DE68919597T2 - Spektrofluorometrisches verfahren und für dieses verfahren wertvolle verbindungen. - Google Patents

Spektrofluorometrisches verfahren und für dieses verfahren wertvolle verbindungen.

Info

Publication number
DE68919597T2
DE68919597T2 DE68919597T DE68919597T DE68919597T2 DE 68919597 T2 DE68919597 T2 DE 68919597T2 DE 68919597 T DE68919597 T DE 68919597T DE 68919597 T DE68919597 T DE 68919597T DE 68919597 T2 DE68919597 T2 DE 68919597T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
group
bis
mmol
chelate
compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE68919597T
Other languages
English (en)
Other versions
DE68919597D1 (de
Inventor
Marek Kwiatkowski
Veli-Matti Mukkala
Christian Sund
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wallac Oy
Original Assignee
Wallac Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wallac Oy filed Critical Wallac Oy
Application granted granted Critical
Publication of DE68919597D1 publication Critical patent/DE68919597D1/de
Publication of DE68919597T2 publication Critical patent/DE68919597T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/26—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/06—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom containing only hydrogen and carbon atoms in addition to the ring nitrogen atom
    • C07D213/22—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom containing only hydrogen and carbon atoms in addition to the ring nitrogen atom containing two or more pyridine rings directly linked together, e.g. bipyridyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D239/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings
    • C07D239/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings
    • C07D239/24—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D239/28—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazine or hydrogenated 1,3-diazine rings not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D239/30—Halogen atoms or nitro radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
    • C07F5/003—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table without C-Metal linkages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07F9/576—Six-membered rings
    • C07F9/58—Pyridine rings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)
  • Developing Agents For Electrophotography (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

    Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung stellt neue Verbindungen bereit, die entweder direkt als Sonden in spektrofluorometrischen Verfahren verwendet werden können, wobei ein, zwei oder mehrere fluoreszierende Sonden für die Detektion von Strukturen (Zielstrukturen), die durch die Sonden spezifisch markiert werden können, oder als Zwischenprodukte für die Synthese dieser Sonden verwendet werden können. Die Verbindungen können auch andere Anwendungen haben.
  • Zeitaufgelöste Fluorometrie ist eine Fluoreszenztechnik, bei der die Lebensdauer der Emission, die nach einer gepulsten Lichtanregung auftritt, bei einer bestimmten Wellenlänge verfolgt wird. Um in der Lage zu sein, die Vorteile der zeitaufgelösten Fluoreszenz nützen zu können, sollten die Marker Fluorophore mit einer deutlich längeren Fluoreszenz-Lebensdauer als der der Komponenten, die zu dem Hintergrundsignal führen, sein. Die Fluoreszenz-Halbwertszeit bestimmter Lanthaniden-Chelate, wie Europium, ist um 5 bis 6 Größenordnungen länger als die konventioneller Fluoreszenzmarker. Die Abklingzeit und Intensität der Lanthaniden- Fluoreszenz hängen sehr stark von der Struktur der Liganden, die das Metall chelatisieren und von seiner physikalischen Umgebung ab. Lanthaniden-Chelate haben bereits weitverbreitete Anwendung in einer Vielzahl biologischer Assays gefunden. Bei den bislang einzigen kommerziellen Methoden wird jedoch ein Zweistufen-Verfahren für die Entwicklung des Fluoreszenzsignals verwendet. Diese Methoden umfassen eine biospezifische Affinitätsreaktion eines mit Lanthaniden-Chelaten markierten Reaktanden, gefolgt von der Freisetzung des Metallions und Bildung eines neuen stark fluoreszierenden Chelats (Dakubu et al., Clin. Biochem., Anal. 14, 71-101 (1984) und Lövgren et al., in: Alternative Immunoassays, Hrsg.: Collins, W.P., John Wiley & Sons Ltd. (1985), 203-17). Dies kann durch die Schwierigkeiten erklärt werden, gute Absorptions- und Energietransfereigenschaften, starke Chelatisierungskapazität und die Fähigkeit starke kovalente Bindungen mit markierten Molekülen an denselben Liganden zu bilden, zu kombinieren.
  • Bei den meisten der zur Zeit existierenden immunologischen oder Hybridisierungsassays werden Reaktionen auf festen Trägern eingesetzt, aber für technische Zwecke ist es bevorzugt, die Fluoreszenz in homogenen Lösungen zu detektieren. Da die Fluoreszenzmarker somit in jedem Fall aus der festen Matrix freigesetzt werden müssen, konnte daher das vorstehend genannte Zweistufen-System ausgedehnte Anwendung finden. Fluoreszierende Lanthaniden-Chelate wurden als sehr vielversprechende Marker erkannt. Als Marker in Immunoassays verwendet, konnten sie mit einer Empfindlichkeit detektiert werden, die zumindest auf demselben Niveau liegt, wie es sich üblicherweise bei ¹²&sup5;I zeigt. Wenn dies auf geeignete Weise realisiert wird, könnte dies die Möglichkeit eröffnen, sie als Marker in Bereichen zu verwenden, in denen bislang traditionelle Fluoreszenzmarker verwendet wurden. Mögliche infrage kommende Anwendungsgebiete sind:
  • 1) Homogene fluorometrische Immunoassays
  • 2) Nucleinsäuresequenzierung
  • 3) Fluoreszenz-Mikroskopie
  • 4) Homogene Hybridisierungsassays für die Detektion von Nucleinsäuren
  • 5) Cytometrie
  • 6) Fingerprinting von Nucleinsäuren und Proteinen
  • Die bisher beschriebenen Fluoreszenz-Chelate, die aus chemisch unterschiedlichen Liganden zusammengesetzt sind, unterscheiden sich untereinander in vielen Aspekten, aber in den meisten Fällen ist ihre Fluoreszenz-Abklingzeit lang genug, um die Verwendung bei zeitaufgelösten Fluoreszenz- Assays zu erlauben. Während es gemeinhin anerkannt ist, daß eine hohe Stabilitätskonstante und intensive Fluoreszenz, d.h. hohe Quantenausbeute, bei einem Fluoreszenz-Chelat erwünscht sind, sind einige andere vieldiskutierte Eigenschaften immer noch Gegenstand der Diskussion. Eine davon ist die Abhängigkeit des emittierten Lichts von der Umgebung in der Nähe des Markers. Unseres Erachtens sollte dies nicht als negativer nicht vorhersagbarer Effekt gesehen werden, sondern als eine neue Eigenschaft, die es ermöglicht, Fluoreszenz-Chelate in neuen Bereichen zu verwenden, z.B. auf dem Gebiet unterschiedlicher Arten homogener Assays. Aus der Literatur wird es deutlich, daß sich die meisten Bemühungen auf die Entwicklung stärker fluoreszierender und stabilerer Chelate konzentriert haben. Wenn die Aspekte Anregung versus Emission bestimmter Chelate untersucht wurden, war der einzige Gegenstand des Interesses, ein Chelat mit einem Anregungsmaximum bei relativ langen Wellenlängen zu entwickeln, wobei gleichzeitig die für Seltenerdmetalle typische große Stokes-Verschiebung erhalten bleibt. Nach unseren Kenntnissen gibt es keine Berichte über systematische Studien, die auf die Entwicklung einer Gruppe von Chelaten abzielt, die wesentlich in ihren Fluoreszenzeigenschaften durch unterschiedliche Anregungs- oder Emissionsspektren differieren und trotzdem Derivate ein und desselben Metalls sind. Dies würde die Möglichkeit eröffnen, solche Chelate gleichzeitig als Mehrfachmarker in demselben Experiment zu verwenden, vorausgesetzt die Formen der Anregungsspektren würden nicht wesentlich miteinander überlappen. Die Mehrfachmarkierungstechnik unter Verwendung traditioneller organischer Fluoreszenzmarker ist eine gut etablierte Methode. Ein allgemein akzeptierter Nachteil ist die vergleichsweise große Geschwindigkeit des Abklingens der Fluoreszenz der verwendeten Marker, wodurch erhebliche Hintergrundprobleme erzeugt werden. Es wurde früher gezeigt, daß die Verwendung von Fluoreszenz-Chelaten bestimter Seltenerdmetalle mit langer Abklingzeit dieses Problem drastisch vermindern kann, einfach dadurch, daß sie die effektive Messung der Markerfluoreszenz erlaubt, nachdem das Hintergrundsignal abgeklungen ist. Wenn die Trennung der markierten Komponenten vor ihrer Bestimmung notwendig oder bevorzugt ist und die Mehrfachmarkierung aller Komponenten die Methode der Wahl ist, ist es für manche Versuche vorteilhaft, Marker mit einem minimalen Grad an Unterschiedlichkeit in den physiko-chemischen Eigenschaften zu verwenden. Beispielsweise war dieses Erfordernis- das nicht immer einfach zu erfüllen ist- die Hauptschwierigkeit beim Zugang zur Nucleinsäuresequenzierung ohne Isotope (Hood et al. 1986, Nature S. 674-679). Offensichtlich gibt es einen Bedarf für eine Familie von Fluoreszenzmarkern, die nicht wesentlich hinsichtlich ihrer chemischen Struktur differieren und trotzdem ein breites Spektrum von Anregungs- oder/und Emissions-Wellenlängen aufweisen. Ein weiterer oft nicht ausreichend betonter Aspekt des Problems ist die Abhängigkeit des emittierten Fluoreszenzlichts von der Art der funktionellen reaktiven Gruppe, die mit dem Fluorophor verbunden ist, um seine Kopplung an biologische Materialien zu erlauben. Es wurde früher gezeigt (EP-A-171 978), daß die Einführung einer Nitrogruppe in das seitliche Phenylringsystem in dem Europiumchelat von 4,7-Diphenyl-1,10- phenanthrolin-2,9-dicarbonsäure die Fluoreszenz um 60% vermindert. Die Reduktion dieser Nitrogruppe, was zur Einführung einer Aminogruppe, die ihre Elektronen über Bindungen vom π-Typ mit dem Rest des Chelats teilt, führt, wird von einer noch größeren Abnahme der Fluoreszenz begleitet - tatsächlich verbleiben nur 0,27% der Fluoreszenz der nichtsubstituierten Verbindung. Kürzlich wurde ein weiterer Typ fluoreszierender Chelate veröffentlicht (EP-A-195 413), bei dem substituiertes 4-Phenylpyridin als Chromophor verwendet wurde. Da die Überlegenheit dieser Verbindungen über alle anderen fluoreszierenden Chelate beansprucht wurde, und keine Fluoreszenzdaten angegeben waren, entschlossen wir uns, deren Wert in der Praxis zu überprüfen. Die Verbindungen mit den folgenden Strukturen wurden synthetisiert
  • und ihre Fluoreszenzeigenschaften wurden gemessen. Wieder fanden wir dieselbe Tendenz zu abnehmender Intensität des Fluoreszenzlichts, wenn die Grundstruktur (I) zu (II) und (III) umgewandelt wird. Insbesondere weist Verbindung (II) in der Form des Eu³&spplus;-Chelats 8% der Fluoreszenz von Verbindung (3) und Verbindung (III) nur 1,8% auf. Noch größere Unterschiede wurden für geeignete Tb³&spplus;-Chelate festgestellt. In diesem Fall zeigte die chelatisierte Verbindung (II) nur 0,006% Fluoreszenz im Vergleich zu der Fluoreszenz des Terbiumchelats von (I). Es ist daher klar, daß eine erfolgreich angewendete reaktive Gruppe immer, falls möglich, an einer solchen Position angebracht sein sollte, daß sie vom Chromophor in der Weise separiert ist, daß ihre elektronische Wechselwirkung mit dem Rest des Moleküls vernachlässigt werden kann- vorzugsweise durch eine aliphatische Kohlenstoffkette. Wenn dies korrekt durchgeführt wird, stellt es auch sicher, daß die Fluoreszenzeigenschaften, die bei den einfachen nichtreaktiven Chelaten (ohne jede zusätzliche reaktive Gruppe) beobachtet werden, im wesentlichen dieselben bleiben werden, falls eine solche reaktive Gruppe mit dem Chelat verbunden wird oder falls ein auf diese Weise funktionalisiertes Chelat mit biologischem Material verknüpft wird. Für einige aromatische Strukturen wurde vorgeschlagen, daß sie als lichtabsorbierende Einheiten- Chromophore- fungieren. Wie bereits erwähnt, sind Phenanthroline vorgeschlagen worden (EP-A-171 978). Phenanthroline als chromophorer Teil von Kryptaten wurden auch in FR-A-2 570 703 vorgestellt. Andere Chromophoreinheiten wurden ebenfalls vorgeschlagen, wie: funktionalisierte Pyridine (EP-A-195 413, EP-203 047), substituierte Phenole (EP- A-68 875), unsubstituierte Terpyridine (J. Am. Chem. Soc. 86 (23), 5117-5125, 1964), Indol- und Benzyl-EDTA (Photochemistry and Photobiology 39 (6), 763-769, 1984) und p-Aminosalicylsäure (Analyst 109, 1449-1450, 1984). Bipyridin selbst ist als exzellenter Chromophor, aber auch als sehr schlechter Chelatligand bekannt. Versuche wurden unternommen, ein oder mehrere Bipyridine in ein chelatisierendes Kryptatsystem (FR-A-2 570 703) sowie in andere Chelatsysteme (WO-A-87/04523) einzubauen.
  • In enger Verbindung mit der vorliegenden Erfindung steht die Beschreibung eines sauren Komplexons, das ein Bipyridinderivat ist, vgl. Chem. Berichte 118, 22-27, 1985. In dieser Veröffentlichung wird jedoch nur der einfachste Ligand der Bipyridinreihe beschrieben und kein fluoreszierendes Seltenerdmetall-Chelat. Zusätzlich wird in der Veröffentlichung auch keine Möglichkeit vorgeschlagen, solche Liganden an irgendein anderes Molekül zu knüpfen.
  • WO-A-86/02734 beschreibt Ru- und Os-Chelate, die ein oder mehrere unterschiedliche Chelatligandengruppierungen enthalten, vorzugsweise Bipyridine, denen chelatisierende Gruppen an ihren 2- und 6'-Positionen fehlen. In WO-A- 87/07 955 werden Methoden für den homogenen Immunoassay unter Verwendung von 2 Markern (einem Lanthaniden-Chelat und einem freien Chelatliganden) beschrieben, um eine einzelne Einheit in einer Probe zu detektieren. Es wird keine Mehrfachmarkierungsmethode für das individuelle Detektieren mehrerer Einheiten in einer Probe beschrieben. US-A-4 637 988 beschreibt allgemein Chelatliganden, die fluoreszierende Lanthaniden-Chelate ergeben, von denen einige ausreichende Stabilität haben könnten, um in wäßrigen Lösungen verwendet zu werden. US-A-4 719 182 bezieht sich darauf, daß die Fluoreszenzlöschung durch Wasser bei Lanthaniden- Chelaten (Z.B. Bipyridinchelate) verhindert wird. Es wird vorgeschlagen, die Chelate in Latexkugeln einzuarbeiten.
    • Beschreibung der Erfindung
  • Die erfindungsgemäßen Chelate haben die gemeinsame Struktur der Formel (IV) als Chelat mit Eu³&spplus;, Tb³&spplus;, Sm³&spplus; oder Dy³&spplus;.
    • Stammverbindung Substituent Formel IV
  • Es ist möglich, aus den erfindungsgemäßen Verbindungen mehrere Paare geeigneter Seltenerdmetall-Chelate auszuwählen, die hinsichtlich ihrer Anregungsspektren ausreichend differieren, so daß es möglich ist, einen von ihnen selektiv in Gegenwart des anderen anzuregen. Die meisten der beschriebenen Verbindungen zeigten eine relativ hohe Fluoreszenz, vergleichbar zu den fluoreszierenden Chelaten, die bereits beschrieben und in verschiedenen Anwendungen verwendet worden sind. Darüberhinaus unterscheiden sich alle beschriebenen Chelate, die Bipyridin-, Bipyrimidinderivate oder eng verwandte Systeme sind, hinsichtlich ihrer biophysikalischen Eigenschaften, wie Molekulargewicht, Hydrophobizität oder elektrophoretische Mobilität, sehr wenig, was von entscheidender Bedeutung ist, wenn sie bei Experimenten verwendet werden, bei denen Mehrfachmarkierung involviert ist.
  • Die Chelate der vorliegenden Verbindung können eine reaktive Funktion haben, ein Merkmal, das für ihre Ankopplung an eine Vielzahl biologisch aktiver Moleküle notwendig ist. Darüberhinaus ist diese reaktive Funktion mit dem Chelat auf eine solche Weise verbunden, daß die Fluoreszenz des Chelats weder in der aktiven Form vor der Kupplung noch nach seiner Kupplung an ein biologisches Molekül verändert wird. Wir erreichten dies, indem wir die reaktive Gruppe in den chelatisierenden Chromophorteil des Moleküls über eine aliphatische Kette, die die zwei Funktionen voneinander trennt oder über ein Linkersystem, bestehend aus sowohl aliphatischen wie aromatischen Teilen, eingeführt haben. Diese Lösung war die einzig akzeptable, wenn der elektronische Zustand der Pyridin- oder Bipyrimidineinheit hinsichtlich der sehr beachtlichen Veränderungen intakt gehalten werden soll, die durch Substituenten, die mit dem lichtabsorbierenden aromatischen System verknüpft sind, verursacht werden können. Die Eigenschaft, daß die Fluoreszenz von der Gegenwart der angeknüpften reaktiven Einheit unabhängig ist, hat noch einen zusätzlichen Vorteil, und zwar wird die Nützlichkeit eines gegebenen Chelats als Marker potentiell vorhersagbar ausschließlich auf der Basis der physiko-chemischen Eigenschaften seiner Grundstruktur (Chelat ohne eine funktionelle reaktive Gruppe):
  • In Formel (IV) ist n die ganze Zahl 1 oder 2, vorzugsweise 1 und--- gibt an, daß die Gruppe X-Y ein Substituent ist, der irgendwo in der Stammverbindung ein Wasserstoffatom ersetzt (mit Einschluß auch beispielsweise von Fällen, wo X-Y ein Substituent an R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5;, R&sub6; ist oder irgendeine dieser Gruppen ersetzt). Die Stammverbindung in der Formel (IV) entspricht dem Fall, daß n den Wert 0 hat.
  • B ist eine Brücke, die i) die Elektronendelokalisierung zwischen den heterocyclischen Ringen und ii) die gleichzeitige Koordinierung der zwei gezeigten Ring-Stickstoffatome mit einem chelatierten Metallion, so daß ein fünf- oder sechsgliedriger Ring gebildet wird, gestattet. B ist daher eine direkte Bindung-O-,-NH- oder-CO-. Im Hinblick auf unsere Versuchswerte werden eine direkte Bindung und-CO- bevorzugt. A&sub1;, A&sub2;, A&sub3;, A&sub4;, A&sub5; und A&sub6; können alle Kohlenstoffatome sein, die bei den bevorzugten Verbindungen zu 2,2'-Bipyridin- oder 2,2'-Ketobipyridinstrukturen führen. A&sub1;, A&sub2;, A&sub3;, A&sub4;, A&sub5; und A&sub6; können auch einzelne Stickstoffatome anzeigen. Bei der bevorzugten Ausführungsform ist nur eine der Gruppen A&sub1;, A&sub2;, A&sub3; und/oder nur eine der Gruppen A&sub4;, A&sub5; oder A&sub6; ein Stickstoffatom, z.B. A oder A&sub3; und/oder A&sub4; oder A&sub6;. Im Falle, daß B eine direkte Bindung ist, entspricht dies der Struktur von 2-Pyridino-2'-pyrimidinen oder 2,2'-Bipyridinen oder den entsprechenden Bipyridazinverbindungen. Die 2,2'-Bipyrimidine sind gewöhnlich symmetrisch, doch schließen die angewendeten Syntheseverfahren auch unsymmetrische Bipyrimidine nicht aus.
  • Jede der Gruppen R&sub1;-R&sub6; ist nichts, wenn das A, an das die Gruppe angefügt ist, ein Stickstoffatom ist. Für jedes A, das ein Kohlenstoffatom ist, sind die Gruppen R&sub1;-R&sub2; aus folgendem ausgewählt:
  • a) Wasserstoff
  • b) eine Kohlenwasserstoffgruppe, die geradkettig, verzweigt oder cyclisch sein kann, wie Alkyl, Alkenyl, Alkinyl und eine aromatische Gruppe (Aryl), die gegebenenfalls zusätzliche Strukturen enthält, die an der Chelatisierung nicht teilnehmen, wie aromatische Ringsysteme, Ether, Thioether, Ester, Amido, Amino (primär, sekundär oder tertiär), Carboxy, Halogen, Cyano etc. und andere Strukturen, die Heteroatome zeigen,
  • c) Cyano, Halogen und Nitro, und
  • d) Carbonsäure (COOH), Amido (CONH&sub2;), Amino (NH&sub2;), Hydroxy (OH) und substituierte Formen dieser vier Gruppen, bei denen ein Wasserstoffatom durch eine Kohlenwasserstoffgruppe entsprechend dem obigen Punkt b) ersetzt worden ist, wobei im Falle der Amino- und Hydroxygruppen, die Wasserstoffatome ebenfalls die Möglichkeit haben, durch eine Acylgruppe oder RCO ersetzt zu sein, wobei R eine Kohlenwasserstoffgruppe gemäß obigem Punkt b) ist.
  • Beispiele für Alkyl sind Niedrigalkylgruppen mit weniger als 12 Kohlenstoffatomen.
  • Beispiele für aromatische Gruppen sind Phenyl, Chinolyl, Naphthyl, Pyridyl, Pyrimidyl usw., die alle zusätzliche Substituenten enthalten können. Durch Auswahl des Alkenyl-, Alkinyl- oder aromatischen Systems, das an irgendeine der zwei heteroaromatischen Ringe in der Formel (IV) direkt oder über eine Carbonylgruppe oder ein Stickstoffatom gebunden ist, kann das konjugierte Elektronensystem auf drei, vier oder mehr aromatische Ringe oder Kohlenstoffatome ausgedehnt werden.
  • Z und Z- stehen für identische oder unterschiedliche Chelatisierungsstrukturen, nämlich N-Biscarboxymethyl- und N- Biscarboxyethylaminogruppen und das analoge Phosphat (-N(- CH&sub2;-O-PO&sub3;²&supmin;)&sub2;) und Phosphonat (-N(-CH&sub2;-PO&sub3;²&supmin;)&sub2;). Z und Z' sind an Eu³&spplus;, Tb³&spplus;, Dy³&spplus; oder Sm³&spplus; chelatisiert. X-Y stellt eine inerte organische Gruppe dar, bei der X eine inerte und stabile Brücke ist und Y (a) eine funktionelle Gruppe oder (b) der Rest einer organischen Verbindung (Y'), die eine biospezifische Affinität zeigt, ist, wobei diese Eigenschaft in der Verbindung der Formel (IV) (n ≠ 1 oder 2) beibehalten wird, nachdem Y' kovalent an die Stammverbindung gekuppelt worden ist. Die obige Bezeichnung "inert" bedeutet, daß die hierdurch charakterisierte Gruppe oder Brücke keinerlei wirksames chelatisierendes Heteroatom hat, das sich näher als 4 Atome an den Heteroatomen befindet, die bei der Chelierung eines Metallions teilnehmen. In der tatsächlichen Praxis bedeutet dies, daß die vier Atome normalerweise durch eine Kette mit vier Kohlenstoffatomen dargestellt werden. Die Bezeichnung "stabil" bedeutet, daß die Brücke X sich nicht zersetzt, wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen zum Einsatz kommen, z.B., daß die Brücke nicht leicht hydrolysiert wird. In der Formel (IV) liegt X- Y vorzugsweise als Substituent vor, der ein Wasserstoffatom in den Z- und/oder Z'-Gruppen, z.B. in einer N-Biscarboxymethylgruppe ersetzt. X-Y kann auch als Substituent an einer der Gruppen R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5; und R&sub6; vorliegen oder eine dieser Gruppen ersetzen, wobei in diesem Fall vorzugsweise eine der Gruppierungen R durch X-Y ersetzt ist.
