 6,26 (4H, bs); 7,70-7,87 (3H, m); 9,83 (2H, s)
- UV (λmax in Ethanol): 301 nm.
- [0110] Ein Gemisch aus der Verbindung 77 (11,1 g; 57, 0 mmol), Acetanhydrid (34,9 g; 342 mmol) und Toluol (150 ml) wurde über Nacht unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Eindampfen auf die Hälfte des ursprünglichen Volumens wurden die Feststoffe abfiltriert und mit Toluol gewaschen. Die Ausbeute betrug 11,6 g (84%).
- ¹H NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 2,71 (6H, s); 8,03 (1H, t; J = 7,7 Hz); 8,21 (2H, d; J = 7,7 Hz)
- UV (λm in Ethanol): 282 und 232 nm. Schema 14: Die Synthese der Verbindung 79
- [0111] Ein Gemisch aus Europium(III)-acetat (78 mg; 0,24 mmol), Trimethylorthoformiat (1,2 ml) und trockenem Acetonitril (6 ml) wurde zwei Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach der Zugabe von 1,7,10,16-Tetraoxa-4,13- diazacyclooctadecan (62 mg; 0,24 mmol) wurde das Reaktionsgemisch 15 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Eine Suspension aus der Verbindung 12 (130 mg; 0,24 mmol) und trockenem Acetonitril (4 ml) wurde zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das Produkt wurde abfiltriert und mit Acetonitril gewaschen. Die Ausbeute betrug 70 mg (37%).
- [0112] Diese Verbindung 80 wurde aus der Verbindung 67 unter Anwendung einer Methode synthetisiert, die der im Beispiel 57b beschriebenen Synthese analog ist.
- [0113] Die relative Lumineszenzausbeute φrel des Europium(III)- und des Terbium(III)-chelats der Verbindung 49 wurde in äquimolaren 10&supmin;&sup5; m Lösungen der Verbindung 49 und des entsprechenden Lanthanidenions gemessen. Die Lumineszenzmessungen erfolgten auf einem Spektrofluorometer Perkin-Elmer LS-5® unter Anwendung des Fluoreszenzmodus, der das Messen der Abklingkurven der Lanthanidenlumineszenz erlaubte. Die Lumineszenzausbeute wird relativ zur Lumineszenz des nichtkomplexierten Lanthanidenkations (Ln) unter Anwendung der Gleichung
- angegeben, worin lche und lLn die vorexponentiellen. Größen der Emissionsabklingkurven für das chelierte bzw. das nicht- komplexierte Lanthanidenkation bedeuten (614 nm für Europium und 544 nm für Terbium). Die Anregungswellenlänge für das nichtkomplexierte Europium(III) lag bei 395 nm und für Terbium(III) bei 370 nm. Cln und Cche sind die Konzentrationen des freien bzw. des komplexierten Lanthanidenkations, und kLn und kche sind die entsprechenden Abklingkonstanten. Für den Europium(III)-Komplex der Verbindung 49 betrug die relative Lumineszenzausbeute 1,3 · 10&sup5; und für den Terbium(III)-Komplex 5,8 · 10&sup5; Die Anregungswellenlänge für Europium(III) war 280 nm und für Terbium(III) 310 nm.
- [0114] Für den Europium(III)-Komplex der Verbindung 30 war die relative Lumineszenzausbeute 8,9 · 10&sup5;. Die Anregungswellenlänge lag bei 336 nm. Für das Terbium (III) betrugen die ent- sprechenden Werte 2,8 · 10³ und 260 nm.
- [0115] Für den Europium(III)-Komplex der Verbindung 76 lag die relative Lumineszenzausbeute bi 5,7 · 10&sup5;. Die Anregungswellenlänge war 340 nm.
