-
Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zum Reduzieren der durch das Meßmedium
bei einem Fluoreszenztest hervorgerufenen Fluoreszenzlöschung,
indem man in das Medium Seltenerdmetallcryptate gibt, die gegenüber dieser
Fluoreszenzlöschung
nicht sehr empfindlich sind.
-
Die
Erfindung betrifft ebenso neue Seltenerdmetallcryptate, die gegenüber der
durch das Meßmedium hervorgerufenen
Fluoreszenzlöschung
nicht sehr empfindlich sind.
-
Die
Erweiterung des biologischen Wissensstandes benötigt in zunehmendem Maße diagnostische Verfahren,
mit denen Biomoleküle
verfolgt oder quantifiziert werden können.
-
Gleichzeitig
wird von den radioaktiven Markierungen, die im allgemeinen bei Referenztestverfahren eingesetzt
werden, Abstand gehalten. Allgemein richten sich zur Zeit die Bemühungen darauf,
radioaktive Indikatoren (Tracer) durch andere Markierungen und vorwiegend
durch Fluoreszenzmarkierungen zu ersetzen. Durch die Verwendung
von Fluoreszenzmarkierungen lassen sich unter idealen Bedingungen
hohe Empfindlichkeiten erzielen, die theoretisch zu den mit radioaktiven
Indikatoren erzielten Empfindlichkeiten gleichwertig sind.
-
Viele
Fluoreszenzmoleküle,
die als Indikatoren in derartigen Tests verwendet werden können, sind
bereits beschrieben worden, wobei unter diesen Seltenerdmetallkomplexe
vorteilhafte Eigenschaften aufweisen.
-
Die
Verwendung bestimmter Komplexe, nämlich Seltenerdmetallcryptate,
ist beispielsweise aus den Patentanmeldungen
WO 9918114 ,
EP 0 180 492 und
EP 0 321 353 bekannt.
-
In
der Praxis sind die Leistungseigenschaften von Fluoreszenzindikatoren
einerseits durch das Vorhandensein eines Hintergrundrauschens, das
häufig
hoch ist, und andererseits durch die Tatsache, daß sie im allgemeinen
sehr empfindlich gegenüber Änderungen
in ihrer Umgebung sind, eingeschränkt. Kleine Änderungen
des pH-Werts, der Polarität,
des Vorhandenseins von gelöstem
Sauerstoff oder der Nähe
von Schweratomen (beispielsweise Iod) oder absorbierender Gruppen
können
ihre Quantenausbeute (im Sinne einer Anregung oder einer Löschung)
modifizieren oder die Emissionswellenlänge verschieben.
-
Die
den Analyseverfahren mittels Fluoreszenzmessung innewohnenden Probleme
sind in einem Übersichtsartikel
(I. Hemmilä,
Clin. Chem. 31/3, 359–370
(1985)) aufgeführt.
-
Die
dem aus der intrinsischen Fluoreszenz von Proteinen und auch von
anderen, in biologischen Proben vorliegenden Biomolekülen entstehenden
Hintergrundrauschen innewohnenden Probleme können teilweise durch die Verwendung
von aus Seltenerdmetallkomplexen (hauptsächlich Europium) gebildeten
Fluoreszenzmarkierungen, durch die eine zeitliche Selektion des
spezifischen Signals gestattet wird, gelöst werden. Die besonders langen
Lebensdauern (ungefähr
0,1 ms bis 1 ms), durch die Europiumkomplexe gekennzeichnet sind,
ermöglichen
es, mittels einer zeitaufgelösten
Messung das beispielsweise von den Serumproteinen gebildete Hintergrundrauschen,
das durch eine relativ kurze Lebensdauer gekennzeichnet ist (etwa
4 ns), loszuwerden.
-
Ein
Format homogener Art weist den erheblichen Vorteil auf, daß die Kinetik
der Ausbildung eines immunologischen Komplexes in Echtzeit verfolgt
werden kann, doch lassen sich damit eventuelle ungünstige Wechselwirkungen
zwischen der Markierung und den in einem biologischen Medium vorliegenden
Molekülen (Löschen der
Fluoreszenz) nicht ausschließen.
-
Eine
Wiederherstellung der fotophysikalischen Eigenschaften, und dabei
insbesondere der Lebenszeit, kann in einem Serummedium dadurch erreicht
werden, daß man
das Medium mit Fluoridionen versetzt, wie aus der Patentanmeldung
EP 0 539 435 bekannt ist.
-
Trotzdem
werden von keinem dieser Verfahren die durch die im Meßmedium
vorhandenen Moleküle verursachten
Interferenzprobleme vollständig
gelöst.
Der Grund hierfür
liegt darin, daß eine
Hauptursache für die
eingeschränkte
Empfindlichkeit der Messung mittels Fluoreszenz in der Existenz
von durch im Medium vorhandene Moleküle verursachten Löschvorgängen besteht,
die die Fluoreszenz des als Markierung im Test verwendeten Fluoreszenzmoleküls hemmen
können.
Im Falle von Seltenerdmetallkomplexen kann die Löschung das Ergebnis von Mechanismen
einer Elektronenübertragung
durch Nähe
sein, wobei das Inhibitormolekül
die freien Koordinationsstellen im Komplex besetzt. Zu nennen sind
hier insbesondere die Redoxreaktionen, die zwischen dem Fluoreszenzmolekül in seinem
Grundzustand oder in seinem angeregten Zustand und im Medium vorhandenen
Molekülen
stattfinden. Diese Mechanismen sind in der Lage, die emittierte
Fluoreszenz merklich zu modifizieren.
-
Die
Hemmung der Fluoreszenz durch Mechanismen unter Beteiligung von
Elektronenübertragung
und allgemein durch Löschmechanismen
stellt in der Praxis eine starke Indisposition dar, da die Hemmfaktoren
entweder als Bestandteile im Meßmedium
natürlicherweise
vorhanden sein können
(beispielsweise Harnsäure
in Serum) oder auch als Zusätze
oder Stabilisatoren für
den Test hinzugegeben werden können.
-
Diese
Inhibitoren beeinträchtigen
die Fluoreszenz des Markierungsmoleküls stark. Insbesondere bringt
im Falle von störenden
Redoxreaktionen der Übergang
vom oxidierten Zustand zum reduzierten Zustand eines Seltenerdmetallions
mittels eines Redoxmechanismus eine Verringerung der Lebensdauer
sowie eine Änderung
des Emissionsspektrums des das Ion enthaltenden Komplexes mit sich,
so daß die
Empfindlichkeit der Messung stark beeinträchtigt wird.
-
Es
wurden nun neue Seltenerdmetallcryptate gefunden, die aus einem
mit einer makropolyzyklischen Verbindung, die wenigstens eine molekulare
Einheit, bestehend aus einem Pyridin, umfaßt, komplexierten Seltenerdmetallsalz
bestehen und neue und unerwartete fotophysikalische Eigenschaften
zeigen.
-
Ebenso
erwies sich, daß diese
vorteilhaften Eigenschaften dann beobachtet werden, wenn diese makropolyzyklische
Verbindung auch eine molekulare Einheit mit einer Triplettenergie
umfaßt,
die höher
ist als die des Emissionsniveaus des komplexierten Seltenerdmetallions,
das mit einer Elektronendonorgruppe substituiert ist.