  • Die Brücke X muß eine Methylengruppe (-CH&sub2;-) in der überbrückenden Kette haben, wenn sie direkt an einen heterocyclischen Ring der Formel (IV) angefügt ist. X enthält auch mindestens ein Strukturelement, ausgewählt aus den folgenden:-NR- (sekundäres und tertiäres Amin),-CONR- und -NRCO- (substituiertes Amid),-S-S- (aliphatisches Disulfid),-S- (aliphatischer Thioether),-O- (Ether),-COO- und -OOC- (Ester),-N=N- (Diaza) und einer reinen Kohlenwasserstoffkette, die geradkettig, verzweigt oder cyclisch sein kann und die 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthält. Die Kohlenstoffkette kann rein aliphatisch oder rein aromatisch (mit Einschluß von Phenyl, Naphthyl, Chinolyl, Pyridyl und Bipyridyl) sein, kann aber auch beide Strukturtypen, wie im Falle von Alkylaryl und andere inerte funkionelle Gruppen, die an der oben genannten Chelatisierung nicht teilnehmen, aufweisen. Das Symbol R in dem obigen substituierten Amid steht vorzugsweise für Wasserstoffatom, kann aber auch für Alkyl, beispielsweise Alkyl mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen stehen. Das gleiche gilt für R in-NR-.
  • Y wird aus zwei Hauptkategorien (A und B wie unten stehend) ausgewählt:
  • A) Y ist ein Rest einer biologisch aktiven Verbindung (Y'), die dazu imstande ist, an biospezifischen Affinitätsreaktionen, wie zwischen Antigenen (Haptenen) und den homologen aktiven Antikörperkomponenten, komplementären Nucleinsäuren (RNA, DNA), Lectinen und Kohlenhydratstrukturen, Protein A und IgG etc. teilzunehmen. Diese Typen von biologisch aktiven Molekülen werden oftmals als zielgerecht bindende Substanzen (zielgerecht bindende Moleküle) bezeichnet. Gewöhnlich sind sie derivatisiert worden oder sie können leicht derivatisiert werden, um funktionelle Gruppen zu enthalten, die eine Konjugation an diversifizierte Typen von Verbindungen gestatten.
  • B) Y kann ein funktionelle Gruppe sein, die so ausgewählt ist, daß sie sich chemisch mit einer funktionellen Gruppe A, einer organischen Verbindung (Y') unter Bildung einer kovalenten Bindung zwischen Y' und einer Verbindung der Formel (IV) umsetzen kann. Die Auswahl von Y hängt von A ab und umgekehrt, es wird jedoch angenommen, daß ein beliebiger Fachmann die richtige Auswahl von gegenseitig reaktiven Gruppen treffen kann. Funktionelle Gruppen Y in der Alternative (B) sind Isothiocyanato, Bromacetamido, Iodacetamido, Succinamido, Pyridyldithio, Mercapto, Carboxyl und die aktiven Ester davon (z.B. N-Hydroxysuccinimido oder p-Nitrophenyl), Hydroxyl, Aldehyd, Amino, Diazonium, Tosyl, Mesitylyl, Trexyl, Phosphodiester oder Phosphotriester. Weitere funktionelle Gruppen sind dem Fachmann bekannt.
  • Bei einer erfindungsgemäßen Verbindung ist es zwingend, daß alle der genannten Gruppen gemeinsam vorliegen können. Doch muß die reaktive Gruppe Y nicht notwendigerweise mit einer erfindungsgemäßen Chelatform gemeinsam vorliegen können. Fur einige Zwecke kann der chelatisierende Teil des Moleküls zeitweise geschützt werden, z.B. in der Form eines Esters, so daß der geschützte Ligand an das zielgerecht bindende Molekül gekuppelt wird. Nach dem Abspalten der Schutzgruppe kann er am Schluß das gewünschte markierte Produkt bilden. Die Schutzgruppe wird nach bekannten Prinzipien ausgewählt [vergleiche z.B. Protective Groups in Organic Synthesis; Greene TN; John Wiley & Sons Inc.; USA (1981)].
  • Bei der Auswahl der Gruppe in Betracht zu ziehende Faktoren sind u.a. die Stabilität der Verbindung, mit der Y umgesetzt werden soll, die Reaktivität von Y und der Strukturtyp, der durch Reaktion von Y und der angestrebten Bindung gebildet wird.
  • Ein Gegenstand der Erfindung umfaßt die Verwendung einer Verbindung der Formel (IV) (n ≠ 0) zur kovalenten Bindung der Fluoreszenzstruktur der Stammverbindung an eine organische Verbindung (Y'), die mindestens eine funktionelle Gruppe A aufweist, die gegenüber Y reaktiv ist. Nach der kovalenten Bindungsreaktion und wenn eine Säure-, Ester- oder Salzform der Verbindung verwendet worden ist, wird das Produkt in an sich bekannter Weise in das jeweilige Chelat umgewandelt. Beispiele der Esterformen, die chelatisierende O-Atome in Z und Z1 umfassen, sind Niedrigalkyl (C&sub1;-C&sub6;)- oder Benzylester. Die Reaktionsbedingungen für die Bindung hängen von dem Paar der funktionellen Gruppen (Y) und (A), Y' und der verwendeten Verbindung der Formel (IV) etc. ab und sind als solche bekannt. Gemäß diesem Gesichtspunkt der Erfindung haben A&sub1;-A&sub6;, R&sub1;-R&sub6;, Z, Z', X, Y, n und--- die vorgenannten Bedeutungen, mit der Ausnahme, daß Y nur eine funktionelle Gruppe sein kann.
  • Schutzgruppen, die an sich bekannt sind, sind manchmal erforderlich, um die Bindung durchzuführen [vergleiche z.B. Protective Groups in Organic Synthesis; Greene TN; John Wiley & Sons Inc.; USA (1981)].
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen ergeben verbesserte multiple Markierungsverfahren für spektrofluorometrische Assays auf das Vorhandensein von speziellen chemischen Strukturen in einer Probe. Für diesen Anwendungszweck werden gleichzeitig mindestens zwei fluoreszierende Lanthaniden- Chelate als Sonden verwendet. Die verwendeten Sonden unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Anregungs- und/oder Emissions-Wellenlängen-Maxima, so daß sie unabhängig gemessen werden können. Chelate mit unterschiedlichen Liganden unterscheiden sich hinsichtlich der Anregungswellenlängen und Chelate mit unterschiedlichen Metallen der seltenen Erden unterscheiden sich hinsichtlich der Emissionswellenlängen. Die chelatisierenden Lanthanide sind Eu³&spplus;, Tb³&spplus;, Sm³&spplus; oder Dy³&spplus;. Dieser Aspekt der Erfindung kann auf die gleichen spektrofluorometrischen Techniken vom allgemeinen Typ angewendet werden, wie sie auf Seite 2 angegeben wurden, und die eine einzige Sonde verwenden. Heterogene Hybridisierungsassays und heterogene Immunoassays sind gleichfalls eingeschlossen. Einige der Methoden erfordern die Entfernung von überschüssiger Sonde, während dies bei anderen nicht der Fall ist (z.B. den homogenen Methoden). Im allgemeinen umfassen die anwendbaren Assays zwei Stufen, nämlich (i) Markierung der Zielstruktur durch die Fluoreszenzsonden, die sich spezifisch an die genannte Struktur binden und (ii) die Messung der Fluoreszenz von den Sonden. Das erfaßte Fluoreszenzmuster ist mit dem Vorhandensein der Zielstruktur assoziiert.
  • Die Sequenz der zwei Stufen kann durch andere Stufen, wie Trennstufen und/oder durch Zugabe von weiteren Reaktanden, wie es im Falle von Immunoassays verschiedener Typen der Fall ist, unterbrochen sein.
  • Die Erfindung wird in den beigefügten Ansprüchen, die Teil der Beschreibung sind, definiert.
  • Die Erfindung wird nunmehr anhand der Synthese und der Verwendung einer großen Anzahl von Verbindungen erläutert. Ihre Struktur sowie die Synthesewege zu ihrer Herstellung sind auf gesonderten Formelseiten (72-83) gezeigt. Im Falle von Diskrepanzen zwischen einem gegebenen Namen und der entsprechenden Strukturformel hat die letztgenannte Vorrang.
    • Beispiel 1 (Schema 1), x = y = H 6,6'-Dimethyl-2,2'-bipyridin (1) Ref. G.R. Newkome et al., J. Inorg. Nucl. Chem., 43, 1529- 1531 (1981)
  • 6-Brom-2-methylpyridin (49,0 g, 0,285 mol), Benzyltriethylammoniumchlorid (11,6 g, 0,0509 mol), Natriumformiat (25,7 g, 0,408 mol), 10% Palladium auf Kohle (1,7 g), 32%ige Natriumhydroxidlösung (29 ml) und Wasser (86 ml) wurden 24 Stunden lang am Rückfluß gekocht. Das Gemisch wurde filtriert und die wäßrige Phase wurde mit Methylenchlorid extrahiert. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels wurde das Produkt destilliert.
  • Ausbeute: 59%
  • F.p. 82-83ºC (Lit. 88-89ºC)
  • UV (in Ethanol): 290 nm, 237 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 2,61 (s, 6 H); 7,11 (d, 2 H, J = 7,6 Hz); 7,64 (t, 2 H, 7,6 Hz); 8,18 (d, 2 H, J = 7,6 Hz).
    • Beispiel 2 (Schema 2) 2-Brom-4-methylpyrimidin (2) Ref. D.D. Bly et al., J. Org. Chem., 27, 2945- (1962)
  • Zu dem Gemisch, das 2-Amino-4-methylpyrimidin (40,0 g, 0,367 mol), Natriumbromid (180 g, 1,75 mol), Natriumnitrit (60,0 g, 0,870 mol) und Wasser (160 ml) enthält, wurde langsam 100 ml konzentrierte Bromwasserstoffsäure gegeben. Die Temperatur wurde während der Zugabe unterhalb 0ºC gehalten. Nach 4stündigem Rühren bei -5ºC- +5ºC wurde die Temperatur auf Raumtemperatur erhöht und das Gemisch wurde mit konzentrierter Natriumhydroxidlösung neutralisiert. Das Produkt wurde aus der wäßrigen Phase mit Chloroform extrahiert. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels wurde das Produkt im Vakuum destilliert.
  • Ausbeute: 23%
  • K.p. 69-70ºC/0,6 mm
  • UV (in Ethanol): 255 nm
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 2,54 (s, 3 H); 7,17 (d, 1 H, J = 5 Hz); 8,42 (d, 1 H, 5 Hz)
    • Beispiel 3 4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyrimidin (3) Entsprechend: M. Tiecco et al., Synthesis 736 (1984)
  • Nickelchloridhexahydrat (8,48 g, 35, 7 mmol) und Triphenylphosphin (37,4 g , 143 mmol) wurden in 180 ml Dimethylformamid von 50ºC aufgelöst. Nach 20minütigem Durchperlenlassen von Stickstoff durch die Lösung wurden 2,30 g (0,0352 Gramm-Atome) Zinkpulver zugegeben und das Gemisch wurde 1 Stunde lang gerührt. 2-Brom-4-methylpyrimidin (2), (6,25 g, 36,1 mmol) wurde zugegeben und das Gemisch wurde 3,5 Stunden lang bei 50ºC gehalten. Nach Eingießen des Gemisches in 500 ml verdünnte Ammoniaklösung wurde das organische Material mit Chloroform extrahiert. Das Produkt wurde aus Chloroform mit 1-N Salzsäure extrahiert. Die Salzsäurelösung wurde alkalisch gemacht und mit Chloroform extrahiert. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt.
  • Ausbeute: 12%
  • UV (in Ethanol): 248 nm
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 2,72 (s, 6 H); 7,28 (d, 2 H, J = 5 Hz); 8,86 (d, 2 H, J = 5 Hz)
    • Beispiel 4 5-Brom-6,6-dimethyl-2,2'-bipyridin (4) Entsprechend: G.R. Newkome et al., J. Inorg. Nucl. Chem. 43, 1529 (1981)
  • 2,5-Dibrom-6-methylpyridin (1,25 g, 5,0 mmol), Natriumformiat (0,51 g, 7,5 mmol), 10% Palladium auf Kohle (30 mg), Benzyltriethylammoniumchlorid (0,20 g, 0,88 mmol) und 8%ige Natriumhydroxidlösung (2,0 ml) wurden zwei Tage lang am Rückfluß gekocht. Das Gemisch wurde filtriert und die wäßrige Phase wurde mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet, das Lösungsmittel wurde abgedampft und das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Kieselsäure, Methylenchlorid) gereinigt. Das Hauptprodukt war eine monobrom substituierte Verbindung.
  • Ausbeute: 35%
  • UV (in Ethanol): 296 nm, 251 nm, 245 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;); 2,61 (s, 3 H); 2,73 (s, 3 H); 7,16 (d, 1 H, J = 7,6 Hz); 7,67 (t, 1 H, 7,6 Hz); 7,88 (d, 1 H, J = 8,5 Hz); 8,12 (d, 1 H, J = 8,5 Hz); 8,19 (d, 1 H, J = 7,6 Hz)
    • Beispiel 5 (Schema 3) 3,3'-Dihydroxy-E,E'-dimethyl-2,2'-bipyridin (5) Ref. J. Rebek et al., J. Heterocyl. Chem., 17, 749-751 (1980)
  • 6-Methyl-3-hydroxypyridin (23,9 g, 0,219 mol), Bleidioxid (98,3 g, 0,411 mol) und Toluol (1 Liter) wurden kombiniert und 5 Stunden lang am Rückfluß gekocht. Die heiße Lösung wurde filtriert und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde mit Hexan am Rückfluß gekocht und noch heiß filtriert. Die Lösung wurde zur Trockene eingedampft, wodurch das Produkt als gelbes Pulver erhalten wurde.
  • Ausbeute: 9,3%
  • UV (in Ethanol): 350 nm, 246 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 2,52 (s, 6 H); 7,10 (d, 2 H, J = 8,2 Hz); 7,31 (d, 2 H, J = 8,2 Hz)
    • Beispiel 6 (Schema 3) 3,3'-Dibenzoyloxy-6,6'-dimethyl-2,2'-bipyridin (6)
  • 3,3'-Dihydroxy-6,6'-dimethyl-2,2'-bipyridin (5) (0,22 g, 1,02 mmol) wurden in 12 ml Pyridin aufgelöst und mit Benzoylchlorid (0,30 g, 2,13 mmol) versetzt. Nach 1,Sstündigem Rühren bei Raumtemperatur wurden 100 ml Chloroform zugegeben und die Lösung wurde mit 100 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung extrahiert. Die Chloroformphase wurde getrocknet und zur Trockene eingedampft. Das Produkt wurde als graues Pulver aus Cyclohexan kristallisiert.
  • Ausbeute: 51%
  • UV (in Ethanol): 276 nm, 232 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 2,33 (s, 6 H), 7,17 (d, 2 H, J = 9 Hz); 7,43 (t, 4 H, J = 8 Hz ); 7,58 (t, 2 H, J = 8 Hz); 7,60 (d, 2 H, J = 9 Hz); 8,01 (d, 4 H, J = 8 Hz)
    • Beispiel 7 (Schema 4) 3,3'-Dicarboxy-6,6'-dimethyl-2,2'-bipyridin (7) Entsprechend: F.L. Wimmer et al., Org. Prep. Proced. 15, 368 (1983)
  • Neocuproinhydrochlorid (2,5 g, 12,1 mmol), Natriumhydroxid (0,76 g), Kaliumpermanganat (4,51 g) und Wasser (60 ml) wurden 24 Stunden lang am Rückfluß gekocht. Nach Abfiltrieren des Lösungsmittels wurde auf das halbe Volumen eingedampft. Der pH wurde mit konzentrierter Salzsäure auf 2 eingestellt und etwas aktivierte Holzkohle wurde zugesetzt. Nach 10 Minuten wurde die Holzkohle abfiltriert und das Produkt wurde mit Ethanol ausgefällt. Das ausgefällte Pulver wurde filtriert und aus Ethanol kristallisiert.
  • Ausbeute: 22%
  • UV (in Ethanol): 270 nm, 226 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, DMSO): 2,60 (s, 6 H); 7,58 (d, 2 H, J = 8,1 Hz); 8,38 (d, 2 H, J = 8,1 Hz)
    • Beispiel 8 (Schema 4) 3,3'-Bis(carbethoxy)-6,6'-dimethyl-2,2'-bipyridin (8)
  • Thionylchlorid (0,5 ml) wurde zu 10 ml trockenem Ethanol gegeben. Nach 15 Minuten wurde 3,3'-Dicarboxy-6,6'-dimethyl-2,2'-bipyridin (740 mg, 2,7 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht am Rückfluß gekocht. Das Gemisch wurde auf Eis gegossen und die Lösung wurde mit Natriumhydrogencarbonat neutralisiert. Das Produkt wurde mit Ethylacetat extrahiert, getrocknet und eingedampft.
  • Ausbeute: 16%
  • UV (in Ethanol): 270 nm, 227 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 1,01 (t, 6 H, J = 7,0 Hz); 2,63 (s, 6 H); 4,08 (g, 4 H, J = 7,0 Hz); 7,28 (d, 2 H, J = 8,1 Hz); 8,28 (d, 2 H, J = 8,1 Hz)
    • Beispiel 9 (Schema 5, R = C&sub6;H&sub5;-CH&sub5;-CH=CH=Styryl) 5,6-Dioxo-1,10-diphenyl-deca-1,3,7,9-tetraen (9) Ref. P. Karrer et al., Helv. Chim. Acta, 28, 1181-1184 (1945)
  • Ein Gemisch aus 2,3-Butandion (30,0 g, 0,348 mol), trans- Cinnamaldehyd (92,0 g, 0,696 mol), Ethanol (100 ml) und Piperidin (2 ml) wurde über Nacht am Rückfluß gekocht. Nach Abkühlen auf 0ºC wurde das kristallisierte Produkt filtriert, mit kaltem Ethanol gewaschen und aus Ethanol umkristallisiert.
  • Ausbeute: 24%
  • UV (in Ethanol): 367 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 6,93-7,08 (m, 6 H); 7,34- 7,40 (m, 6 H); 7,49- 7,51 (dd, 4 H, J = 1,5 Hz & 8,0 Hz); 7,58- 7,65 (m, 2 H)
    • Beispiel 10 (Schema 5) 6,6'-Dimethyl-4,4'-distyryl-2,2'-bipyridin (10) Ref. F. Kröhnke, Synthesis, 1-24 (1976)
  • 5,6-Dioxo-1,10-diphenyldeca-1,3,7,9-tetraen (9) (15,7 g, 50 mmol), Acetonylpyridiniumchlorid (17,2 g, 100 mmol), Ammoniumacetat (100 g) und Methanol (500 ml) wurden 2 Stunden lang am Rückfluß gekocht. Nach Abkühlen wurde das Produkt filtriert, mit Ethanol gewaschen und aus Dimethylformamid kristallisiert.
  • Ausbeute: 14%
  • UV (in Ethanol): 311 nm
  • ¹HNMR (60 NHz, CDCl&sub3;): 2,68 (s, 6 H), 7,20- 7,61 (m, 16H), 8,34 (s, 2 H)
    • Beispiel 11 (Schema 6, Ausgangsmaterial) 6-Brom-2-dimethoxymethylpyridin (11)
  • 6-Brom-2-pyridincarboxaldehyd (J. Am. Chem. Soc. 91, (11), 3500 (1970)) (11,38 g, 62,2 mmol) wurden in einem Gemisch aus trockenem Methanol (200 ml) und Trimethylorthoformiat (26,5 g, 250 mmol) aufgelöst. Nach der Zugabe von p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (250 mg) wurde das Gemisch 1 Stunde lang am Rückfluß gekocht, abgekühlt und durch Zugabe von Pyridin (5 ml) neutralisiert. Das Abdampfen des Lösungsmittels und die Destillation des Produkts bei vermindertem Druck ergaben reines Dimethylacetal als farblose Flüssigkeit.
  • Ausbeute: 96%
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 3,36 (s, 6 H), 5,25 (s, 1 H); 7,46 (m, 3 H)
    • Beispiel 12 (Schema 6) Bis (6-dimethoxymethyl-2-pyridyl) keton (12)
  • 6-Brom-2-dimethoxymethylpyridin (11) (14,2 g, 61 mmol) wurde in trockenem Diethylether (200 ml) aufgelöst und in einem Dreihals-Rundkolben, der mit einem Rückflußkondensator und einem Tropftrichter versehen war, auf -70ºC abgekühlt, während ein mäßiger Strom von trockenem Argon durch das magnetisch gerührte Gemisch geleitet wurde.
  • Butyllithium (25,1 ml (2,6M), 65,3 mmol) wurde tropfenweise zugegeben und die Temperatur des Reaktionsgemisches wurde unterhalb -60ºC gehalten. Nach beendigter Zugabe wurde das Gemisch eine weitere Stunde lang gerührt und sodann wurde Ethylchlorformiat (4,52 g, 41,7 mmol), gelöst in trockenem Diethylether mit einer solcher Geschwindigkeit eingeführt, daß die Temperatur nicht über -60ºC hinausging. Die gelbe Suspension wurde 45 Minuten lang bei -60ºC und sodann weitere 15 Minuten lang bei -40ºC gerührt. Die Reaktion wurde mit Methanol (20 ml) abgeschreckt und das Reaktionsgemisch wurde in gesättigte wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung (300 ml) eingegossen. Die Etherphase wurde abgetrennt und die wäßrige Phase wurde zweimal mit 100 ml Dichlormethan extrahiert. Die kombinierte organische Phase wurde eingedampft und mit Toluol gemeinsam abgedampft, wodurch die rohe Titelverbindung (12) erhalten wurde.
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 3,38 (s, 12 H); 5,30 (s, 2 H); 8,18 - 7,64 (m, 6 H)
    • Beispiel 13 (Schema 6) Bis (6-formyl-2-pyridyl)keton (13)
  • Rohes Bis(6-dimethoxymethyl-2-pyridyl)keton (12) wurde in Dioxan (40 ml) und Wasser (25 ml) aufgelöst. Konzentrierte Salzsäure (3 ml) wurde zugegeben und das magnetisch gerührte Gemisch wurde 15 Minuten lang zum Sieden erhitzt. Hierauf wurde die dunkle Lösung in eine gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung (100 ml) eingegossen und mit Chloroform (3 x 100 ml) extrahiert. Der Rückstand nach Eindampfen der kombinierten Extrakte wurde durch eine kurze Säule von Kieselsäuregel filtriert, wobei 4% EtOH/CHCl&sub3; als Lösungsmittel verwendet wurde. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden eingedampft. Das Produkt wurde aus heißem Toluol (100 mi) kristallisiert.
  • Ausbeute: 65% (bezogen auf die Verbindung 11)
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 8,48- 8,11 (m, 6 H); 10,07 (s, 2 H)
    • Beispiel 14 (Schema 6) Bis(6-hydroxymethyl-2-pyridyl)keton (14)
  • Zu der Verbindung (13) (2,5 g, 52,5 mmol) in trockenem Ethanol (50 ml) wurde Natriumborhydrid (400 mg, 52,5 mmol), gelöst in trockenem Ethanol (30 ml) tropfenweise bei 0ºC unter mäßigem Rühren gegeben. Ein zufriedenstellendes Verhältnis von Diol (14)/Triol wurde erhalten, als etwa 2/3 des Borhydrids zugesetzt worden waren. Aceton (20 ml) wurde zugesetzt, um nichtumgesetztes Reduktionsmittel zu zerstören und das Gemisch wurde eingedampft. Das Produkt wurde in Chloroform/Ethanol 1:1 gelöst und mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung extrahiert. Die organische Phase wurde eingedampft, gemeinsam mit Toluol eingedampft und durch Chromatographie in einer Kieselsäuregel-Säule gereinigt, wobei EtOH/CHCl&sub3; 1:9 als Elutionslösungsmittel verwendet wurde.