- [0116] Die IgG-Fraktion der Kaninchen-anti-Maus-IgG (RaM) (Dako, Dänemark) wurde in einem Markierungspuffer gereinigt, der aus 50 mmol Carbonat (pH 9,3) bestand. RaM-Fraktionen (jeweils 1 mg) wurden mit dem Chelat 68 unter Einsatz eines 100-, 300- und 1200-fachen molaren Überschusses des Chelats in dem Markierungspuffer markiert, wobei 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Anschließend wurden die IgG-Konjugate mit einer gemeinsamen Säule aus Trisacryl® GF5 (Reactifs IBF, Frankreich) und Sephacryl® S-300 (Pharmacia Biosystems, Schweden) gereinigt, wobei mit dreifach gepufferter Salzlösung (50 mmol; pH 7,75) eluiert wurde. Es wurde sowohl die teilweise aggregierte als auch die monomere IgG-Fraktion gesammelt und bezüglich Protein und der Terbium(III)-Konzentration analysiert. Die Terbium(III)- Konzentrationen wurden mit einem modifizierten DELFIA®-System (Wallac, Finnland) unter Verwendung von 2,4,6- Trimethoxyphenyldipicolinsäure als fluorogenem Liganden gemessen. Der Inkorporierungsgrad variierte zwischen 12, 2 und 69 Terbium(III)/IgG.
- [0117] Die relative Lumineszenz von markierten Antikörpern wurde in verschiedenen Puffern im pH-Bereich zwischen 3, 2 und 11, 7 gemessen. Die höchsten Lumineszenzen wurden bei neutralem pH-Wert erreicht. Bei einem pH-Wert unter 5 nahm die Lumineszenz rasch ab, bei einem pH-Wert über 9 war die Abnahme langsam. Die Lumineszenz wurde durch einen Innenfiltereffekt nicht gedämpft. Das Anregungsmaximum lag bei 310 nm, wobei typische Emissionslinien bei 490 und 544 nm (zusätzlich zu unbedeutenden Linien bei längeren Wellenlängen) erzeugt wurden. Im Vergleich zu dem System im Beispiel 83 kam die Quantenausbeute nahe an 25%, und die Abklingzeit lag bei 1,46 ms (im Puffer).
- [0118] Die Immunoreaktivität der vorliegenden terbium(III)- markierten Antikörper wurde in einem Modellprüfsystem getestet, das aus Polystyrol-Microtitrationsstreifen bestand, die physikalisch mit monoklonalen Antikörpern (MIgG) beschichtet worden sind, wobei mit Albumin (BSA) beschichtete Streifen als Kontrolle dienten. Die Streifen wurden in einem Assay-Puffer (Wallac) inkubiert, der verschiedene Mengen an terbium(III)-markiertem RaM enthielt. Das spezifische Signal lag im Bereich von 3.000 cps mit 1 ng/ml Terbium(III)-RaM bis 1.000.000 cps mit 10 ug/ml Terbium(III)-RaM.
- [0119] Terbium(III)-markiertes RaM wurde auch in einem allergiespezifischen IgE-Bindungstest unter Einsatz einer Matrix (CAP®-Matrix, Pharmacia Diagnostics), die mit Allergenmaterial immobilisiert war, geprüft. Die Bindung von spezifischem IgE von Patientenserum wurde durch Färben mit Maus-anti-Human-IgE und nachfolgend mit terbium(III)-markiertem RaM sichtbar gemacht. Die gefärbte Matrix wurde mit einem Mikroskop mit zeitaufgelöster Fluoreszenz geprüft, und das Signal mit einer CCD-Kamera aufgezeichnet.
