DE60131176T2 - Fluoreszierende verbindungen - Google Patents
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Description
- Technisches Gebiet
- Diese Erfindung betrifft allgemein neue fluoreszierende Verbindungen und Verbindungen, welche als fluoreszierende Farbstoffe dienen können, Verfahren zum Isolieren derartiger Verbindungen aus Mikroorganismen und Verwendungen derartiger Verbindungen in wissenschaftlichen Anwendungen.
- Stand der Technik
- Verbindungen, die fluoreszieren, haben viele Verwendungen und sind bekannt dafür, für biologische Anwendungen, bei denen Fluoreszenz zur Detektion ganzer Zellen, zellulärer Komponenten und zellulärer Funktionen erforderlich ist, besonders geeignet zu sein. Zum Beispiel erfordern viele Diagnose- und analytische Verfahren, dass die Proben fluoreszierend markiert sind, so dass sie detektiert werden können. Dieses wird durch Verwenden von fluoreszierenden Farbstoffen erreicht oder Sonden, welche mit einer breiten Vielzahl von Materialien, wie Zellen, Geweben, Proteinen, Antikörpern, Enzymen, Arzneistoffen, Hormonen, Lipiden, Nukleotiden, Nucleinsäuren, Kohlenhydraten oder natürlichen oder synthetischen Polymeren, wechselwirken, um fluoreszierende Konjugate herzustellen.
- Mit synthetischen fluoreszierenden Sonden werden häufig Liganden verwendet, um einer biochemischen Reaktion, die beobachtet werden soll, Spezifität zu verleihen, und der fluoreszierende Farbstoff stellt das Mittel der Detektion oder Quantifizierung der Wechselwirkung bereit. Diese Anwendungen schließen unter anderem die Detektion von Proteinen (zum Beispiel in Gelen oder wässriger Lösung), Zellverfolgung, die Detektion von Proteinen über fluoreszierend markierte Antikörper, die Einschätzung von enzymatischer Aktivität, das Anfärben von Nucleinsäuren, ein.
- Die Absorption langer Wellenlängen erhöht gewöhnlich die Nützlichkeit einer fluoreszierenden Sonde, weil sie die Interferenz von zellulärer Autofluoreszenz verringert und die cytotoxische Wirkung des Fluorophors in Verbindung mit Licht verringert. Obwohl Laser als eine starke Lichtquelle zur Anregung der Fluoreszenz besonders nützlich sind, wird die Ausgangsleistung der Laser zur Zeit auf bestimmte Wellenlängen des Lichtes beschränkt. Verbindungen, deren Anregungsspektren mit der Laserausgangsleistung übereinstimmen, sind deshalb von hoher Nützlichkeit. Der Argonlaser ist die häufigste Lichtquelle zur Anregung der Fluoreszenz und weist Hauptausgangsleistungen auf, Licht bei 488 nm und 514 nm. Fluoreszierende Verbindungen, die durch eine dieser Wellenlängen angeregt werden, sind deshalb von besonderer Nützlichkeit. In einer anderen Ausführungsform kann eine Anregung der Fluoreszenz unter Verwendung von Festkörperlichtquellen, wie Licht emittierenden Dioden, erreicht werden. Fluoreszierende Verbindungen, die durch das Licht angeregt werden, das von diesen alternativen Quellen emittiert wird, sind auch von besonderer Nützlichkeit.
- Rotfluoreszierende Verbindungen werden umfangreich auf vielen Gebieten der biologischen Untersuchung verwendet. Viele von diesen, einschließlich Texasrot, Tetramethylrhodaminisothiocyanat oder rotemittierende BODIPY-Farbstoffe, erfordern Anregung bei grünen Wellenlängen, wie 542 nm. Dieses beschränkt ihre Verwendung bei vielen Anwendungen, besonders solchen, bei denen der Argon-Ionenlaser zur Anregung verwendet wird. Verbindungen, wie Ethidiumbromid, können mit Licht vom Argon-Ionenlaser (520 nm-Band) angeregt werden, sind aber allgemein nicht zum Markieren von anderen organischen Molekülen als Nucleinsäuren geeignet. Andere Verbindungen, wie Phycoerythrin, können mit dem Argon-Ionenlaser (488 nm) angeregt werden und emittieren in orange/roten Wellenlängen. Phycoerythrin weist jedoch eine schlechte Stabilität und ein hohes Molekulargewicht auf, das es für viele Anwendungen, wie Zelltverfolgung, Markieren von Nucleinsäuren oder Anfärben von Proteinen, ungeeignet macht.
- Zum Anfärben von Proteinen gibt es mehrere erhältliche Verfahren. Diese Verfahren können nichtfluoreszierende Verbindungen oder fluoreszierende Verbindungen verwenden. Das am häufigsten verwendete Verfahren verwendet Coomassie-Blau, welches nichtfluoreszierend ist, kann die Verwendung von großen Mengen organischer Lösungsmittel erfordern und ist zeitaufwendig. Andere Protein-Detektionsverfahren auf Fluoreszenzbasis sind verfügbar, welche möglicherweise sensitiver als nichtfluoreszierende Verfahren sind. Jedoch sind diese Verfahren allgemein viel kostspieliger als nichtfluoreszierende Verfahren, welches ihre weitverbreitete Verwendung beschränkt. Deshalb sind Verbindungen, die nützliche spektrale Eigenschaften und verhältnismäßig hohe Sensitivität kombinieren, von besonderer Nützlichkeit.
- Es gibt mehrere Verfahren zur Quantifizierung von Protein in Lösung. Diese Verfahren beruhen auf einem Bereich von Verfahren, und schließen Verfahren ein, bei denen Farbstoffe an lösliche Proteine binden. Diese Farbstoffe können entweder nichtfluoreszierende oder fluoreszierende Verbindungen sein. Verfahren auf Basis von fluoreszierenden Farbstoffen sind häufig sensitiver als die nichtfluoreszierenden Farbstoffe und lassen die Bestimmung der Proteinkonzentration über einem breiten Bereich von Konzentrationen zu. Verbindungen, die nützliche spektrale Eigenschaften mit einer Fähigkeit, Proteine zu binden, kombinieren, sind von besonderer Nützlichkeit.
- In den enzymatischen Studien gibt es eine weitverbreitete Verwendung von fluoreszierenden Verbindungen zur Detektion von bestimmten enzymatischen Aktivitäten. Zum Beispiel ist Fluorescein-di-β-D-galactopyranosid (FDG) eine nichtfluoreszierende Verbindung fluoreszierend. Die Spaltung der FDG-Verbindung kann durch die Zunahme der Fluoreszenz in der Lösung überwacht werden, und erlaubt folglich eine sensitive Quantifizierung der enzymatischen Aktivität. Zur Zeit sind nur eine beschränkte Anzahl von Fluorophoren für dieses Verfahren geeignet. Deshalb sind neue fluoreszierende Verbindungen, die zu einer Vielzahl von Substraten konjugiert werden können, von Nützlichkeit.
- Für das Zweifarben-Anfärben gibt es eine sehr beschränkte Auswahl an Fluorophoren mit niederem Molekulargewicht. Der vorherrschende grüne Fluorophor ist Fluoreszein, welcher Licht vom 488 nm-Band des Argon-Ionenlasers stark absorbiert und bei 518 nm wieder emittiert. Zur Zeit gibt es wenige kompatible rote oder orange Fluorophore, die von niederem Molekulargewicht sind und durch die 488 nm- oder 514 nm-Banden des Argon-Ionenlasers angeregt werden. Deshalb sind Verbindungen mit niederem Molekulargewicht, die durch den Argon-Ionenlaser angeregt werden und bei Wellenlängen von größer als 600 nm emittieren, von Nützlichkeit, besonders wenn es eine minimale spektrale Überlappung mit Fluoreszein gibt.
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EP-0 578 067 offenbart ein Reagenz zur photochemischen Markierung, das eine Europiumionenchelatbildende Struktur und ein Furocumarinderivat enthält, das über einen Abstandshalter verbunden ist, und seine Verwendung in Gensondensystemen. - Stadler, M. et al. Nat. Prod. Lett., 1995, 7(1), 7–14 offenbart die Azaphilonderivate Bulgarolacton A und B.
- Die Erfinder haben neue Verbindungen isoliert, die sich von einem Pilz ableiten, die in der Lage sind, leicht mit einem Bereich von organischen Molekülen zu kombinieren, um fluoreszierende Komplexe herzustellen.
- Offenbarung der Erfindung
- In einer ersten Ausführungsform der Erfindung wird ein Komplex bereitgestellt, umfassend eine Verbindung gemäß Formel (I):wobei:
jeder der Reste R, R' und R'' ein Wasserstoffatom, Halogenatom oder ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkyl-, -Alkenyl- oder -Alkinylrest ist, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen, Hydroxy- und/oder Oxogruppen substituiert ist;
die Ringe A, B und C gegebenenfalls eine oder mehrere Doppelbindungen beinhalten;
die Ringe B und C gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen substituiert sind, einschließlich der Tautomere der Formel (I), und
ein organisches Molekül,
wobei das organische Molekül eine Stickstoff-haltige Verbindung ist; und
wobei die Verbindung der Formel (I) mit dem organischen Molekül wechselwirkt, um nach Anregung zu fluoreszieren. - Vorzugsweise umfasst der Komplex eine Verbindung der Formel (Ia), einschließlich ihrer Tautomere:
- Vorzugsweise umfasst der Komplex eine Verbindung mit der in Formel (Ib) gezeigten Stereochemie, einschließlich ihrer Tautomere:
- Vorzugsweise ist R ein geradkettiger oder verzweigter konjugierter C1-20-Alkenylrest, der gegebenenfalls mit Hydroxy- und Oxogruppen substituiert ist; R' ist ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkylrest, der gegebenenfalls mit einer Hydroxygruppe substituiert ist, und R'' ist ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkylrest, einschließlich ihrer Tautomere.