  • Ausbeute: 48%
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3; + CD&sub3;OD): 4,77 (s, 4 H); 7,98- 7,27 (m, 6 H)
    • Beispiel 15 (Schema 8) 6,6'-Dimethyl-2,2'-bipyridin-N-oxid (15)
  • 6,6'-Dimethyl-2,2'-bipyridin (1,97 g, 0,0107 mol, Beispiel 1) wurde in Chloroform (10 ml) aufgelöst. m-Chlorbenzoesäure (1,85 g, 0,0107 mol) wurde in Chloroform (40 ml) aufgelöst und langsam zu der Bipyridinlösung bei 0- 5ºC gegeben. Nach zweistündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lösung zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und dreimal mit Wasser extrahiert. Die Chloroformphase wurde getrocknet und eingedampft. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt.
  • Ausbeute: 70%
  • UV (in Ethanol): 270 nm, 250 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 2,61 (s, 3 H); 2,62 (s, 3 H); 7,19 (d, 1 H, J = 8 Hz); 7,28 (d, 1 H, J = 5 Hz); 7,69 (t, 1 H, J = 8 Hz); 7,97 (t, 1 H; J = 5 Hz); 8,53 (d, 1 H, J = 8 Hz)
    • Beispiel 16 (Schema 8) 6,6'-Dimethyl-2,2'-bipyridin-N.N'-dioxid (16)
  • 6,6'-Dimethyl-2,2'-bipyridin (10,0 g, 0,054 mol) wurde in Chloroform (50 ml) aufgelöst. m-Chlorbenzoesäure (21,0 g, 0,122 mol) wurde in Chloroform (200 ml) aufgelöst und die Lösungen wurden kombiniert. Nach über Nacht erfolgendem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel abgedampft und das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt (Kieselsäure, 0- 30% Methanol/Chloroform)
  • Ausbeute: 68%
  • UV (in Ethanol): 263 nm, 225 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 2,58 (s, 6 H); 7,23 (t, 2 H, J = 8 Hz); 7,34 (dd, 2 H, J = 8 Hz & 2 Hz); 7,36 (dd, 2 H, J = 8 Hz & 2 Hz)
    • Beispiel 17 (Schema 8) 6,6'-Dimethyl-4-nitro-2,2'-bipyridin-N-oxid (17)
  • 6,6'-Dimethyl-2,2'-bipyridin-N-oxid (1,50 g, 0,00749 mol) wurde in konzentrierter Schwefelsäure (8,0 ml) und rauchender Salpetersäure (6,0 ml) aufgelöst und das Gemisch wurde 4 Stunden lang auf 100ºC erhitzt. Die Lösung wurde langsam in Eiswasser gegossen, und der pH-Wert wurde mit 10%iger Natriumhydroxidlösung auf 5,5 eingestellt. Das Produkt wurde filtriert und getrocknet.
  • Ausbeute: 53%
  • F.p. 160- 163ºC
  • UV (in Ethanol): 337 nm, 294 nm, 233 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 2,62 (s, 3 H); 2,65 (s, 3 H); 7,27 (d, 1 H, J = 8 Hz); 7,75 (t, 1 H, J = 8 Hz); 8,10 (d, 1 H, J = 3 Hz); 8,56 (d, 1 H, J = 8 Hz); 8,93 (d, 1 H, J = 3 Hz)
    • Beispiel 18 (Schema 8) 6,6'-Dimethyl-4,4'-dinitro-2,2'-bipyridin-N,N'-dioxid (18)
  • 6,6'-Dimethyl-2,2'-bipyridin-N,N'-dioxid (6,84 g, 0,0316 mol) wurde mit konzentrierter Schwefelsäure (33,5 ml) und rauchender Salpetersäure (25,0 ml) bei 100ºC 5 Stunden lang gerührt. Der pH-Wert wurde mit 10%iger Natriumhydroxidlösung auf 5,5 eingestellt. Das ausgefällte Produkt wurde filtriert und im Vakuum getrocknet.
  • Ausbeute: 48%
  • UV (in Ethanol): 336 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, DMSO): 2,48 (s, 6 H); 8,53 (d, 2 H, J = 4 Hz); 8,61 (d, 2 H, J = 4 Hz)
    • Beispiel 19 (Schema 8) 4-Brom-6,6'-dimethyl-2,2'-bipyridin (19)
  • 6,6'-Dimethyl-4-nitro-2,2'-bipyridin-N-oxid (0,50 g, 2,0 mmol) wurde in Acetylbromid (10,0 ml) und Phosphortribromid (2,5 ml) aufgelöst. Nach 1,5stündigem Rückfluß wurde das Gemisch auf 100 g Eis gegossen und die Lösung wurde mit 30%iger Natriumhydroxidlösung neutralisiert. Das Gemisch wurde mit Chloroform extrahiert und die Chloroformphase wurde getrocknet und eingedampft. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt.
  • UV (in Ethanol): 291 nm, 242 nm, 217 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 2,59 (s, 3 H); 2,62 (s, 3 H); 7,17 (d, 1 H, J = 7,6 Hz); 7,33 (d, 1 H, 1,5 Hz);; 7,68 (t, 1 H, J = 7,6 Hz); 8,17 (d, 1 H, J = 7,6 Hz); 8,41 (d, 1 H, J = 1,5 Hz)
    • Beispiel 20 (Schema 8) 4-Amino-6,6'-dimethyl-2,2'-bipyridin (20)
  • 6,6'-Dimethyl-4-nitro-2,2'-bipyridin-N-oxid (17) (2,0 g, 8,2 mmol) wurde in Methanol (20 ml) aufgelöst. 10% Palladium auf Kohle (0,36 g) wurde zugesetzt und danach wurde langsam Natriumborhydrid (3,6 g, 95 mmol) zugegeben. Nach 1 Stunde wurde das Reaktionsgemisch filtriert und die Lösung wurde eingedampft. Der Rückstand wurde in 0,1 N Natriumhydroxidlösung aufgelöst und das Produkt wurde mit Chloroform aus der Wasserphase extrahiert. Die Chloroformphase wurde getrocknet und eingedampft.
  • Ausbeute: 80%
  • F.p. 101-103ºC
  • UV (in Ethanol): 284 nm, 236 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 2,48 (s, 3 H); 2,61 (s, 3 H); 6,40 (d, 1 H, J = 2,1 Hz); 7,12 (d, l H, J = 7,6 Hz); 7,47 (d, 1 H, J = 2,1 Hz); 7,65 (t, 1 H, 7,6 Hz); 8,13 (d, 1 H, J = 7,6 Hz)
    • Beispiel 21 6,6'-Dimethyl-4-ethoxy-2,2'-bipyridin-X-oxid (21)
  • 6,6'-Dimethyl-4-nitro-2,2'-bipyridin-N-oxid (17) (1,0 g, 4,1 mmol) wurde zu einer Natriumethoxidlösung gegeben, die aus Natrium (0,19 g, 0,0083 Gramm-Atome) und 25 ml Ethanol hergestellt worden war. Das Geinisch wurde 30 Minuten lang bei 70ºC gerührt. Nach der Neutralisation mit konzentrierter Salzsäure wurde das Reaktionsgemisch filtriert und zur Trockene eingedampft. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt (Kieselsäure, 0%-50% Methanol/Chloroform).
  • Ausbeute: 90%
  • UV (in Ethanol): 272 nm, 239 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 1,45 (t, 3 H, J = 7,0 Hz); 2,58 (s, 3 H); 2,61 (s, 3 H); 4,14 (q, 2 H, J = 7,0 Hz); 6,84 (d, 1 H, J = 3,4 Hz); 7,20 (d, 1 H, J = 7,7 Hz); 7,54 (d, 1 H, J = 3,4 Hz); 7,70 (t, 1 H, 7,7 Hz); 8,65 (d, 1 H, J = 7,7 Hz)
    • Beispiel 22 (Schema 8) 6,6'-Dimethyl-4-ethoxy-2,2'-bipyridin (22)
  • 6,6'-Dimethyl-4-ethoxy-2,2'-bipyridin-N-oxid (21) (0,96 g, 3,93 mmol) wurde in Chloroform (34 ml) aufgelöst. Nach der Zugabe von Phosphortribromid (3,0 ml) wurde das Gemisch 1,5 Stunden lang am Rückfluß gekocht. Die Lösung wurde auf Eis gegossen, etwas Chloroform wurde zugegeben und die Phasen wurden getrennt. Die Chloroformphase wurde mit Wasser extrahiert. Die wäßrigen Phasen wurden kombiniert, mit Natriumhydroxidlösung alkalisch gemacht und mit Chloroform extrahiert. Das Eindampfen der organischen Phase und die anschließende Kieselsäuregel-Chromatographie lieferten das reine Titelprodukt.
  • Ausbeute: 69%
  • UV (in Ethanol): 286 nm, 243 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 1,45 (t, 3 H, J = 7,0 Hz); 2,56 (s, 3 H), 2,62 (s, 3 H); 4,18 (q, 2 H, J = 7,0 Hz); 6,67 (d, 1 H, J = 2,1 Hz); 7,14 (d, 1 H, J = 7,6 Hz); 7,67 (t, 1 H, J = 7,6 Hz); 7,75 (d, 1 H, J = 2,1 Hz); 8,16 (d, 1 H, J = 7,6 Hz)
    • Beispiel 23 (Schema 9) 4-(2-Hydroxyethoxy)-6,6'-dimethyl-2,2'-bipyridin-N-oxid (23)
  • Natriumhydrid (2,07 g, 51,8 mmol), wurde zu 1,2-Dihydroxyethan (100 ml) gegeben. Nach 15 Minuten wurde 6,6'-Dimethyl-4-nitro-2,2'-bipyridin-N-oxid (17) (6,35 g, 25,9 mmol) zugegeben und das Gemisch wurde 4 Stunden lang bei 60ºC gerührt. Überschüssiges 1,2-Dihydroxyethan wurde durch Abdampfen in einem Hochvakuum entfernt und das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt
  • Ausbeute: 79%
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;). 2,52 (s, 3 H), 2,57 (s, 3 H); 3,83 - 4,06 (m, 4 H); 6,80 (d, 1 H, J = 4 Hz); 7,16 (d, 1 H, J = 8 Hz); 7,45 (d, 1 H, J = 4 Hz); 7,66 (t, 1 H, J = 8 Hz); 8,27 (d, 1 H, J = 8 Hz)
    • Beispiel 24 (Schema 9) 4-(2-Hydroxyethoxy)-6,6'-dimethyl-2,2'-bipyridin (24)
  • 4-(2-Hydroxyethoxy)-6,6'-dimethyl-2,2'-bipyridin-N-oxid (23) (2,40 g, 9,22 mmol) wurde in Methanol (75 ml) aufgelöst. 10% Palladium auf Kohle (0,54 g) und sodann wurden langsam Natriumborhydrid (3,24 g, 85,6 mmol) zugegeben. Das Palladium auf Kohle wurde herausfiltriert und das Lösungsmittel wurde abgedampft. Das Produkt wurde durch Flash- Chromatographie (Kieselsäure, 5-50% Nethanol/Chloroform) gereinigt.
  • Ausbeute: 91%
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 2,57 (s, 3 H), 2,61 (s, 3 H); 3,98 - 4,25 (m, 4 H); 6,69 (d, 1 H, J = 2 Hz); 7,14 (d, 1 H, J = 7 Hz); 7,67 (t, 1 H, J = 7 Hz); 7,81 (d, 1 H, J = 2 Hz); 8,19 (d, 1 H, J = 7 Hz)
    • Beispiel 25 (Schema 9) 4-(2-Benzoyloxyethoxy)-6,6'-dimethyl-2,2'-bipyridin (25)
  • 4-(2-Hydroxyethoxy)-6,6'-dimethyl-2,2'-bipyridin (24) (1,0 g, 4,1 mmol) wurden in trockenem Pyridin (20 ml) aufgelöst und mit Benzoylchlorid (0,63 g, 4,5 mmol) versetzt. Nach 30 Minuten wurde Chloroform (50 ml) zugegeben und die Lösung wurde mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Die Chloroformphase wurde getrocknet und das Lösungsmittel wurde abgedampft. Das Produkt wurde mit trockenem Toluol gemeinsam eingedampft. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Kieselsäure, 0 - 50% Methanol/Dichlormethan) gereinigt.
  • Ausbeute: 56%
  • F.p. 81-83ºC
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;); 2,55 (s, 3 H); 2,60 (s, 3 H); 3,96 - 4,22 (m, 4 H); 6,71 (d, 1 H, J = 2 Hz); 7,13 (d, 1 H, J= 8 Hz); 7,36 - 7,56 (m, 3 H); 7,65 (t, 1 H, J = 8 Hz); 7,86 (d, 1 H, J = 2 Hz); 7,98- 8,14 (m, 2 H); 8,20 (d, 1 H, J = 8 Hz)
    • Beispiel 26 (Schema 10, Ausgangsmaterial) 4,4',6,6'-Tetramethyl-2,2'-bipyridin (26)
  • Diese Verbindung wurde nach einem dem Verfahren des Beispiels 1 analogen Verfahren synthetisiert, wobei 2-Brom- 4,6-dimethylpyridin als Ausgangsmaterial verwendet wurde.
  • UV (in Ethanol): 289 nm, 241 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 2,35 (s, 6 H); 2,56 (s, 6 H); 6,94 (s, 2 H); 8,00 (s, 2 H)
    • Beispiel 27 (Schema 10) 4,4'-Bis(2-phenylethyl)-6,6'-dimethyl-2,2'-bipyridin (27)
  • Zu flüssigem Ammoniak (20 ml) von -50ºC wurde genügend Natrium zugesetzt, daß eine blau gefärbte Lösung aufrechterhalten wurde. Eisen(III)-nitrat (20 mg) wurde zugegeben und sodann wurde Natrium (0,19 g, 0,008 Gramm-Atom) zugesetzt. Nach 45 Minuten wurde 4,4',6,6'-Tetramethyl-2,2'-bipyridin (26) (1,06 g, 5,00 mmol) in kleinen Portionen zugegeben und das Gemisch wurde 1,5 Stunden lang bei -50ºC gerührt. Benzylbromid (1,88 g, 11,0 mmol) wurde bei -50ºC im Verlauf von 2 Stunden zugesetzt. Das Gemisch wurde sich erwärmen gelassen und mit Wasser (50 ml), Ethanol (20 ml) und Chloroform (30 ml) versetzt. Die organische Phase wurde mit gesättigter Ammoniumsulfatlösung extrahiert, mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Durch Zugabe von Ethylacetat wurde etwas reine Verbindung ausgefällt. Der Rest wurde durch Flash-Chromatographie (Kieselsäure, 0 - 6% Methanol/Dichlormethan) gereinigt.
  • Ausbeute: 53%
  • UV (in Ethanol): 290 nm, 241 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 2,60 (s, 6 H), 2,98 (bs, 8 H); 6,97 (s, 2 H); 7,18 - 7,35 (m, 10 H); 8,07 (s, 2 H)
    • Beispiel 28 (Schema 10) 4,4'-Bis(2-(p-nitrophenyl)-ethyl)-6,6'-dimethyl-2,2'-bipyridin (28)
  • 4,4'-Bis(2-phenylethyl)-6,6'-dimethyl-2,2'-bipyridin (27) (3,0 g, 7,6 mmol) wurde in Tetrahydrofuran (30 ml) aufgelöst. 65%ige Salpetersäure (0,81 g) wurde zugegeben und die Lösung wurde eingedampft. Konzentrierte Schwefelsäure (26 ml) wurde zugesetzt und die Lösung wurde 30 Minuten lang bei 60ºC gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde langsam auf 200 ml Eis gegossen. Die wäßrige Lösung wurde mit festem Natriumcarbonat neutralisiert und sodann mit einer Chloroform/Ethanollösung extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet und eingedampft. Das Produkt wurde durch Flash- Chromatographie gereinigt.
  • Ausbeute: 34%
  • UV (in Ethanol): 285 nm, 251 nm
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 2,59 (s, 6 H); 3,05 (bs, 6 H), 6,95 (s, 2 H); 7,34 (d, 4 H, J = 9 Hz); 8,08 (s, 2 H); 8,15 (d, 4 H, J = 9 Hz)
    • Beispiel 29
  • Verfahrensweisen zur Einführung von reaktiven Halogenmethylgruppen in Bipyridine oder Bipyrimidine
    • A) ALLGEMEINE VERFAHRENSWEISE ZUR DIREKTEN HALOGENIERUNG VON DIMETHYLVERBINDUNGEN MIT N-HALOGENSUCCINIMIDEN
  • Ref. G.R. Newkome et al., J. Org. Chem., 48, 5112-5114 (1983)
  • Die Dimethylverbindung (4,0 mmol) wurde in Tetrachlorkohlenstoff (100 ml) aufgelöst. N-Bromsuccinimid (9,0 mmol) und eine katalytische Menge von Dibenzoylperoxid wurden zugegeben, und das Gemisch wurde über Nacht am Rückfluß gekocht. Das Gemisch wurde filtriert und die Lösung wurde zur Trockene eingedampft. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt.
    • B) ALLGEMEINE VERFAHRENSWEISE ZUR SYNTHESE DER BIS-HALOGEN- METHYLBIPYRIDINE UND -BIPYRIMIDINE AUF DEM WEGE ÜBER DAS BIS-ACETAT (SCHEMA II)
  • i) Allgemeine Verfahrensweise zur N,N'-Dioxid-Synthese
  • Ref. W. Sont et al. Org. Prep. Proce. Int. 243-244 (1980)
  • Ein 6,6'-Dimethyl-2,2'-bipyridin (oder ein analoges Dimethylbipyrimidin) (5 mmol) wurde in Chloroform (100 ml) aufgelöst. m-Chlorperbenzoesäure (15 mmol) wurde zugegeben und die Lösung wurde 3 Stunden lang gerührt. Nach der Extraktion mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung wurde die Chloroformphase getrocknet und zur Trockene eingedampft. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt.
  • ii) Allgemeine Verfahrensweise zur Diacetat-Synthese aus N,N'-Dioxid
  • Ref. G.R. Newkome, J. Org. Chem., 47, 4116-4120 (1982)
  • Ein 6,6'-Dimethyl-2,2'-bipyridin-N,N'-dioxid (3 mmol) wurde in Essigsäureanhydrid (20 ml) aufgelöst und die Lösung wurde 0,5 Stunden lang am Rückfluß gekocht. Das Essigsäureanhydrid wurde abgedampft und der Rückstand wurde zwischen gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und Chloroform aufgeteilt. Die organische Phase wurde getrocknet, eingedampft und das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt.
  • iii) Allgemeine Verfahrensweise zur Dialkohol-Synthese
  • Das Diacetat (1 mmol) wurde in Aceton (10 ml) aufgelöst und mit 1 N Natriumhydroxidlösung (10 ml) versetzt. Nach einstündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lösung mit Salzsäure neutralisiert. Das Aceton wurde abgedampft und die Wasserphase wurde mit Chloroform extrahiert. Das Chloroform wurde abgedampft und das Produkt wurde durch Flash- Chromatographie gereinigt.
  • iv) Allgemeine Verfahrensweise für die Dibromid- oder Dichlorid-Synthese aus Dialkohol
  • Der Dialkohol (1 mmol) wurde in Chloroform (15 ml) aufgelöst und mit Phosphortribromid oder Phosphortrichlorid (1,5 mmol) versetzt. Nach 2stündigem Kochen am Rückfluß wurde das Gemisch abgedampft und mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung extrahiert. Die Chloroformphase wurde getrocknet und zur Trockene eingedampft. Die Reinigung durch Flash-Chromatographie lieferte das reine Dibromid.
    • C) ALLGEMEINE VERFAHRENSWEISE ZUR EINFÜHRUNG VON BIS-CHLOR- METHYLGRUPPEN DIREKT AUS DI-N,N'-OXID (SCHEMA II)
  • Ref. T. Sakamoto et al., Heterocycl., 20, 991-994 (1983)
  • Ein 6,6'-Dimethyl-2,2'-bipyridin-N,N'-dioxid (1 mmol) (oder ein analoges Bipyrimidin-N,N'-dioxid) wurde in 1,4-Dioxan (20 ml) aufgelöst und mit Phosphoroxychlorid (7 mmol) versetzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden am Rückfluß gekocht und sodann zur Trockene eingedampft. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt.
    • Beispiel 30 6,6'-Bis(chlormethyl)-2,2'-bipyridin (30)
  • Ref. G. R. Newkome et al., J. Org. Chem., 48, 5112-5114 (1983)
  • Nach der allgemeinen direkten Halogenierungs-Verfahrensweise des Beispiels 29A
  • 6,6'-Dimethyl-2,2'-bipyridin (1) (0,26 g, 2,3 mmol), N- Chlorsuccinimid (0,47 g, 5,5 mmol), Dibenzoylperoxid (3,6 mg) und Tetrachlormethan (7,2 ml) wurden 24 Stunden lang am Rückfluß gekocht. Das Gemisch wurde filtriert und das Lösungsmittel wurde abgedampft. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Kieselsäure, Cyclohexan/Methylenchlorid 9:1) gereinigt.
  • Ausbeute: 12%
  • UV (in Ethanol): 287 nm, 238 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 4,73 (s, 4 H); 7,47 (d, 2 H, J = 7,5 Hz); 7,80 (t, 2 H, J = 7,5 Hz); 8,38 (d, 2 H, J = 7,5 Hz)
    • Beispiel 31 (Schema 14) 4-Brom-6,6'-bis(brommethyl)-2,2'-bipyridin (31)
  • Nach der allgemeinen Verfahrensweise (Beispiel 29A) zur Halogenierung der Dimethylverbindungen mit N-Halogensuccinimiden und unter Verwendung von (19) als Ausgangsmaterial.
  • UV (in Ethanol): 290 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 4,56 (s, 3 H); 4,62 (s, 3H); 7,49 (dd, 1 H, J = 7,8 & 1,0 Hz); 7,63 (d, 1 H, J = 1,7 Hz); 7,82 (t, 1 H; J = 7,8 Hz); 8,35 (dd, 1 H, J = 7,8 & 1,0 Hz); 8,57 (d, 1 H, J = 1,7 Hz)
    • Beispiel 32 (Schema 9) 4-(2-Benzoloxythoxy)-6,6'-bis (brommethyl)-2,2'-bipyridin (32)
  • Nach der allgemeinen Verfahrensweise zur Halogenierung der Dimethylverbindungen mit N-Halogensuccinimiden (Beispiel 29A) und der Verbindung (25) als Ausgangsmaterial
  • Ausbeute: 20%
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 4,54 (s, 2 H); 4,59 (s, 2 H); 4,43 - 4,73 (m, 4 H); 7,02 (d, 1 H, J = 2 Hz); 7,43 (dd, 1 H, J = 1 & 8 Hz); 7,36 - 7,56 (m, 3 H); 7,78 (t, 1 H, J = 8 Hz); 7,99 (d, 1 H, J = 2 Hz); 7,99 - 8,15 (m, 2 H); 8,38 (dd, 1 H, J = 1 & 8 Hz)
    • Beispiel 33 (Schema 10) i) 4,4'-Bis-(2-(p-nitrophenyl)ethyl)-6,6'-dimethyl-2,2'-bipvridin-N,N'-diozid (33)
  • Nach der allgemeinen Verfahrensweise des Beispiels 29 B i) unter Anwendung auf die Verbindung (28)
  • Ausbeute: 46%
  • UV (in Ethanol): 269 nm
  • ¹HNMR (60 NHz, CDCl&sub3;): 2,53 (s, 6 H); 3,00 (bs, 8 H); 7,12 (bs, 4 H); 7,30 (d, 4 H, J = 9 Hz); 8,17 (d, 4 H, J = 9 Hz)
    • ii) 4,4'-Bis(2-(p-nitrophenyl)ethyl)-6,6'-bis(acetoxymethyl)-2,2'-bipyridin (34)
  • Nach der allgemeinen Verfahrensweise für die Diacetat-Synthese nach Beispiel 29B
  • ii) ausgehend von dem N,N'-Dioxid (33)
  • Ausbeute: 54%
  • UV (in Ethanol): 286 nm, 251 nm
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 2,17 (s, 6 H); 3,09 (bs, 8 H); 5,27 (s, 4 H), 7,12 (s, 2 H), 7,34 (d, 4 H, J = 9 Hz); 8,16 (d, 4 H, J = 9 Hz), 8,23 (s, 2 H)
    • iii) 4,4'-Bis(2-(p-nitrophenyl)ethyl)-6,6'-bis(hydroxymethyl)-2,2'-bipyridin (35)
  • Nach der allgemeinen Verfahrensweise für die Diolsynthese (Beispiel 29 B iii)) und unter Verwendung der Verbindung (34) als Ausgangsmaterial
  • Ausbeute: 90%
  • UV (in Ethanol): 284 nm
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 3,10 (bs, 8 H); 4,81 (s, 4 H); 7,21 (s, 2 H); 7,34 (d, 4 H, J = 9 Hz); 8,17 (d, 4 H, J = 9 Hz); 8,17 (s, 2 H)
    • iv) 4,4'-Bis(2-(p-nitrophenyl)ethyl)-6,6'-bis(chlormehyl)- 2,2'-bipyridin (36)
  • Nach der allgemeinen Verfahrensweise des Beispiels 29 B iv) unter Anwendung der Verbindung (35) als Ausgangsmaterial
  • Ausbeute: 36%
  • UV (in Ethanol): 278 nm, 253 nm
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 3,10 (bs, 8 H); 4,70 (s, 4 H); 7,26 (s, 2 H); 7,34 (d, 4 H, J = 9 Hz); 8,17 (d, 4 H, J = 9 Hz); 8,24 (s, 2 H)
    • Beispiel 34 i) 2,2'-Dimethyl-4,4'-bipyrimidin-N,N'-dioxid (37)
  • Die Synthese wurde nach der allgemeinen Beschreibung des Beispiels 29 B i) durchgeführt.
  • 2,2'-Dimethyl-4,4'-bipyrimidin (150 mg, 0,81 mmol) (erhalten gemäß F. Effenberger, Chem. Ber. 98, 2260-2265 (1986) vgl. Schema 7) wurde in Chloroform (2 ml) aufgelöst. m-Chlorperbenzoesäure (420 mg, 2,4 mmol), gelöst in Chloroform (5 ml) wurde langsam zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt.