-
Eine
mechanistische Hypothese diesbezüglich
besteht darin, daß der
Austausch einer molekularen Einheit mit größerem sterischem Volumen gegen
ein Pyridin die Kavität
des Makrozyklus reduziert und einen Einfluß auf das Redoxgleichgewicht
des Seltenerdmetallions ausübt,
indem dadurch dessen oxidierter Zustand gefördert wird.
-
Durch
das Vorhandensein einer Elektronendonorgruppe kann das Redoxpotential
des Seltenerdmetallions ebenfalls beeinflußt werden.
-
Die
erfindungsgemäßen Seltenerdmetallcryptate
weisen somit die vorteilhafte Eigenschaft auf, daß sie im
Vergleich mit entsprechenden Cryptaten, die keine Pyridineinheit
und/oder Substitution mit einer Elektronendonorgruppe umfassen,
weniger empfindlich gegenüber
dem Phänomen
einer Fluoreszenzlöschung,
die von einer Wechselwirkung mit im Medium vorhandenen Molekülen herrührt, sind.
-
Diese
Beobachtung ist von größtem Interesse,
da damit Fluoreszenzmessungen in biologischen Medien ohne Verwendung
eines Adjuvants, wie beispielsweise Fluoridionen, durchgeführt werden
können.
-
Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
bestehen somit aus neuartigen Markierungen, die an ein biologisches
Molekül
mit einer Erkennungsrolle gekoppelt werden können und die an einen Partner
binden können,
während
sie gleichzeitig ihre löschungsresistenten
Eigenschaften beibehalten.
-
Gemäß einem
ersten Aspekt betrifft die Erfindung somit ein Verfahren zum Reduzieren
der Fluoreszenzlöschung,
die durch das Meßmedium
bei einem Fluoreszenztest eines Analyten unter Verwendung von wenigstens
einer Fluoreszenzmarkierung hervorgerufen wird, dadurch gekennzeichnet,
daß ein
makropolyzyklischer Seltenerdkomplex in das Meßmedium eingeführt wird,
wobei dieser Komplex aus wenigstens einem Seltenerdmetallsalz besteht,
das komplexiert ist mit einer makropolyzyklischen Verbindung, die
der nachfolgenden Formel II entspricht:
in welcher:
- – der
Ring der Formel der Bis-Bipyridinmakrozyklus
ist, mit der Formel:
- – n
= 0, 1 oder 2 ist,
- – A
eine funktionelle Gruppe ist, die in der Lage ist, kovalent mit
einer biologischen Substanz zu binden,
- – R1 eine -COOR3-Gruppe
ist, in welcher R3 Wasserstoff oder eine
C1- bis C10-Alkylgruppe
ist und vorzugsweise für
eine Methyl-, Ethyl- oder tert.- Butylgruppe
steht, oder R1 eine -CO-NH-Y-A- oder -Y-A-Gruppe ist;
- – R2 Wasserstoff, eine Elektronendonorgruppe,
insbesondere Carboxylat, -NH2, -NHAlk, -N(Alk)2, OH, O-, -OAlk, Alk, -CH(Alk)2,
-C(Alk)3, -NHCOAlk, gegebenenfalls substituiert
mit Phenyl, wobei Alk eine (C1-C4)-Alkylgruppe ist, oder eine Gruppe -CO-NH-Y-A oder -Y-A
ist, mit der Vorgabe, daß nicht
mehr als einer der Substituenten R1 und
R2 eine Gruppe -CO-NH-Y-A oder -Y-A darstellt
und R1 und R2 nicht
gleichzeitig eine Gruppe -CO-NH-YA oder -Y-A darstellen;
- – Y
eine Beabstandergruppe oder ein Beabstandungsarm ist, der aus einem
divalenten organischen Rest besteht, gewählt unter linearen oder verzweigten
C1- bis
C20-Alkylengruppen, die wahlweise eine oder
mehrere Doppelbindungen und/oder ein oder mehrere Heteroatome enthalten,
wie Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel oder Phosphor, oder eine oder
mehrere Carbamoyl- oder Carboxamidogruppe(n), oder auch gewählt unter
C5- bis C8-Cycloalkylengruppen
oder unter C6- bis C14-Arylengruppen,
wobei die Alkylen-, Cycloalkylen- oder Arylengruppen wahlweise mit
Alkyl-, Aryl- oder Sulfonatgruppen substituiert sind.
-
In
der folgenden Beschreibung bedeutet der Begriff "Analyt" eine beliebige Substanz oder Gruppe
von Substanzen, ebenso wie Analoge davon, die wünschenswerterweise nachgewiesen
und/oder bestimmt werden soll.
-
In
der vorliegenden Beschreibung bezeichnet der Ausdruck "funktionelle Gruppe,
die in der Lage ist, kovalent mit einer biologischen Substanz zu
binden" eine beliebige
funktionelle Gruppe, die in der Lage ist, über eine kovalente Bindung
direkt oder nach Aktivierung mit wenigstens einer der natürlich vorhandenen
oder künstlich
in die biologische Substanz eingeführten Funktionen zu binden.
Derartige Funktionen sind insbesondere NH2-,
COOH-, SH- und OH-Funktionen. Solche Gruppen und die Aktivierungsvorgänge werden
ausführlich
von P. Tijssen in "Practice
and Theory of Enzyme immunoassays" Elsevier 1985, beschrieben.
-
Als
Beispiele für
funktionelle Gruppen, die sich für
die erfindungsgemäßen Zwecke
eignen, sind zu nennen insbesondere Amino-, Thio-, Cyano-, Isocyano-,
Isothiocyano-, Thiocyano-, Carboxyl-, Hydroxyl-, Maleimido-, Succinimido-,
Mercapto-, Phenol-, Imidazol-, Aldehyd-, Epoxid-, Halogen-, Thionyl-,
Sulfonyl-, Nitrobenzyl-, Carbonyl-, Triazo-, Anhydrid-, Halogenacetat-,
Hydrazinn-, Acridin- usw. Gruppen.
-
Besonders
bevorzugte Gruppen sind Amino-, Thiol- und Carboxylgruppen, die
vor der kovalenten Kopplung mit der biologischen Substanz aktiviert
werden müssen,
und ebenso Maleimido-, Succinimido- und Isothiocyanatgruppen, die
direkt mit der biologischen Substanz binden können.
-
Bei
dem komplexierten Seltenerdmetallion handelt es sich vorzugsweise
um ein Europiumion.
-
In
der vorliegenden Beschreibung sind die "Cryptat"-Theorie
und die Nomenklatur der Makrozyklen und Polyzyklen wie bei J.M.
Lehn in Struct. Bonding (Berlin), 16, 1, 1973 und in Acc. Chem.
Res. 11, 49, (1978) definiert.
-
Zur
Bezeichnung der die Makro(Poly)zyklen aufbauenden molekularen Einheiten
wurden die folgenden Abkürzungen
verwendet:
- 2,2'-Bipyridin
- = bpy
- Pyridin
- = Py
- 4-Methylisonicotinat
- = Py(CO2Me)
- 2,2'-Bipyridin-4,4'-diethylcarboxylat
- = bpy(CO2Et)2
- 2,2'-Bipyridin-4,4'-di-tert.-butylcarboxylat
- = bpy (CO2tbu)2
- 2,2'-Bipyridin-4,4'-dicarbonsäure
- = bpy(CO2H)2
- Pyridin-3,5-diethylcarboxylat
- = Py(CO2Et)2
- 3,5-Bis[N-(2-aminoethyl)carboxamidyl]pyridin)
- = Py(NH2)2
- 3,5-Bis[N-(4-maleimidomethylcyclohexylcarboxamido-2-ethyl)carboxamidyl]pyridin)
- = Py[CONH(CH2)2NHR4]2,
mit
R4 =
-
Für die erfindungsgemäßen Zwecke
besonders bevorzugte makropolyzyklische Seltenerdmetallkomplexe
sind die Europiumcryptate [Eu
3+ ⊂ py·Bpy(CO
2H)
2·Bpy(CO
2H)
2] (Beispiel 4,
b), [Eu
3+ ⊂ bpy(CO
2H)
2·bpy (CO
2H)
2·py(NH
2)
2] (Beispiel 6)
und [Eu
3+ ⊂ bpy(CO
2H)
2·bpy(CO
2H)
2·py(CONH(CH
2)
2NHR
4]
2, mit
R
4 =
(Beispiel 7).