Claims (9)
1. Lumineszierendes Lanthanidenchelat, bestehend aus einem
Lanthanidenion und einem Chelatbildner der Formel
dadurch gekennzeichnet, daß
a) das Symbol "~" eine kovalente Bindung zwischen zwei
Kohlenstoffatomen bedeutet,
b) das Symbol "-" eine kovalente Bindung bedeutet,
c) E die Gruppe Methylen (CH&sub2;) oder Carbonyl (C=O)
bedeutet,
d) einer oder zwei der Reste [A&sub1;], [B] und [A&sub2;] einen
bivalenten heterocyclischen ungesättigten fünfgliedrigen
Ring bzw. derartige Ringe bedeutet bzw. bedeuten,
wobei der Ring bzw. die Ringe aus den folgenden Gruppen
2,5-furylen
2,4-thiazolylen
2,5-thiazolylen
2-thiazolin-2,4-ylen
3-thiazolin-2,4-ylen
2,4-oxazolylen
2-oxazolin-2,4-ylen
3-oxazolin-2,4-ylen
2,4-imidazolylen
2-imidazolin-2,4-ylen
3-imidazolin-2,4-ylen
1,2,4-triazol-3,5-ylen
1,3,4-oxadiazol-2,5-ylen
1,2,4-oxadiazol-3,5-ylen
1,3-pyrazolylen
und
2,5-pyrrolylen
und entsprechenden Ringen, in denen ein Wasserstoff
durch eine geeignete Gruppe G&sub1;, G&sub2; oder G&sub3; ersetzt
ist, die gleich oder verschieden sind, ausgewählt ist
bzw. sind,
der übrige Rest oder die übrigen Reste [A&sub1;], [B] und
[A&sub2;] einen 2,6-Pyridylenrest oder den entsprechenden
Rest, in dem ein Wasserstoff durch den geeigneten
Rest G&sub1;, G&sub2; und G&sub3;, die gleich oder verschieden sind,
ersetzt ist, bedeutet bzw. bedeuten,
wobei ein Heteroatom in jedem Ring [A&sub1;], [B] und [A&sub2;]
mit dem gleichen Lanthanidenion koordiniert ist, so
daß zwei fünfgliedrige Ringe gebildet werden, in
denen ein Glied das Lanthanidenion ist und zwei
Glieder koordinierte Heteroatome verschiedener Ringe [A&sub1;],
[B] und [A&sub2;] sind,
e) Ch&sub1; und Ch&sub2; identische oder verschiedene
chelatisierende Reste bedeuten, die miteinander verbunden sein
können,
wobei jeder dieser Reste mindestens zwei Heteroatome
enthält, die mit dem Lanthanidenion koordiniert und
aus der Gruppe Sauerstoff und Stickstoff ausgewählt
sind, mindestens eines der genannten koordinierten
Heteroatome in jedem der Reste Ch&sub1; und Ch&sub2; zusammen
mit dem Lanthanidenion und einem koordinierenden
Heteroatom eines der Reste [A&sub1;], [B] und [A&sub2;] einen
fünf- oder sechsgliedrigen Ring bildet,
und wobei der Abstand zwischen jedem Paar der
Heteroatome, die an der Chelatisierung und der
Bildung desselben fünf- oder sechsgliedrigen Rings
beteiligt sind, zwei bzw. drei Atome beträgt, sowie
f) G&sub1;, G&sub2; und G&sub3; jeweils aus der Gruppe der Reste
Hydroxy-, Nitro-, Amino-, Niederalkylamino-,
Niederarylamino-, Niederacylamino-, Alkyl-, Aryl-,
Alkylaryl-, Arylalkyl-, Arylethinyl-, wie der
Phenylethinylgruppe, Alkoxy- und Aryloxyrest
ausgewählt sind, mit der Maßgabe, daß die Alkylreste 1 bis
12 Kohlenstoffatome enthalten und die Arylreste aus
der Phenyl-, Naphthyl- und Pyridylgruppe ausgewählt
sind,
oder G&sub1;, G&sub2; und G&sub3; jeweils einen Rest bedeuten, der
Aryl- und Alkylenteile enthält, wobei der Alkylenteil
1 bis 8 Kohlenstoffatome und zusätzlich 0 bis 4
andere Atome, wie Sauerstoff, Schwefel, Stickstoff oder
Phosphor, aufweist und der Arylrest aus der Phenyl-,
Naphthyl- und Pyridylgruppe ausgewählt ist, wobei
jeder der vorgenannten Reste gegebenenfalls einen
Amino-, Aminooxy-, Carboxy-, Hydroxy-, Aldehyd- oder
Mercaptorest oder eine aktivierte Form hiervon
enthält, z. B. die Isothiocyanato-, Isocyanato-,
Diazonium-, Bromacetamido- oder Iodacetamidogruppe oder
reaktionsfähige Ester, wie die
N-Hydroxysuccinimidogruppe, oder die 4-Nitrophenyl-, 2,4-Dinitrophenyl-,
Pyridyl-2-dithio-, 4-Chlor-6-ethoxytriazon-2-ylamino-
oder 4,6-Dichlortriazon-2-ylaminogruppe, zum Binden
an eine Verbindung, die eine biospezifische Affinität
aufweist.