  • Ausbeute: 72%
  • UV (in Ethanol): 368 nm, 295 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3; + CH&sub3;OH): 2,81 (s, 6 H), 8,29 (d, 2 H, J = 7 Hz); 8,51 (d, 2 H, J = 7 Hz)
    • ii) 2,2'-Bis(chlormethylen)-4,4'-bipyrimidin (38)
  • Die Synthese erfolgte nach der allgemeinen Beschreibung in Beispiel 29 C.
  • 2,2'-Dimethyl-4,4'-bipyrimidin-N,N'-dioxid (70 mg, 0,32 mmol), Phosphoroxychlorid (300 mg, 2,0 mmol) und 1,4-Dioxan (7 ml) wurden 4 Stunden lang am Rückfluß gekocht. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und das Produkt wurde durch eine Kurzsäulenchromatographie (5% Methanol/Chloroform) gereinigt.
  • Ausbeute: 41%
  • UV (in Ethanol): 285 nm, 276 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 4,85 (s, 4 H); 8,41 (d, 2 H, J = 5 Hz); 9,00 (d, 2 H, J = 5 Hz)
    • Beispiel 35 4,4'-Dimethyl-2,2'-Bipyrimidin-N,N'-dioxid (39)
  • Gemäß der Verfahrensweise des Beispiels 29 B i).
  • 4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyrimidin (3) (210 mg, 1,13 mmol) und m-Chlorperbenzoesäure (1,4 g, 8,4 mmol) wurden in Chloroform (15 ml) aufgelöst und 5 Stunden lang am Rückfluß gekocht. Nichtgelöste m-Chlorperbenzoesäure wurde herausfiltriert und die Produkte (drei verschiedene N,N'-Dioxide) wurden durch Flash-Chromatographie gereinigt.
  • Isomeres 1:
  • Ausbeute: 29 mg
  • UV (in Ethanol): 312 nm, 274 nm
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 2,61 (s, 6 H); 7,42 (d, 2 H, J = 5 Hz); 8,26 (d, 2 H, J = 5 Hz)
  • Isomeres 2:
  • Ausbeute: 50 mg
  • UV (in Ethanol): 316 nm, 272 nm
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 2,59 (s, 6 H); 7,44 (d, 1 H, J = 5 Hz); 7,44 (d, 1 H, J = 7 Hz); 8,28 (d, 1 H, J = 5 Hz); 8,49 (d, l H, J = 7 Hz)
  • Isomeres 3:
  • Ausbeute: 32 mg
  • UV (in Ethanol): 320 nm, 273 nm
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 2,59 (s, 6 H); 7,29 (d, 2 H; J = 7 Hz); 8,47 (d, 2 H, J = 7 Hz)
    • ii) 4,4'-Bis(chlormethylen)-2,2'-bipyrimidin (40)
  • Nach der Verfahrensweise des Beispiels 29 C
  • 4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyrimidin-N,N'-dioxid (39) (150 mg, 0,23 mmol) (Isomeres 2) wurde in 1,4-Dioxan (4 ml) gelöst und mit Phosphoroxychlorid (400 ul, 1,6 mmol) versetzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden lang am Rückfluß gekocht und sodann zur Trockene eingedampft. Etwas Ethanol wurde zugegeben und das Gemisch wurde erneut eingedampft. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Kieselsäure, 0- 5 % Methanol/Chloroform) gereinigt.
  • Ausbeute: 31%
  • UV (in Ethanol): 248 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;); 4,85 (s, 4 H); 7,76 (d, 2 H, J = 5 Hz); 9,09 (m, 2 H)
  • Die beiden anderen isomeren N,N'-Dioxide lieferten bei identischen Bedingungen das gleiche Dichlorid.
    • Beispiel 36 (Schema 6) Bis (6-brommethyl-2-pyridyl)keton (41)
  • Bis(6-hydroxymethyl-2-pyridyl)keton (14) (410 mg, 1,68 mmol), suspendiert in Dichlormethan (15 ml) wurde bei Raumtemperatur in einem 50 ml-Rundkolben gerührt. Phosphortribromid (1,82 g, 6,72 mmol) wurde auf einmal zugegeben und das Gemisch wurde 5 Minuten lang am Rückfluß gekocht. Das abgekühlte Gemisch wurde zwischen gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und Chloroform aufgeteilt. Die organische Phase wurde gesammelt, eingedampft, mit Toluol gemeinsam eingedampft und durch Flash-Chromatographie, wobei Chloroform als Lösungsmittel verwendet wurde, gereinigt.
  • Ausbeute: 87%
  • UV (in Dichlormethan): 282 nm
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 4,55 (s, 4 H); 8,16 - 7,22 (m, 6 H)
    • Beispiel 37 (Schema 12) L-Lysinethylester (42)
  • Thionylchlorid (5,0 ml, 8,06 g, 68 mmol) wurde in 500 ml eisgekühltem trockenem Ethanol eingetropft. Das geruhrte Gemisch wurde 20 Minuten lang bei dieser Temperatur gehalten und mit L-Lysinhydrochlorid (20 mg, 109 mmol) versetzt.
  • Danach wurde das Gemisch 3 Stunden lang am Rückfluß gekocht und zu einem Volumen von etwa 200 ml konzentriert. 200 ml Diethylether wurden zugegeben und das kristallisierte Produkt wurde abfiltriert.
  • Ausbeute: 97% Dihydrochlorid
    • Beispiel 38 (Schema 12) ω-N-(4-Nitrobenzoyl-L-lysinethylester (43)
  • L-Lysin HCl (5 g, 27,4 mmol), gelöst in 50 ml Wasser wurde mit 5 M NaOH bis zu einem pH-Wert von 10,5 titriert. 4-Nitrobenzoylchlorid (6,6 g, 36 mmol) in Dioxan (50 ml) und 5 M NaOH wurden langsam zugesetzt, während das heftig gerührte Reaktionsgemisch bei einem pH-Wert von 10,5 gehalten wurde.
  • Nach vollständiger Zugabe und verschwindender rosa Farbe des Reaktionsgemisches wurde mit konzentrierter HCl auf einen pH-Wert von 2 angesäuert und viermal mit Diethylether extrahiert. Die wäßrige Phase wurde zur Trockene eingedampft, zweimal mit 200 ml trockenem Ethanol gemeinsam eingedampft und das Produkt wurde in 250 ml trockenem Ethanol, der zuvor mit 10 ml Thionylchlorid behandelt worden war, suspendiert. Das Gemisch wurde 3 Stunden lang am Rückfluß gekocht, filtriert und eingedampft. Das zurückgebliebene Material wurde zwischen gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und Chloroform/Ethanol 1:1 aufgeteilt und die organische Phase wurde auf Magnesiumsulfat getrocknet, wodurch ein Rohprodukt erhalten wurde, das durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von 5% EtOH/Chloroform gereinigt wurde.
  • Ausbeute: 12%
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 8,25 (d, 2 H, J = 9 Hz); 7,93 (d, 2 H, J = 9 Hz); 6,87 (s, breit, 1 H); 4,17 (g, 2 H, J = 7 Hz); 3,30- 3,60 (m, 3 H); 1,40- 1,75 (m, 8 H); 1,24 (t, 3 H, J = 7 Hz)
    • Beispiel 39 (Schema 12) α-N-(Methoxycarbonylmethyl)-ω-N-(4-nitrobenzoyl)-L-lysinethylester (44)
  • Die Verbindung (43) (0,54 g, 1,7 mmol) wurde mit Toluol, gelöst in trockenem Acetonitril (10 ml), gemeinsam eingedampft und Bromessigsäuremethylester (0,265 g, 1,7 mmol) und anschließend pulverisiertes trockenes Natriumcarbonat (2,0 g) wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde 3 Stunden lang am Rückfluß gekocht.
  • Das Abfiltrieren der anorganischen Salze und das Abdampfen des Acetonitrils lieferte ein öliges Rohprodukt, das durch Flash-Chromatographie gereinigt wurde
  • Ausbeute: 68%
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 8,25 (d, 2 H, J = 9 Hz); 7,93 (d, 2 H, J = 9 Hz); 6,63 (s, breit, 1 H); 4,13 (q, 2 H, J = 7 Hz); 3,68 (s, 3 H); 3,30- 3,60 (m, 3 H); 1,40- 1,75 (m, 7 H); 1,24 (t, 3 H, J = 7 Hz)
    • Beispiel 40 (Schema 12) ω-N-Monomethoxytrityl-L-lysinethylester (45)
  • Trockenes Triethylamin (1,8 ml, 18 mmol) wurde zu einer Suspension von (42) (1,5 g, 6 mmol) in 20 ml trockenem Pyridin gegeben. Zu diesem bei Raumtemperatur gerührten Gemisch wurde festes Monomethoxytritylchlorid (1,96 g, 6 mmol) (NMTrCl) in kleinen Portionen während eines Zeitraums von 1 Stunde gegeben, wonach das Gemisch weitere 2 Stunden lang gerührt wurde. Eine Standard-Natriumbicarbonat-Aufarbeitung und eine anschließende Extraktion mit Chloroform ergab ein Rohprodukt, das mit dem α-MMTr-Isomeren verunreinigt war.
  • Das reine Titelprodukt wurde leicht durch Flash-Säulenchromatographie aufgrund der großen Rf-Differenz zwischen den Isomeren isoliert.
  • Ausbeute: 48%
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 7,5- 6,75 (m, 14 H); 4,18 (q, 2 H, J = 7 Hz); 3,78 (s, 3 H); 3,45- 3,37 (m, 1 H); 2,14 - 2,10 (t, 2 H, J = 7 Hz); 1,75 - 1,35 (m, 9 H); 1,26 (t, 3 H, J = 7 Hz)
  • Ausbeute: 87%
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 7,10 (t, 1 H, austauschbar); 4,21 - 4,16 (q, 2 H); 3,45 - 3,40 (m, 1 H); 3,38- 3,31 (m, 2 H); 1,84 (s, 2 H, austauschbar); 1,82 - 1,40 (m, 6 H); 1,28 (t, 3 H)
    • Beispiel 43 (Schema 12) α-N-(Methoxycarbonylmethyl)-ω-N-trifluoracetyl-L-lysinethylester (48)
  • Das L-Lysinderivat (47) (1,0 g, 3,7 mmol) wurde in das Produkt (48) nach einer Beispiel 39 analogen Methode umgewandelt.
  • Ausbeute: 83%
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3; + CD&sub3;OD): 4,4 - 4,0 (q, 2 H); 3,68 (s, 3 H); 3,5 - 3,1 (m, 5 H); 1,8 - 1,4 (m, 6 H); 1,23 (t, 3 H)
    • Beispiel 44 (Schema 12) ω-N-(4-Hydroxybutyryl)-L-lysinethylester (49)
  • L-Lysinethylester, 2 HCl (42) (2 g, 8,1 mmol) in 30 ml trockenem Ethanol wurde mit trockenem Triethylamin (5,63 ml, 40,5 mmol) und γ-Butyrolacton (0,7 g, 8,1 mmol) behandelt, und die erhaltene Suspension wurde 3 Stunden lang am Rückfluß gekocht.
  • Das Abdampfen der flüchtigen Substanzen und das gemeinsame Abdampfen mit Toluol ergab ein Rohprodukt, das mit Flash- Chromatographie unter Verwendung von 20% Methanol/Chloroform als Lösungsmittel gereinigt wurde.
  • Ausbeute: 73%
  • ¹HNMR (400 MHZ, CDCl&sub3; + CD&sub3;OD): 4,30 - 4,22 (q, 2 H); 3,72 - 3,77 (m, 1 H); 3,58 - 3,65 (t, 2 H); 3,18 - 3,28 (m, 2 H); 2,30 - 2,36 (t, 2 H), 1,40 - 2,00 (m, 8 H); 1,28 - 1,34 (t, 3 H)
    • Beispiel 45 (Schema 12) α-N-(Methoxycarbonylmethyl)-ω-N-(4-hydroxybutyryl)-L-lysinethylester (50)
  • Die Verbindung (49) (1,22 g, 4,68 mmol) in 20 ml trockenem Acetonitril wurde durch eine dem Beispiel 39 analoge Reaktion in das Produkt (50) umgewandelt.
  • Ausbeute: 64%
  • ¹HNMR (400 MHZ, CDCl&sub3;): 6,25 (s, breit, 1 H), 4,16 - 4,21 (q, 2 H); 3,73 (s, 3 H); 3,67 - 3,69 (t, 2 H); 3,33 - 3,49 (m, 2 H); 3,20 - 3,30 (m, 3 H); 2,34 - 2,37 (t, 2 H); 1,40 - 1,90 (m, 8 H); 1,26 - 1,30 (t, 3 H)
    • Beispiel 46 (Schema 13) ALLGEMEINE VERFAHRENSWEISE ZUR SYNTHESE DES NICHT-FUNKTIONALISIERTEN TETRAESTERS
  • Die Bis(halogenmethyl)verbindung (1,0 mmol), Di-t-butyl-, Diethyl- oder Dimethyliminodiacetat (2,5 mmol), Natriumcarbonat (250 mg), und Acetonitril (10 ml) werden über Nacht am Rückfluß gekocht. Das Gemisch wird filtriert, das Lösungsmittel wird abgedampft und das Produkt wird durch Flash-Chromatographie gereinigt.
    • Beispiel 47 (Schema 9) 4-(2-Benzoyloxyethoxy)-6,6'-bis(N,N-bis(ethoxycarbonylmethyl)aminomethyl)-2,2'-bipyridin (51)
  • Unter Verwendung der allgemeinen Verfahrensweise der Tetraestersynthese des Beispiels 46 und der Verbindung (32) als Ausgangsmaterial.
  • Ausbeute: 63%
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 1,23 (t, 12 H, J = 7 Hz); 3,65 (s, 8 H); 4,10 (s, 4 H); 4,16 (q, 8 H, J = 7 Hz); 4,50 - 4,77 (m, 4 H); 7,24 (d, 1 H, J = 2 Hz); 7,56 (d, 1 H, J = 8 Hz); 7,39 - 7,60 (m, 3 H); 7,79 (t, 1 H, J = 8 Hz); 7,97 - 8,16 (m, 2 H); 8,02 (d, 1 H, J = 2 Hz); 8,31 (d, 1 H, J = 8 Hz)
    • Beispiel 48 (Schema 9) 4-(2-Hydroxyethoxy)-6,6'-bis(N,N-bis(ethoxycarbonylmethyl)aminomethyl)-2,2'-bipyridin (52)
  • 4-(2-Benzoyloxyethoxy)-6,6'-bis(N,N-bis(ethoxycarbonylmethyl)aminomethyl)-2,2'-bipyridin (220 mg, 0,31 mmol) wurde zu einer Lösung, enthaltend Ethanol (20 ml) und Thionylchlorid (1,5 ml), gegeben. Das Gemisch wurde über Nacht am Rückfluß gekocht und sodann eingedampft. Der Rückstand wurde in Chloroform aufgelöst und mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Das Produkt wurde durch Flash- Chromatographie (Kieselsäure, 0- 5% Methanol/Chloroform) gereinigt.
  • Ausbeute: 36%
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 1,25 (t, 12 H, J = 7 Hz); 3,65 (s, 8 H); 4,11 (s, 4 H); 4,17 (q, 8 H, J = 7 Hz); 3,99 - 4,35 (m, 4 H); 7,21 (d, 1 H, J = 2 Hz); 7,54 (dd, 1 H, J = 2 & 7 Hz); 7,77 (t, 1 H, J = 7 Hz); 7,90 (d, 1 H, J = 2 Hz); 8,28 (dd, 1 H, J = 2 & 7 Hz)
    • Beispiel 49 (wie in Schema 13) 4,4'-Bis(N,N-bis(t-butoxycarbonylmethyl)aminomethyl)-2,2'- bipyrimidin (53)
  • 4,4'-Bis(chlormethyl)-2,2'-bipyrimidin (18,0 mg, 0,0793 mmol), Di-t-butyliminodiacetat (76,3 mg, 0,31 mmol), Natriumcarbonat (210 mg) und Acetonitril (3 ml) wurden über Nacht am Rückfluß gekocht. Das Gemisch wurde filtriert, das Lösungsmittel wurde abgedampft und das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie (Kieselsäure 0 - 5% Methanol/Chloroform) gereinigt.
  • Ausbeute: 47%
  • UV (in Ethanol): 244 nm
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 1,45 (s, 36 H); 3,50 (s, 8 H); 4,23 (s, 4 H); 7,97 (d, 2 H, J = 5 Hz); 8,97 (d, 2 H, J = 5 Hz)
    • Beispiel 50 (Schema 14) 4-Brom-6,6'-bis(N.N-bis(t-butoxycarbonylmethyl)aminomethyl)-2,2-bipyridin (54)
  • Nach der allgemeinen Verfahrensweise des Beispiels 46 und unter Verwendung der Verbindung (31) als Ausgangsmaterial.
  • UV (in Ethanol): 291 nm, 242 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 1,47 (s, 36 H); 3,52 (s, 8 H); 4,10 (s, 2 H); 4,11 (s, 2 H); 7,66 (d, 1 H, J = 7,6 Hz); 7,78 (t, 1 H, J = 7,6 Hz); 7,83 (s, 1 H); 8,27 (d, 1 H, J = 7,6 Hz); 8,49 (s, 1 H)
    • Beispiel 51 2,2'-Bis(N,N-bis(t-butoxycarbonylmethyl)aminomethyl)-4,4'- bipyrimidin (55)
  • Unter Verwendung der allgemeinen Verfahrensweise von Beispiel 46 und der Verbindung (38) als Ausgangsmaterial
  • UV (in Ethanol): 276 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 1,45 (s, 36 H); 3,68 (s, 8 H); 4,34 (s, 4 H); 8,34 (d, 2 H, J = 5,1 Hz); 8,91 (d, 2 H, J = 5,1 Hz)
    • Beispiel 52 6,6'-Bis(N,N-bis(ethoxycarbonylmethyl)aminomethyl-2-pyridyl)keton (56)
  • Diese Verbindung wurde nach der allgemeinen Verfahrensweise des Beispiels 46 unter Anwendung der Verbindung (41) als Ausgangsmaterial synthetisiert.
  • Ausbeute: 82%
  • UV (in CH&sub2;Cl&sub2;): 280 nm
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 1,21 (t, 12 H); 3,60 (s, 8 H); 4,08 (s, 4 H); 4,15 (q, 8 H); 7,95 - 7,80 (m, 6 H)
    • Beispiel 53 (Schema 13) ALLGEMEINE VERFAHRENSWEISE ZUR SYNTHESE DER REAKTIVEN LIGANDEN ODER DES CHELATS UNTER ANWENDUNG VON DERIVATEN VON α,ω-DIAMINOSÄUREN ALS AUSGANGSMATERIAL
  • a) Das entsprechende Dihalogenmethylbipyridin oder -bipyrimidin (1 mmol) in trockenem Acetonitril (10 ml) wird mit 1 mmol einer der Verbindungen (44), (46), (48) oder (50) in Gegenwart von 2 g pulversisiertem trockenem Natriumcarbonat bei Raumtemperatur unter heftigem Rühren umgesetzt. Nach über Nacht erfolgendem Rühren wird das resultierende Gemisch, bestehend aus nicht-umgesetztem Dihalogenmethylderivat, Monohalogenmethyldiester und Tetraester eingedampft, mit Toluol gemeinsam eingedampft und Flash-chromatographiert, wodurch der reine Monohalogenmethylester erhalten wird.
  • b) Der erhaltene Monohalogenmethylester (0,2 mmol) wird gemeinsam mit trockenem Acetonitril eingedampft, und das Produkt wurde in 3 ml Acetonitril aufgelöst. Es werden 1 g gepulvertes Natriumcarbonat und anschließend Iminodiessigsäurediethylester (0,25 mmol) zugesetzt. Das Gemisch wird über Nacht am Rückfluß gekocht, filtriert und eingedampft. Der gewünschte funktionalisierte Tetraester wird durch Kurzsäulen-Chromatographie erhalten.
  • c) Wenn die Verbindung (44) als Ausgangsmaterial in Beispiel 53 a) verwendet wird, dann muß die Nitrogruppe zu der Aminogruppe vor der Estergruppenhydrolyse und der Chelatbildung reduziert werden. Dies wird wie folgt durchgeführt:
  • Festes Natriumborhydrid (0,3 mmol) wird zu dem Gemisch des Beispiels 53 b) gegeben. Danach werden 0,2 g Palladium auf Kohle (10%) in 5 ml trockenem Ethanol umgesetzt. Das resultierende Gemisch wird bei Raumtemperatur 10 Minuten lang gerührt und zwischen gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und Chloroform aufgeteilt. Die eingedampften organischen Extrakte werden Flash-chromatographiert, wodurch die jeweiligen Tetraester, die eine reaktive Aminogruppe enthalten, erhalten werden.
  • d) Wenn die Verbindung (50) als Ausgangsmaterial in Beispiel 53 a) verwendet wird, dann muß ihre Seitenketten- Hydroxylgruppe aktiviert werden, um die nachfolgende Kupplung eines solchen Liganden an die anderen hydroxylhaltigen Materialien zu gestatten. Dies kann auf verschiedenen Wegen, die dem Fachmann bekannt sind, durchgeführt werden. Hierin wird eine der Möglichkeiten angegeben, die beispielsweise für die direkte Kupplung eines aktivierten Liganden an durch das Festphasenverfahren synthetisierte Oligonucleotide angewendet werden kann.
  • 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylaminophosphochloridat (2 mmol) wird zu einem Gemisch des Hydroxytetraesters des Beispiels 53 b) und von Diisopropylethylamin (4,6 mmol) wasserfreiem Dichlormethan (10 ml) gegeben. Nach 15minütigem Rühren bei Raumtemperatur wird das Gemisch mit kalter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, mit Dichlormethan extrahiert, eingedampft und durch Silicagel-Säulenchromatographie gereinigt, wobei Petrolester/Triethylamin 9:1 als Elutionslösungsmittel verwendet werden.
    • Beispiel 54 (Schema 13) ALLGEMEINE VERFAHRENSWEISE FÜR DIE TETRASÄURESYNTHESE AUSGEHEND VON DEM DIETHYL- ODER TETRAETHYLESTER
  • Das Bis(N,N-bis(ethoxycarbonylmethyl)aminomethyl)derivat (0,25 mmol) wurde in Aceton (10 ml) aufgelöst. 1 N Natriumhydroxidlösung (10 ml) wurde zugesetzt. Nach 1 Stunde wurde die Lösung mit konzentrierter Salzsäure neutralisiert. Der größte Teil der Salzsäure wurde durch Zugabe von Aceton ausgefällt. Nach dem Filtrieren wurde die Lösung zur Trokkene eingedampft.
    • Beispiel 55 (Schema 13) ALLGEMEINE VERFAHRENSWEISE FÜR DIE TETRASÄURESYNTHESE AUSGEHEND VON DEM TETRA-t-BUTYLESTER
  • Das Bis(N,N-bis(t-butoxycarbonylmethyl)aminomethyl)derivat (0,25 mmol) wurde in Trifluoressigsäure (10 ml) aufgelöst. Nach 5stündigem Rühren wurde die Trifluoressigsäure abgedampft und es wurde etwas Diethylether zugesetzt. Das Produkt wurde filtriert und getrocknet.
    • Beispiel 56 ALLGEMEINE VERFAHRENSWEISE ZUR EUROPIUM- ODER TERBIUMCHELATSYNTHESE
  • Die Tetrasäure (0,20 mmol) wurde in Wasser aufgelöst und der pH-Wert wurde auf 5,0 - 5,5 eingestellt. Europium- oder Terbiumchlorid (0,20 mmol), gelöst in Wasser, wurde zugesetzt. Nach 30minütigem Rühren wurde der pH-Wert auf 8,0 eingestellt und der Niederschlag wurde herausfiltriert. Der größte Teil des Wassers wurde bei vermindertem Druck abgedampft und das Produkt wurde durch Zugabe von Aceton ausgefällt.
    • Beispiel 57 (Schema 14) VERFAHRENSWEISE FÜR DIE PHENYLETHYNYLIERUNG DER BIPYRIDINTETRAESTER
  • Ref: J. Kankare et al., EP-A-203 047
  • 4-Brom-6,6'-bis(N,N-bis(t-butoxycarbonylmethyl)aminomethyl)-2,2'-bipyridin (750 mg, 1,0 mmol) oder das entsprechende 4,4'-Dibromderivat (414 mg, 0,50 mmol), Bis(triphenylphosphin)palladium(II)-chlorid (14,0 mg, 0,020 mmol) und Kupfer(I)-iodid (7,6 mg, 0,040 mmol) wurden in trockenem Triethylamin (15 ml) aufgelöst. Nach 10minütigem Durchperlenlassen von Stickstoffgas durch das System wurde ein substituiertes Alkin (1,2 mmol) zugegeben. Nach Rühren bei 40 - 50ºC, das gewöhnlich 3 Stunden lang durchgeführt wurde, wurde die Lösung filtriert und der Niederschlag wurde mit trockenem Triethylamin gewaschen. Die Lösungsmittel wurden abgedampft und der Rückstand wurde in Chloroform aufgelöst. Nach der Extraktion mit Wasser wurde die Chloroformphase getrocknet und abgedampft. Das Produkt wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt.
    • 4- (p-Aminophenylethynyl)-6,6'-bis(N,N-bis(t-butoxycarbonylmethyl)aminomethyl)-2,2'-bipyridin (57)
  • Unter Verwendung von p-Aminophenylacetylen als substituiertes Alkin