-
Gemäß einem
bevorzugten Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der makrozyklische
Seltenerdmetallkomplex als alleinige Markierung oder als eine der
Markierungen in dem Test verwendet.
-
Vorteilhafterweise
ist das Meßmedium
ein biologisches Medium, insbesondere ein Serummedium.
-
Die
makro(poly)zyklischen Verbindungen, die im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden können,
werden nach bekannten Verfahrensweisen hergestellt. Die Herstellung
des Bipyridinmakrozyklus, die über
eine Tosylzwischenstufe erfolgt, ist insbesondere in J. Org. Chem.
1983, 48, 4848 beschrieben; die funktionalisierten makrozyklischen
Analoge des Typs bpy·bpy·(R2)2 wurden über den
gleichen Ansatz erhalten.
-
Im
allgemeinen werden die makrobizyklischen Liganden gemäß den im
Patent
EP 0 321 353 bzw.
in Helv. Chim. Acta, 1988, 71, 1042 offenbarten Techniken hergestellt.
Insbesondere wurden diese Moleküle durch
Alkylierung eines in einem polaren aprotischen Lösungsmittel vorgeformten makrozyklischen
Diamins in Gegenwart eines als Base und Matrizenion fungierenden
Alkalicarbonats hergestellt.
-
Die
makropolyzyklischen Seltenerdmetallkomplexe, die erfindungsgemäß verwendet
werden können, können mit
den herkömmlichen
Verfahren zur Herstellung von Metallkomplexen, bei denen die komplexierende
Verbindung mit einer Verbindung, die das zu komplexierende Kation
zur Verfügung
stellt, umgesetzt wird, erhalten werden.
-
Beispielsweise
können
die makropolyzyklischen Komplexe dadurch erhalten werden, indem
man eine Verbindung, die ein Seltenerdmetallkation zur Verfügung stellt,
mit der die oben definierten Eigenschaften aufweisenden makropolyzyklischen
Verbindung umsetzt, wobei jede Verbindung vorteilhafterweise in
Lösung, vorzugsweise
im gleichen Lösungsmittel
oder in vergleichbaren Lösungsmitteln,
die hinsichtlich der Komplexierung inert sind, vorliegt. Im allgemeinen
wird als Lösungsmittel
Acetonitril oder Methanol verwendet, wobei bis zum Rückfluß erhitzt
wird.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ebenso makropolyzyklische
Seltenerdmetallkomplexe, die aus wenigstens einem Seltenerdmetallsalz
bestehen, das komplexiert ist mit einer makropolyzyklischen Verbindung,
die der Formel II entspricht:
in welcher:
- – der
Ring der Formel der Bis-Bipyridinmakrozyklus
ist, mit der Formel:
- – n
= 0, 1 oder 2 ist,
- – Y
eine Beabstandergruppe oder ein Beabstandungsarm ist, der aus einem
divalenten organischen Rest besteht, gewählt unter linearen oder verzweigten
C1- bis
C20-Alkylengruppen, die wahlweise eine oder
mehrere Doppelbindungen und/oder ein oder mehrere Heteroatome enthalten,
wie Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel oder Phosphor, oder eine oder
mehrere Carbamoyl- oder Carboxamidogruppe(n), oder auch gewählt unter
C5- bis C8-Cycloalkylengruppen
oder unter C6- bis C14-Arylengruppen,
wobei die Alkylen-, Cycloalkylen- oder Arylengruppen wahlweise mit
Alkyl-, Aryl- oder Sulfonatgruppen substituiert sind.
- – A
eine funktionelle Gruppe ist, die in der Lage ist, kovalent mit
einer biologischen Substanz zu binden,
- – R1 eine -COOR3-Gruppe
ist, in welcher R3 Wasserstoff oder eine
C1- bis C10-Alkylgruppe
ist und vorzugsweise für
eine Methyl-, Ethyl- oder tert.-Butylgruppe
steht, oder R1 eine -CO-NH-Y-A- oder -Y-A-Gruppe ist;
- – R2 Wasserstoff, eine Elektronendonorgruppe,
insbesondere Carboxylat, -NH2, -NHAlk, N(Alk)2, OH, O-, -OAlk, Alk, -CH(Alk)2,
-C(Alk)3, -NHCOAlk, gegebenenfalls substituiert
mit Phenyl, wobei Alk eine (C1-C4)-Alkylgruppe ist, oder eine Gruppe -CO-NH-Y-A oder -Y-A
ist, mit der Vorgabe, daß nicht
mehr als einer der Substituenten R1 und
R2 eine Gruppe -CO-NH-Y-A oder -Y-A darstellt
und R1 und R2 nicht
gleichzeitig eine Gruppe -CO-NH-Y-A oder -Y-A darstellen; und mit
der Vorgabe daß,
wenn n = 0, R2 verschieden von Wasserstoff
ist.
-
Bevorzugte
Komplexe sind solche, in denen die makropolyzyklische Verbindung
der Formel II entspricht, in welcher:
- – n = 0,
- – Y,
A und R1 wie oben definiert sind und
- – R2 wie oben definiert ist und einer der Substituenten
R2 eine -CO-NH-Y-A- oder -Y-A-Gruppe ist.
-
Besonders
vorteilhafte Komplexe sind die Europiumcryptate [Eu
3+ ⊂ Py·Bpy(CO
2H)
2·Bpy(CO
2H)
2], [Eu
3+ ⊂ bpy(CO
2H)
2·bpy(CO
2H)
2·Py(NH
2)
2] und [Eu
3+ ⊂ bpy(CO
2H)
2·bpy(CO
2H)
2·Py(CONH(CH
2)
2NHR
4]
2, mit
-
Die
makropolyzyklischen Seltenerdmetallkomplexe gemäß der vorliegenden Erfindung
werden mit den oben erwähnten
Verfahren hergestellt.
-
Die
Erfindung betrifft ebenso Fluoreszenzkonjugate, bestehend aus den
wie oben definierten makropolyzyklischen Seltenerdmetallkomplexen,
die kovalent an einen Teil eines Paars von Molekülen, die in der Lage sind,
spezifisch aneinander zu binden, gebunden sind, insbesondere ein
Polypeptid, ein Protein, einen Zellrezeptor, ein Antigen, einen
Antikörper
oder eine Nukleinsäure.
-
Gemäß einem
weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ebenso die Verwendung eines
makropolyzyklischen Seltenerdmetallkomplexes wie oben definiert
zur Reduzierung der Fluoreszenzlöschung,
die durch das Meßmedium
bei einem Fluoreszenztest eines Analyten hervorgerufen wird.
