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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Diese Erfindung betrifft neuartige
Verbindungen, die zur Markierung eines biospezifischen Bindungsreaktanten
unter Verwendung der Festphasensynthese geeignet sind. Die Erfindung
betrifft weiter neuartige Verfahren zur Markierung eines biospezifischen
Bindungsreaktanten in einer Festphasensynthese.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Festphasensynthese ist eine gut bekannte
und weit verbreitete Technologie in der modernen organischen Chemie
zur Herstellung verschiedener biologisch wichtiger Verbindungen.
Sie hat viele neue Anwendungen gefunden, wie kombinatorische Bibliotheken
und das Peptid-basierte DNA-Analogon (PNA, Peptid-Nukleinsäuren). Mit
der technologischen Entwicklung hat sich ein Bedarf entwickelt,
diese biologisch interessanten Verbindungen während der Festphasensynthese
zur markieren. Einige nicht-fluoreszierende Markierungsverbindungen
sind veröffentlicht
worden (Arya, R. und Gariepy, J., 1991, Bioconjugate Chem., 2, 323, Cuenoud,
B. und Schepartz, A., 1991, Tetrahedron, 47, 2535; Rana, T. M.,
Ban, M. und Hearst, J. E., 1992, Tetrahedron Lett., 33, 4521; Song,
A. I. und Rana, T. A., 1997, Bioconjugate Chem., 8, 249). Diese
Markierungen sind hauptsächlich
entwickelt worden um Metallionen, wie Fe, Cu, in ein Peptid einzubauen
um als Sequenz-spezifisches Spaltungsagens für Proteine zu fungieren. Radioaktives 153Gd, 111In, usw.,
können
zur in-vivo-Tumorlokalisierung und Radioimmunotherapie verwendet
werden. Diese veröffentlichten
Monomere können
als lumineszierende Markierungen verwendet werden, die Lanthanidionen
und einen getrennten Lumineszenzverstär kungsschritt verwenden. Es
ist jedoch ein getrennter Verstärkungsschritt
erforderlich um die Lumineszenz, die zu bestimmen ist, zu erzeugen.
Während
der Lumineszenzverstärkung
muss das Lanthanid von der Markierung getrennt werden, und folglich
geht räumliche
Information verloren.
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Fluoreszierende Markierungsmonomere
für die
Festphasensynthese sind veröffentlicht
worden (Lohse, J., Nielsen, P. E., Harrit, N. und Dahl, O., 1997,
Bioconjugate Chem., 8, 503; McCafferty, D. G., Bishop, B. M., Wall,
C. G., Hughes, S. G., Mecklenberg, S. L., Meyer, T. J. und Erickson,
B. W., 1995, Tetrahedron, 51, 1093; WO96/03409). Fluorescein und
andere organische Chromophore werden in diesen Studien verwendet. Derartige
Markierungen und markierte Biomoleküle leiden jedoch unter vielen
allgemein bekannten Nachteilen, wie Raman-Streuung, anderen fluoreszierenden
Verunreinigungen, niedriger Wasserlöslichkeit, Konzentrationslöschung,
usw.
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In speziellen Bindungsassays, wie
z. B. Immunoassays, DNA-Hybridisierungsassays,
Rezeptorbindungsassays und zellulären Bindungsassays, liegen
im Allgemeinen sehr niedrige Konzentrationen des zu messenden Analyten
vor. Daher sind verschiedene Markierungsverbindungen entwickelt
worden, die es gestatten, den zu bestimmenden markierten Reaktanten
qualitativ und quantitativ mit hoher Empfindlichkeit zu bestimmen.
In Immunoassays und DNA-Hybridisierungsassays ist zeitaufgelöste Lumineszenzspektroskopie unter
Verwendung von Lanthanidchelaten gut bekannt (z. B. I. Hemmilä, T. Ståhlberg
und P. Mottram (Hrsg.), "Bioanalytical
Applications of Labeling Technologies", Wallac, Turku; 1994). Stabile, photolumineszierende
(in diesem Zusammenhang einfach als lumineszierend bezeichnet) Lanthanidchelate
besitzen auch andere Anwendungen, z. B. Fluoreszenzmikroskopie und
Cytometrie. Daher ist eine Anzahl an Versuchen gemacht worden, neue
hochgradig lumineszierende Chelatmarkierungsverbindungen zu entwickeln,
die für
diese Arten von zeitaufgelösten,
fluorometrischen Anwendungen geeignet sind. Diese beinhalten beispielsweise
stabile Chelatverbindungen, die aus Derivaten von Pyridinen (
US 4 920 195 ,
US 4 801 722 ,
US 4 761 481 , PCT/FI91/00373,
US 5 459 186 , EP-A 0770610,
Remuinán,
M. J., Román,
H., Alonso, M. T. und Rodriguez-Ubis, J. C., 1993, J. Chem. Soc.,
Perkin Trans.2, 1099), von Bipyridinen (
US 5 216 134 ), von Terpyridinen (
US 4 859 777 ,
US 5 202 423 ,
US 5 324 825 ) oder ver-schiedenen
phenolischen Verbindungen (
US
4 670 572 ,
US 4 794
191 , Ital. Pat. 42508 A/89) als Energie-vermittelnde Gruppen
und Polycarbonsäuren
als chelatisierende Teile zusammengesetzt sind. Zusätzlich sind
verschiedene Dicarboxylatderivate (
US
5 032 677 ,
US 5 055
578 ,
US 4 772 563 ),
makrocyclische Cryptate (
US 4
927 923 , WO 93/5049, EP-A-493 745) und makrocyclische Schiff-Basen
(EP-A-369 000) patentiert worden. Keines dieser Patente und keiner
dieser Artikel bieten Verfahren zur Markierung eines biospezifischen
Bindungsreaktanten, wie ein Hapten, ein Peptid, ein Rezeptorligand,
ein Wirkstoff oder PNA-Oligomer,
mit lumineszierenden Markierungen unter Verwendung der Festphasensynthese.
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AUFGABEN UND
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung
ist es, die Probleme in Verbindung mit der Markierung kleiner Moleküle mit lumineszierenden
Chelaten zu lösen
und Verfahren zur einfacheren Markierung zu entwickeln. Durch Herstellen
geeigneter Ligandstrukturen mittels Festphasensynthese ist das Markieren
kleiner Moleküle mit
direkt lumineszierenden Lanthanidchelaten zugänglich.