2. Chelat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß [B]
die 2,6-Pyridylengruppe oder die entsprechende Gruppe, in
der ein Wasserstoff durch G&sub2; ersetzt wurde, ist.
3. Chelat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß [A&sub1;]
und [A&sub2;] jeweils die 2,6-Pyridylengruppe oder die
entsprechende Gruppe, in der ein Wasserstoff durch G&sub1; bzw. G&sub3;
ersetzt wurde, sind.
4. Chelat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das Lanthanidenion aus Eu³&spplus;, Tb³&spplus;, Sm³&spplus; und
Dy³&spplus; ausgewählt ist.
5. Chelat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß die chelatisierenden Heteroatome von Ch&sub1;
und Ch&sub2; aus Aminostickstoffen (primären, sekundären oder
tertiären) und negativ geladenen Sauerstoffen, wie in
Carboxyläten, Phosphonaten und Phosphaten, ausgewählt
sind.
6. Chelat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß Ch&sub1; und Ch&sub2; aus den Gruppen N(CH&sub2;COO&supmin;)&sub2;,
N(CH&sub2;CH&sub2;COO&supmin;)&sub2;, N(CH&sub2;-PO&sub3;²&supmin;)&sub2; und der
2,6-Dicarboxypiperidin-1-ylgruppe ausgewählt sind.
7. Chelat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß Ch&sub1; und Ch&sub2; eine oder zwei Brücken bilden,
die aus gesättigten Kohlenstoff-, Ethersauerstoff- und
Stickstoffatomen bestehen, wobei die Brücken die Reste
[A&sub1;] und [A&sub2;] kovalent verbinden und der genannte
Stickstoff aus sekundären oder tertiären
Aminostickstoffen ausgewählt ist.
8. Chelat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das zusätzlich
einen Rest einer Verbindung mit biospezifischer Affinität
enthält, die aus der Gruppe der Proteine, Enzyme,
Antikörper, Antigene, Haptene, Oligo- und Polynucleotide,
Lektine, Rezeptoren, Kohlenhydratstrukturen, Dextrane,
des Proteins A, der Arzneistoffe und IgG ausgewählt ist,
wobei dieser Rest die biospezifische Affinität der
genannten Verbindung beibehält und an den Rest G&sub1;, G&sub2;
oder G&sub3; des Chelats gebunden ist.
9. Verfahren zum Bestimmen eines Analyten in einer Probe,
mit folgenden Stufen:
a) Kontaktieren der Probe mit einem Reaktionspartner,
der gegenüber dem Analyten eine biospezifische Affinität
aufweist, wobei sich die Bildung eines Komplexes ergibt,
der den Analyten und den Reaktionspartner enthält, und
wobei die Bedingung und die Mengen des Reaktionspartners
derart gewählt werden, daß die Menge des gebildeten
Komplexes eine Funktion der Menge des Analyten in der
Probe ist, (b) quantitatives oder qualitatives Messen der
Menge eines Komplexes, der durch Einsatz eines
Reaktionspartners, der gegenüber dem genannten Komplex
eine biospezifische Affinität aufweist und mit einer
analytisch feststellbaren Gruppe markiert ist, gebildet
wurde, und (c)Herstellen einer Beziehung zwischen der
gemessenen Menge des Komplexes und der Menge des Analyten
in der Probe,
dadurch gekennzeichnet, daß der mit einer analytisch
feststellbaren Gruppe markierte Reaktionspartner mit
einem Lanthanidenchelat nach einem der Ansprüche 1 bis 8
übereinstimmt.
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