  • UV (in Ethanol): 338 nm, 314 nm, 294 nm, 231 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 1,47 (s, 18 H); 1,48 (s, 18 H); 3,53 (s, 4 H); 3,55 (s, 4 H); 4,12 (s, 2 H); 4,13 (s, 2 H); 6,65 (d, 2 H, J = 8,7 Hz); 7,36 (d, 2 H, J = 8,7 Hz); 7,64 (d, 1 H, J = 7,8 Hz); 7,67 (d, 1 H, J = 1,4 Hz); 7,78 (t, 1 H, J = 7,8 Hz); 8,30 (d, 1 H, J = 7,8 Hz); 8,37 (d, 1 H, J = 1,4 Hz)
    • Beispiel 58 (Schema 14) 4-(p-Aminophenylethynyl)-6,6'-bis(N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl)-2,2'-bipyridin (58)
  • Unter Verwendung der Methode des Beispiels 55 mit Verbindung (57) als Ausgangsmaterial.
  • UV (in Wasser): 297 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, DMSO): 3,68 (s, 4 H); 3,70 (s, 4 H); 4,22 (s, 2 H); 4,30 (s, 2 H); 6,62 (d, 2 H; J = 8,0 Hz); 7,33 (d, 2 H, J = 8,0 Hz); 7,65 (s, 1 H); 7,66 (d, 1 H, J = 7,5 Hz); 8,01 (t, 1 H, J = 7,5 Hz); 8,29 (d, 1 H, J = 7,5 Hz); 8,33 (s, 1 H)
    • Beispiel 59 (Schema 14) 4-(p-Aminophenylethynyl)-6,6'-bis(N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl)-2,2'-bipyridin als Europiumchelat (59)
  • Die Synthese wurde nach der allgemeinen Vertahrensweise für die Europiumchelat-Synthese gemäß Beispiel 56 und unter Anwendung der Verbindung (58) durchgeführt.
  • UV (in Wasser): 317 nm, 240 nm
    • Beispiel 60 ALLGEMEINE VERFAHRENSWEISE FÜR DIE ISOTHIOCYANATCHELAT-SYNTHESE
  • Ref: Mikola et al., EP-A-0 139 675
  • Das Aminochelat (0,05 mmol) wurde in 3 ml Wasser aufgelöst und mit Natriumhydrogencarbonat (20 mg) versetzt. Diese Chelatlösung wurde langsam zu der Thiophosgenlösung (20 ul) in Chloroform (3 ml) gegeben und 30 Minuten lang gerührt. Die Phasen wurden getrennt und die wäßrige Phase wurde mit Chloroform extrahiert. Die wäßrige Phase wurde zu einem kleinen Volumen eingedampft und das Produkt wurde mit Aceton ausgefällt und getrocknet.
    • Beispiel 61 (Schema 14) 4-(p-Isothiocyanatphenylethynyl)-6,6'-bis(N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl)-2,2'-bipyridin als Europiumchelat (60)
  • Unter Anwendung der Isothiocyanat-Synthese des Beispiels 60 auf das Chelat 59.
  • UV (in Wasser): 317 nm
    • Beispiel 62 (Schema 9) Synthese des (61)-Phosphitamidatderivats der Verbindung (52)
  • Diese Synthese wurde im wesentlichen entsprechend Beispiel 53 d) unter Verwendung der Verbindung (52) als Ausgangsmaterial durchgeführt.
  • Ausbeute: 72%
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 1,20 (d, 6 H, J = 2 Hz); 1,21 (d, 6 H, J = 2 Hz); 1,25 (t, 6 H, J = 7 Hz); 1,27 (t, 6 H, J = 7 Hz); 2,65 (t, 2 H, J = 5 Hz); 3,67 (s, 8 H); 3,60 - 3,70 (m, 2 H); 3,82 - 3,92 (m, 2 H); 3,9 3- 4,00 (m, 1 H); 4,04 - 4,11 (m, 1 H); 4,10 (s, 2 H); 4,15 (s, 2 H); 4,17 (q, 8 H, J = 7 Hz); 4,30 (t, 2 H, J = 5 Hz); 7,18 (d, 1 H, J = 2 Hz); 7,59 (d, 1 H, J = 8 Hz); 7,76 (t, 1 H, J = 8 Hz); 7,89 (d, 1 H, J = 2 Hz); 8,29 (d, 1 H, J = 8 Hz)
  • ³¹PNMR (CDCl&sub3;): 148,9 (s)
    • Beispiel 63 (Schema 10) 4,4'-Bis(2-(p-nitrophenyl)-ethyl)-6,6'-bis(N,N-bis(ethoxycarbonylmethyl)aminomethyl)-2,2'-bipyridin (62)
  • Die Synthese wurde unter Anwendung der allgemeinen Methode zur Tetraestersynthese wie in Beispiel 46 unter Verwendung der Verbindung (36) durchgeführt.
  • Ausbeute: 45%
  • UV (in Ethanol): 282 nm
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 1,25 (t, 12 H, J = 7 Hz); 3,09 (bs, 8 H); 3,62 (s, 8 H); 4,12 (s, 4 H); 4,18 (q, 8 H, J = 7 Hz); 7,35 (d, 4 H, J = 9 Hz); 7,43 (s, 2 H); 8,15 (d, 4 H, J = 9 Hz); 8,16 (s, 2 H)
    • Beispiel 64 (Schema 10) 4,4'-Bis(2-(p-aminophenyl)-ethyl)-6,6'-bis(N,N-bis(ethoxycarbonylmethyl)aminomethyl)-2,2'-bipyridin (63)
  • Die Synthese wurde im wesentlichen entsprechend Beispiel 53 c) unter Verwendung der Verbindung (62) als Ausgangsmaterial durchgeführt.
  • Ausbeute: 28%
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 1,25 (t, 12 H, J = 7 Hz); 2,91 (bs, 8 H); 3,70 (s, 8 H); 4,12 (s, 4 H); 4,18 (q, 8 H, J = 7 Hz); 6,64 (d, 4 H, J = 8 Hz); 6,99 (d, 4 H, J = 8 Hz); 7,30 (s, 2 H); 8,10 (s, 2 H)
    • Beispiel 65 (Schema 10) 4,4'-Bis(2-(p-aminophenyl)-ethyl)-6,6'-bis(N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl)-2,2'-bipyridin (64)
  • Die Synthese wurde nach der allgemeinen Methode entsprechend Beispiel 54 und unter Verwendung der Verbindung (63) als Ausgangsmaterial durchgeführt.
  • UV (in Wasser): 300 nm, 289 nm, 235 nm
  • ¹HNMR (60 MHz, DMSO): 3,00 (bs, 8 H); 3,35 (s, 8 H); 3,64 (s, 4 H); 6,65 (d, 4 H, J = 8 Hz); 7,02 (d, 4 H, J = 8 Hz); 7,28 (s, 2 H); 8,10 (s, 2 H);
    • Beispiel 66 (Schema 10) 4,4'-Bis(2-(p-aminophenyl)-ethyl)-6,6'-bis(N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl)-2,2'-bipyridin als Europiumchelat (65)
  • Die Synthese wurde nach der allgemeinen Verfahrensweise für die Europiumchelat-Synthese (Beispiel 56) unter Verwendung der Verbindung (64) als Ausgangsmaterial durchgeführt.
  • UV (in Wasser): 310 nm, 299 nm, 234 nm
    • Beispiel 67 (Schema 10) 4,4'-Bis(2-(p-isothiocyanatphenyl)-ethyl)-6,6'-bis(N,N- bis(carboxymethyl)aminomethyl)-2,2'-bipyridin-europiumchelat (66)
  • Die Synthese wurde unter Verwendung der allgemeinen Verfahrensweise für die Isothiocyanatchelat-Synthese (Beispiel 60), angewendet auf die Verbindung (65) durchgeführt.
  • UV (in Wasser): 318 nm, 280 nm
    • Beispiel 68 (Schema 5) 6,6'-Dimethyl-4,4'-diphenyl-2,2'-bipyridin (67)
  • Ref: F. Kroehnke, Synthesis, 1 - 24 (1976)
  • 2,62 g (10,0 mmol) 1,6-Dipheny1-3,4-dioxo-butan-1,5-dien, 3,43 g (20 mmol) Acetonylpyridiniumchlorid, 20 g Ammoniumacetat und 100 ml Methanol wurden 4 Stunden lang am Rückfluß gekocht. Nach dem Abkühlen auf 0ºC wurde das ausgefällte Produkt abfiltriert und aus Methanol umkristallisiert.
  • Ausbeute: 40%
  • UV (in Ethanol): 302 nm, 246 nm
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 2,70 (s, 6 H); 7,41 - 7,79 (m, 12 H); 8,50 (s, 2 H)
    • Beispiel 69 (Schema 15A) 6,6'-Bis(brommethyl)-4,4'-diphenyl-2,2'-bipyridin (68)
  • Diese Verbindung wurde nach der allgemeinen Verfahrensweise des Beispiels 29 zur Halogenierung von Dimethylverbindungen mit N-Halogensuccinimiden synthetisiert.
  • Ausbeute: 32%
  • UV (in Ethanol): 299 nm, 252 nm
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 4,71 (s, 4 H); 7,45 - 7,74 (m, 12 H); 8,68 (d, 2 H, J = 2 Hz)
    • Beispiel 70 (Schema 15A) 4,4'-Diphenyl-6-(N-(methoxycarbonylmethyl)-N-(1-(5-(p-nitrobenzamido))-1-(ethoxycarbonyl)-pentyl)-aminomethyl)-6'- brommethyl-2,2'-bipyridin (Verbindung (69)) und 4,4'-Diphenyl-6,6'-bis(N-(methoxycarbonylmethyl)-N-(1-(5-(p-nitrobenzamido))-1-(ethoxycarbonyl)-pentyl)aminomethyl)-2,2'-bipyridin (Verbindung (70))
  • Die allgemeine Verfahrensweise des Beispiels 53a lieferte sowohl Diester- als auch Tetraesterverbindungen, als das 6,6'-Bis(brommethyl)-4,4'-diphenyl-2,2'-bipyridin (68) und der modifizierte Iminodiessigsäureester (Verbindung 44) im Verhältnis 1:1,2 verwendet wurden.
  • Verbindung (69)
  • Ausbeute: 41%
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 1,26 (t, 3 H, J = 7 Hz); 1,56- 1,90 (m, 6 H) ; 3,30 - 3,54 (m, 3 H); 3,54 (s, 3 H); 3,75 (s, 2 H); 4,14 (s, 2 H); 4,19 (q, 2 H, J = 7 Hz); 4,70 (s, 2 H), 7,36- 7,85 (m, 12 H); 7,78 (d, 2 H, J = 9 Hz); 8,12 (d, 2 H, J = 9 Hz); 8,60 (d, 1 H, J = 2 Hz); 8,63 (d, 1 H, J = 2 Hz)
  • Verbindung (70)
  • Ausbeute: 21%
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 1,28 (t, 6 H, J = 7 Hz); 1,56 - 1,90 (m, 12 H); 3,28 - 3,50 (m, 6 H); 3,56 (s, 6 H); 3,74 (s, 4 H); 4,14 (s, 4 H); 4,20 (q, 4 H, J = 7 Hz); 7,36 - 7,80 (m, 12 H); 7,80 (d, 4 H, J = 9 Hz); 8,10 (d, 4 H, J = 9 Hz); 8,57 (d, 2 H, J = 2 Hz)
    • Beispiel 71 (Schema 15A) 4,4'-Diphenyl-6-(N-(methoxycarbonylmethyl)-N-(1-(5-(p-nitrobenzamido))-1-(ethoxycarbonyl)-pentyl)-aminomethyl)-6'- (N,N-bis(ethoxycarbonylmethyl)aminomethyl)-2,2'-bipy-ridin (71)
  • Diese Verbindung wurde nach der allgemeinen Verfahrensweise für die Tetraestersynthese gemäß Beispiel 53b unter Verwendung der Verbindung (69) und von Diethyliminodiacetat als Ausgangsmaterial synthetisiert.
  • Ausbeute: 51%
  • UV (in Ethanol): 300 nm, 252 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 1,21 (t, 6 H, J = 7 Hz); 1,27 (t, 3 H, J = 7 Hz); 1,50 - 1,90 (m, 6 H); 3,35 - 3,50 (m, 3 H); 3,57 (s, 3 H); 3,71 (s, 6 H); 4,14 (q, 6 H, J = 7 Hz); 4,18 (s, 2 H); 4,19 (s, 2H); 7,45 - 7,83 (m, 12 H); 7,73 (d, 2 H, J = 8 Hz); 8,11 (d, 2 H, J = 8 Hz); 8,58 (d, 2 H, J = 2 Hz)
    • Beispiel 72 (Schema 15B) 4,4'-Diphenyl-6,6'-bis(N-(methoxycarbonylmethyl)-N-(1-(5- (p-aminobenzamido))-1-(ethoxycarbonyl)-pentyl)aminomethyl)- 2,2'-bipyridin (72)
  • Die Verbindung (70) wurde mit Palladium auf Kohle und Natriumborhydrid gemäß der allgemeinen Beschreibung des Beispiels 53c reduziert.
  • Ausbeute: 76%
  • UV (in Ethanol): 270 nm, 256 nm
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 1,25 (t, 6 H, J = 7 Hz); 1,43 - 1,87 (m, 6 H) ; 3,22 - 3,52 (m, 6 H); 3,61 (s, 6 H) ; 3,71 (s, 4 H); 4,16 (q, 4 H, J = 7 Hz), 4,19 (s, 4 H); 6,55 (d, 4 H, J = 8 Hz); 7,38 - 7,91 (m, 12 H); 7,53 (d, 4 H, J = 8 Hz); 8,62 (d, 2 H, J = 2 Hz)
    • Beispiel 73 (Schema 15) 4,4'-Diphenyl-6-(N-(methoxycarbonylmethyl)-N-(1-(5-(p-aminobenzamido))-1-(ethoxycarbonyl)-pentyl)aminomethyl)-6'- (N,N-bis(ethoxycarbonylmethyl)aminomethyl)-2,2'-bipyridin (73)
  • Diese Verbindung wurde durch eine Synthese, die derjenigen des Beispiels 72 analog war, unter der Verwendung der Verbindung (71) als Ausgangsmaterial hergestellt.
  • Ausbeute: 79%
  • UV (in Ethanol): 252 nm
  • ¹HNMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 1,25 (t, 9 H, J = 7 Hz); 1,47 - 1,87 (m, 6 H); 3,25 - 3,47 (m, 3 H); 3,61 (s, 3 H); 3,69 (s, 4 H); 3,71 (s, 2 H); 4,16 (q, 6 H, J = 7 Hz); 4,22 (s, 4 H); 6,57 (d, 2 H, J = 8 Hz); 7,39 - 7,91 (m, 12 H); 7,53 (d, 2 H, J = 8 Hz); 8,60 (d, 1 H, J = 2 Hz); 8,63 (d, 1 H, J = 2 Hz)
    • Beispiel 74 (Schema 15) 4,4'-Diphenyl-6,6'-bis(N-(carboxymethyl)-N-(1-(5-(p-aminobenzamido))-1-carboxypentyl)aminomethyl)-2,2'-bipyridin und das entsprechende Europiumchelat (74)
  • Unter Verwendung der Verbindung (72) als Ausgangsmaterial wurde die Titelverbindung durch die allgemeine Verfahrensweise zur Hydrolyse der Tetraester (Beispiel 55) und der Europiumchelatbildung (allgemeines Beispiel 56) erhalten.
  • UV (als Natriumsalz): 261 nm
  • UV (als Eu³&spplus;-Komplex): 330 nm, 315 nm, 268 nm
    • Beispiel 75 (Schema 15) 4,4'-Diphenyl-6-(N-(carboxymethyl)-N-(1-(5-(p-aminobenzamido))-1-carboxypentyl)aminomethyl)-6'-(N,N -bis(carboxymethyl)aminomethyl)-2,2'-bipyridin und entsprechendes Europiumchelat (75)
  • Unter Verwendung der Verbindung (71) als Ausgangsmaterial wurde die Titelverbindung durch die allgemeinen Verfahrensweisen für die Hydrolyse der Tetraester (Beispiel 55) und der Europiumchelatbildung (wie in allgemeinem Beispiel 56) erhalten.
  • UV (als Natriumsalz): 310 nm, 256 nm
  • UV (als Eu³&spplus;-Komplex): 330 nm, 315 nm, 261 nm
    • Beispiel 76 (Schema 16) 4-Ethoxy-6,6'-bis(brommethyl)-2,2'-bipyridin (76)
  • Diese Verbindung wurde nach der allgemeinen Verfahrensweise des Beispiels 29A zur Halogenierung der Dimethylverbindungen mit N-Halogensuccinimiden unter Verwendung der Verbindung (22) als Ausgangsmaterial synthetisiert.
  • Ausbeute: 19%
  • UV (in Ethanol): 286 nm, 225 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 1,45 (t, J = 7,0 Hz); 4,19 (q, J = 7,0 Hz); 4,55 (s); 4,60 (s); 6,95 (d, J = 2,3 Hz); 7,43 (dd, J = 0,9 Hz & 7,6 Hz); 7,77 (t, J = 7,6 Hz); 7,90 (d, J = 2,3 Hz); 8,35 (dd, J = 0,9 Hz & 7,6 Hz)
    • Beispiel 77 (Schema 16) 4-Ethoxy-6-(N-(methoxycarbonylmethyl)-N-(1-(5-(p-nitrobenzamido))-1-(ethoxycarbonyl)-pentyl)-aminomethyl)-6'- brommethyl-2,2'-bipyridin (77)
  • Diese Verbindung wurde nach der allgemeinen Verfahrensweise des Beispiels 53a synthetisiert. 4-Ethoxy-6,6'- bis(brommethyl)-2,2'-bipyridin (76) und modifizierter Iminodiessigsäureester (Verbindung 44) wurden als Ausgangsmaterialien verwendet.
  • Ausbeute: 38%
  • UV (in Ethanol): 286 nm, 220 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 1,30 (t, J = 7 Hz); 1,45 (t, J = 7 Hz); 1,55 - 1,68 (m); 1,75 - 1,83 (m); 3,45 (m); 3,50 (m); 3,55 (d, J = 15 Hz); 3,64 (s); 3,66 (d, J = 15 Hz); 3,94 (d, J = 15 Hz); 4,03 (d, J = 15 Hz); 4,18 (q, J = 7 Hz); 4,19 (q, J = 7 Hz); 4,58 (s); 6,83 (s); 7,45 (s); 7,62 (d, J = 7 Hz); 7,76 (t, J = 7 Hz); 8,00 (d, J = 9 Hz); 8,25 (d, J = 9 Hz); 8,28 (d, J = 7 Hz); 8,35 (s)
    • Beispiel 78 (Schema 16) 4-Ethoxy-6-(N-(methoxycarbonylmethyl)-N-(1-(5-(p-nitrobenzamido))-1-(ethoxycarbonyl)-pentyl)-aminomethyl-6'-(N,N- bis(ethoxycarbonylmethyl)aminomethyl)-2,2'-bipyridin (78)
  • Diese Verbindung wurde nach der allgemeinen Tetraester-Synthese des Beispiels 53b unter Verwendung der Verbindung (77) und von Diethyliminodiacetat als Ausgansmaterialien hergestellt.
  • Ausbeute: 62%
  • UV (in Ethanol): 287 nm, 222 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 1,26 (t, J = 7 Hz); 1,28 (t, J = 7 Hz); 1,46 (t, J = 7 Hz); 1,59 (m); 1,76 (m); 3,35 (m); 3,49 (m); 3,58 (d, J = 15 Hz); 3,65 (s); 3,66 (s); 3,67 (s); 3,71 (d, J = 15 Hz); 3,96 (d, J = 15 Hz); 4,05 (d, J = 15 Hz); 4,09 (s); 4,14 (q, J = 7 Hz); 4,17 (q, J = 7 Hz); 6,88 (s); 7,15 (d, J = 2 Hz); 7,50 (d, J = 7 Hz); 7,75 (d, J = 7 Hz); 7,83 (d, J = 2 Hz); 8,01 (d, J = 9 Hz); 8,24 (d, J = 7 Hz); 8,26 (d, J = 9 Hz)
    • Beispiel 79 (Schema 16) 4-Ethoxy-6-(N-(methoxycarbonylmethyl)-N-(1-(5-(p-aminobenzamido))-1-(ethoxycarbonyl)-pentyl)-aminomethyl)-6'- (N,N-bis(ethoxycarbonylmethyl)aminomethyl)-2,2'-bipyridin (79)
  • Diese Verbindung wurde nach der allgemeinen Verfahrensweise zur Reduktion der Nitrogruppen des Beispiels 53c, wobei die Verbindung (78) als Ausgangsmaterial verwendet wurde, synthetisiert.
  • Ausbeute: 71%
  • UV (in Ethanol): 286 nm, 222 nm
  • ¹HNMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 1,26 (t, J = 7 Hz); 1,28 (t, J = 7 Hz); 1,46 (t, J = 7 Hz); 1,60 (m); 1,75 (m); 3,41 (m); 3,44 (m); 3,54 (d, J = 15 Hz); 3,62 (d, J = 15 Hz); 3,64 (s); 3,69 (s); 3,92 (d, J = 15 Hz); 4,01 (s); 4,04 (d, J = 15 Hz); 4,16 (q, J = 7 Hz); 4,17 (q, J = 7 Hz); 6,30 (s); 6,64 (d, J = 9 Hz); 7,16 (d, J = 2 Hz); 7,50 (d, J = 7 Hz); 7,63 (d, J = 9 Hz); 7,78 (t, J = 7 Hz); 7,80 (d, J = 2 Hz); 8,24 (d, J = 7 Hz)
    • Beispiel 80 (Schema 16) 4-Ethoxy-6-(N-(carboxymethyl)-N-(1-(5-(p-aminobenzamido))- 1-carboxypentyl)aminomethyl)-6'-(N,N-bis(carboxymethyl)- aminomethyl)-2,2'-bipyridin (80) und das entsprechende Europiumchelat (81)
  • Die Verbindung (79) wurde nach der allgemeinen Methode des Beispiels 54 hydrolysiert und das Europiumchelat wurde gemäß Beispiel 56, ausgehend von der Verbindung (80), gebildet.
  • UV (als Natriumsalz in Wasser): 295 nm, 286 nm, 225 nm UV (als Europiumchelat in Wasser): 308 nm, 290 nm, 230 nm
    • Beispiel 81 (Schema 16) 4-Ethoxy-6-(N-(carboxynethyl)-N-(1-(5-(p-isothiocyanatbenzamido))-1-carboxypentyl)aminomethyl)-6'-(N,N- bis(carboxymethyl)aminomethyl)-2,2'-bipyridin als Europiumchelat (82)
  • Die Aminogruppe in der Verbindung (81) wurde unter Anwendung der allgemeinen Verfahrensweise des Beispiels 60 in die Isothiocyanatgruppe umgewandelt.
  • UV (in Wasser): 309 nm, 290 nm, 228 nm
    • Beispiel 82 (Schema 6) 6-(N-(carboxymethyl)-N-(1-(5-(p-isothiocyanatbenzamido))-1- carboxypentyl)aminomethyl)-6'-N,N-bis(carboxymethyl)-aminomethyl-2,2'-dipyridylketon
  • Diese Verbindung wurde im wesentlichen nach der gleichen Verfahrensweise wie bei der Synthese der Verbindung (82) hergestellt. Bis(6-brommethyl-2-pyridyl)keton (41) wurde mit modifizierter Iminodiessigsäure (44) gemäß Beispiel 77 umgesetzt. Nach der Verfahrensweise der Beispiele 78 -> 79 -> 80 wurde das Produkt in eine Aminoform von Europiumchelat umgewandelt. Die Aminogruppe wurde mit Thiophosgen analog der Verfahrensweise des Beispiels 81 umgesetzt, wodurch das aktive Isothiocyanat (83) gebildet wurde.
    • Beispiel 83 Fluorimetrische Methode unter Verwendung der erfindungsgemäßen Lanthaniden-Chelate beim multiplen Markieren
  • Monoclonale Antikörper gegenüber Human-Laminin und Keratin (10 mg) wurden gesondert mit einem 100fachen molaren Überschuß Isothiocyanatderivate von Eu-Chelaten (82) und (83) markiert. Die Markierung erfolgte in einem Carbonatpuffer, 50 mM, pH 9,8, durch über Nacht erfolgendes Inkubieren. Die markierten Antikörper wurden sodann von den freien Chelaten durch Gelfiltration durch eine Sephadex G50-Säule (1,5 x 30 cm), Eluieren mit Tris-HCl (50 mM, pH 7,75), enthaltend 9 g NaCl und 0,5 g NaN&sub3; pro Liter, gereinigt. Das gebundene Chelat wurde durch Messung von Eu³&spplus; nach Kation-Dissoziierung mit Säure (Hemmilä et al., Anal. Biochem. 1984; 137: 335-343) quantitativ bestimmt.
  • Cryostat-Sektionen von Geweben wurden in periodat-Lysin-Paraformaldehyd-Fixativ fixiert. Immunofluoreszenzanfärbungen erfolgten nach Standardverfahrensweisen. Die markierten Antikörper wurden in Verdünnungen von 1:10 bis 1:1000 verwendet und mit Schrägkulturen über Nacht bei +4ºC inkubiert. Die Sektionen wurden mit Ethanol entwässert und unbedeckt mit einem Fluoreszenzmikroskop (Leitz Dialux), das mit einem epi-Beleuchtungs-Filter-Block und einer Quecksilberlampe versehen war, betrachtet. Es wurden vier Anregungsfilter mit einer Bandbreite von 340 nm bis 380 nm verwendet und für die Emission wurde ein Filter mit einer engen Bandbreite von 613 nm verwendet.
  • Die Fluoreszenz der Chelate wurde gemäß Kankare et al. (europäischer Patentanmeldung 86 850 172.7) gemessen.
  • Die relative Fluoreszenz der Chelate wurde nach folgender Formel errechnet:
  • , worin Iche und IEu prä-exponentielle Bezeichnungen für das Chelat und das Eu³&spplus; (wäßrig) (als Referenz verwendet) sind, cche und cEu sind ihre Konzentrationen und kche und kEu sind ihre Zerfallkonstanten.
  • Zum Test des Lösungsmitteleffekts der Fluoreszenz der Chelate wurde die Fluoreszenz in einem Boratpuffer mit pH 8,5 und in Ethanol gemessen. Die Fluoreszenzeigenschaften einiger Chelate sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Tabelle 1 Fluoreszenzeigenschaften von einigen 6,6'-Bis(n,N- bis(carboxymethyl)aminomethyl)-2,2'-bipyridinen 1 = Log (relative Fluoreszenz) 2 = Anregungswellenlänge (nm) 3 = Zerfallzeit (us) Substituenten Boratpuffer pH 8,5 Ethanol Grundverbindung 4,4'-Dimethyl 4-Nitro 4,4'-Dinitro 4-Amino 4-Ethoxy 4,4'-Diethoxy 4-Brom 4,4'-Dibrom Substituenten Boratpuffer pH 8,5 Ethanol 4,4'-Bis(p-methoxyphenyl) 4,4'-Bis-(2-furyl) 4,4'-Distyryl Grundverbindung-N,N'-dioxid 4-(Phenylethylnyl) 4-(m-Isothiocyanatophenylethynyl) (59) 4-(m-Aminophenylethynyl) 4-(p-Isothiocyanatophenylethynyl) (60) 4-(4-Amino-3-(methoxycarbonylphenylethynyl 4-(4-Hydroxy-3-(methoxycarbonyl)-phenylethynyl Verbindung 80 60-(N-(Carboxymethyl)-N-(1-(5-(p-aminobenzamido))-1-carboxypentyl)aminomethyl)- 6'-N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl-2,2'-dipyridylketon substituenten Boratpuffer pH 8,5 Ethanol 5-Brom 3,3'-Dicarboxy 4,4'-Dicarboxy 3,3'-Bis(carbethoxy) 3,3'-Bis(benzoxy) 3,3'-Dihydroxy 4,4'-Diphenyl Schema Styryl Phenyl Schema Schema Schema Schema Schema Monomethoxytritylchlorid Schema Schema Schema Schema Schema Schema