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Eine Aufgabe der Erfindung ist es,
einen neuen Markierungsreaktanten zur Verfügung zu stellen, der zur Markierung
eines biospezifischen Bindungsreaktanten unter Verwendung der Festphasensynthese
geeignet ist.
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Eine weitere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung ist es, ein neuartiges Verfahren zur Markierung eines biospezifischen
Bindungsreaktanten in der Festphasensynthese bereitzustellen.
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Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung ist es, ein Verfahren zur Markierung eines biospezifischen
Bindungsreaktanten mit einer exakten, vorbestimmten Anzahl von Markierungsreaktanten
(einer oder mehrere) bereitzustellen.
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Damit betrifft die vorliegende Erfindung
unter einem Gesichtspunkt einen neuartigen Markierungsreaktanten
der Formel (I) der zur Markierung eines biospezifischen Bindungsreaktanten
unter Verwendung der Festphasensynthese geeignet ist
worin
A eine zweiwertige
aromatische Struktur ist, die fähig
ist, Licht oder Energie zu absorbieren und die Anregungsenergie
auf ein Lanthanidion zu übertragen,
nachdem das durch die Festphasensynthese hergestellte Produkt vom
verwendeten festen Träger
freigesetzt, von Schutzgruppen befreit und in ein Lanthanidchelat überführt worden
ist;
R für
-Z(G'-NH-X)G''-E steht, worin
R eine transiente
Schutzgruppe ist, wobei diese Gruppe z. B. 2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethoxycarbonyl,
Trityl, 4-Methoxytrityl,
4,4'-Dimethoxytrityl,
tert.-Butoxycarbonyl, Fluorenylmethyloxycarbonyl ist;
E eine
Carbonsäure,
ihr Salz, Aktivester oder Halogenid ist, worin dieser Ester z. B.
ein N-Hydroxysuccinimido, o-, p- oder m-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol
oder Pentafluorophenol ist, und das Halogenid Fluorid, Bromid oder
Chlorid ist;
Z der Brückenpunkt
ist und aus
oder substituierten oder
unsubstituierten dreiwertigen Derivaten von Cyclohexan, Cyclohexen,
Cyclohexadien, Benzol, Cyclopentan, Cyclopenten, Cyclopentadien,
Cyclobutan, Cyclobuten, Cyclobutadien, Aziridin, Diaziridin, Oxetan,
Thietan, Azet, Azetidin, 1,2-Dihydro-1,2-diazet, 1,2-Diazetidin, Furan,
Tetrahydrofuran, Thiophen, 2,5-Dihydrothiophen, Thiolan, Selenophen,
Pyrrol, Pyrrolidin, Phosphol, 1,3-Dioxolan, 1,2-Dithiol, 1,2-Thiolan, 1,3-Dithiol,
1,3-Dithiolan, Oxazol, 4,5-Dihydrooxazol, Isoxazol, 4,5-Dihydroisoxazol,
2,3-Dihydroisoxazol, Thiazol, Isothiazol, Imidazol, Imidazolidin,
Pyrazol, 4,5-Dihydropyrazol,
Pyrazolidin, Triazol, Pyran, Pyran-2-on, 3,4-Dihydro-2H-pyran, Tetrahydropyran,
4H-Pyran, Pyran-4-on,
Pyridin, Pyridon, Piperidin, Phosphabenzol, 1,4-Dioxin, 1,4-Dithiin, 1,4-Oxathiin, Oxazin,
1,3-Oxazinon, Morpholin, 1,3-Dioxan, 1,3-Dithian, Pyridazin, Pyrimidin,
Pyrazin, Piperazin, 1,2,4-Triazin, 1,3,5-Triazin, 1,3,5-Triazacyclohexan-2,4,6-trion
gebildet wird;
G eine Brücke
zwischen A und Z ist, G' eine
Brücke
zwischen NH und Z ist und G'' eine Brücke zwischen
E und Z ist, die gleich oder verschieden sind, nicht notwendigerweise
vorliegen und aus einer bis zehn Gruppierungen gebildet werden,
wobei jede Gruppierung ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Phenylen, 1–12 Kohlenstoffatome enthaltendes
Alkylen, Ethindiyl (-C≡C-),
Ether (-O-), Thioether (-S-), Amid (-CO-NH- und -NH-CO- und -CO-NR'- und – NR'-CO-), Carbonyl (-CO-),
Ester (-COO- und -OOC-), Disulfid (-S-S-), Diaza (-N=N-) und tertiärem Amin
(- N(R'')-), worin R'' ein Alkyl darstellt, das weniger als
5 Kohlenstoffatome enthält;
R' für -COOR''' steht,
worin R''' ein Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,
Phenyl oder Benzyl ist, wobei das Phenyl oder Benzyl substituiert
oder unsubstituiert sein kann.
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Unter einem anderen Gesichtspunkt
betrifft diese Erfindung die Verwendung eines Markierungsreaktanten
der Formel (I)
worin
A eine zweiwertige
aromatische Struktur ist, die fähig
ist, Licht oder Energie zu absorbieren und die Anregungsenergie
auf ein Lanthanidion zu übertragen,
nachdem das durch die Festphasensynthese hergestellte Produkt vom
verwendeten festen Träger
freigesetzt, von Schutzgruppen befreit und in ein Lanthanidchelat überführt worden
ist;
R für
-Z(G'-NH-X)G''-E steht, worin
R eine transiente
Schutzgruppe ist, worin diese Gruppe z. B. 2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethoxycarbonyl,
Trityl, 4-Methoxytrityl,
4,4'-Dimethoxytrityl,
tert.-Butoxycarbonyl, Fluorenylmethyloxycarbonyl ist;
E eine
Carbonsäure,
ihr Salz, aktiver Ester oder Halogenid ist, worin dieser Ester z.