- Vorzugsweise ist die Stickstoff-haltige Verbindung aus Proteinen, Aminosäuren, Peptiden, Nucleinsäuren und aliphatischen oder aromatischen Aminen ausgewählt.
- Vorzugsweise wechselwirkt die Verbindung der Formel (I) mit dem organischen Molekül in Gegenwart eines grenzflächenaktiven Mittels, um nach Anregung zu fluoreszieren. Vorzugsweise ist das grenzflächenaktive Mittel aus Salzen langkettiger Fettsäuren oder Sulfonsäuren ausgewählt.
- In einer zweiten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Verbindung gemäß Formel (I) bereit:wobei jeder der Reste R, R' und R'' ein Wasserstoffatom, Halogenatom oder ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkyl-, -Alkenyl- oder -Alkinylrest ist, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen, Hydroxy- und/oder Oxogruppen substituiert ist;
die Ringe A, B und C gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen substituiert sind; und
die Ringe A, B und C gegebenenfalls eine oder mehrere Doppelbindungen beinhalten;
mit der Maßgabe, dass: - (i) R ≠ -C(OH)CHC(O)(CH)6CH(Et)(Me), wenn R' = -CH2OH, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a;
- (ii) R ≠ -C(OH)CHC(O)(CH)6CH(Et)(Me), wenn R' = Me, R'' = Me; Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a;
- (iii) R ≠ -C(OH)CHC(O)(CH)6CH(Et)(Me), wenn R' = Me, R'' = Me; Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6;
- (iv) R ≠ -C(O)(CH)4Me, wenn R' = -n-propyl, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6;
- (v) R ≠ -C(O)(CH)6Me, wenn R' = -n-propyl, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6;
- (vi) R ≠ -C(O)(CH)5Me, wenn R' = -(CH)2Me, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6;
- (vii) R ≠ -C(O)(CH)6Me, wenn R' = -(CH)2Me, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6;
- (viii) R ≠ -(CH)2C(Me)CHC(Me)(Et), wenn R' = Ac, R'' = Me, C4 = C1, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6;
- (ix) R ≠ -(CH)2C(Me)CHC(Me)(Et), wenn R' = -Ac, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6;
- (x) R ≠ -(CH)2C(Me)CH-i-Propyl, wenn R' = -Ac, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6;
- (xi) R ≠ -C(O)(CH)4Me, wenn R' = -(CH)2Me, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6;
- (xii) R ≠ -C(O)(CH)4Me, wenn R' = -n-propyl, R'' = Me, Ring A beinhaltet keine Doppelbindung; und Ringe B und C beinhalten Doppelbindungen zwischen C8a und C4a und C5 und C6;
- (xiii) R ≠ -C(O)(CH)4Me, wenn R' = -n-propyl, R'' = Me, Ringe A, B und C beinhalten keine Doppelbindungen;
- (xiv) R ≠ -C(O)(CH)6Me, wenn R' = -C(CH)2Me, R'' = Me, Ring A beinhaltet keine Doppelbindung; und Ringe B und C beinhalten Doppelbindungen zwischen C8a und C4a und C5 und C6;
- (xv) R ≠ -C(O)(CH)4Me, wenn R' = -C(CH)2(Me), R'' = Me, Ring A beinhaltet keine Doppelbindung; und Ringe B und C beinhalten Doppelbindungen zwischen C8 und C4a und C5 und C6;
- (xvi) R ≠ -C(O)(CH)4Me, wenn R' = -(CH)2Me, R'' = Me, Ring A beinhaltet keine Doppelbindung; und Ringe B und C beinhalten Doppelbindungen zwischen C8a und C4a und C5 und C6;
- (xvii) R ≠ -C(O)(CH2)4Me, wenn R' = -n-propyl, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6;
- (xviii) R ≠ -C(O)(CH2)6Me, wenn R' = -n-propyl, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6;
- (xix) R ≠ -C(O)(CH2)5Me, wenn R' = -(CH)2Me, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6;
- (xx) R ≠ -C(O)(CH2)6Me, wenn R' = -(CH)2Me, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6;
- (xxi) R ≠ -Ac, wenn R' = -(CH)2C(Me)CHCH(Me)(Et), R'' = Me, C4 = C1, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6;
- (xxii) R ≠ -Ac, wenn R' = -(CH)2C(Me)CHCH(Me)(Et), R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6;
- (xxiii) R ≠ -Ac, wenn R' = -(CH)2C(Me)CH-i-Propyl, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6;
- (xxiv) R ≠ -C(O)(CH2)4Me, wenn R' = -(CH)2Me, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6;
- (xxv) R ≠ -C(O)(CH2)4Me, wenn R' = -n-propyl, R'' = Me, Ring A beinhaltet keine Doppelbindung; und Ringe B und C beinhalten Doppelbindungen zwischen C8a und C4a und C5 und C6;
- (xxvi) R ≠ -C(O)(CH2)4Me, wenn R' = -n-propyl, R'' = Me, Ringe A, B und C beinhalten keine Doppelbindungen;
- (xxvii) R ≠ -C(O)(CH2)6Me, wenn R' = -(CH)2Me, R'' = Me, Ring A beinhaltet keine Doppelbindung; und Ringe B und C beinhalten Doppelbindungen zwischen C8a und C4a und C5 und C6;
- (xxviii) R ≠ -C(O)(CH2)4Me, wenn R' = -C(CH2)(Me), R'' = Me, Ring A beinhaltet keine Doppelbindung; und Ringe B und C beinhalten Doppelbindungen zwischen C8a und C4a und C5 und C6;
- (xxix) R ≠ -C(O)(CH2)4Me, wenn R' = -(CH)2Me, R'' = Me, Ring A beinhaltet keine Doppelbindung; und Ringe B und C beinhalten Doppelbindungen zwischen C8a und C4a und C5 und C6,
- Vorzugsweise ist die Verbindung gemäß der zweiten Ausführungsform der Erfindung gemäß der Formel (Ia), und weist stärker bevorzugt die in Formel (Ib) gezeigten Stereochemie auf.
- Noch stärker bevorzugt ist der Rest R -C(OH)CHC(O)(CH)6CH3, ist der Rest R' -CH2OH und ist der Rest R'' Me, so dass die vorliegende Erfindung gemäß der zweiten Ausführungsform aus der Verbindung 5,6-Dihydro-3-[(1Z,4E,6E,8E)-1-hydroxy-3-oxo-1,4,6,8-decatetraenyl]-6-hydroxymethyl-9a-methyl-2H-furo[3,2-g][2]benzopyran-2-9(9aH)-dion gemäß Formel (Ic) besteht, einschließlich ihrer Tautomere:
- In einer dritten Ausführungsform der Erfindung wird die Verwendung einer Verbindung gemäß Formel (I) bereitgestellt:wobei:
jeder der Reste R, R' und R'' ein Wasserstoffatom, Halogenatom oder ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkyl-, -Alkenyl- oder -Alkinylrest ist, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen, Hydroxy- und/oder Oxogruppen substituiert ist;
die Ringe A, B und C gegebenenfalls eine oder mehrere Doppelbindungen beinhalten;
die Ringe B und C gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen substituiert sind, einschließlich der Tautomere der Formel (I);
oder einer Verbindung der Formel (Ia), einschließlich ihrer Tautomere:oder einer Verbindung mit der in Formel (Ib) gezeigten Stereochemie, einschließlich ihrer Tautomere:
oder einer Verbindung der Formel (I), (Ia) oder (Ib), wobei R ein geradkettiger oder verzweigter konjugierter C1-20-Alkenylrest ist, der gegebenenfalls mit Hydroxy- und Oxogruppen substituiert ist; R' ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkylrest ist, der gegebenenfalls mit einer Hydroxygruppe substituiert ist, und R'' ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkylrest ist, einschließlich ihrer Tautomere, oder einer Verbindung nach einem der Ansprüche 8 bis 12 zur Bildung eines Komplexes mit einem organischen Molekül, wobei das organische Molekül eine Stickstoff-haltige Verbindung ist, und der Komplex in der Lage ist, bei Anregung zu fluoreszieren.
- Vorzugsweise ist das Stickstoff-haltige organische Molekül ein Protein, eine Aminosäure, ein Peptid, Zucker, eine Nucleinsäure, ein Zelloberflächenmolekül oder Detergens, oder ist in einem Antikörper oder einer Zelle enthalten.
- Vorzugsweise ist die Verbindung mit dem organischen Molekül über ein verbindendes Molekül verbunden.
- In einer vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend:
- (i) eine Verbindung gemäß Formel
(I) wobei: jeder der Reste R, R' und R'' ein Wasserstoffatom, Halogenatom oder ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkyl-, -Alkenyl- oder -Alkinylrest ist, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen, Hydroxy- und/oder Oxogruppen substituiert ist; die Ringe A, B und C gegebenenfalls eine oder mehrere Doppelbindungen beinhalten; die Ringe B und C gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen substituiert sind, einschließlich der Tautomere der Formel (I), und
- (ii) ein organisches Molekül, wobei das organische Molekül ein Stickstoff-haltiges Molekül ist; wobei die Verbindung mit einem organischen Molekül wechselwirkt, um nach Anregung zu fluoreszieren.