-
Die
Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele veranschaulicht,
bei denen die zur Kennzeichnung und Identifizierung der Verbindungen
verwendeten Techniken wie folgt sind:
Die Schmelzpunkte wurden
unter Verwendung einer Schmelzpunktkapillarapparatur: electrothermal
IA8103 bestimmt und sind nicht korrigiert.
-
Die
Dünnschichtchromatographien
(DC) wurden auf Macherey-Nagel-Platten: Al2O3(Polygram Alox N/UV254) und SiO2(Polygram
SIL 6/UV254) mit Fluoreszenzindikator durchgeführt.
-
Die
Flüssigkeitschromatographien
(HPLC) wurden unter Verwendung eines aus den folgenden Bestandteilen
zusammengesetzten chromatographischen LKB-Systems durchgeführt: 2152
Mikroprozessor, 2150 Pumpe, Uvicord 21.58 Detektor; Merck 50734
Lichrosphes 100RP18 Säule;
aufgetragener Gradient [Zeit(min)-Flußgeschwindigkeit/ml) Anteil
des Lösungsmittels
B (%): 0–1–15; 5–1–15; 35–1–100]; Lösungsmittel
A = H2O mit 1% TFA, Lösungsmittel B = CH3CN.
-
Die
Retentionszeiten TR sind in Minuten ausgedrückt.
-
Die
NMR-Spektren wurden unter Verwendung des Bruker-Geräts
AC 250 [250 (1H); 62,9 (13C)]
aufgezeichnet. Die chemischen Verschiebungen sind in ppm relativ
zum entsprechenden inneren Standard angegeben.
-
Für die Messungen
bezüglich
(1H) gilt: CHCl3 =
7,26; CH3OH = 3,34; tBuOH = 1,36. Die folgenden Symbole
wurden verwendet:
- s
- = Singulett
- d
- = Dublett
- t
- = Triplett
- m
- = Multiplett
- AB
- = Kopplungssystem
- J
- = Kopplungskonstante
-
Für die Messungen
bezüglich
Kohlenstoff (13C) gilt: CHCl = 77,0, wobei
die folgenden Symbole verwendet wurden:
Ct = tertiärer Kohlenstoff;
Cq = quarternärer
Kohlenstoff.
-
Bei
den für
die Massenspektren verwendeten Ionisierungsverfahren handelt es
sich um FAB+ = Fast Atom Bombardment (Beschuß mit schnellen
Atomen) im positiven Modus (MNBA-Matrix: Meta-Nitrobenzylalkohol
oder Thioglyzerin) und EI (Electron Impact).
-
Die
Absorptionsspektren (UV-sichtbar) wurden unter Verwendung des Spektrofotometers
lambda 15 von Perkin Elmer mit 10–5 M
Lösungen
aufgezeichnet.
-
Die
Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele veranschaulicht,
in denen die folgenden Abkürzungen
verwendet werden:
- AIBN:
- Azobisisobutyronitril
- HPLC:
- Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
- M.A.:
- Mikroanalyse
- Fp.:
- Schmelzpunkt
- M.S.:
- Massenspektrum
- NBS:
- N-Bromsuccinimid
- 1H
NMR:
- Protonenkernmagnetresonanz
- 13C
NMR:
- Kohlenstoff-13-Kernmagnetresonanz
- SPDP:
- N-Succinimidyl-3-(2-pyridylthio)propionat
Sulfo-SMCC = 3-Sulfo-N-hydroxysuccinimidester von 4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexan-1-carbonsäure
- TFA:
- Trifluoressigsäure
- DC:
- Dünnschichtchromatographie
- TMS:
- Tetramethylsilan
-
Beispiel 1: Herstellung des Makrobizyklus
der Formel (6) bpy·bpy·py(CO2Me)
-
Die
Alkylierung des makrozyklischen Diamins (5) mit dem Dibrommethylderivat
(4) ergibt die nachfolgend dargestellte Verbindung (6).
-
-
a) Darstellung von 4-Methyl-2, 6-dibrommethylisonicotinat
(4)
-
Die
nachfolgend dargestellte Reaktionsabfolge gestattet die Isolierung
der Verbindung (4).
-
-
– 4-Cyano-2,6-dimethylpyridin
(1)
-
Die
in J. Am. Chem. Soc., 1959, 81, 4004 beschriebenen Untersuchungen
von W.E. Feely und E.M. Beavers bezüglich der Cyanierung von Aminoxidsalzen
ermöglichen
die Gewinnung der Verbindung (1).
-
– 2,6-Dimethylisonikotinsäure (2)
-
Ein
Gemisch aus 1 g (7,56 mmol) von (1) und 5 ml konzentrierter Schwefelsäure wird
5 Stunden bei 100°C erhitzt.
Die erhaltene Lösung
wird anschließend
im Eisbad abgekühlt,
mit 10 N Natriumhydroxid auf pH 3,5 gebracht und dann zur Trockne
eingeengt. Durch 48stündige
Etherextraktion (Soxhlet) eines Teils des erhaltenen Rückstands
erhält
man 50 mg 2,6-Dimethylisonikotinsäure (2)
zur Analyse. Das restliche rohe Reaktionsprodukt, das nicht mit
Ether behandelt wurde, wird in seiner bestehenden Form in der Veresterungsreaktion
ohne weitere Aufreinigung eingesetzt.
NMR: 1H (D
2O);
innerer Standard tBuOH 1,29 ppm. 2,82 (s, 6H, CH
3);
8,05 (s, 2H, Py).
MS (EI): 151 (M+, 100); 134 (M+ -OH, 7,2);
106 (M+ -CO
2H, 16,4)
MA: C
8H
9NO
2 + 0,1 NaHSO
4 (163,16)
Berechnet: | C | 58,89 | H | 5,62 | N | 8,58 | O | 23,53 |
Gefunden: | C | 58,73 | H | 5,90 | N | 8,37 | O | 23,7 |
-
– 4-Methyl-2,6-dimethylisonikotinat
(3)
-
Ein
Gemisch aus 2 g 2,6-Dimethylisonikotinsäure (2) (ungereinigt), 100
ml Methanol und 1 ml 98%ige Schwefelsäure wird am Rückfluß 24 Stunden
erhitzt. Nach dem Abkühlen
wird das Reaktionsmedium mit gesättigter
NaHCO3-Lösung
neutralisiert und anschließend
fünfmal
mit 60 ml CHCl3 extrahiert. Die vereinigten Chloroformphasen
werden dann über
Na2SO4 getrocknet
und anschließend
eingeengt. Der erhaltene Feststoff wird danach viermal mit 50 ml
Ether extrahiert und die Etherphase anschließend eingeengt. Die Chromatographie
des erhaltenen weißen
Rückstands
an Aluminiumoxid [Gradient: Cyclohexan/CH2Cl2 (50/50) zu reinem CH2Cl2] ergibt 1 g 4-Methyl-2,6-dimethylisonikotinat
(3).
Fp.: 45–47°C
DC:
Rf: 0,3 [SiO2/CH2Cl2-MeOH (97/3)]
HPLC: Tr: 2,4
UV:
CHCl3: 290,6 nm (3650)
NMR: 1H CDCl3; innerer
Standard TMS
2,59 (s, 6H, CH3); 3,93
(s, 3H, CO2CH3);
7,51 (s, 2H, Py)
13C CDCl3;
innerer Standard 77,0 ppm
24,5 (CH3);
52,5 (OCH3); 119,5 (Ct); 137,9, 158,9 (Cq);
166,1 (C=O).