B. ein N-Hydroxysuccinimido, o-, p- oder m-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol
oder Pentafluorophenol ist, und das Halogenid Fluorid, Bromid oder
Chlorid ist;
Z der Brückenpunkt
ist und aus
oder substituierten oder
unsubstituierten dreiwertigen Derivaten von Cyclohexan, Cyclohexen,
Cyclohexadien, Benzol, Cyclopentan, Cyclopenten, Cyclopentadien,
Cyclobutan, Cyclobuten, Cyclobutadien, Aziridin, Diaziridin, Oxetan,
Thietan, Azet, Azetidin, 1,2-Dihydro-1,2-diazet, 1,2-Diazetidin, Furan,
Tetrahydrofuran, Thiophen, 2,5-Dihydrothiophen,
Thiolan, Selenophen, Pyrrol, Pyrrolidin, Phosphol, 1,3-Dioxolan,
1,2-Dithiol, 1,2-Thiolan, 1,3-Dithiol,
1,3-Dithiolan, Oxazol, 4,5-Dihydrooxazol, Isoxazol, 4,5-Dihydroisoxazol,
2,3-Dihydroisoxazol, Thiazol, Isothiazol, Imidazol, Imidazolidin,
Pyrazol, 4,5-Dihydropyrazol,
Pyrazolidin, Triazol, Pyran, Pyran-2-on, 3,4-Dihydro-2H-pyran, Tetrahydropyran,
4H-Pyran, Pyran-4-on,
Pyridin, Pyridon, Piperidin, Phosphabenzol, 1,4-Dioxin, 1,4-Dithiin, 1,4-Oxathiin, Oxazin,
1,3-Oxazinon, Morpholin, 1,3-Dioxan, 1,3-Dithian, Pyridazin, Pyrimidin,
Pyrazin, Piperazin, 1,2,4-Triazin, 1,3,5-Triazin, 1,3,5-Triazacyclohexan-2,4,6-trion
gebildet wird;
G eine Brücke
zwischen A und Z ist, G' eine
Brücke
zwischen NH und Z ist und G'' eine Brücke zwischen
E und Z ist, die gleich oder verschieden sind, nicht notwendigerweise
vorliegen und aus einer bis zehn Gruppierungen gebildet werden,
wobei jede Gruppierung ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Phenylen, 1–12 Kohlenstoffatome enthaltendes
Alkylen, Ethindiyl (-C≡C-),
Ether (-O-), Thioether (-S-), Amid (-CO-NH- und -NH-CO- und -CO-NR'- und – NR'-CO-), Carbonyl (-CO-),
Ester (-COO- und -OOC-), Disulfid (-S-S-), Diaza (-N=N-) und tertiärem Amin
(- N(R'')-), worin R'' ein Alkyl darstellt, das weniger als
5 Kohlenstoffatome enthält;
R' für -COOR''' steht,
worin R''' ein Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,
Phenyl oder Benzyl ist, wobei das Phenyl oder Benzyl substituiert
oder unsubstituiert sein kann;
zur Markierung eines biospezifischen
Reaktanten unter Verwendung der Festphasensynthese.
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Unter noch einem anderen Gesichtspunkt
betrifft diese Erfindung ein neuartiges Verfahren zur Markierung
eines biospezifischen Bindungsreaktanten mit einer exakten, vorbestimmten
Anzahl an Markierungsreaktanten der Formel (I) in einer Festphasensynthese,
wobei das Verfahren die Stufen
- a) des Umsetzens
eines Markierungsreaktanten der Formel (I)
worin
A eine zweiwertige
aromatische Struktur ist, die fähig
ist, Licht oder Energie zu absorbieren und die Anregungsenergie
auf ein Lanthanidion zu übertragen,
nachdem das durch die Festphasensynthese hergestellte Produkt vom
verwendeten festen Träger
freigesetzt, von Schutzgruppen befreit und in ein Lanthanidchelat überführt worden
ist;
R für
-Z(G'-NH-X)G''-E steht, worin
X eine transiente
Schutzgruppe ist, wobei diese Gruppe z. B. 2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethoxycarbonyl,
Trityl, 4-Methoxytrityl, 4,4'-Dimethoxytrityl,
tert.-Butoxycarbonyl, Fluorenylmethyloxycarbonyl ist;
E eine
Carbonsäure,
ihr Salz, aktiver Ester oder Halogenid ist, worin dieser Ester z.
B. ein N-Hydroxysuccinimido, o-, p- oder m-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol
oder Pentafluorophenol ist, und das Halogenid Fluorid, Bromid oder
Chlorid ist;
Z der Brückenpunkt
ist und aus oder substituierten oder
unsubstituierten dreiwertigen Derivaten von Cyclohexan, Cyclohexen,
Cyclohexadien, Benzol, Cyclopentan, Cyclopenten, Cyclopentadien,
Cyclobutan, Cyclobuten, Cyclobutadien, Aziridin, Diaziridin, Oxetan,
Thietan, Azet, Azetidin, 1,2-Dihydro-1,2-diazet, 1,2-Diazetidin, Furan,
Tetrahydrofuran, Thiophen, 2,5-Dihydrothiophen,
Thiolan, Selenophen, Pyrrol, Pyrrolidin, Phosphol, 1,3-Dioxolan,
1,2-Dithiol, 1,2-Thiolan, 1,3-Dithiol,
1,3-Dithiolan, Oxazol, 4,5-Dihydrooxazol, Isoxazol, 4,5-Dihydroisoxazol,
2,3-Dihydroisoxazol, Thiazol, Isothiazol, Imidazol, Imidazolidin,
Pyrazol, 4,5- Dihydropyrazol,
Pyrazolidin, Triazol, Pyran, Pyran-2-on, 3,4-Dihydro-2H-pyran, Tetrahydropyran,
4H-Pyran, Pyran-4-on,
Pyridin, Pyridon, Piperidin, Phosphabenzol, 1,4-Dioxin, 1,4-Dithiin, 1,4-Oxathiin, Oxazin,
1,3-Oxazinon, Morpholin, 1,3-Dioxan, 1,3-Dithian, Pyridazin, Pyrimidin,
Pyrazin, Piperazin, 1,2,4-Triazin, 1,3,5-Triazin, 1,3,5-Triazacyclohexan-2,4,6-trion
gebildet wird;
G eine Brücke
zwischen A und Z ist, G' eine
Brücke
zwischen NH und Z ist und G'' eine Brücke zwischen E
und Z ist, die gleich oder verschieden sind, nicht notwendigerweise
vorliegen und aus einer bis zehn Gruppierungen gebildet werden,
wobei jede Gruppierung ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Phenylen, 1–12 Kohlenstoffatome enthaltendes
Alkylen, Ethindiyl (-C≡C-),
Ether (-O-), Thioether (-S-), Amid (-CO-NH- und -NH-CO- und -CO-NR'- und – NR'-CO-), Carbonyl (-CO-),
Ester (-COO- und -OOC-), Disulfid (-S-S-), Diaza (-N=N-) und tertiärem Amin
(- N(R'')-), worin R'' ein Alkyl darstellt, das weniger als
5 Kohlenstoffatome enthält;
R' für -COOR''' steht,
worin R''' ein Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,