- In einer fünften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Komplex bereitgestellt, umfassend eine Verbindung gemäß Formel (I), wobei:
jeder der Reste R, R' und R'' ein Wasserstoffatom, Halogenatom oder ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkyl-, -Alkenyl- oder -Alkinylrest ist, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen, Hydroxy- und/oder Oxogruppen substituiert ist;
die Ringe A, B und C gegebenenfalls eine oder mehrere Doppelbindungen beinhalten;
die Ringe B und C gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen substituiert sind, einschließlich der Tautomere der Formel (I), und
ein anorganisches Molekül,
wobei das anorganische Molekül ein Stickstoff-haltiges Molekül ist; und
wobei die Verbindung in der Lage ist, mit dem anorganischen Molekül wechselzuwirken, um nach Anregung zu fluoreszieren. - Vorzugsweise ist der Komplex gemäß der fünften Ausführungsform der Erfindung gemäß Formel (Ia), einschließlich ihrer Tautomere; und weist stärker bevorzugt die in Formel (Ib) gezeigte Stereochemie auf, einschließlich ihrer Tautomere.
- Vorzugsweise ist R ein geradkettiger oder verzweigter konjugierter C1-20-Alkenylrest, der gegebenenfalls mit Hydroxy- und Oxogruppen substituiert ist; R' ist ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkylrest, der gegebenenfalls mit einer Hydroxygruppe substituiert ist, und R'' ist ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkylrest, einschließlich ihrer Tautomere.
- Vorzugsweise umfasst der Komplex gemäß der fünften Ausführungsform der Erfindung eine Verbindung, wobei der Rest R -C(OH)CHC(O)(CH)6CH3 ist, der Rest R' -CH2OH ist und der Rest R'' Me ist, so dass die Verbindung aus der Verbindung 5,6-Dihydro-3-[(1Z,4E,6E,8E)-1-hydroxy-3-oxo-1,4,6,8-decatetraenyl]-6-hydroxymethyl-9a-methyl-2H-furo[3,2-g][2]benzopyran-2-9(9aH)-dion gemäß Formel (Ic) besteht, einschließlich ihrer Tautomere.
- Vorzugsweise ist das Stickstoff-haltige anorganische Molekül aus Ammonium, Hydrazin und Hydroxylamin, Ammonium-haltigen Verbindungen, Hydrazin-haltigen Verbindungen und Hydroxylamin-haltigen Verbindungen ausgewählt.
- Vorzugsweise wechselwirkt die Verbindung der Formel (I) mit der anorganischen Verbindung in Gegenwart eines grenzflächenaktiven Mittels, um nach Anregung in einem breiten Wellenlängenbereich zu fluoreszieren. Vorzugsweise ist das grenzflächenaktive Mittel aus Salzen langkettiger Fettsäuren oder Sulfonsäuren ausgewählt.
- Vorzugsweise emittiert der Komplex gemäß der fünften Ausführungsform der Erfindung nach Anregung bei ultravioletten bis blauen Wellenlängen Fluoreszenz. Vorzugsweise emittiert der Komplex gemäß der fünften Ausführungsform der Erfindung bei Anregung durch Licht im Bereich von 300 bis 560 nm Fluoreszenz. Vorzugsweise emittiert der Komplex gemäß der fünften Ausführungsform der Erfindung bei Anregung durch Licht bei etwa 400 nm, 488 nm oder 514 nm Fluoreszenz. Vorzugsweise emittiert der Komplex gemäß der fünften Ausführungsform der Erfindung im sichtbaren Wellenlängenbereich nach Anregung bei 488 nm Fluoreszenz.
- In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die einen Komplex gemäß der fünften Ausführungsform der Erfindung und einen analytisch verträglichen Träger und gegebenenfalls ein Fluorochrom umfasst.
- Chemisch sind die Verbindungen der Formel (I)–(Ic), wie 5,6-Dihydro-3-[(1Z,4E,6E,8E)-1-hydroxy-3-oxo-1,4,6,8-decatetraenyl]-6-hydroxymethyl-9a-methyl-2H-furo[3,2-g][2]benzopyran-2-9(9aH)-dion, Mitglieder der Azaphilonfamilie. Die Azaphilonverbindungen werden durch eine Vielzahl von Pilzen produziert und sind auf ihre Rolle als Farbmittel in Nahrungsmitteln untersucht worden.
- Der Azaphilonkern ist auch in Pigmenten gefunden worden, die durch Monascus spp. produziert werden. Die Pigmente, die den gewöhnlichen Azaphilonkern enthalten, schließen Dihydromonascorubin ein. Es gibt keine Aufzeichnung über ihre Nützlichkeit als fluoreszierende Farbstoffe zum Anfärben von Biomolekülen oder organischen Verbindungen.
- Kein Stand der Technik, der den Anmeldern bekannt ist, lehrt oder legt nahe, dass eine Verbindung der in Formel (I)–(Ic) beschriebenen Struktur fluoreszierend sein würde, noch legt er nahe, dass sie zur Verwendung beim fluoreszierenden Anfärben von Biomolekülen oder organischen Verbindungen geeignet sein würde. Es gibt demgemäß unerwartete und vorteilhafte Eigenschaften, die mit dieser Verbindung verbunden sind, einschließlich der sensitiven Detektion von Proteinen in Gelen, Zellverfolgung und Zwei-Farben-Anfärben.
- Die Erfinder haben unerwarteterweise festgestellt, dass Verbindungen gemäß Formel (I)–(Ic) in wässriger Lösung nicht fluoreszierend sind, aber in der Lage sind, mit Stickstoff-haltigen organischen Verbindungen zu Wechselwirken, um eine intensiv fluoreszierende Anfärbung zu produzieren. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Verbindungen gemäß Formel (I)–(Ic) der Erfindung bei der Detektion und dem Markieren von Stickstoff-haltigen organischen Molekülen verwendet.
- Vorzugsweise emittiert die Verbindung gemäß Formel (I)–(Ic), wenn sie an ein Stickstoffhaltiges organisches Molekül gebunden ist, Fluoreszenz nach Anregung bei blauen Wellenlängen. Stärker bevorzugt werden die Verbindungen gemäß Formel (I)–(Ic) durch Licht im Absorptionsbereich von 300–560 nm angeregt.
- In einer bevorzugten Ausführungsform wechselwirkt eine Verbindung gemäß Formel (I)–(Ic) mit Proteinen, um einen fluoreszierenden Komplex herzustellen, der durch Licht angeregt werden kann, das durch Standard-UV-Durchleuchtungsgeräte (307 nm) erzeugt wird. Bei Anregung emittiert der fluoreszierende Komplex Licht über einem breiten Bereich von Wellenlängen, was erlaubt, dass die Proteinkomplexe detektiert werden. Die Anregungswellenlänge des Protein/Farbstoffkomplexes schließen die von Ethidiumbromid ein, das mit DNA komplexiert ist (Absorptionsmaximum 518 nm, Emissionsmaxima 605 nm). Dieses ist von besonderer Nützlichkeit, weil es erlaubt, dass dieselbe Ausrüstung verwendet wird, um sowohl DNA als auch Protein in Gelen zu detektieren. Der breite Bereich von Anregungswellenlängen erlaubt, dass die Verbindung durch 488 nm- und 514 nm-Banden des Argon-Ionenlasers stark angeregt wird, sowie Licht absorbiert, das von Diodenlichtquellen, wie solchen, die bei ungefähr 400 nm emittieren, emittiert wird.
- In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist eine fluoreszierende Form der Verbindung gemäß Formel (I)–(Ic) in der Lage, Licht von der 488 nm-Ausgangsleistung des Argon-Ionenlasers stark zu emittieren, und das Licht bei Wellenlängen von länger als 600 nm wieder zu emittieren.
- In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Verbindung gemäß Formel (I) in einer Zusammensetzung, zusammen mit einem analytisch verträglichen Träger eingeschlossen und kann in Verbindung mit einem Fluorochrom, wie Fluoreszein, in Zwei-Farbenanfärbe-Anwendungen verwendet werden. Ein derartiges Fluorochrom kann in der Zusammensetzung eingeschlossen sein oder getrennt verwendet werden.
- Die Verbindung gemäß Formel (I)–(Ic) kann durch eine Pilzspezies produziert werden. Vorzugsweise ist die Pilzspezies der Stamm, der bei den Australian Government Analytical Laboratories (AGAL) am 15. Januar 1998, identifiziert durch die Accession Number NM98/00507, hinterlegt wurde.
- Die Verfahren zur Reinigung, Isolierung, sowie der Struktur des neuen Fluorophors 5,6-Dihydro-3-[(1Z,4E,6E,8E)-1-hydroxy-3-oxo-1,4,6,8-decatetraenyl]-6-hydroxymethyl-9a-methyl-2H-furo[3,2-g][2]benzopyran-2-9(9aH)-dion und verwandter Verbindungen sind vorher nicht beschrieben worden.
- Die Bindung der Verbindung gemäß Formel (I)–(Ic) an Stickstoff-haltige organische Moleküle kann eine direkte chemische oder physikalische Bindung einschließen oder kann durch die Verwendung von „verbindenden Molekülen", die auf dem Fachgebiet bekannt sind, erreicht werden. Organische Moleküle, welche durch die Verbindung der Erfindung gebunden werden können, wenn sie als ein fluoreszierender Farbstoff verwendet werden, schließen zum Beispiel Proteine, Peptide, Zucker, Nucleinsäuren, Antikörper, Zelloberflächenbiomoleküle, Detergenzien und Zellen ein. Wegen der fluoreszierenden Eigenschaft und der Eigenschaft, eine organische Verbindung zu binden, der Verbindung ist es ersichtlich, dass die Verbindung Verwendung in jeder Anwendung hat, bei der Detektion eines fluoreszierenden Farbstoffs erforderlich ist, der mit einer Stickstoff-haltigen organischen Verbindung verbunden ist.
- In einer weiteren Ausführungsform besteht die vorliegende Erfindung aus einem Verfahren zum Herstellen einer Verbindung gemäß der Formel (I)–(Ic) der zweiten Ausführungsform der Erfindung, wobei das Verfahren das Züchten einer Pilzspezies unter solchen Bedingungen umfasst, dass die Pilzspezies die Verbindung produziert; und das Abtrennen der Verbindung von der Kultur.
- Die Verbindung gemäß Formel (I)–(Ic) kann als fluoreszierender Farbstoff verwendet werden, wenn er sich in einem Rohkulturextrakt befindet oder wenn er durch Extraktions- und Trennverfahren gereinigt wird.
- Es ist von den Erfindern festgestellt worden, dass nach Impfung und Inkubation des Stammes, der durch die AGAL-Acession Number NM98/00507 identifiziert ist, auf Wachstumsmedium, eine Verbindung, welche als fluoreszierender Farbstoff geeignet ist, durch den Pilz produziert wird.
- Es ist ersichtlich, dass es möglich sein sollte, Verbindungen gemäß Formel (I)–(Ic) unter Verwendung von anderen Verfahren als vom Überstand einer geeigneten Pilzkultur zu produzieren. Wenn der Pilz zum Beispiel eine „Vorstufe" produziert, dann ist es möglich, diese Vorstufe durch chemische, physikalische oder enzymatische Mittel zu seiner fluoreszierenden Form zu modifizieren. Das Wissen, dass derartige Verbindungen von Mikroorganismen erhalten werden können, sollte die Entdeckung und Produktion anderer Verbindungen, die zur Verwendung als fluoreszierende Farbstoffe geeignet sind, die zu derselben Familie gehören, oder von völlig unterschiedlichen Verbindungen mit nützlichen Eigenschaften erlauben. Die Verbindung gemäß Formel (I) kann auch durch direkte chemische Synthese oder durch Modifikation von Zwischenprodukt(en) im biosynthetischen Weg, der durch die Pilze verwendet wird, synthetisch produziert werden.
- Die Verbindung gemäß Formel (I)–(Ic) der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann auch durch chemische Mittel synthetisch hergestellt werden. Das Wissen, dass eine neue fluoreszierende Verbindung durch Pilze produziert wird, kann zu anderen Mitteln zum Herstellen der Verbindung, abgesehen vom Züchten der Pilze unter den erforderlichen Bedingungen, führen.
- Die Verbindung gemäß Formel (I)–(Ic) weist den eindeutigen Vorteil auf, dass sie an Zellen und andere organische Moleküle in ihrer fluoreszierenden Form bindet, kann also als Mittel verwendet werden, um die Zellen oder die anderen organischen Moleküle zu verfolgen, wenn sie mit der Verbindung markiert sind.
- In einer sechsten Ausführungsform besteht die vorliegende Erfindung in der Verwendung der Verbindung gemäß Formel (I)–(Ic) als fluoreszierender Farbstoff oder Marker, vorzugsweise in wissenschaftlichen Verfahren zum Anfärben, Markieren und/oder Detektieren von Stickstoffhaltigen organischen Molekülen.
- Beispiele der Verwendung der Verbindung gemäß Formel (I)–(Ic) schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Farbstoffe zur Zellverfolgung für die Mikroskopie, Membranfluiditätsfarbstoffe, Konjugation mit Antikörpern, Konjugation mit Nucleinsäuren, Farbstoffe zur Bildgebung von Zelloberflächenliganden, Konjugation mit Zuckern, cytometrische Analyse und konfokale Mikroskopie. Es ist jedoch ersichtlich, dass die Verbindung für jede Verwendung geeignet sein würde, bei der die Fluoreszenz in den roten Wellenlängen, einschließlich bei Anregung bei 488 nm, erforderlich ist.
- In einer siebenten Ausführungsform besteht die vorliegende Erfindung aus einem Verfahren von Fluoreszenzmarkierung einer Stickstoff-haltigen organischen Verbindung, wobei das Verfahren das Bewirken des Bindens der Verbindung gemäß Formel (I)–(Ic) an eine Stickstoff-haltige organische Verbindung umfasst, so dass die organische Verbindung mit der Verbindung fluoreszierend markiert ist.
- Vorzugsweise wird die fluoreszierend markierte organische Verbindung detektiert, wenn sie einem breiten Bereich von Wellenlängen, vorzugsweise Wellenlängen im Bereich von 300–560 nm ausgesetzt wird.
- Die Stickstoff-haltige organische Verbindung kann einschließen, ist aber nicht beschränkt auf Proteine, Peptide, Zucker, Nucleinsäuren, Antikörper, Zelloberflächenbiomoleküle, Detergenzien und Zellen. Die Verbindung kann direkt an die organische Verbindung binden, die auf eine chemische oder physikalische Bindung zurückzuführen ist, oder kann an die organische Verbindung über ein verbindendes Molekül binden. Wenn die Verbindung mit einem Liganden verbunden ist, der für die organische Verbindung spezifisch ist, zum Beispiel ein Antikörper oder ein Lectin, dann bewirkt das Binden dieses Liganden an die organische Verbindung, dass die organische Verbindung fluoreszierend markiert wird.
- In einer achten Ausführungsform besteht die vorliegende Erfindung aus einem Verfahren des Detektierens einer Stickstoff-haltigen organischen Verbindung in einer Probe, einschließlich der organischen Verbindung, wobei das Verfahren das Markieren der organischen Verbindung gemäß dem Verfahren der siebenten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst; und das Detektieren der organischen Verbindung in der Probe durch Überwachen oder das Detektieren ihrer Fluoreszenz. Vorzugsweise wird die markierte organische Verbindung detektiert, wenn die Probe Licht eines breiten Bereichs von Wellenlängen, vorzugsweise Wellenlängen im Bereich von 300–560 nm, stärker bevorzugt blauen Wellenlängen ausgesetzt wird.
- Das Überwachen oder Detektieren der Fluoreszenz der markierten organischen Verbindung kann durch jedes Mittel erfolgen, das auf dem Fachgebiet bekannt ist. Derartige Mittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Durchleuchtung, Spektroskopie, Mikroskopie und Cytometrie.
- In der gesamten Beschreibung ist es selbstverständlich, dass das Wort „umfassen" oder Variationen, wie „umfasst" oder „umfassend", das Einschließen eines angegebenen Elements, einer ganzen Zahl oder eines Schrittes, oder einer Gruppe von Elementen, ganzen Zahlen oder Schritten, aber nicht das Einschließen von jedem anderen Element, ganzen Zahl oder Schrittes, oder einer Gruppe von Elementen, ganzen Zahlen oder Schritten, bedeutet.
- Jede Diskussion über Dokumente, Handlungen, Materialien, Vorrichtungen, Gegenstände oder dergleichen, welche in der vorliegenden Beschreibung eingeschlossen sind, ist nur zum Zweck des Bereitstellens eines Zusammenhangs für die vorliegende Erfindung. Sie soll nicht als Zugeständnis genommen werden, dass eine oder alle diese Angelegenheiten Teil der Grundlage des Stands der Technik bilden oder gewöhnliches allgemeines Wissen auf dem Gebiet waren, das für die vorliegende Erfindung relevant ist, wie es in Australien vor dem Prioritätsdatum jedes Patentanspruchs dieser Anwendung bestand.
- Damit die vorliegende Erfindung klarer verstanden werden kann, werden bevorzugte Formen mit Bezug auf die folgenden Beispiele und die dazugehörigen Zeichnungen beschrieben.
- Kurze Beschreibung der Zeichnungen
-
1 zeigt ein NMR-Spektrum von 5,6-Dihydro-3-[(1Z,4E,6E,8E)-1-hydroxy-3-oxo-1,4,6,8-decatetraenyl]-6-hydroxymethyl-9a-methyl-2H-furo[3,2-g][2]benzopyran-2-9(9aH)-dion, einer fluoreszierenden Verbindung gemäß den ersten, zweiten, dritten und vierten Ausführungsformen der Erfindung. -
2 zeigt ein Beispiel von Emissionsspektren der Verbindung, die durch1 identifiziert sind, wenn sie an Rinderserumalbumin (BSA) und Propidiumiodid gebunden ist, das an DNA gebunden ist. Die Anzahl an Molen der gereinigten Verbindung, die verwendet wurde, um überschüssiges BSA zu binden, war gleich der Anzahl an Molen von Propidiumiodid, das verwendet wurde, um an überschüssige DNA zu binden. Es gibt zwei Anregungsbanden, die Emission bei 605 nm zur Folge haben. Wie gesehen, hat Anregung durch Licht bei 390–400 nm eine maximale Emission von Licht bei 605 nm zur Folge. - Wege zum Ausführen der Erfindung
- Beispiel 1: Produktion von Extrakt A.
- Eine biologisch reine Kultur des Mikroorganismus, der alle der identifizierenden Eigenschaften des Stammes aufweist, der durch die AGAL-Accession Number NM98/00507 identifiziert ist, wurde erhalten.
- Ein Wachstumsmedium für den Pilz, AGAL-Accession Number NM98/00507, wurde durch Zufügen von 40 g Saccharose (CSR), 5 g Hefeextrakt (Difco), 10 g Pepton (Difco) und 10 g Agar (Difco) zu 1 l Wasser hergestellt. Das Gemisch wurde 15 Minuten lang bei 115°C autoklaviert, um sowohl das Medium zu sterilisieren als auch das Agar zu lösen. Die Flüssigkeit wurde in Kulturschalen gegossen und bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach dem Abgekühlen wurde eine Kultur des Pilzes auf die Oberfläche des Mediums geimpft und bei 25°C drei Tage lang inkubiert. Die Kultur wurde in einen Kühlschrank überführt und bei 4°C inkubiert, bis die Kultur zu einer intensiven roten Farbe wechselte und die Farbstoffproduktion hoch war (normalerweise 3 bis 5 Tage).
- Sobald die Kultur ausreichenden Farbstoff zum Ernten produzierte, wurde das Kulturmedium, das die Pilzbiomasse einschließt, in Ethanol in einem Verhältnis von einem Volumen Kulturmedium zu zwei Volumina Ethanol überführt. Der Farbstoff wurde durch Inkubation bei 4°C und 16 Stunden langem Schütteln in die ethanolische Phase extrahiert. Die flüssige Phase wurde vom Restkulturmedium dekantiert und bei 3000 U/min 10 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert.
- Der geklärte Extrakt (Extrakt A) wurde entweder zur Verwendung gelagert oder gemäß einem der Verfahren, die unter den Beispielen 2 und 3 beschrieben sind, weiter gereinigt.
- Beispiel 2: Reinigung des Extraktes A zum Produzieren des Extraktes B.
- Der ethanolische Rohextrakt von Extrakt A, der gemäß dem Verfahren produziert wurde, das in Beispiel 1 beschrieben wurde, wurde unter hohem Vakuum im Volumen verringert, auf Cellulosepulver unter Verwendung von Methanol als Lösungsmittel chromatographiert und auf eine Sephadex LH-20-Säule aufgebracht, die auch mit Methanol eluiert wurde. Fraktionen wurden über 48 Stunden gesammelt und die purpurrote Bande, die nahe dem Ende eluiert, wurde gesammelt. Diese Fraktion wurde gefriergetrocknet und in einem minimalen Volumen (0,1% Essigsäure) Methanol resuspendiert und gelagert.
- Beispiel 3: Reinigung von 5,6-Dihydro-3-[(1Z,4E,6E,8E)-1-hydroxy-3-oxo-1,4,6,8-decatetraenyl]-6-hydroxymethyl-9a-methyl-2H-furo[3,2-g][2]benzopyran-2-9(9aH)-dion.
- Der Extrakt B, der gemäß dem Verfahren produziert wurde, das in Beispiel 2 beschrieben wurde, wurde einer HPLC-Reinigung (Supelco C16-Amidsäule, gelöst in 75% Methanol/Wasser, 0,05% Essigsäure, dann 50% Acetonitril/Wasser, 0,05% Essigsäure) unterzogen. Die Endfraktion wurde eingefroren (–20°C), um Wasser zu entfernen, und das restliche Acetonitril wurde unter einem Stickstoffstrom verdampft.
- Dieses Verfahren produzierte analytisch reines 5,6-Dihydro-3-[(1Z,4E,6E,8E)-1-hydroxy-3-oxo-1,4,6,8-decatetraenyl]-6-hydroxymethyl-9a-methyl-2H-furo[3,2-g][2]benzopyran-2-9(9aH)-dion, welches ein oranger Feststoff war.
- Beispiel 4: Strukturbestimmung von 5,6-Dihydro-3-[(1Z,4E,6E,8E)-1-hydroxy-3-oxo-1,4,6,8-decatetraenyl]-6-hydroxymethyl-9a-methyl-2H-furo[3,2-g][2]benzopyran-2-9(9aH)-dion.
- Die Verbindung, die gemäß Beispiel 3 produziert wurde, wurde unter Verwendung einer Kombination von NMR-Spektroskopie und hochauflösender Massenspektrometrie analysiert, um die Struktur von 5,6-Dihydro-3-[(1Z,4E,6E,8E)-1-hydroxy-3-oxo-1,4,6,8-decatetraenyl]-6-hydroxymethyl-9a-methyl-2H-furo[3,2-g][2]benzopyran-2-9(9aH)-dion zu bestimmen.
- Kernspinresonanzspektroskopie.
- Die NMR-Probe wurde durch Lösen der HPLC-gereinigten Verbindung, die von Beispiel 3 (~ 5 mg) erhalten wurde, in CDCl3 (0,5 ml; 99,96 Atom-%, Aldrich) und Filtrieren dieser in ein NMR-Röhrchen (PP527, Wilmald) erzeugt. Die Probe wurde unter Stickstoffatmosphäre entgast und equilibriert.
- Die NMR-Daten wurden auf einem Bruker DRX600 (600 MHz) NMR-Spektrometer bei 27°C erhalten und unter Verwendung von xwinNMR (Version 2.6; Bruker) verarbeitet. Alle 2D-NMR-Experimente wurden mit Quadraturdetektion mit einer spektralen 1H-Breite von 6009 Hz und einer Kreislaufverzögerung (einem Recycle-Delay) von 2 s laufen gelassen. Chemische Verschiebungen wurden auf das restliche CHCl3 (δH 7,26 ppm; δC 77,01 ppm) bezogen. Hochleistungs-1H-π/2-Impulse wurden bestimmt zu 9,5 ms und Niederleistung (für MLEV-Spinsicherung(-Spin Lock)) bei 25,15 ms. 13C-Hochleistungs-π/2-Impulse betrugen 10,5 ms und ein Niederleistungsimpuls von 65 ms wurde zur GARP-Entkopplung verwendet. Gradientenimpulse wurden entlang der Z-Achse unter Verwendung eines 100 Schritt-Sinusprogramms zugeführt.
- Daten für 1D-Experimente wurden unter Verwendung von 32 K realen Punkten und null, die zu 64 K gerillt wurden, und dann Gaußsch multipliziert zur Auflösungsverbesserung, erhalten. Die Kohlenstoff-Wasserstoff-Korrelation (HSQC) wurde über einen sensitivitätserhöhten Doppel-INEPT-Transfer unter Verwendung einer Echo/Antiecho-TPPI-Gradientenselektion erreicht (Palmer, A. G., III, Cavanagh, J. und Wright, P. (1991) J. Magn. Reson. 93, 151–70; Schleucher, J., Schwendinger, M., Sattler, M. und Schmidt, P. (1994) J. Biomol. NMR 4, 301–6; Kay, L. E., Keifer, P. und Saarinen, T. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114(26), 10663–5). 2K Datenpunkte wurden in t2 (128 Scans pro Stufe) mit einem Recycle-Delay von 1,3 s unter Entkopplung während der Erfassung gesammelt. Bei t1 wurden 512 Stufen verwendet (10–170 ppm), und die INEPT-Sequenz wurde für eine X-H-Kopplung von 145 Hz optimiert. Ein Gradientenverhältnis von 80:20,1 wurde verwendet, um die Sensitivität der Echo/Antiecho-TPPI-Phasen auszuwählen.
- Eindimensionale ROESY-Spektren wurden unter Verwendung eines selektiven Gaußschen Impulses auf das Proton von Interesse gemessen (Kessler, H., H. Oschkinat, C. Griesinger & W. Bermel, (1986) J. Magn. Reson. 70, 106; Stonehouse, J., P. Adell, J. Keeler & A.J. Shaka, (1994) J. Am. Chem. Soc. 116, 6037; Stott, K., J. Stonehouse, J. Keeler, T. L. Hwang & A. J. Shaka, (1995) J. Am. Chem. Soc. 117, 4199–4200). Ein Gaußsches Programm mit 1000 Schritten (60 ms, 64,6 dB) wurde verwendet, um einen π/2-Impuls zu erreichen. Eine Mischzeit von 100 ms (13 dB) wurde für einen kontinuierlichen Spin Lock verwendet. Die Gradientenauswahl wurde mit einem 15%-Gradienten entlang der z-Achse erreicht. 10 K Übergänge wurden über 6009 Hz gesammelt. ROE-Verbesserungen wurden als Prozentsatz des Bestrahlungspeaks gemessen und nicht für den Ausgleich von der Trägerfrequenz kompensiert.
- Zweidimensionale Homonuklear-Hartman-Hahn-Transferspektren (TOCSY) wurden unter Verwendung der MLEV17- (Bax, A. & Davis, D. G. (1985) J. Magn. Reson. 63(1), 207–13) Impulssequenz, flankiert von 2 ms Niederleistungstrimimpulsen, gemessen. Sinusglockeverschobene (90°)-Apodisation wurde bei der Verarbeitung beider Dimensionen verwendet.
- 2D-1H-13C-Korrelation über die Heteronuklear-Null- und Doppelquantenkohärenz, die für Langzeitkopplungen (HMBG) mit Tiefpass-J-filter (145 Hz) optimiert wurde, um die Einbandenkorrelationen zu unterdrücken (Bax, A. & M. F. Summers, (1986) J. Am. Chem. Soc. 108, 2093–2094), wurde ohne Entkopplung während der Erfassungszeit und unter Verwendung von Gradientenimpulsen (50:30:40,1) zur Auswahl erhalten. Die Verzögerung zur Entwicklung von Langzeitkopplungen wurde für Kopplungen von 20, 10, 5 und 2 Hz in getrennten Experimenten optimiert. Eine spektrale Breite von 210 ppm wurde in F1 verwendet und in der Endspektrumgrößenordnung berechnet, um die Phaseninformation zu zerstören.
- 1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ 1,75, s, C9a-Me; 1,84, dd, J 6,7, 1,1 Hz, C9'-Me; 2,80, dd, J 17,2, 3,6 Hz, H5α; 2,89, ddd, J 17,1, 11,5, 1,9 Hz, H5β; 3,85, dd, J 12,2, 5,5 Hz, C6CH 2OH; 3,97, dd, J 12,2, 3,4 Hz, C6CH 2OH; 4,39, m, H6; 5,97, m, H9'; 6,10, d, J 15,1 Hz, H4', 6,19, ddd, J 15,1, 10,6, 1,6 Hz, H8'; 6,25, dd, J 14,6, 11,2 Hz, H6'; 6,58, dd, J 14,5, 10,5 Hz, H7'; 6.79, s, H2'; 7,16, bs, H4, 7,32, dd, J 15,2, 11,2 Hz, H5'; 7,85, s, H8.
- 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 18,8, C9'-Me; 28,0, C9a-Me; 29,3, C5; 63,4, C6-CH2OH; 79,0, C6; 86,2, C9a; 101,0, C2'; 112,2, C8a; 113,4, C4; 115,3, C3; 126,5, C4'; 128,6, C6'; 131,7, C8'; 136,0, C9'; 140,9, C4a; 142,0, C7'; 142,6, C5'; 159,0, C8; 168,2, C2/C3a; 177,7, C1'; 185,0, C3'; 190,0, C9.