MS (EI): 165 (M+, 24);
134 (M+-OCH3, 13);
106 (M+-CO2Me)
-
– 4-Methyl-2,6-dibrommethylisonikotinat
(4)
-
Ein
Gemisch aus 1,372 g (8,3 mmol) von (3), 60 mg AlBN und 2,866 g (16,1
mmol) NBS in 120 ml CCl4 wird unter einer
Stickstoffatmosphäre
am Rückfluß erhitzt
und dabei 8 Stunden mit einer 100 W-Lampe bestrahlt. Das Reaktionsmedium
wird dann auf Raumtemperatur zurückgebracht
und dann mit 200 ml gesättigter NaHCO3-Lösung gewaschen.
Nach Abtrennen der unteren Phase (CCl4)
wird die wäßrige Phase
4 mal mit 50 ml CHCl3 extrahiert; die vereinigten
organischen Extrakte werden dann mit 100 ml H2O
gewaschen, getrocknet (Na2SO4)
und danach zur Trockne eingeengt. Die Reinigung des erhaltenen Rückstands
mittels Chromatographie an Siliziumdioxid [Gradient: Cyclohexan-CH2Cl2 (80/20) zu reinem
CH2Cl2] ermöglicht die
Abtrennung einer ersten Fraktion des Bromderivats (4) von den Polybromspezies,
von einem Gemisch von Isomeren symmetrischer und asymmetrischer
Dibromderivate sowie von den ebenso gebildeten Monobromspezies.
-
Um
eine größere Menge
an Methyl-2,6-dibrommethylisonikotinat zur Verfügung zu haben, wird die oben
isolierte Monobromverbindung [0,543 g (2,2 mmol)] mit 0,4 g (2,2
mmol) NBS, 23 mg AlBN und 50 ml CCl4 gemischt
und danach unter den obigen Bromierungsbedingungen unter Erhalt
einer zweiten Fraktion von (4) umgesetzt.
-
Schließlich erhält man durch
Aufreinigung der in den obigen beiden Reaktionen isolierten Gemische von
Dibromisomeren über
Chromatographie an Siliziumdioxid [Gradient: reines Cyclohexan zu
Cyclohexan/EtOAc (85/15)] eine Endfraktion von (4), d. h. insgesamt
596 mg (22%)
Fp. 90–92°C:
DC:
Rf: 0,6 (SiO
2/CH
2Cl
2)
HPLC: Tr: 20 min 5 sek
UV: CHCl
3: 290,8 nm (4270); 240,3 nm (3010)
NMR:
1H CDCl
3; innerer
Standard TMS 3,98 (s, 3H, CH
3); 4,58 (s,
4H, CH
2); 7,92 (s, 2H, Py)
13C
CDCl
3; innerer Standard 77,0 ppm 32,8 (CH
2); 52,9 (OCH
3);
122,2 (Ct); 139,8, 157,9 (Cq); 164,7 (C=O)
MS (EI): 322,9 (M
+, 15); 243,9 (M
+-Br,
100); 163 (M
+-2Br, 15,7).
MA: C
9H
9NO
2Br
2 (322,
98)
berechnet: | C | H | N | O
9,90 |
| 33,47 | 2,80 | 4,33 | |
gefunden: | C | H | N | O |
| 33,69 | 2,81 | 4,29 | 10,17 |
-
b) Herstellung des Alkalicryptats [Na+ ⊂ bpy·bpy·pyCO2Me]Br– der Formel (6).
-
Ein
Gemisch aus 0,2 g (0,508 mmol) makrocyclischem Bipyridindiamin (5)
(beschrieben in J. Org. Chem., 1983, 48, 4848) und 0,376 g (5,08
mmol) Li
2CO
3 in
400 ml CH
3CN wird 40 min unter einer Stickstoffatmosphäre am Rückfluß erhitzt.
Eine Lösung
von 0,165 g (0,508 mmol) 4-Methyl-2,6-dibrommethylisonikotinat (4)
in 100 ml CH
3CN wird zu der erhaltenen Suspension
zugetropft (2 Stunden). Nach erfolgter Zugabe wird weitere 22 Stunden
unter den gleichen Bedingungen gerührt und das Reaktionsmedium
danach im Eisbad abgekühlt.
Anschließend
wird das Carbonat abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingeengt.
Chromatographie des erhaltenen Rückstands
an Siliziumdioxid [Gradient: CH
2Cl
2 mit 10% MeOH] ergibt 117,5 mg der Verbindung
(6) (35%).
DC: Rf: 0,4 (Al
2O
3/CHCl
3-MeOH (90/10)]
HPLC:
Tr: 4 min 1 sek
UV: CHCl
3: 246 nm (27950);
291 nm (27410).
NMR:
1H (CDCl
3); innerer Standard TMS. 3,94 (s, 3H, CH
3); 4,00 (d, J = 15 Hz, AB, 4H, CH
2); 4,08 (d, J = 14,7 Hz, AB, 4H, CH
2); 4,09 (s, 4H, CH
2);
7,39-7,42 (m, 4H, BPy); 7,77 (s, 2H, Py); 7,85-7,89 (m, 8H, BPy).
13C (CDCl
3); innerer
Standard 77 ppm. 52,9 (CH
3, CO
2 Me; 59,4 (CH
2);
59,5 (CH
2); C
t (119,9;
122,1; 123,4; 138,8) Cq (139,2; 154,6; 158,5; 159,6); 165,3 (
CO 2Me).
MS(FAB
+): Thioglyzerinmatrix.
578,2 (Ligand-Li
++Na
+, 100%); 556,2
(Ligand-Li
++H, 10%).
Thioglyzerinmatrix
+ 1% TFA
578 (Ligand-Li
++Na
+, 20%); 556,1 (Ligand-Li
++H,
100%).
MA: C
33H
29N
7O
2NaBr, 3H
2O (712,53).
berechnet: | C | H | N |
| 55,62 | 4,95 | 13,76 |
gefunden: | C | H | N |
| 55,93 | 4,73 | 13,61 |
-
Beispiel 2: Herstellung des Europiumcryptats
[Eu3 + ⊂ bpy·bpy·pyCO2Me]Cl– 3 von
Ligand (6) aus Beispiel (1)
-
11,8
mg EuCl3·6H2O
(3,22 × 10–5 mol)
werden zu 20,2 mg (2,84 × 10–5 mol)
des in 5 ml wasserfreiem Methanol vorliegenden Makrobizyklus (6)
gegeben.
-
Das
entstandene homogene Gemisch wird 23 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre am Rückfluß erhitzt.
Danach führt
die Zugabe von 4 ml Ether zu dieser auf Raumtemperatur abgekühlten Lösung zur
Kristallisierung von 14,2 mg (52%) des Europiumcryptats.
HPLC:
Tr: 14,1
UV: H
2O: 250 nm (18270); 309
nm (24400).
MS (FAB
+): Nitrobenzylalkoholmatrix
778: [(Eu
3 + ⊂ L + 2Cl
–)
+, 40%]; 743 [(Eu
2 + ⊂ L+Cl
–)
+, 90%]; 707 [(Eu
3+ ⊂ L –2H)
+, 100%]
MA: C
33H
29N
7O
2EuCl
3, 0,13 EuCl
3, NaBr,
2 CH
3OH (1014,51)
berechnet: | C | H | N |
| 41,43 | 3,67 | 9,66 |
gefunden: | C | H | N |
| 41,23 | 3,95 | 9,63 |
-
Beispiel 3: Herstellung des Makrobizyklus
der Formel (12) Py·Bpy(CO2Et)2·Bpy(CO2Et)2
-
Diese
Verbindung wird gemäß dem nachfolgend
dargestellten Schema hergestellt.
-
-
a) Herstellung des Makrozyklus der Formel
(11)
-
Die
folgende Reaktionsabfolge ergibt den bpy·bpy-Diamintetraester-makrozyklus (11).
-
-
– Tosyl-bpy·bpy-tetraester-makrozyklus
(9)
-
Ein
Gemisch aus 5,5 g (12 mmol) 6,6'-Dimethyl-2,2'-dibrommethyl-4,4'-bipyridindicarboxylat (8) (beschrieben
in Helv. Chim. Acta, 1988, 71, 1042), 4,64 g frisch hergestelltem
Tosylamid-Natriumsalz (24 mmol), und 900 ml absolutem Ethanol wird
26 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre am Rückfluß erhitzt. Diese Suspension
wird danach im Eisbad 1 Stunde abgekühlt und anschließend filtriert.
Der isolierte Niederschlag wird dann mit 700 ml Wasser, 500 ml Ethanol
und 20 ml Chloroform gewaschen, so daß man 1,88 g (31,6%) von (9)
erhält.
DC:
Rf: 0,7 [SiO
2/CHCl
3-MeOH
(99/1)]
HPLC: Tr: 36,1
MS (FAB)+: MNBA-Matrix 991 (M
+, 45%); 835 (L-Tos, 12%).
MA: C
50H
50O
12N
6S
2NaBr. (1094)
berechnet: | C | H
4,6 | N | S | Na
2,1 |
| 54,89 | | 7,68 | 5,86 | |
gefunden: | C | H | N | S | Na |
| 55,66 | 4,64 | 7,75 | 6,04 | 3,19 |
-
Bpy·Bpy·-Tetrasäure-makrozyklus
(10)
-
Eine
Lösung
von 0,15 g (0,15 mmol) des Tosylmakrozyklus (9) in 1 ml konzentrierter
H2SO4 wird 3 Stunden
unter einer Stickstoffatmosphäre
bei 100°C
erhitzt. Anschließend
wird das Reaktionsmedium im Eisbad abgekühlt, durch Zugabe von 5 ml
Wasser verdünnt
und danach durch Zugabe von 7 ml 5 N NaOH auf pH 3,0 gebracht. Der
gebildete Niederschlag wird anschließend abfiltriert, gründlich mit
Wasser (50 ml) gewaschen und danach getrocknet. Der auf diese Weise
(wahrscheinlich in Form des Aminsalzes) isolierte Tetrasäuremakrozyklus
(10) wird ohne weitere Aufreinigung im nächsten Schritt eingesetzt.
-
Bpy·Bpy·Diamin-tetraethylester-makrozyklus
(11)
-
Eine
Suspension von 53 mg Verbindung (10) in 100 ml absolutem Ethanol
und 0,5 ml konzentrierter H
2SO
4 wird
28 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre am Rückflut erhitzt. Die erhaltene
homogene Lösung wird
danach nacheinander im Eisbad abgekühlt, mit gesättigter
NaHCO
3-Lösung
neutralisiert und mit 80 ml CHCl
3 (4 × 20) versetzt,
so daß 60
mg Verbindung (11) (quantitativ) erhalten werden.
DC: Rf: 0,7
[Al
2O
3/CH
2Cl
2-MeOH (80/20)]
HPLC:
Tr: 17,2
UV: CHCl
3: 243,1 nm (24150);
303,2 nm (25210).
NMR:
1H (CDCl
3); innerer Standard TMS.
1,44 (t, J
= 7,0 Hz, 12H, CH
3); 2,29 (s, breit, NH);
4,17
(s, 8H, CH
2) 4,39 (q, J = 6,9 Hz, 8H, CH
2-Ester);
7,43 (d, J = 1,4 Hz, 4H, BPy);
8,29 (d, J = 1,1 Hz, 4H, BPy).
13C
(CDCl
3); innerer Standard 77,0 ppm.
14,9
(CH
3, CO
2CH
2 CH 3); 56,8 (CH
2); 62,3
(CO
2CH
2 CH 3); Ct (119;
122,5); Cq (138,9; 158,9; 161,4); 165,7 (
CO
2C
2H
5)
MS(FAB
+):
Thioglyzerinmatrix
683 (M
+, 100)
MA:
C
36H
38N
6O
8, H
2O (700,74)
berechnet: | C | H | N |
| 61,7 | 5,75 | 11,99 |
gefunden: | C | H | N |
| 62,2 | 6,01 | 11,48 |
-
b) Herstellung des Alkalicryptats der
Formel (12) [Na+ ⊂ Py·Bpy(CO2Et)2·Bpy(CO2Et)2]Br–
-
Ein
Gemisch aus 180,7 mg (0,265 mmol) makrozyklischem Diamin (11) und
195,5 mg (2,65 mmol) Li
2CO
3 in
360 ml wasserfreiem CH
3CN wird unter einer
Stickstoffatmosphäre
35 min am Rückfluß erhitzt.
Die erhaltene Suspension wird mit einer Lösung von 70,7 mg (0,267 mmol)
2,6-Dibrommethylpyridin (7) [die Darstellung dieser Verbindung wurde
von Vogtle, ausgehend von Lutidin, beschrieben: Synthesis, 1977,
273] in 360 ml wasserfreiem CH
3CN langsam
versetzt (5 Stunden). Die Rückflußtemperatur
wird 72 Stunden beibehalten und das Reaktionsmedium anschließend im
Eisbad abgekühlt.
Nach Filtration der unlöslichen
Carbonate wird das Filtrat zur Trockne eingeengt. Der erhaltene
Feststoffrückstand
wird an einer Aluminiumoxidsäule
mit CH
2Cl
2/EtOH
als Elutionsmittel (99/1–85/15)
unter Erhalt von 78 mg (12) (33%) chromatographiert.
DC: Rf
= 0,6 [Al
2O
3/CHCl
3-MeOH (90/10)]
HPLC: Tr = 20,8
UV:
CHCl
3: 250 nm (24900); 316 nm (18900)
NMR:
1H (CDCl
3); innerer
Standard TMS
1,45 (t, J = 7,1 Hz, 12H, CH
3);
4,07 (s, 4H, CH
2); 4,14 (d, J = 15,4 Hz,
AB, 4H, CH
2); 4,22 (d, J = 15,3 Hz, AB, 4H,
CH
2); 4,46 (q, J = 7Hz, 8H, CH
2-Ester);
7,27 (d, J = 7,7 Hz, 2H; Py); 7,66 (t, j = 7,7 Hz, 1H, Py); 7,93
(s, 4H, Bpy); 8,42 (s, 4H, Bpy).
13C
(CDCl
3); innerer Standard 77 ppm.
14,3
(CH
3, CO
2Et); 59,4
(CH
2); 59,5 (CH
2);
62,5 (CH
2, CO
2Et);
Ct (119,3; 122,8; 123; 138,1); Cq (140,5; 155,1; 157,8; 160,1);
164,5 (CO
2Et).
MS: (FAB
+/NBA-Matrix)
808,4
(Ligand-Li
++Na
+,
100%); 663,3 (Ligand+Na
+-2CO
2Et,
5%).
MA: C
43H
43N
7O
8NaBr, CH
2Cl
2 (972, 68)
berechnet: | C | H | N
10 |
| 54,3 | 4,6 | |
gefunden: | C | H | N |
| 54,9 | 4,0 | 9,8 |
-
Beispiel 4: Herstellung des Europiumcryptats
der Formel 12a [Eu3 + ⊂ Py·Bpy(CO2H)2·Bpy(CO2H)2]
-
-
a) Herstellung des Europiumkomplexes von
Ligand 12 aus Beispiel 3 [Eu3+ ⊂ Py·Bpy(CO2Et)2Bpy(CO2Et)2]
-
33
mg (9 × 10–5 mol)
EuCl3·6H2O werden zu 69 mg (7,7 × 10–5 mol)
des in 32 ml wasserfreiem CH3CN vorliegenden
Natriumcryptats (12) gegeben. Die erhaltene Suspension wird 27 Stunden
unter einer Stickstoffatmosphäre
am Rückfluß erhitzt;
nach Abkühlen
wird das Lösungsmittel
abgezogen. Anschließend
ergibt eine Umkehrphasenchromatographie des erhaltenen Rückstands
25 mg des Europiumcryptats [Eu3+ ⊂ 12] (25%).
HPLC:
Tr: 21
UV: EtOH/330 nnm (21000)
MS: (FAB+)
Thioglyzerinmatrix
1164,2 [ (Eu3 + ⊂ 12
+ 2CF3CO2 –)+, 64%
1051,8 [Eu3+ ⊂ 12 + CF3CO2 – +
H) 100%]
937,4 [ (Eu2 + ⊂ 12 – 1H) 35%]
-
b) Herstellung des Säurecryptats der Formel 12a
-
100 μl wäßrige 1,6
M Natriumhydroxidlösung
werden zu einer wäßrigen Lösung von
10 mg (7,83 × 10–6 mol)
Europiumcryptat [Eu3 + ⊂ 12] gegeben.
Das erhaltene Gemisch wird bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt und
anschließend
zur Trockne eingeengt. Die Aufreinigung des erhaltenen Rückstands
mittels (Umkehrphasen-)Chromatographie mit einem Gemisch von H2O mit 1% TFA/CH3CN
als Elutionsmittel ergibt 8 mg (quantitativ) des Europiumcryptats
der Formel 12a.
-
Beispiel 5: Herstellung des Pyridindiethylesterbispyridin-tetra-tert.-butylester-makrobizyklus
der Formel (16)
-
-
a) Herstellung von 2,6-Dibrommethyl-3,5-pyridincarbonsäurediethylester
der Formel (14)
-
Diese
Verbindung wird nach einer herkömmlichen
Vorschrift zur Bromierung mit freien Radikalen, wobei von kommerziellem
2,6-Dimethyl-3,5-pyridincarbonsäurediethylester
ausgegangen wird, synthetisiert.
-
-
Ein
Gemisch von 0,5 g (2 mmol) 2,6-Diethyl-3,5-dimethylpyridincarboxylat, 0,89 g (5
mmol) NBS und 4 mg AIBN in 20 ml Tetrachlorkohlenstoff wird 2 Stunden
unter Bestrahlung mit einer Lampe im sichtbaren Bereich (100 W)
am Rückfluß erhitzt.
Anschließend
wird die Suspension im Eisbad abgekühlt und danach zur Abtrennung
des gebildeten Succinimids filtriert. Das Filtrat wird dann zur
Trockne eingeengt; die Chromatographie des erhaltenen Rückstands
an Siliziumdioxid mit einem Hexan/Chloroform-Gemisch als Elutionsmittel (Gradient:
50/50–30/70)
ergibt 195 mg des Bromderivats der Formel (14) (26%).
DC: Rf
= 0,4 (SiO2/CH2Cl2)
HPLC: Tr = 25,5
UV: CHCl3/245 nm (9400)
NMR: 1H
(CDCl3); innerer Standard TMS
1,45
(t, J = 7,0 Hz, 6H, CH3); 4,47 (q, J = 7,2
Hz, 4H CH2); 5 (s, 4H, CH2Br);
8,80 (s, 1H, Py)
-
b) Herstellung des Diamin-bisbipyridin-tetra-tert.-butylester-makrozyklus
der Formel (15)
-
-
Diese
Verbindung wird durch einfache Umesterung synthetisiert, wobei von
Lithium-tert.-butanolat und dem Makrozyklus (11) aus Beispiel 3
ausgegangen wird.
-
Ein
Gemisch aus 251 mg Makrozyklus (11) (0,36 mmol), 363 mg (4,5 mmol)
Lithium-tert.-butanolat, 35 ml trockenem Toluol und 35 ml trockenem
tert.-Butanol wird bei 80°C
unter einem Stickstoffstrom etwa 3 Stunden erhitzt. Nach dem Abkühlen wird
das tert.-Butanol durch Abdampfen abgetrennt; die zurückbleibende
organische Phase wird zunächst
mit Wasser auf einen neutralen pH-Wert gewaschen (6 × 50 ml) und anschließend nacheinander über Na2SO4 getrocknet,
filtriert und zur Trockne eingeengt. Durch Umkehrphasenchromatographie
des erhaltenen Rückstands
mit CH3CN und H2O
mit 1% TFA als Elutionsmittel erhält man 117 mg des Makrozyklus
(15) (40%).
HPLC: Tr = 22,4
UV: CHCl3/311
nm (18000); 280 nm (8300); 268 nm (7200)
NMR: 1H
(CDCl3); innerer Standard TMS
1,65
(s, 36H, CH3); 4,69 (s, 8H, CH2);
7,97 (s, 4H, H bpy); 8,51 (s, 4H, Hbpy).
MS: (ES) 796 (M+H).
-
c) Herstellung des Alkalicryptats der
Formel (16) (Li+ ⊂ bpy(CO2tbu)2·bpy(CO2tbu)2·Py(CO2Et)2]Br–
-
Ein
Gemisch aus 25,3 mg (3,18 × 10–5 mol)
Makrozyklus (15) und 27 mg (3,65 × 10–4 mol)
Li2CO3 in 25 ml
wasserfreiem CH3CN wird 15 min unter einem
Stickstoffstrom am Rückfluß erhitzt.
Eine Lösung
von 12,7 mg (3,1 × 10–5 mol)
2,6-Diethyl-3,5-dibrommethylpyridincarboxylat (14) in 12 ml CH3CN wird über
10 min zu der erhaltenen Suspension zugetropft. Unter diesen Bedingungen
wird 23 Stunden lang gerührt
und das Reaktionsmedium anschließend im Eisbad abgekühlt und
danach filtriert. Nach Eindampfen des Filtrats zur Trockne erhält man durch
Umkehrphasenchromatographie des erhaltenen Rückstands 12 mg (35%) Makrobizyklus
(16)
HPLC: Tr = 28,5
MS: (ES) 1042,3 [Ligand-Li+-Br– (100%)]; 1064,3 [Ligand-Li+-Br–+Na+ (30%)]
-
Beispiel (6): Herstellung des Europiumcryptats
der Formel (19) [Eu3 + ⊂ bpy(CO2H)2·bpy(CO2H)2·Py(NH2)2]
-
-
a) Herstellung des Europiumkomplexes des
Liganden (16) aus Beispiel (6) [Eu3+ ⊂ bpy(CO2tbu)2·bpy·(CO2tbu)2·Py(CO2Et)2
-
12,8
mg (3,5 × 10–5 mol)
EuCl3·6H2O werden zu einer Lösung von 17,1 mg (1,51 × 10–5 mol)
Lithiumcryptat (16) in 10 ml wasserfreiem Acetonitril gegeben. Anschließend wird
der Reaktionsansatz 3 Stunden unter einem Stickstoffstrom am Rückfluß erhitzt.
Nach dem Abkühlen
wird das Lösungsmittel
abgezogen und der erhaltene Rückstand
(m = 27,6 mg) ohne weitere Aufreinigung im anschließenden Schritt
eingesetzt.
-
b) Herstellung des Säure-Europiumcryptats [Eu3+ ⊂ bpy(CO2H)2·bpy(CO2H)2·Py(CO2Et)2](CF3CO2)3
-
Diese
Reaktion besteht in der selektiven Hydrolysierung der von den Bipyridinuntereinheiten
getragenen tert.-Butylester
durch Versetzen mit reiner Trifluoressigsäure.
-
27,6
mg des in Abschnitt a) aus Beispiel 6 erhaltenen Rückstands
werden in 14 ml Trifluoressigsäure gelöst. Die
erhaltene homogene Lösung
wird 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend zur Trockne
eingeengt, indem die Säure
im Vakuum abgezogen wird. Durch Umkehrphasenchromatographie mit einem
Gemisch von H2O mit 1% TFA/CH3CN
als Elutionsmittel erhält
man 10,4 mg des Europiumcryptats [Eu3+ ⊂ bpy(CO2H)2·bpy(CO2H)2·Py(CO2Et)2](CF3CO2)3
HPLC:
Tr = 13,7
UV: MeOH/324,6 nm (16000); 337 nm (13300)
-
c) Herstellung des Europiumcryptats der
Formel (19)
-
Eine
Lösung
von 300 μl
Ethylendiamin (4,45 × 10–3 mol)
in 300 μl
wasserfreiem MeOH wird über
5 min unter Kühlen
im Eisbad sowie einem Stickstoffstrom zu einer Lösung von 10 mg (8,03 × 10–6 mol)
Europiumcryptat [Eu3+ ⊂ bpy(CO2H)2·bpy(CO2H)2·Py(CO2Et)2] in 2 ml wasserfreiem
MeOH gegeben. Anschließend
erhöht
man die Temperatur des Mediums allmählich auf 20°C, wonach
2,5 Stunden unter diesen Bedingungen gerührt wird. Nach Abziehen des
Lösungsmittels
erhält
man durch Umkehrphasenchromatographie des erhaltenen Rückstands
mit einem Gemisch von H2O mit 1% TFA/CH3CN als Elutionsmittel 5,5 mg Cryptat (19) (45%).
UV:
MeOH/325 nm (17000)
-
Beispiel 7: Herstellung des Europiumcryptats
der Formel (20)
-
Diese
Verbindung wird gemäß dem nachfolgend
dargestellten Schema hergestellt.
-
-
Eine
Lösung
von 195 µg
(4,45 × 10–7 mol)
SulfoSMCC 168 µl
Phosphatpuffer wird über
45 min zu einer im Eisbad gekühlten
Lösung
von 0,2 mg (1,28 × 10–7 mol)
Verbindung (19) in 200 µl
0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) zugetropft. Nach erfolgter Zugabe
wird die Temperatur des Mediums auf 20–25°C zurückgebracht und die Reaktion
unter diesen Bedingungen weitere 3 Stunden fortgesetzt. Anschließend erhält man durch
direkte Aufreinigung mittels Umkehrphasenchromatographie mit einem
Gemisch von H2O mit 1% TFA/CH3CN
als Elutionsmittel 100 µg
Cryptat (20) (50%).
-
Beispiel 8: Kupplung der Verbindung der
Formel (20) mit Protein
-
a) Aktivierung des Proteins
-
3,14
mg (4,43 mg/ml) Antikörper
(freier PSA, Klon A455, CIS bio international, Frankreich) werden
30 min bei Raumtemperatur in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) aktiviert,
indem mit 26,2 µl
einer ethanolischen Lösung
von SPDP mit 2 mg/ml (ursprüngliches
Molverhältnis
von Reagens zu Protein: 8) versetzt wird. Am Ende dieses Zeitraums
werden Thiolfunktionen (SH) erzeugt, indem das Reaktionsmedium mit
37 µl
einer Dithiothreitol(DTT)-Lösung
mit 61,7 mg/ml in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) versetzt wird und
15 min bei Raumtemperatur inkubiert wird; anschließend wird
das Gemisch an einer Sephadex G25 HR10-10-Säule mit dem während der
Aktivierung verwendeten Puffer als Elutionsmittel aufgereinigt.
-
b) Kupplung des aktivierten Proteins und
des Cryptats der Formel (20)
-
55 µl einer
Lösung
mit 1 mg/ml Cryptat der Formel (20) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH
7,0) werden zu 386 µl
einer Lösung
des Antikörpers
A455 (1,2 mg/ml im gleichen Puffer), der gemäß der in Abschnitt a) aus Beispiel
8 beschriebenen Vorschrift aktiviert wurde, gegeben, wonach 20 Stunden
bei 4°C
inkubiert wird; am Ende dieses Zeitraums wird der Reaktionsansatz
an einer Sephadex G25 HR10-30-Säule
mit dem Puffer für die
Kupplungsreaktion als Elutionsmittel aufgereinigt. Absorptionsmessungen
des Antikörper-Cryptat-Konjugats
bei 280 nm und 325 nm ergeben einen Markierungsgrad von 8,0 sowie
eine Ausbeute von 80%.
-
Beispiel 9: Demonstration der geringen
Empfindlichkeit der Pyridincryptate aus Beispielen 2, 4(b), 6(c),
7 und 8 gegenüber
Löschung
im Serum.
-
Die
unten angegebenen Bestimmungen wurden an einem LS-50-Spektrofluorimeter
von Perkin-Elmer durchgeführt.
-
Die
Fluoreszenzlebensdauermessungen der getesteten Cryptate wurden gemäß der in
der
EP 0 601 113 offenbarten
Vorschrift durchgeführt.
-
Die
Verbindungen wurden in einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) sowie
in NCS (Newborn Calf Serum) getestet. Die Lösungen zur Messung der Cryptatkonzentration
von etwa 10–6 M/l
wurden durch Verdünnen
der Stammlösung
auf 1/100 entweder mit dem Puffer allein oder mit einem Gemisch
aus 2/3 Puffer bis 1/3 Serum hergestellt.
-
Die
Pyridincryptate aus Beispielen 2, 4(b), 6(c), 7 und 8 wurden im
Vergleich mit dem Trisbipyridindiamincryptat (KNH
2)
und dem Pyridinbispyridin-cryptat [Eu
3 +Cpy·Bpy·Bpy],
deren Herstellung jeweils in der
EP 0
321 353 bzw. in der Helv. Chim. Acta 1988, 71, 1042 beschrieben
ist, getestet.
-
Die
Formeln dieser beiden Moleküle
sind nachfolgend angegeben:
-
Die
Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben: Tabelle
1
-
Diese
Ergebnisse zeigen, daß der
Austausch einer Bipyridineinheit gegen eine Pyridineinheit in einer Trisbipyridin-Cryptatstruktur
dazu führt,
daß die
durch das Serum verursachte Fluoreszenzlöschung reduziert wird. Diese
Ergebnisse zeigen ebenso, daß das
Vorliegen von Carboxylatgruppen an den Bipyridineinheiten einen
günstigen
Einfluß auf
die Reduzierung der Löschung
hat.