Phenyl oder Benzyl ist, wobei das Phenyl oder Benzyl substituiert
oder unsubstituiert sein kann,
mit einer funktionellen Gruppe,
die an eine feste Phase gebunden ist, wobei diese funktionelle Gruppe
wahlweise
- i) eine von Schutzgruppen befreite funktionelle Gruppe des Markierungsreaktanten
der Formel (I) ist, der an diese feste Phase gebunden ist, oder
- ii) der biospezifische Bindungsreaktant ist, der an diese feste
Phase gebunden ist,
- b) des Entfernens der transienten Schutzgruppe X und gegebenenfalls
anderer transienter Schutzgruppen, die an die feste Phase gebunden
sind,
- c) des Umsetzens des Markierungsreaktanten der Formel (I) zu
der in Stufe b) von Schutzgruppen befreiten funktionellen Gruppe
des Markierungsreaktanten der Formel (I), der in Stufe a) an die
feste Phase gebunden wurde,
- d) gegebenenfalls der Wiederholung der Stufen b) bis c) so oft
es notwendig ist um die exakte, vorbestimmte Anzahl an Markierungsreaktanten
der Formel (I), die an die feste Phase gebunden sind, zu erhalten,
- e) des Abspaltens des nach der letzten Stufe c) erhaltenen Produkts
von der festen Phase, des Umwandelns von R' in -COOH, des Entfernens der Gruppe
oder der Gruppen, die das Produkt an die feste Phase gebunden haben,
und des Entfernens möglicher
Schutzgruppen sowie
- f) des Umwandelns des Produkts aus Schritt e) in ein Lanthanidchelat
umfasst.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
ein Umkehrphasen-HPLC-Chromatogramm des Oligopeptid-Konjugats R-E-S-Q-N-Y-P-I-V-X1-CONH2 nach Entschützen (rohes
Reaktionsgemisch). X1 ist das entschützte Markierungsreagens
5, das an den COOH-Terminus des Oligopeptids gebunden ist, und
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2 zeigt
ein Elektronenspray-Massenspektrum des Oligopeptid-Konjugats (Hauptpeak
des in 1 gezeigten HPLC-Profils).
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die neuartigen Markierungsreaktanten
und neuartigen Markierungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
sind besonders geeignet zur Markierung kleiner Moleküle. Die
kleinen Moleküle
sind biospezifische Bindungsreaktanten, die Antigene, Haptene, Peptide,
Rezeptorliganden, Wirkstoffe oder PNA-Oligomere enthalten, aber
nicht darauf beschränkt
sind, die in auf einer spezifischen Bioaffinität basierenden Bindungsassays,
wie Immunoassays, DNA-Hybridisierungsassays, Rezeptorbindungsassays,
immunocytochemischen oder immunohistochemischen Assays, die fluorometrische
oder zeitaufgelöste
fluorometrische Bestimmung der spezifischen Lumineszenz verwenden,
verwendet werden.
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Besonders bevorzugte transiente Schutzgruppen
X sind 2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethoxycarbonyl,
Trityl, 4-Methoxytrityl, 4,4'-Dimethoxytrityl,
Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) oder tert.-Butoxycarbonyl (Boc).
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Der Substituent R''' ist vorzugsweise
Methyl, Ethyl oder tert.-Butyl.
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Der Ausdruck "zweiwertig" in der Definition von A soll eine chemische
Gruppe bedeuten, die an zwei benachbarte Atome gebunden ist.
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Die zweiwertige aromatische Struktur
A ist vorzugsweise ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus den in Schema 1 beschriebenen Strukturen.
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Am meisten bevorzugt ist der Markierungsreaktant
entweder 6-{N-{4-{2'''-{2''',6'''-Bis{N,N-bis-[(tert.-butoxycarbonyl)methyl]aminomethyl}-4'''-pyridyl}ethinyl}phenoxymethylcarbonyl}amino}-2-[N-(fluorenylmethyloxycarbonyl)-amino]hexansäure (5); 6-{N-{4'-{2''-{1''',3'''-Bis[(tert.-butoxycarbonyl)methyl]aminometh-5''''-yl-2''''- pyridyl}-1H-pyrazol-4''''-yl}ethyl}phenoxymethylcarbonyl}-amino-2-[N-(fluorenylmethyloxycarbonyl)amino]hexansäure (10)
oder Tetra(tert.-butyl) {2,2',2'',2'''-[[4-[4-[N-(carboxymethyl)-N-[2-(4-methoxytritylamino)ethyl]aminocarbonylmethoxy]phenylethinyl]pyridin-2,6-diyl)bis(methylennitrilo)tetrakis(acetat)}
(13).
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist das Lanthanidchelat ein Europium(III)-, Terbium(III)-,
Samarium(III)- oder Dysprosium(III)chelat.
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Das Markieren des biospezifischen
Bindungsreaktanten wird unter Verwendung von Festphasensyntheseverfahren
durchgeführt.
Es erschien wünschenswert,
geeignete geschützte
Monomere herzustellen, die in die biospezifischen Reaktanten während der
Festphasensynthese eingebaut werden konnten. Die erfindungsgemäßen Markierungsreaktanten
bilden einen Lumineszenz-markierten biospezifischen Bindungsreaktanten
nach Freisetzen des Produkts vom festen Träger, Entschützen und Zugabe eines geeigneten
Lanthanidions. Die erfindungsgemäße Markierungstechnik
besitzt viele Vorteile gegenüber
herkömmlicher
Markierung in flüssiger
Phase, wie hohe Ausbeuten einfach gereinigter Produkte, einfache
Routineautomatisierung unter Erzielung einer verbesserten Unempfindlichkeit;
Scale-up und Wiederholbarkeit der Synthese und des Markierens biospezifischer
Bindungsreaktanten mit einer exakten Anzahl stabiler, lumineszierender
Lanthanchelate ist möglich.
Obwohl viele der Vorteile eine Festphasenmarkierung betreffen, können die
erfindungsgemäßen Verbindungen
auch bei Markierung in flüssiger
Phase verwendet werden.
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Die Markierungsreaktanten und Verfahren
dieser Erfindung kombinieren mehrere wichtige Merkmale, wie:
- – eine
aromatische Struktur, die dazu in der Lage ist, Licht oder Energie
zu absorbieren und die Anregungsenergie auf ein Lanthanidion zu übertragen,
nachdem das durch die Festphasensynthese hergestellte Produkt vom
verwendeten festen Träger
freigesetzt, entschützt
und in ein Lanthanidchelat überführt worden
ist,
- – eine
funktionelle Gruppe oder Gruppen, die ein effizientes Kuppeln der
Verbindung des biospezifischen Bindungsreaktanten ohne Zerstörung seiner
Bindungseigenschaften und Verringerung der Lumineszenzeigenschaften
des endgültigen,
markierten, biospezifischen Bindungsreaktanten gestatten,
- – andere
funktionelle Gruppen werden geeigneterweise gegen die in der Festphasensynthese
verwendeten Bedingungen und Reaktanten geschützt, und es ist einfach, die
funktionellen Gruppen während
der Festphasensynthese und/oder nachdem das Produkt vom festen Träger freigesetzt
worden ist, zu entschützen (bzw.
von Schutzgruppen zu befreien).
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Es ist jedoch wirklich nicht notwendig,
dass der endgültige
biospezifische Bindungsreaktant bereits an die feste Phase gebunden
ist, wenn der Markierungsreaktant an die funktionelle Gruppe auf
der festen Phase angebracht wird. Der endgültige biospezifische Reaktant
kann an der festen Phase nach der Ankupplung des Markierungsreaktanten
synthetisiert werden, oder alternativ dazu kann das Produkt, das
den Markierungsreaktanten und gegebenenfalls auch Spacermoleküle umfasst,
an der festen Phase aufgebaut und dann davon abgespalten werden,
wonach das abgespaltene Produkt letztlich in Lösung mit dem biospezifischen
Bindungsreaktanten umgesetzt wird, bevor oder nachdem es in ein
Lanthanidchelat umgewandelt worden ist.
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Nach einem Ausführungsbeispiel wird ein Spacermolekül mit einer
transienten Schutzgruppe mit einer funktionellen Gruppe auf der
festen Phase umgesetzt und die transiente Schutzgruppe wird vor
einer Einführung
des Markierungsreaktanten auf die feste Phase entfernt. Als Beispiel
eines derartigen Spacermoleküls kann
6-Aminohexansäure,
die die Aminogruppe mit einer transienten Schutzgruppe, z. B. eine
Gruppe X, wie zuvor erwähnt,
geschützt
hat, angeführt
werden.
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Der Markierungsreaktant kann in Biomoleküle mit Hilfe
eines Peptidsyntheseautomaten (Peptidsynthesizer) eingeführt werden.
Das Reagens wird an einen Amin-gebundenen festen Träger oder
eine immobilisierte Aminosäure,
beispielsweise durch Carbodiimidchemie, die in Jones, J., The Chemical
Synthesis of Peptides, Oxford University Press, Oxford, 1994, beschrieben
ist, gekoppelt (d. h., die Carbonsäurefunktion des Markierungsreagens
reagiert mit der Aminogruppe des festen Trägers oder der Aminosäure in Anwesenheit eines
Aktivators). Wenn der Kondensationsschritt abgeschlossen ist, wird
die transiente Aminoschutzgruppe des Markierungsreagens selektiv
entfernt, während
das Material immer noch am festen Träger gebunden ist (d. h., mit
Piperidin im Fall der Fmoc-Schutzgruppe). Das zweite Ankoppeln eines
Markierungsreagens oder eines anderen Reagens (Aminosäure, Hapten)
wird wie oben durchgeführt.
Wenn die Synthese des gewünschten
Moleküls
abgeschlossen ist, wird das Material vom festen Träger abgelöst und entschützt. Die
Reinigung kann durch HPLC-Techniken durchgeführt werden. Letztlich wird
der gereinigte Ligand in das entsprechende Lanthanid(III)-chelat
durch Zugabe einer bekannten Menge eines Lanthanid(III)-ions überführt (Mukkala,
V. -M, et al., Helv. Chim. Acta 1993, 76, 1361, und M. Kwiatkowski,
M. Samiotaki, U. Lamminmäki,
V. -M. Mukkala und U. Landegren, Nucleic Acid Res., 1994, Band 22,
2604– 2611).
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Die Erfindung wird durch die folgenden
Beispiele weiter erläutert.
Die im experimentellen Teil verwendeten Strukturen und Synthesewege
sind in den Schemata 2 bis 5 abge bildet. Schema 2 veranschaulicht
das Syntheseverfahren zur Herstellung des Markierungsreagens 5.
Die experimentellen Details sind in den Beispielen 1 bis 4 angegeben.
Schema 3 zeigt Syntheseverfahren zur Herstellung des Markierungsreagens
10. Die experimentellen Details sind in den Beispielen 5 bis 8 angegeben.
Schema 4 veranschaulicht Syntheseverfahren zur Herstellung des Markierungsreagens
13. Die experimentellen Details sind in den Beispielen 9 bis 11
angegeben. Die Einführung
des Markierungsreagens 5 in eine Oligopeptidstruktur unter Verwendung maschinell
gestützter
Festphasenchemie ist in Beispiel 12 beschrieben. Ein Festphasenverfahren
zur Herstellung eines Östradiolkonjugats,
das an vier Markierungsreagentien 5 angebunden ist, ist in Schema
5 dargestellt. Um die Kopplungswirksamkeit zu erhöhen, ist
ein aliphatisches Spacermolekül
(6-Aminohexansäure) zwischen
die Markierungsreagentien eingeführt
worden. Die experimentellen Details sind in Beispiel 13 angegeben.
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EXPERIMENTELLE
VERFAHREN
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Adsorptionssäulenchromatographie wurde an
Säulen,
die mit Kieselgel 60 (Merck) gefüllt
waren, durchgeführt.
Analytische DSC wurde auf Silicagel 60-F254-Platten
(Merck) unter Verwendung der folgenden Lösungsmittelsysteme durchgeführt. System
A: Petrolether/Ethylacetat 5/2 (V/V); System B: CHCl3/MeOH
8/2 (V/V); NMR-Spektren wurden auf einem Gerät des Typs Jeol LA-400 bei
399,8 MHz für 1H bzw. 105,0 MHz für 13C
aufgenommen. TMS wurde als interner Standard verwendet. Kopplungskonstanten
sind in Hertz angegeben. IR-Spektren wurden auf einem Perkin Elmer
2400-Spektrophotometer
aufgenommen.
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Beispiel 1
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Synthese von Methyl-(4-ethinylphenoxy)acetat
(2)
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Eine Lösung von Methyl-(4-trimethylsilylethinylphenoxy)-acetat (20,00 g,
76 mmol) in Dichlormethan (400 ml) wurde mit Argon entlüftet. Tetrabutylammoniumfluorid
(24,40 g, 91 mmol) wurden zugegeben und das Gemisch wurde 30 Minuten
lang bei Raumtemperatur gerührt.
Die Lösung
wurde mit 10%iger wässriger
Zitronensäure
(200 ml) und Wasser (5× 400
ml) gewaschen, über
Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde in Diethylether
gelöst
und durch eine mit Kieselgel gefüllte
Säule geführt. Verdampfen
des Diethylethers ergab die Titelverbindung als Feststoff (12,63
g, 83%), der chromatographisch und spektroskopisch mit vorher synthetisiertem
Material identisch war (Takalo, H., Hemmilä, I., Sutela, T. und Latva,
M., 1996, Helv. Chim. Acta, 79, 789). Rf (A)
0,50.
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Beispiel 2
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Synthese von Tetra(tert.-butyl)-2,2',2'',2'''-{{4-[4'-(methoxycarbonylmethoxy)phenylethinyl]pyridin-2,6-diyl}-bis(methylennitrilo)}tetrakis(acetat)
(3)
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Ein Gemisch von Tetra(tert.-butyl)-2,2',2'',2'''-[(4-brompyridin-2,6-diyl)bis(methylennitrilo)]tetrakis(acetat)
(1) (2,32 g, 3,4 mmol), Bis(triphenylphosphin)palladium(II)chlorid
(0,050 g, 70 mmol) und CuI (0,027 g, 140 mmol) in trockenem THF
(10 ml) und trockenem Triethylamin (10 ml) wurden mit Argon entlüftet. Verbindung (2)
(0,79 g, 4,1 mmol) wurde zugegeben und das Gemisch wurde 7 Stunden
lang bei 50°C
gerührt.
Die gekühlte
Lösung
wurde filtriert, das Filtrat eingedampft und in Chloroform (150
ml) wieder aufgelöst.
Die Lösung
wurde mit Wasser (3× 150
ml) gewaschen, getrocknet und eingedampft. Reinigung an Kieselgel
(System A) führte zur
Titelverbindung in Form eines Öls
(2,01 g, 75%). Rf (A) 0,40. IR (Film): 2212
(C≡C);
1750 (C=O); 1730 (C=O). 1H-NMR (CDCl3): δ 1,47
(36H, s); 3,50 (8H, s); 3,83 (3H, s); 4,02 (4H, s); 4,67 (2H, s);
6,90 (2H, d, J 9,0); 7,46 (2H, d, J 9,0); 7,60 (2H, s). 13C-NMR (CDCl3): δ 28, 19;
52, 36; 55, 86; 59, 73; 65, 18; 81, 25; 86, 96; 92,89; 114,74; 115,90;
122,66; 132,68; 132,69; 133,44; 158,19; 168,98; 171,11.
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Beispiel 3
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Synthese von 4-{2''',6'''-Bis{N,N-bis[(tert.-butoxycarbonyl)methyl]aminomethyl}-4'''-pyridyl}ethinyl}phenoxymethylessigsäure (4)
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Verbindung (3) (1,98 g, 2,5 mmol)
wurden in 0,25 M KOH (25 ml, 98% EtOH, 2% Wasser) gelöst und das
Gemisch wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Die
Reaktion wurde durch Zugabe von l0%iger wässriger Zitronensäure (100
ml) gequencht. Die resultierende Suspension wurde mit Chloroform
(100 ml) gequencht. Die organische Schicht wurde mit Zitronensäure (2× 100 ml)
und Wasser (2× 100
ml) gewaschen. Eindampfen bis zur Trockne ergab die Titelverbindung
in Form eines Feststoffs (87%). Rf (B) 0,4.
IR (Film): 2209 (C≡C). 1H-NMR (DMSO-d6): δ 1,41 (36H,
s); 3,48 (8H, s); 3,89 (4H, s); 4,76 (2H, s); 6,99 (2H, d, J 8,8);
7,52 (2H, d, J 8,8); 7,52 (2H, s).
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Beispiel 4
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Synthese von 6-{N-{4-{2''-{2''',6'''-Bis{N,N-bis[(tert.-butoxycarbonyl)methyl]aminomethyl}-4'''-pyridyl}ethinyl}-phenoxymethylcarbonyl}amino}-2-[N-(fluorenylmethyloxycarbonyl)amino]hexansäure (5).
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Verbindung 4 (0,75 g, 0,98 mmol)
und N-Hydroxysuccinimid (HO-Su) (0,13 g, 1,1 mmol) wurden in trockenem
Dioxan (30 ml) gelöst.
In trockenem Dioxan (5 ml) vorgelöstes DCC (0,23 g, 1,1 mmol)
wurde zugegeben und das Gemisch wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur
gerührt
und auf eine Lösung
eines Fmoc-Lysin-Hydrochlorids (0,88 g, 2,2 mmol) in einem Gemisch
von trockenem DMF (15 ml) und Pyridin (5 ml) filtriert. Nach 4 Stunden
wurde Ethanol-freies Chloroform (150 ml) zugegeben, und die Lösung wurde
mit 10%iger wässriger
Zitronensäure
(3× 50
ml) und Wasser (50 ml) gewaschen, getrocknet (Molekularsieb 4A) und
eingeengt. Reinigung an Silicagel (System B) führte zur Titelverbindung in
Form eines Feststoffs (56%). IR (Film): 3315 (OH); 2210 (C≡C); 1681
(C=O). 1H-NMR (DMSO-d6): δ 1,23 (2H,
m); 1,40 (36H, s); 3,10 (2H, m); 3,30 (4H, m); 3,42 (8H, s); 3,89
(4H, s); 3,73 (1H, m), 4,24 (5H, m); 4,51 (2H, m); 7,01 (2H, d,
J 8,8); 7,32 (2H, t, J 7,2); 7,40 (2H, t, J 7,2); 7,51 (2H, s);
7,52 (2H, d, J 8,8); 7,69 (2H, d, J 7,5); 7,88 (2H, d, J 7,5); 8,17 (1H,
t, J 6,3); 8,32 (1H, s).
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Beispiel 5
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Synthese von Tetra(tert.-butyl)-2,2',2'',2'''-{{6,6'-[4'-(methoxycarbonylmethoxy)phenylethinyl]-1H-pyrazol-1'',3''-diyl}bis(pyridin)-2,2'-diyl}bis(methylennitrilo)}tetrakis(acetat)
(7)
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Ein Gemisch von Verbindung 6 (2,14
g, 2,5 mmol), Bis(triphenylphosphin)palladium(II)chlorid (35 mg, 50
mmol) und CuI (19 mg, 0,1 mmol) in trockenem DMF (12,5 ml), das
trockenes Triethylamin (10 ml) enthielt, wurden mit Argon entlüftet. Das
Gemisch wurde über
Nacht bei 35°C
gerührt.
Die Lösung
wurde filtriert und eingeengt. Der Rückstand wurde in Chloroform
(100 ml) aufgenommen, mit Wasser (3× 100 ml) gewaschen, getrocknet
und eingeengt. Die Reinigung wurde auf einer Kieselgelsäule (System
A) durchgeführt.
Die Ausbeute betrug 1,12 g (45%). Rf (A)
0,2. IR (Film): 1737 (C=O); 1143 (C-O, C=O). 1H-NMR
(DMSO-d6): δ 1,38 (18H, s); 1,42 (18H, s);
3,49 (4H, s); 3,52 (4H, s); 3,72 (3H, s); 4,00 (2H, s); 4,08 (2H,
s); 4,86 (2H, s); 6,98 (2H, d, J 8,9); 7,95 (1H, t, J 7,8); 8,01
(1H, d, J 7, 1); 8, 88 (1H, s).
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Beispiel 6
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Synthese von Tetra(tert.-butyl)-2,2',2'',2'''-{{6,6'-{2-[4'-(methoxycarbonylmethoxy)phenyl]ethyl}-1H-pyrazol-1'',3''-diyl}bis(pyridin)-2,2'-diyl}bis(methylennitrilo)}-tetrakis(acetat)
(8).
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Verbindung 7 (0,82 g, 0,88 mmol)
wurden in trockenem Methanol (60 ml) gelöst. Pd/C (0,16 g; 10%) wurden
zugegeben und das Gemisch wurde 4 Stunden lang unter einer Wasserstoffatmosphäre gerührt. Die Lösung wurde
durch Celite filtriert und eingedampft. Die Ausbeute betrug 0,57
g (70%). Rf (A) 0,3. IR (Film): 1738 (C=O);
1143 (C-O). 1H-NMR (DMSO-d6): δ 1,37 (18H,
s); 1,41 (18H, s); 2,88 (2H, d, J 8,4); 3,18 (2H, d, J 8,4); 3,48
(4H, s); 3,49 (4H, s); 3,68 (3H, s); 3,98 (2H, s); 4,04 (2H, s);
4,73 (2H, s); 6,82 (2H, d, J 8,4); 7,18 (2H, d, J 8,4); 7,47 (1H,
d, J 7,6); 7,55 (1H, d, J 7,6); 7,87 (1H, d, J 7,8), 7,88 (1H, t,
J 7,6); 7,96 (1H, t, J 7,8); 7,98 (1H, t, J 7,6), 8,44 (1H, s).
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Beispiel 7
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Synthese von {4'-{2''-{1''',3'''-Bis[(tert.-butoxycarbonyl)methyl]aminometh-5''''-yl-2''''-pyridyl}-1H-pyrazol-4'''-yl}ethylphenoxy}essigsäure (9).
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Die Titelverbindung (9) wurde, wie
oben für
4 in Beispiel 2 beschrieben, unter Verwendung von Verbindung 8 (0,57
g, 0,62 mmol) als Ausgangsmaterial synthetisiert. Reinigung wurde
an Silicagel (Petrolether/Ethylacetat 5/2 → MeOH/CHCl3 2/8)
durchgeführt.
Die Ausbeute betrug 100%. Rf (B) 0,95. 1H-NMR (DMSO-d6): δ 1,37 (18H,
s); 1,41 (18H, s); 2,84 (2H, d, J 8,4); 3,15 (2H, d, J 8,4); 3,47
(4H, s); 3,48 (4H, s); 3,98 (2H, s); 4,03 (2H, s); 4,17 (2H, s);
6,74 (2H, d, J 8,4); 7,11 (2H, d, J 8,4); 7,46 (1H, d, J 7,8); 7,55
(1H, d, J 6,9); 7,87 (1H, d, J 7,8); 7,88 (1H, t, J 7, 9); 7,95
(1H, d, J 6,9); 7,98 (1H, t, J 7,8); 8,44 (1H, s).
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Beispiel 8
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Synthese von 6-{N-{4'-{2''-{1''',3'''-Bis[(tert.-butoxycarbonyl)methyl]aminometh-5''''-yl-2''''-pyridyl}-1H-pyrazol-4'''-yl}ethyl}phenoxymethylcarbonyl}amino-2-[N-(fluorenylmethyloxycarbonyl)amino]hexansäure (10).
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Die Titelverbindung (10) wurde, wie
in Beispiel 4 für
5 beschrieben, unter Verwendung von 9 als Ausgangsmaterial hergestellt. 1H-NMR (DMSO-d6): δ 1,05 (1H,
m); 1,20 (2H, m); 1,36 (18H, s); 1,40 (18H, s); 1,60 (2H, s); 1,71
(2H, m); 2,86 (2H, t, J 7,9); 3,10 (2H, m); 3,18 (2H, m); 3,30 (4H,
s); 3,38 (4H, s); 3,80 (1H, m); 3,97 (2H, s); 4,03 (2H, s); 4,23
(4H, m); 4,39 (2H, s); 6,85 (2H, d, J 8,6); 7,17 (2H, d, J 8,6);
7,31 (2H, 7, J 7,4); 7,40 (2H, t, J 7,4); 7,47 (1H, d, J 7,7); 7,55
(1H, d, J 7,7); 7,70 (2H, d, J 7,3); 7,88 (1H, d, J 7,6); 7,99 (1H,
d, J 7,8); 8,44 (1H, s).
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Beispiel 9
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Synthese von Methyl-N-[2-{4-Methoxytrityl)amino}ethyl]-glycinat (11).
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N-[4-Methoxytrityl]-1,2-diaminoethan
(4,69 g, 14,2 mmol) wurden in trockenem THF (20 ml) gelöst. Trockenes
TEA (2 ml) und Methylbromacetat (1,58 ml, 14,2 mmol) wurden zugegeben
und das Gemisch wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt, wonach
der gebildete Niederschlag abfiltriert wurde. Nach dem Einengen
wurde das Filtrat in Ethylacetat gelöst, mit gesättigter Na2SO4-Lösung
und Wasser gewaschen und getrocknet. Reinigung an Silicagel (Eluent
PE : EA : TEA 5 : 1 : 1) ergab die Titelverbindung in Form eines Öls. 1H-NMR (CDCl3): δ 1,93 (1H,
br); 2,26 (2H, t, J 5,6); 2,72 (2H, t, J 5,6); 3,34 (2H, s); 3,69
(3H, s); 3,74 (3H, s); 6,80 (2H, d, J 8,8); 7,14 (2H, t); 7,24 (4H,
t); 7,36 (2H, d); 7,46 (4H, t).
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Beispiel 10
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Synthese von Tetra(tert.-butyl)-{2,2',2'',2'''-[[4-[4-[N-(methoxycarbonylmethyl)-N-[2-(4-methoxytritylamino)ethyl]-aminocarbonylmethoxy]phenylethinyl]pyridin-2,6-diyl]bis(methylennitrilo)tetrakis(acetat)}
(12).
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Verbindung 4 (0,5 g, 0,65 mmol),
Verbindung 11 (0,26 g, 0, 65 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (115 mg,
1, 0 mmol) wurden in trockenem Acetonitril gelöst. DCC (134 mg, 0,65 mmol;
in trockenem Acetonitril vorgelöst)
wurden zugegeben und das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur
gerührt.
Gebildetes DCU wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt.
Reinigung an Silicagel führte
zu 12. 1H-NMR (CDCl3): δ 1,41 (36H,
s); 2,27 (2H, m); 2,61 (2H, m); 3,38 (2H, s); 3,47 (8H, s); 3,68
(3H, s); 3,76 (3H, s); 4,00 (4H, s); 6,77 (2H, d, J 8,8); 6,89 (2H,
d, J 8,8); 7,41– 7,14
(14H, m); 7,51 (2H, s).
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Beispiel 11
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Synthese von Tetra(tert.-butyl)-{2,2',2'',2'''-[[4-[4-[N-(carboxymethyl)-N-[2-(4-methoxytritylamino)ethyl]aminocarbonylmethoxy]phenylethinyl]pyridin-2,6-diyl]bis(methylennitrilo)tetrakis(acetat)}
(13).
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Verbindung 12 wurde hydrolysiert
und wie in Beispiel 3 beschrieben gereinigt. Die Ausbeute betrug 65%. 1H-NMR (CDCl3): δ 1,39 (36H,
s); 2,26 (2H, m); 2,61 (2H, m); 3,38 (2H, s); 3,47 (8H, s); 3,70
(3H, s); 3,78 (3H, s); 4,00 (4H, s); 6,77 (2H, d, J 8,8); 6,89 (2H,
d, J 8,8); 7,42– 7,17
(14H, m); 7,54 (2H, s).
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Beispiel 12
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Einführung des Markierungsreagens
in Oligopeptide
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Um die Anwendbarkeit der hergestellten
Liganden bei der Markierung von Oligopeptiden zu zeigen, wurde eine
Sequenz R-E-S-Q-N-Y-P-I-V-X1-CONH2 auf einem Perkin Elmer 433A-Peptidsyntheseautomat
(5 mmol-Maßstab)
unter Verwendung von Standard-Fmoc-Chemie synthetisiert. Der Ligand
5 wurde im ersten Kopplungsschritt unter Verwendung einer verlängerten
Kopplungszeit (1 h anstelle von 30 min.) eingeführt. Als die Kettenbildung
vollständig
war, wurde das Oligopeptid entschützt und durch HPLC gereinigt.
Ein typisches HPLC-Chromatogramm (ein rohes Reaktionsgemisch) ist
in 1 gezeigt. Das Produkt
wurde durch Elektronenspray-Massenspektrometrie (2) bestätigt. Letztlich wurde das gereinigte
Material in das entsprechende Europium(III)chelat unter Verwendung
der Standardvorschrift überführt.
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Beispiel 13
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Markierung von Östradiol
mit vier Europium(III)chelaten
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Das Markierungsreagens 5 wurde, wie
in Beispiel 12 beschrieben, in einen Amino-derivatisierten festen
Träger
eingeführt.
Nach Entfernen der α-Fmoc-Schutzgruppe
wurde 6-Fmoc-Aminohexansäure
gekoppelt. Diese Zyklen wurden dreimal wiederholt und ein Östradiolderivat,
das an einem Carbonsäurelinker
gebunden war, wurde als letzter Kopplungsschritt eingeführt. Entschützen und
Reinigen wurden wie in Beispiel 12 beschrieben durchgeführt.
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Es ist offensichtlich, dass die erfindungsgemäßen Verfahren
in der Form einer Vielzahl von Ausführungsformen, von denen nur
wenige hierin beschrieben sind, einbezogen sein können. Die
beschriebenen Ausführungsformen
sind veranschaulichend und sollten nicht als einschränkend interpretiert
werden.
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