- Heteronuklear-Einzelquantenkohärenz (HSQC) wurde verwendet, um alle Protonen zu protonierten Kohlenstoffatomen zu korrelieren und zuzuordnen. Außerdem wurde jedes Spinsystem durch Laufenlassen einer Reihe von Gesamtkorrelationsspektroskopie-(TOCSY)Experimenten mit Mischzeiten von 8 ms, 20 ms, 100 ms charakterisiert. Die kürzeste Mischzeit ergab Korrelationen nur zu den direkt gekoppelten Protonen, wohingegen die längste Mischzeit das gesamte Spinsystem identifizierte und Information über sehr kleine Langzeitkopplungen ergab, welche für das Zuordnen der Positionen der vielen (anscheinend) ungekoppelten Protonen wertvoll waren. Völlige Raumverbindungen wurden durch eine Reihe von eindimensionalen selektiven Drehrahmenkorrelationsspektroskopie-(ROESY)Experimenten erreicht. Selektive Anregung wurde durch einen Gaußschen Niederleistungs-90°-Impuls und unter Verwendung einer Gradientenauswahl erreicht, um nur ROE's, frei von TOCSY-Transfers, zu beobachten. Es wurde festgestellt, dass eine Mischzeit von 100 ms optimal ist. Es wurde festgestellt, dass Langzeit-Heteronuklear-Multipelquantenkohärenz-(HMBC)Spektren mit Mischzeiten von 25, 50, 100 und 250 ms wesentlich sind, um alle nichtprotonierten Kohlenstoffatome zuzuordnen. Sogar nach diesem wurde festgestellt, dass C2 nicht mit allen Protonen korreliert und mit C3a bei 168,2 ppm übereinstimmte.
- Aus den spektralen Daten waren mehrere trizyklische Gerüste theoretisch möglich, aber eines, (5,6-Dihydro-3-[(1Z,4E,6E,8E)-1-hydroxy-3-oxo-1,4,6,8-decatetraenyl]-6-hydroxymethyl-9a-methyl-2H-furo[3,2-g][2]benzopyran-2-9(9aH)-dion), passte auf die erhältlichen Daten genau.
- Massenspektrometrie
- Die Verbindung, die gemäß Beispiel 3 produziert wurde, wurde Hochauflösungsmassenspektrometrie unterzogen, um zu bestimmen, dass die Molekülformel der Verbindung C23H22O7 war.
- Massenspektrum (ESI, positives Ion) m/e 411 (M + H+, 55%), 317 (5), 249 (12), 163 (10), 121 (100), 93 (4). Negatives Ion ESI-FTICR, gefunden: M – H+, 409,1304, C23H21O7 erfordert 409,1293; gefunden: 247,0617, C13H12O5 erfordert 247,0685.
- UV-vis-Spektrometrie und Infrarot-Spektrometrie
-
- λmax (MeOH) 432, 555 nm, ε 10000, 4000. λmax (alkalische MeOH) 432 nm, ε 16000. λmax (saures MeOH) 390, 560 nm, ε 6000, 10000.
- νmax (pur) 3400 (br), 2925, 2854, 1744, 1712, 1589, 1259, 1010 cm–1.
- Beispiel 5: Proteingelanfärbung unter Verwendung von Extrakt A.
- Ein Proteingel wurde gemäß irgendeinem von mehreren Standardprotokollen hergestellt. Zum Beispiel wurde ein SDS-PAGE-Gel gemäß dem Protokoll von Laemmli (U.K. 1970, Nature, 227:680–685) hergestellt. Nachdem die Elektrophorese beendet war, wurde das Gel aus dem Elektrophoresegerät entfernt. Das Gel wurde in einem Behälter fixiert, der 100 ml einer Färbelösung enthält, die aus 90 ml Wasser, 10 ml Glycerin und 5 ml Extrakt A bestand. Das Gel und die Färbelösung wurden unter leichtem Schütteln 90 Minuten lang inkubiert. Nach dem 90 Minuten langen Färbeverfahren wurde die Lösung entfernt und das Gel dreimal kurz in Wasser gewaschen. Nach diesen kurzen Waschungen wurde das Gel in 100 ml 10% Glycerin in Wasser gelegt und unter Schütteln weitere 30 Minuten lang inkubiert.
- Um die Proteine im Gel sichtbar zu machen, wurde das Gel auf ein UV-Durchleuchtungsgerät (307 nm) überführt und unter Verwendung eines Polaroid 667-Schwarz-Weiß-Films und eines Filtersatzes, der für die Detektion von Ethidiumbromidgelen entworfen wurde, fotografiert (z. B. Molecular Probes E-7591).
- Beispiel 6: Epifluoroeszenz-Unterscheidung von sporenbildenden und vegetativen Zellen.
- Ein Mikroorganismus wird unter Bedingungen gezüchtet, um die Sporenbildung zu fördern, und Extrakt B wird verwendet, um die Identifikation von sporenbildenden Zellen innerhalb einer überwiegend vegetativen Zellkultur zu erleichtern. Zum Beispiel wurde Saccharomyces cerevisiae in einer Brühe auf Wasserbasis wachsen gelassen, die 10 g/l Glukose, 5 g/l Hefeextrakt und 10 g/l Pepton enthält. Nach einer 16 Stunden langen Inkubation bei 30°C wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und in 1 ml Wasser resuspendiert. Die 5 μl-Aliquots der Kultur wurden auf ein halbfestes Medium getüpfelt, das aus 5% Kaliumacetat, 2% Agar und Wasser bestand. Die Kulturen wurden bei 22°C 4 Tage lang inkubiert, um die Sporenbildung der Hefezellen zu erlauben. Die sporenbildende Kultur wurde in Wasser zu einer Dichte von 1 × 109 Zellen pro ml resuspendiert. 5 μl Extrakt B wurde zu 1 ml sporenbildender Kultur zugefügt. Zum Gegenfärben wurden 5 μl einer 10 mM Lösung (in DMSO) von 5(6)-Carboxyfluoresceindiacetat (CFDA) zu der sporenbildenden Kultur zugefügt. Nach 5 Minuten wurde die sporenbildende Kultur durch Zentrifugation geerntet und in 1 ml Wasser resuspendiert. Untersuchung unter einem Epifluoreszenzmikroskop (Anregung 488 nm) ließ schnelle Unterscheidung zwischen sporenbildenden und vegetativen Zellen zu.
- Es ist für den Fachmann ersichtlich, dass zahlreiche Veränderungen und/oder Änderungen an der Erfindung durchgeführt werden können, wie in den spezifischen Ausführungsformen gezeigt, ohne vom Wesen oder Schutzbereich der Erfindung abzuweichen, wie ausführlich beschrieben. Die vorliegenden Ausführungsformen sind deshalb in jeder Hinsicht als veranschaulichend und nichtbeschränkend zu betrachten.
Claims (48)
- Komplex, umfassend eine Verbindung gemäß Formel (I):wobei: jeder der Reste R, R' und R'' ein Wasserstoffatom, Halogenatom oder ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkyl-, -Alkenyl- oder -Alkinylrest ist, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen, Hydroxy- und/oder Oxogruppen substituiert ist; die Ringe A, B und C gegebenenfalls eine oder mehrere Doppelbindungen beinhalten; die Ringe B und C gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen substituiert sind, einschließlich der Tautomere der Formel (I), und ein organisches Molekül, wobei das organische Molekül eine Stickstoff-haltige Verbindung ist; und wobei die Verbindung der Formel (I) mit dem organischen Molekül wechselwirkt, um nach Anregung zu fluoreszieren.
- Komplex nach Anspruch 1, umfassend eine Verbindung der Formel (Ia), einschließlich ihrer Tautomere:
- Komplex nach Anspruch 2, umfassend eine Verbindung mit der in Formel (Ib) gezeigten Stereochemie, einschließlich ihrer Tautomere:
- Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend eine Verbindung, in der R ein geradkettiger oder verzweigter konjugierter C1-20-Alkenylrest ist, der gegebenenfalls mit Hydroxy- und Oxogruppen substituiert ist; R' ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkylrest ist, der gegebenenfalls mit einer Hydroxygruppe substituiert ist, und R'' ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Allylrest ist, einschließlich ihrer Tautomere.
- Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Stickstoff-haltige Verbindung aus Proteinen, Aminosäuren, Peptiden, Nucleinsäuren und aliphatischen oder aromatischen Aminen ausgewählt ist.
- Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Verbindung der Formel (I) mit dem organischen Molekül in Gegenwart eines grenzflächenaktiven Mittels wechselwirkt, um nach Anregung zu fluoreszieren.
- Komplex nach Anspruch 6, wobei das grenzflächenaktive Mittel aus Salzen langkettiger Fettsäuren oder Sulfonsäuren ausgewählt ist.
- Verbindung gemäß Formel (I):wobei jeder der Reste R, R' und R'' ein Wasserstoffatom, Halogenatom oder ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkyl-, -Alkenyl- oder -Alkinylrest ist, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen, Hydroxy- und/oder Oxogruppen substituiert ist; die Ringe A, B und C gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen substituiert sind; und die Ringe A, B und C gegebenenfalls eine oder mehrere Doppelbindungen beinhalten; mit der Maßgabe, dass: (i) R ≠ -C(OH)CHC(O)(CH)6CH(Et)(Me), wenn R' = -CH2OH, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a; (ii) R ≠ -C(OH)CHC(O)(CH)6CH(Et)(Me), wenn R' = Me, R'' = Me; Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a; (iii) R ≠ -C(OH)CHC(O)(CH)6CH(Et)(Me), wenn R' = Me, R'' = Me; Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6; (iv) R ≠ -C(O)(CH)4Me, wenn R' = -n-propyl, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6; (v) R ≠ -C(O)(CH)6Me, wenn R' = -n-propyl, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6; (vi) R ≠ -C(O)(CH)5Me, wenn R' = -(CH)2Me, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6; (vii) R ≠ -C(O)(CH)6Me, wenn R' = -(CH)2Me, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6; (viii) R ≠ -(CH)2C(Me)CHC(Me)(Et), wenn R' = -Ac, R'' = Me, C4 = C1, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6; (ix) R ≠ -(CH)2C(Me)CHC(Me)(Et), wenn R' = -Ac, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6; (x) R ≠ -(CH)2C(Me)CH-i-Propyl, wenn R' = -Ac, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6; (xi) R ≠ -C(O)(CH)4Me, wenn R' = -(CH)2Me, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6; (xii) R ≠ -C(O)(CH)4Me, wenn R' = -n-propyl, R'' = Me, Ring A beinhaltet keine Doppelbindung; und Ringe B und C beinhalten Doppelbindungen zwischen C8a und C4a und C5 und C6; (xiii) R ≠ -C(O)(CH)4Me, wenn R' = -n-propyl, R'' = Me, Ringe A, B und C beinhalten keine Doppelbindungen; (xiv) R ≠ -C(O)(CH)6Me, wenn R' = -C(CH)2Me, R'' = Me, Ring A beinhaltet keine Doppelbindung; und Ringe B und C beinhalten Doppelbindungen zwischen C8a und C4a und C5 und C6; (xv) R ≠ -C(O)(CH)4Me, wenn R' = -C(CH)2(Me), R'' = Me, Ring A beinhaltet keine Doppelbindung; und Ringe B und C beinhalten Doppelbindungen zwischen C8 und C4a und C5 und C6; (xvi) R ≠ -C(O)(CH)4Me, wenn R' = -(CH)2Me, R'' = Me, Ring A beinhaltet keine Doppelbindung; und Ringe B und C beinhalten Doppelbindungen zwischen C8a und C4a und C5 und C6; (xvii) R ≠ -C(O)(CH2)4Me, wenn R' = -n-propyl, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6; (xviii) R ≠ -C(O)(CH2)6Me, wenn R' = -n-propyl, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6; (xix) R ≠ -C(O)(CH2)5Me, wenn R' = -(CH)2Me, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6; (xx) R ≠ -C(O)(CH2)6Me, wenn R' = -(CH)2Me, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6; (xxi) R ≠ -Ac, wenn R' = -(CH)2C(Me)CHCH(Me)(Et), R'' = Me, C4 = C1, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6; (xxii) R ≠ -Ac, wenn R' = -(CH)2C(Me)CHCH(Me)(Et), R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6; (xxiii) R ≠ -Ac, wenn R' = -(CH)2C(Me)CH-i-Propyl, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6; (xxiv) R ≠ -C(O)(CH2)4Me, wenn R' = -(CH)2Me, R'' = Me, Ring A beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C3 und C3a; Ring B beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C4 und C4a; und Ring C beinhaltet eine Doppelbindung zwischen C8 und C8a und C5 und C6; (xxv) R ≠ -C(O)(CH2)4Me, wenn R' = -n-propyl, R'' = Me, Ring A beinhaltet keine Doppelbindung; und Ringe B und C beinhalten Doppelbindungen zwischen C8a und C4a und C5 und C6; (xxvi) R ≠ -C(O)(CH2)4Me, wenn R' = -n-propyl, R'' = Me, Ringe A, B und C beinhalten keine Doppelbindungen; (xxvii) R ≠ -C(O)(CH2)6Me, wenn R' = -(CH)2Me, R'' = Me, Ring A beinhaltet keine Doppelbindung; und Ringe B und C beinhalten Doppelbindungen zwischen C8a und C4a und C5 und C6; (xxviii) R ≠ -C(O)(CH2)4Me, wenn R' = -C(CH2)(Me), R'' = Me, Ring A beinhaltet keine Doppelbindung; und Ringe B und C beinhalten Doppelbindungen zwischen C8a und C4a und C5 und C6; (xxix) R ≠ -C(O)(CH2)4Me, wenn R' = -(CH)2Me, R'' = Me, Ring A beinhaltet keine Doppelbindung; und Ringe B und C beinhalten Doppelbindungen zwischen C8a und C4a und C5 und C6, einschließlich ihrer Tautomere.
- Verbindung nach Anspruch 8 gemäß Formel (Ia):
- Verbindung nach Anspruch 9 mit der in Formel (Ib) gezeigten Stereochemie:
- Verbindung gemäß Formel (Ic), wobei R -C(OH)CHC(O)(CH)6CH3 ist, R' -CH2OH ist und R'' Me ist, wobei es sich um die Verbindung 5,6-Dihydro-3-[(1Z,4E,6E,8E)-1-hydroxy-3-oxo-1,4,6,8-decatetraenyl]-6-hydroxymethyl-9a-methyl-2H-furo[3,2-g][2]benzopyran-2-9(9aH)-dien gemäß Formel (Ic) handelt, einschließlich ihrer Tautomere:
- Verbindung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei die Verbindung in der Lage ist, mit einem Stickstoff-haltigen organischen Molekül wechselzuwirken, um nach Anregung zu fluoreszieren.
- Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder Verbindung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei die Verbindung bei Wechselwirkung mit einem Stickstoff-haltigen organischen Molekül nach der Anregung bei ultravioletten bis blauen Wellenlängen Fluoreszenz emittiert.
- Komplex nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder Verbindung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei die Verbindung bei Wechselwirkung mit einem Stickstoff-haltigen organischen Molekül bei Anregung durch Licht im Bereich von 300 bis 560 nm Fluoreszenz emittiert.
- Komplex oder Verbindung nach Anspruch 14, wobei das organische Molekül ein Protein ist und die Verbindung bei Wechselwirkung mit dem Protein nach Anregung bei 307 nm Fluoreszenz emittiert.
- Komplex oder Verbindung nach Anspruch 14, wobei die Verbindung bei Anregung durch Licht bei etwa 400 nm, 488 nm und 514 nm Fluoreszenz emittiert.
- Komplex oder Verbindung nach Anspruch 16, wobei die Verbindung bei etwa 600 nm nach Anregung bei 488 nm Fluoreszenz emittiert.
- Zusammensetzung, umfassend einen Komplex oder eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 17 und einen analytisch verträglichen Träger und gegebenenfalls ein Fluorochrom.
- Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, umfassend die Kultivierung einer Pilzspezies unter derartigen Bedingungen, dass die Pilzspezies die Verbindung erzeugt, und Trennen der Verbindung von der Kultur.
- Verwendung einer Verbindung gemäß Formel (I):wobei: jeder der Reste R, R' und R'' ein Wasserstoffatom, Halogenatom oder ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkyl-, -Alkenyl- oder -Alkinylrest ist, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen, Hydroxy- und/oder Oxogruppen substituiert ist; die Ringe A, B und C gegebenenfalls eine oder mehrere Doppelbindungen beinhalten; die Ringe B und C gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen substituiert sind, einschließlich der Tautomere der Formel (I); oder einer Verbindung der Formel (Ia), einschließlich ihrer Tautomere:
oder einer Verbindung mit der in Formel (Ib) gezeigten Stereochemie, einschließlich ihrer Tautomere:
oder einer Verbindung der Formel (I), (Ia) oder (Ib), wobei R ein geradkettiger oder verzweigter konjugierter C1-20-Alkenylrest ist, der gegebenenfalls mit Hydroxy- und Oxogruppen substituiert ist; R' ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkylrest ist, der gegebenenfalls mit einer Hydroxygruppe substituiert ist, und R'' ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkylrest ist, einschließlich ihrer Tautomere, oder einer Verbindung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, als fluoreszierender Farbstoff oder Marker nach Wechselwirkung mit einem Stickstoff-haltigen organischen Molekül.
- Verwendung nach Anspruch 20 in einem Verfahren zum Anfärben, Markieren und/oder Nachweis organischer Moleküle.
- Verwendung einer Verbindung gemäß Formel (I):wobei: jeder der Reste R, R' und R'' ein Wasserstoffatom, Halogenatom oder ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkyl-, -Alkenyl- oder -Alkinylrest ist, der gegebenenfalls mit einem oder zwei Halogenatomen, Hydroxy- und/oder Oxogruppen substituiert ist; die Ringe A, B und C gegebenenfalls eine oder mehrere Doppelbindungen beinhalten; die Ringe B und C gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen substituiert sind, einschließlich der Tautomere der Formel (I); oder einer Verbindung der Formel (Ia), einschließlich ihrer Tautomere:
oder einer Verbindung mit der in Formel (Ib) gezeigten Stereochemie, einschließlich ihrer Tautomere:
oder einer Verbindung der Formel (I), (Ia) oder (Ib), wobei R ein geradkettiger oder verzweigter konjugierter C1-20-Alkenylrest ist, der gegebenenfalls mit Hydroxy- und Oxogruppen substituiert ist; R' ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkylrest ist, der gegebenenfalls mit einer Hydroxygruppe substituiert ist, und R'' ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkylrest ist, einschließlich ihrer Tautomere, oder einer Verbindung nach einem der Ansprüche 8 bis 12 zur Bildung eines Komplexes mit einem organischen Molekül, wobei das organische Molekül ein Stickstoff-haltiges Molekül ist und der Komplex in der Lage ist, bei Anregung zu fluoreszieren.
- Verfahren zum fluoreszenten Markieren eines Stickstoff-haltigen organischen Moleküls, umfassend das Bewirken einer Bindung einer Verbindung gemäß Formel (I):wobei: jeder der Reste R, R' und R'' ein Wasserstoffatom, Halogenatom oder ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkyl-, -Alkenyl- oder -Alkinylrest ist, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen, Hydroxy- und/oder Oxogruppen substituiert ist; die Ringe A, B und C gegebenenfalls eine oder mehrere Doppelbindungen beinhalten; die Ringe B und C gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen substituiert sind, einschließlich der Tautomere der Formel (I); oder einer Verbindung der Formel (Ia), einschließlich ihrer Tautomere:
oder einer Verbindung mit der in Formel (Ib) gezeigten Stereochemie, einschließlich ihrer Tautomere:
oder einer Verbindung der Formel (I), (Ia) oder (Ib), wobei R ein geradkettiger oder verzweigter konjugierter C1-20-Alkenylrest ist, der gegebenenfalls mit Hydroxy- und Oxogruppen substituiert ist; R' ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkylrest ist, der gegebenenfalls mit einer Hydroxygruppe substituiert ist, und R'' ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkylrest ist, einschließlich ihrer Tautomere, oder einer Verbindung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, an ein Stickstoff-haltiges organisches Molekül derart, dass das organische Molekül mit der Verbindung fluoreszent markiert wird.
- Komplex, Verbindung, Verfahren, Zusammensetzung oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, 13 bis 15 und 19, wobei das organische Molekül ein Protein, Peptid, Zucker, Nucleinsäure, Zelloberflächenmolekül oder Detergens ist oder in einem Antikörper oder einer Zelle enthalten ist.
- Komplex, Verbindung, Zusammensetzung, Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 24, wobei die Verbindung an das organische Molekül über ein verbindendes Molekül gebunden ist.
- Verfahren zum Nachweis eines Stickstoff-haltigen organischen Moleküls in einer Probe, die das organische Molekül beinhaltet, wobei das Verfahren das Markieren des organischen Moleküls nach dem Verfahren von Anspruch 23 und den Nachweis des organischen Moleküls in der Probe durch Überwachen oder Nachweis seiner Fluoreszenz umfasst.
- Verfahren nach Anspruch 26, wobei das markierte organische Molekül nachgewiesen wird, wenn die Probe Licht innerhalb eines breiten Wellenlängenbereichs, vorzugsweise Wellenlängen im Bereich von 300 bis 560 nm, noch mehr bevorzugt ultravioletten bis blauen Wellenlängen, ausgesetzt wird.
- Verfahren nach Anspruch 26 oder Anspruch 27, wobei das Überwachen oder der Nachweis der Fluoreszenz des markierten organischen Moleküls durch Durchleuchtung, Spektroskopie, Mikroskopie oder Cytometrie erfolgt.
- Zusammensetzung, umfassend: (i) eine Verbindung gemäß Formel (I)wobei: jeder der Reste R, R' und R'' ein Wasserstoffatom, Halogenatom oder ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkyl-, -Alkenyl- oder -Alkinylrest ist, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen, Hydroxy- und/oder Oxogruppen substituiert ist; die Ringe A, B und C gegebenenfalls eine oder mehrere Doppelbindungen beinhalten; die Ringe B und C gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen substituiert sind, einschließlich der Tautomere der Formel (I), und (ii) ein organisches Molekül, wobei das organische Molekül ein Stickstoff-haltiges Molekül ist; wobei die Verbindung mit einem organischen Molekül wechselwirkt, um nach Anregung zu fluoreszieren.
- Komplex, umfassend eine Verbindung gemäß Formel (I):wobei: jeder der Reste R, R' und R'' ein Wasserstoffatom, Halogenatom oder ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkyl-, -Alkenyl- oder -Alkinylrest ist, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen, Hydroxy- und/oder Oxogruppen substituiert ist; die Ringe A, B und C gegebenenfalls eine oder mehrere Doppelbindungen beinhalten; die Ringe B und C gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen substituiert sind, einschließlich der Tautomere der Formel (I), und ein anorganisches Molekül, wobei das anorganische Molekül ein Stickstoff-haltiges Molekül ist; und wobei die Verbindung in der Lage ist, mit dem anorganischen Molekül wechselzuwirken, um nach Anregung zu fluoreszieren.
- Komplex nach Anspruch 30, umfassend eine Verbindung gemäß Formel (Ia), einschließlich ihrer Tautomere:
- Komplex nach Anspruch 31, wobei die Verbindung die in Formel (Ib) gezeigte Stereochemie besitzt, einschließlich ihrer Tautomere:
- Komplex nach einem der Ansprüche 30 bis 32, wobei R ein geradkettiger oder verzweigter konjugierter C1-20-Alkenylrest ist, der gegebenenfalls mit Hydroxy- und Oxogruppen substituiert ist; R' ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkylrest ist, der gegebenenfalls mit einer Hydroxygruppe substituiert ist, und R'' ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkylrest ist, einschließlich seiner Tautomere.
- Komplex nach Anspruch 32 oder 33, umfassend eine Verbindung, wobei R -C(OH)CHC(O)(CH)6CH3 ist, R' -CH2OH ist und R'' Me ist, wobei es sich um die Verbindung 5,6-Dihydro-3-[(1Z,4E,6E,8E)-1-hydroxy-3-oxo-1,4,6,8-decatetraenyl]-6-hydroxymethyl-9a-methyl-2H-furo[3,2-g][2]benzopyran-2-9(9aH)-dion gemäß Formel (Ic) handelt, einschließlich ihrer Tautomere:
- Komplex nach einem der Ansprüche 30 bis 34, wobei das Stickstoff-haltige Molekül aus Ammoniak, Hydrazin und Hydroxylamin, Ammoniak-haltigen Verbindungen, Hydrazin-haltigen Verbindungen und Hydroxylamin-haltigen Verbindungen ausgewählt ist.
- Komplex nach einem der Ansprüche 30 bis 35, wobei die Verbindung mit dem anorganischen Molekül in Gegenwart eines grenzflächenaktiven Mittels wechselwirkt, um nach Anregung in einem breiten Wellenlängenbereich zu fluoreszieren.
- Komplex nach Anspruch 36, wobei das grenzflächenaktive Mittel aus Salzen langkettiger Fettsäuren oder Sulfonsäuren ausgewählt ist.
- Komplex nach einem der Ansprüche 30 bis 37, wobei die Verbindung bei Wechselwirkung mit einem anorganischen Molekül nach Anregung bei ultravioletten bis blauen Wellenlängen Fluoreszenz emittiert.
- Komplex nach einem der Ansprüche 30 bis 37, wobei die Verbindung bei Anregung durch Licht im Bereich von 300 bis 560 nm Fluoreszenz emittiert.
- Komplex nach Anspruch 39, wobei die Verbindung bei Anregung durch Licht bei etwa 400 nm, 488 nm oder 514 nm Fluoreszenz emittiert.
- Komplex nach Anspruch 40, wobei die Verbindung im sichtbaren Wellenlängenbereich nach Anregung bei 488 nm Fluoreszenz emittiert.
- Zusammensetzung, umfassend einen Komplex nach einem der Ansprüche 30 bis 41, einen analytisch verträglichen Träger und gegebenenfalls ein Fluorochrom.
- Verwendung einer Verbindung gemäß Formel (I)als fluoreszenter Farbstoff oder Marker nach Wechselwirkung mit einem anorganischen Molekül, wobei: das anorganische Molekül ein Stickstoff-haltiges Molekül ist; jeder der Reste R, R' und R'' ein Wasserstoffatom, Halogenatom oder ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkyl-, -Alkenyl- oder -Alkinylrest ist, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen, Hydroxy- und/oder Oxogruppen substituiert ist; die Ringe A, B und C gegebenenfalls eine oder mehrere Doppelbindungen beinhalten; die Ringe B und C gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen substituiert sind, einschließlich der Tautomere der Formel (I).
- Verwendung nach Anspruch 43 in einem Verfahren zum Anfärben, Markieren und/oder Nachweis anorganischer Moleküle.
- Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen durch Fluoreszenz, wobei das Verfahren das Wechselwirken einer Verbindung gemäß Formel (I)mit dem Biomolekül umfasst, wobei: jeder der Reste R, R' und R'' ein Wasserstoffatom, Halogenatom oder ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkyl-, -Alkenyl- oder -Alkinylrest ist, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen, Hydroxy- und/oder Oxogruppen substituiert ist; die Ringe A, B und C gegebenenfalls eine oder mehrere Doppelbindungen beinhalten; die Ringe B und C gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen substituiert sind, einschließlich der Tautomere der Formel (I).
- Verfahren nach Anspruch 45, wobei das Biomolekül nachgewiesen wird, wenn die Probe Licht innerhalb eines breiten Wellenlängenbereichs, vorzugsweise Wellenlängen im Bereich von 300 bis 560 nm, noch mehr bevorzugt ultravioletten bis blauen Wellenlängen, ausgesetzt wird.
- Verfahren nach Anspruch 45 oder Anspruch 46, wobei das Überwachen oder der Nachweis der Fluoreszenz des Biomoleküls durch Durchleuchtung, Spektroskopie, Mikroskopie oder Cytometrie erfolgt.
- Zusammensetzung, umfassend: (i) eine Verbindung gemäß Formel (I)wobei: jeder der Reste R, R' und R'' ein Wasserstoffatom, Halogenatom oder ein geradkettiger oder verzweigter C1-20-Alkyl-, -Alkenyl- oder -Alkinylrest ist, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen, Hydroxy- und/oder Oxogruppen substituiert ist; die Ringe A, B und C gegebenenfalls eine oder mehrere Doppelbindungen beinhalten; die Ringe B und C gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen substituiert sind, einschließlich der Tautomere der Formel (I), und (ii) ein anorganisches Molekül, wobei das anorganische Molekül ein Stickstoff-haltiges Molekül ist; wobei die Verbindung in der Lage ist, mit einem anorganischen Molekül wechselzuwirken, um nach Anregung zu fluoreszieren.
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