Claims (12)

1. Chelat aus Eu³&spplus;, Tb³&spplus;, Dy³&spplus; oder Sm³&spplus; und einer Verbindung mit der Formel Substituent Stammverbindung Formel IV
worin
i) A&sub1;-A&sub6; Einzelatome, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Kohlenstoffatom und einem Stickstoffatom, sind,
ii) n den Wert 1 oder 2 hat,
iii) jeder der Reste R&sub1;-R&sub6; nichts ist, wenn A, an das diese Gruppe angefügt ist, Stickstoff ist und für jedes A, das ein Kohlenstoffatom ist, die Reste R&sub1;-R&sub6; aus der Gruppe, bestehend aus
(a) Wasserstoff, einer Kohlenwasserstoffgruppe, Cyano, Halogen, Nitro und
(b) carboxy (-COOH), Amido (-CONH&sub2;), Amino (-NH&sub2;), Hydroxy (-OH) und substituierten Formen dieser vier Gruppen, bei denen der Wasserstoff durch eine Kohlenwasserstoffgruppe ersetzt worden ist und wobei bei Amino und Hydroxy die Wasserstoffatome ebenfalls die Möglichkeit haben, durch eine Acylgruppe (R-CO-) ersetzt zu sein, wobei R für eine Kohlenwasserstoffgruppe steht, ausgewählt sind,
iv) Z und Z' für identische oder unterschiedliche Chelatisierungsstrukturen stehen und N-Biscarboxymetnylamino, N-Biscarboxyethylamino und das analoge Phosphat (-N(-CH&sub2;-O-PO&sub3;²&supmin;)&sub2; und das Phosphonat-N(-CH&sub2;-PO&sub3;²&supmin;)&sub2; sind
v) B aus der Gruppe, bestehend aus einer direkten Bindung,-NH-, -CO- und -O- ausgewählt ist,
vi) ---- angibt, daß die Gruppe -X-Y ein Substituent ist, der irgendwo in der Stammverbindung ein Wasserstoffatom ersetzt,
vii) X-Y eine organische Gruppe darstellt, die sich beim Gebrauch der Verbindung nicht zersetzt und die kein chelatisierendes Heteroatom hat, das näher als vier Atome von einem chelatisierenden Heteroatom in der Stammverbindung der Formel IV angeordnet ist, und
Y
(a) eine funktionelle Gruppe, ausgewählt aus Isothiocyanat, Bromacetamido Iodacetamido, Succinamido, Pyridyldithio, Mercapto, Carboxyl und deren aktiven Estern, Hydroxyl, Aldehyd, Amino, Diazonium, Tosyl, Mesitylyl, Trexyl, Phosphodiester oder Phosphotriester, oder aus
(b) einem Rest eines bio1ogisch aktiven Moleküls, das die Fähigkeit zur Teilnahme an biospezifischen Affinitätsreaktionen hat, ist, und
X aus Gruppen, ausgewählt aus -NR- (sekundäres oder tertiäres Amin), -CONR- und -RNCO- (substituiertes Amid), -S-S- (aliphatisches Disulfid), -S- (aliphatischer Thioether), -O- (Ether), -COO- und -OOC- (Ester), -N=N- (Diaza) und reinen Kohlenwasserstoffketten, enthaltend 1 bis 12 Kohlenstoffatome, wobei die Reste R für eine Alkylgruppe mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen stehen, besteht,
mit der Maßgabe, daß, wenn eine Gruppe-X-Y an einen der heterocyclischen Ringe der Formel IV angefügt ist, X eine Methylengruppe (-CH&sub2;-) besitzt, die an den Ring bindet.
2. Chelat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Z und Z' identisch sind.
3. Chelat nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß jede Gruppe Z und Z' N-Biscarboxymethylamino ist.
4. Chelat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß n gleich 1 und X-Y einen der Reste R&sub1;-R&sub6; ersetzt, während das A, an das X-Y gebunden ist, ein Kohlenstoffatom ist.
5. Chelat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß X-Y in mindestens einer der Gruppen Z und Z' ein Wasserstoffatom ersetzt.
6. Chelat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Y ein Rest eines biologischen Moleküls ist, das die Fähigkeit hat, an biospezifischen Affinitätsreaktionen teilzunehmen.
7. Chelat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Y eine funktionelle Gruppe, ausgewählt aus Isothiocyanat, Bromacetamido, Iodacetamido, Succinamido, Pyridyldithio, Mercapto, Carboxyl und ihren aktiven Estern, Hydroxyl, Aldehyd, Amino, Diazonium, Tosyl, Mesitylyl, Trexyl, Phosphodiester oder Phosphotriester ist.
8. Chelat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß nur eine der Gruppierungen A&sub1;-A&sub6; ein Stickstoffatom ist.
9. Chelat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß nur eine der Gruppierungen A&sub1;-A&sub3; ein Stickstoffatom ist und daß nur eine der Gruppierungen A&sub4;-A&sub6; ein Stickstoffatom ist.
10. Verwendung von zwei oder mehreren unterschiedlichen Chelaten nach einem der Ansprüche 1 bis 9 als fluoreszierende Sonden zur Markierung einer jeweiligen Zielstruktur bei einem spektrofluorometrischen Verfahren zur Bestimmung der genannten jeweiligen Zielstruktur, wobei sich das genannte Chelat hinsichtlich der Anregungs - und/oder der Emissions-Wellenlangenmaxima unterscheidet.
11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sich die genannten Sonden hinsichtlich ihrer Anregungs-Wellenlängenmaxima unterscheiden.
12. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekenn- zeichnet, daß sich die genannten Sonden hinsichtlich ihrer Emissions-Wellenlängenmaxima unterscheiden.
DE68919597T 1988-02-23 1989-02-22 Spektrofluorometrisches verfahren und für dieses verfahren wertvolle verbindungen. Expired - Fee Related DE68919597T2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE8800613A SE8800613D0 (sv) 1988-02-23 1988-02-23 A novel spectrofluorometric method and compounds that are of value for the method
PCT/SE1989/000073 WO1989008263A1 (en) 1988-02-23 1989-02-22 A novel spectrofluorometric method and compounds that are of value for the method

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE68919597D1 DE68919597D1 (de) 1995-01-12
DE68919597T2 true DE68919597T2 (de) 1995-05-18

Family

ID=20371454

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE68919597T Expired - Fee Related DE68919597T2 (de) 1988-02-23 1989-02-22 Spektrofluorometrisches verfahren und für dieses verfahren wertvolle verbindungen.

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP0357731B1 (de)
JP (1) JPH02504074A (de)
AT (1) ATE114819T1 (de)
DE (1) DE68919597T2 (de)
SE (1) SE8800613D0 (de)
WO (1) WO1989008263A1 (de)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5367080A (en) * 1990-11-08 1994-11-22 Sterling Winthrop Inc. Complexing agents and targeting radioactive immunoreagents useful in therapeutic and diagnostic imaging compositions and methods
FR2680787B1 (fr) * 1991-08-30 1994-11-04 Cis Bio Int Complexes macrocycliques de terres rares et leur utilisation pour reduire les interferences dans un dosage par fluorescence.
CN1871233B (zh) * 2003-08-29 2011-07-13 沃拉克有限公司 新型螯合剂和螯合物及其应用
WO2005058877A1 (en) 2003-12-18 2005-06-30 Wallac Oy Novel chelating agents and highly luminescent and stable chelates and their use
US8071626B2 (en) 2003-12-18 2011-12-06 Wallac Oy Chelating agents and highly luminescent and stable chelates and their use
WO2018049214A1 (en) 2016-09-09 2018-03-15 Incyte Corporation Pyrazolopyridine derivatives as hpk1 modulators and uses thereof for the treatment of cancer
AU2017322427B2 (en) 2016-09-09 2021-12-23 Incyte Corporation Pyrazolopyridine derivatives as HPK1 modulators and uses thereof for the treatment of cancer
TW201811799A (zh) 2016-09-09 2018-04-01 美商英塞特公司 吡唑并嘧啶化合物及其用途
WO2018152220A1 (en) 2017-02-15 2018-08-23 Incyte Corporation Pyrazolopyridine compounds and uses thereof
WO2019051199A1 (en) 2017-09-08 2019-03-14 Incyte Corporation 6-CYANO-INDAZOLE COMPOUNDS AS HEMATOPOIETIC PROGENITOR KINASE 1 (HPK1) MODULATORS
KR20200133747A (ko) 2018-02-20 2020-11-30 인사이트 코포레이션 암을 치료하기 위한 hpk1 억제제로서의 n-(페닐)-2-(페닐)피리미딘-4-카복스아미드 유도체 및 관련 화합물
US10752635B2 (en) 2018-02-20 2020-08-25 Incyte Corporation Indazole compounds and uses thereof
US10745388B2 (en) 2018-02-20 2020-08-18 Incyte Corporation Indazole compounds and uses thereof
US11299473B2 (en) 2018-04-13 2022-04-12 Incyte Corporation Benzimidazole and indole compounds and uses thereof
US10899755B2 (en) 2018-08-08 2021-01-26 Incyte Corporation Benzothiazole compounds and uses thereof
WO2020068729A1 (en) 2018-09-25 2020-04-02 Incyte Corporation Pyrazolo[4,3-d]pyrimidine compounds as alk2 abd/or fgfr modulators
KR20220059480A (ko) 2019-08-06 2022-05-10 인사이트 코포레이션 고체 형태의 hpk1 억제제

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1205028A (en) * 1981-07-01 1986-05-27 Jerald C. Hinshaw Fluorescent chelates and labeled specific binding reagents prepared therefrom
US4637988A (en) * 1981-07-01 1987-01-20 Eastman Kodak Company Fluorescent labels for immunoassay
US4584277A (en) * 1983-04-05 1986-04-22 Syntex (U.S.A.) Inc. Fluorescent multiparameter particle analysis
US5238808A (en) * 1984-10-31 1993-08-24 Igen, Inc. Luminescent metal chelate labels and means for detection
US4719182A (en) * 1985-03-18 1988-01-12 Eastman Kodak Company Fluorescent labels and labeled species and their use in analytical elements and determinations
EP0272320B1 (de) * 1986-06-17 1994-03-23 Baxter Diagnostics Inc. Homogenes fluortestverfahren mit abstoss des fluorzenten hintergrundes.

Also Published As

Publication number Publication date
EP0357731A1 (de) 1990-03-14
ATE114819T1 (de) 1994-12-15
WO1989008263A1 (en) 1989-09-08
JPH02504074A (ja) 1990-11-22
SE8800613D0 (sv) 1988-02-23
EP0357731B1 (de) 1994-11-30
DE68919597D1 (de) 1995-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE68919597T2 (de) Spektrofluorometrisches verfahren und für dieses verfahren wertvolle verbindungen.
US5216134A (en) Spectrofluorometric method and compounds that are of value for the method
DE68927886T2 (de) Terpyridin-derivate
US5324825A (en) Terpyridine derivatives
DE3587380T2 (de) Makropolyzyklische Komplexe von seltenen Erden und Verwendung als fluoreszierende Markierungen.
DE69634909T2 (de) Mit lumineszierenden Lanthanidchelaten markierte, biospezifisch bindende Reaktanden und ihre Verwendung
AT405461B (de) Lumineszenzindikator
Paull et al. The synthesis of XTT: A new tetrazolium reagent that is bioreducible to a water‐soluble formazan
DE3855177T2 (de) Makrozyklische tetraaza-verbindungen
DE3881735T2 (de) Diagnostischer Fluoreszenztest, Testbestandteile und Konjugate.
DE3689288T2 (de) Substituierte Pyridinderivate.
DE69216621T2 (de) Makrozyklische Seltener-Erden-Komplexe und deren Verwendung für die Reduzierung von Interferenzen in Fluoreszenzbestimmungsverfahren
DE69632244T2 (de) Diagnostisches Markierungsmittel
DE60131276T2 (de) Kryptate der seltenen erden mit verringerter fluoreszenz-löschung
DE69818044T2 (de) Chemilumineszente energietransfer-konjugate und ihre verwendung als markierungsmittel in bindungstests
AT405462B (de) Verfahren zur bestimmung eines alkaliions
DE3856358T3 (de) Für Tests verwendbare chemilumineszierende Ester, Thioester und Amide
DE69909611T2 (de) Reagenz zum nachweis von singulett-sauerstoff
EP0567622B1 (de) Neue pentacyclische verbindungen und ihre verwendung als absorptions- oder fluoreszenzfarbstoffe
DE68917438T2 (de) Durch die Verwendung von Substraten, deren Fluoreszenzeigenschaften sich von denen der umgewandelten Produkte unterscheiden, gekennzeichnete Methode zur Bestimmung der Enzymaktivität.
DE3879528T2 (de) Biotin-uebertraeger.
DE69911314T2 (de) Markierungsreagenzien und deren Verwendung
US20040224420A1 (en) Sensors, and methods of making and using the same
EP0281829B1 (de) Addukte aus Ketoverbindungen und Anionen von Oxasäuren, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung sowie Azoketoverbindungen.
CH412889A (de) Verfahren zur Herstellung von 2-Methyl-3-oxypyridinen

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee