KR20030016251A - 형광성 화합물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 식 (Ⅰ)의 형광성 염료 화합물에 관한 것이다. 이들 화합물은 유기 화합물과 상호작용하여 빛의 특정 파장에 의해 여기되어 형광성을 방출한다. 형광성의 검출 및/또는 감시는 이들 형광 염료 화합물에 결합하는 유기 화합물의 검출 또는 정량화를 위한 수단을 제공하다.
(Ⅰ)
상기 식에서,
R, R' 및 R" 각각은 수소 원자, 할로겐 원자, 또는 선택적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록시 및/또는 옥시기로 치환되는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-20알킬, 알케닐, 또는 알키닐기이고,
고리 A, B, 및 C는 선택적으로 하나 이상의 이중 결합을 포함하고,
고리 B 및 C는 선택적으로 하나 이상의 할로겐 원자로 치환됨.
Description
형광성을 나타내는 화합물은 수많은 용도가 있고 특히 전세포, 세포의 성분 및 세포의 기능을 검출하는 데 형광성이 필요한 생물학 분야에 적합하다는 것은 알려져 있다. 예를 들면 형광에 의해 표적이 되어 검출될 수 있는 샘플이 수많은 진단 및 분석 기술에 필요하다. 이러한 기술은 세포, 조직, 단백질, 항체, 효소, 약물, 호르몬, 지질, 뉴클레오타이드, 핵산, 탄수화물, 또는 천연 또는 합성 폴리머와 같은 다양한 물질과 상호작용하여 형광성 접합체를 형성하는 형광성 염료 또는 프로브를 이용하여 달성되는 것이다.
합성 형광 프로브와 함께, 리간드가 종종 사용되어 관찰하고자 하는 생화학적 반응에 대한 특이성을 제공하고 형광성 염료는 상호작용의 검출과 정량화의 수단을 제공한다. 이러한 용도로는 다른 것 중에서 단백질의 검출(예를 들면 겔 또는 수용액 상에서), 세포 추적, 형광으로 표지된 항체를 통한 단백질의 검출, 효소 활성의 평가, 핵산의 염색을 포함한다.
장파장 흡수는 세포의 자기 형광(auto-fluorescence)으로부터의 간섭을 감소시키고 빛과 조합하여 형광단의 세포독성을 감소시키기 때문에, 통상 형광 프로브의 활용성을 증가시킨다. 비록 레이저가 형광성의 여기를 위한 집중된 광원으로 특히 유용하지만, 현재의 레이저 출력은 광의 특정 파장으로 제한된다. 따라서, 레이저 출력과 동일한 여기 스펙트럼을 가진 화합물이 특히 유용하다. 아르곤 레이저가 형광성의 여기를 위한 가장 보편적인 광원이고 488 nm와 514 nm의 광에서 주된 출력을 가진다. 따라서, 이들 파장 중 어느 하나에 의해 여기되는 형광성 화합물은 특히 유용하다. 또는, 발광 다이오드와 같은 고체 상태의 광원을 이용하여 형광성의 여기를 달성할 수 있다. 이들 대체 광원에서 나온 빛에 의해 여기된 형광성 화합물은 또한 특정한 활용성이 있다.
적색의 형광 화합물은 수많은 생물학 연구 분야에서 폭넓게 사용된다. Texas red, Tetramethyl rhodamine-isothiocyanate 또는 적색 발광 BODIPY 염료를 포함하는 이들 중 다수는 542 nm와 같은 녹색 파장에서 여기하는 것이 필요하다. 이것으로 인해 많은 용도에서 특히 아르곤-이온 레이저가 여기를 위해 사용되는 경우 이들의 사용이 제한된다. 에티듐 브로마이드와 같은 화합물은 아르곤-이온 레이저(520 nm 대역)에서 나온 빛에 의해 여기될 수 있지만, 핵산 이외의 유기 분자의 표지화(tagging)에는 일반적으로 적합하지 않다. 피코에리트린(phycoerythrin)과 같은 다른 화합물은 아르곤-이온 레이저(488 nm)를 이용하여 여기될 수 있지만, 오렌지/적색 파장에서 방출된다. 그러나 피코에리트린은 안정성이 불량하고 높은 분자량을 가져서 세포 추적, 핵산의 표지화, 또는 단백질의 염색과 같은 많은 용도에 부적합하게 만든다.
단백질을 염색하는 데에는 다수의 방법이 활용되고 있다. 이들 방법은 비형광 화합물 또는 형광 화합물을 활용할 수 있다. 가장 흔하게 사용되는 방법에서는 비형광성인 Coomassie blue를 활용하여 다량의 유기 용매의 사용이 필요하고 시간이 소모된다. 비형광성 방법 보다 더욱 민감한 다른 형광성 물질을 기반으로 한 단백질 검출방법이 활용될 수도 있다. 그러나 이러한 방법은 비형광성 방법보다 일반적으로 비용이 훨씬 비싸고 폭넓은 사용이 제한된다. 따라서 유용한 스펙트럼 특징과 상대적으로 높은 감도가 조합된 화합물은 특별한 활용도가 있을 것이다.
용액 내의 단백질을 정량화하는 방법은 몇 가지가 있다. 이러한 방법은 여러 가지 기술을 기초로 하고 염료를 가용성 단백질에 결합시키는 방법을 포함한다. 이들 염료는 비형광성 또는 형광성 화합물 중 하나 일 수 있다. 형광성 염료를 기반으로 하는 방법은 종종 비형광성 염료보다 더욱 민감하여 광범위한 농도에 걸쳐 단백질의 농도를 측정하는 것이 가능하다. 유용한 스펙트럼 특성과 단백질에 결합하는 능력을 갖춘 화합물이 특히 유용할 것이다.
효소 연구에 있어서, 특정 효소 활성을 측정하기 위한 형광성 화합물이 폭넓게 사용되고 있다. 예를 들면 플루오레세인 디-β-D-갈락토피라노사이드(FDG)는 비형광성 화합물로, 우선 β-갈락토사이다제 효소에 의해 가수분해되어서 플루오레세인 모노갈락토사이드를 생성하고 이후 강한 형광성인 플루오레세인이 된다. FDG 화합물의 분열은 용액에서 형광성의 증가에 의해 감시되어 효소 활성의 민감한 정량화가 가능하게 된다. 현재, 제한된 개수의 형광단만이 이러한 방법에 적합하다.따라서, 다양한 기질에 접합될 수 있는 새로운 형광성 화합물이 요구되고 있다.
2가지 색상의 염색을 위한 저분자량의 형광단을 선택하는 데에는 제한이 매우 많다. 주로 녹색의 형광단은 아르곤 이온 레이저의 488 nm 대역에서 나온 빛을 강하게 흡수하고 518 nm에서 방출하는 플루오레세인이다. 현재, 저분자량이고 아르곤 이온 레이저의 488 nm 및 514 nm에서 여기되는 적색 또는 오렌지색이 양립하는 형광단은 거의 없다. 따라서, 아르곤 이온 레이저에 의해 여기되고 600 nm 이상의 파장에 방출하는 저분자량 화합물은 특히 플루오레세인과 스펙트럼의 오버랩이 최소인 경우 특히 유용할 것이다.
본 발명자는 일련의 유기 분자와 용이하게 결합하여 형광성 복합체를 생산할 수 있는 곰팡이 유래의 새로운 화합물을 분리하였다.
본 발명은 새로운 형광성 화합물 및 형광성 염료로 작용할 수 있는 화합물, 상기 화합물을 미생물로부터 분리하는 방법, 및 과학적 용도에 상기 화합물을 사용하는 용도에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 제1 및 제2 양태에 따르는 5,6-디하이드로-3-[(1Z, 4E, 6E,8E)-1-하이드록시-3-옥소-1,4,6,8-데카테트라에닐]-6-하이드록시메틸-9a-메틸-2H-furo[3,2-g][2]벤조피란-2-9(9aH)-디온 형광성 화합물의 NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 2는 소의 혈청 알부민(BSA)에 결합된 도 1로 확인된 화합물 및 DNA에 결합된 프로피듐 아오다이드의 방출 스펙트럼의 예를 나타내는 도면. 과다한 BSA에 결합하는 데 사용된 정제된 화합물의 몰수는 과다한 DNA에 결합하는 데 사용된 프로피듐 아이다이드의 물수와 동일한 것이다. 605 nm에서 방출하는 2개의 여기 대역이 있다. 도시된 바와 같이 390-400 nm의 빛에 의해 여기되면 605 nm에서 최대로 빛을 낸다.
본 발명의 제1 양태는 식 (Ⅰ)에 따르는 화합물에 관한 것이다:
(Ⅰ)
상기 식에서,
R, R' 및 R" 각각은 수소 원자, 할로겐 원자, 또는 선택적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록시 및/또는 옥시기로 치환되는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-20알킬, 알케닐, 또는 알키닐기이고,
고리 A, B, 및 C는 선택적으로 하나 이상의 이중 결합을 포함하고,
고리 B 및 C는 선택적으로 하나 이상의 할로겐 원자로 치환되고,
이 화합물은 유기 화합물과 상호작용할 수 있고, 유기 화합물과 상호작용하는 경우 이 화합물은 광범위한 파장에서 여기된 후 형광성을 나타낸다. 이 화합물은 바람직하게 300-560 nm, 더욱 바람직하게 380-530 nm, 더욱 더 바람직하게 자외선 파장 및/또는 청색 파장에서 여기된다. 바람직하게 이 화합물은 460 내지 700 nm의 파장에서 방출한다. 더욱 바람직하게 소듐 도데실 설페이트와 같은 유기 화합물과 상호작용한 경우 이의 방출피크는 약 530 nm에 집중되고, 단백질 또는 세포와 같은 생체분자와 상호작용하는 경우 약 605 nm에 집중된다.
본 발명의 제1 양태의 화합물은 다음의 식 (Ⅰa)으로 표현되는 화합물이 바람직하다:
(Ⅰa)
식 (Ⅰa)로 표현되는 화합물은 식 (Ⅰb)로 표현되는 입체화학적 특징을 가지는 것이 바람직하다:
(Ⅰb)
바람직하게, R은 하이드록시와 옥시기로 선택적으로 치환된 직쇄 또는 분지쇄의 C1-20공액결합된 알케닐기이고; R'은 하이드록시기와 선택적으로 치환된 직쇄 또는 분지쇄의 C1-20알킬기이고; R"은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-20알킬기이다.
더욱 바람직한 것은 R은 -C(OH)CHC(O)(CH)6CH3, R'은 -CH2OH이고 R"은 Me로, 본 발명의 제1 및 제2 양태는 다음 식 (Ⅰc)로 표현되는 5,6-디하이드로-3-[(1Z, 4E, 6E, 8E)-1-하이드록시-3-옥소-1,4,6,8-데카테트라에닐]-6-하이드록시메틸-9a-메틸-2H-furo[3,2-g][2]벤조피란-2-9(9aH)-디온의 화합물로 이루어진 것이다.
(Ic)
제2 양태에서, 본 발명은
R, R' 및 R" 각각은 수소 원자, 할로겐 원자, 선택적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록시 및/또는 옥시기로 치환된 직쇄 또는 분지쇄의 C1-20알킬, 알케닐, 또는 알키닐기이고,
고리 A, B 및 C는 하나 이상의 할로겐 원자로 치환되고;
고리 A, B 및 C는 선택적으로 하나 이상의 이중 결합을 포함하는 식 (I)로 표현되는 화합물로서,
(i)R'이-CH2OH이고, R''가 Me이고, 고리 A가 C3과 C3a 사이에 이중결합을포함하고; 고리 B가 C4과 C4a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 C가 C8과 C8a 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 -C(OH)CHC(O)(CH)6C(Et)(Me)이 아니고;
(ii)R'이 Me이고, R''이 Me이고, 고리 A는 C3과 C3a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 B는 C4과 C4a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 C는 C8과 C8a 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 -C(OH)CHC(O)(CH)6C(Et)(Me)이 아니고;
(iii)R'이 Me이고, R''이 Me이고, 고리 A는 C3과 C3a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 B는 C4과 C4a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 C는 C8과 C8a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 -C(OH)CHC(O)(CH)6C(Et)(Me)이 아니고;
(iv)R'는 -n-프로필이고, R''는 Me이고, 고리 A는 C3과 C3a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 B는 C4과 C4a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 C는 C8과 C8a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 C(O)(CH)4Me가 아니고;
(v)R'는 -n-프로필이고, R''은 Me이고, 고리 A는 C3과 C3a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 B는 C4과 C4a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 C는 C8과 C8a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 C(O)(CH)6Me가 아니고;
(vi)R'는 -(CH)2Me이고, R''은 Me이고, 고리 A는 C3과 C3a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 B는 C4과 C4a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 C는 C8과 C8a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 C(O)(CH)5Me가 아니고;
(vii)R'은 -(CH)2Me이고, R''은 Me이고, 고리 A는 C3과 C3a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 B는 C4과 C4a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 C는 C8과 C8a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 C(O)(CH)6Me가 아니고;
(viii)R'은 -Ac이고, R''은 Me이고, C4는 Cl이고, 고리 A는 C3과 C3a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 B는 C4과 C4a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 C는 C8과 C8a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 (CH)2C(Me)CHC(Me)(Et)가 아니고;
(ix)R'은 -Ac이고, R''은 Me이고, 고리 A는 C3과 C3a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 B는 C4과 C4a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 C는 C8과 C8a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 -(CH)2C(Me)CHC(Me)(Et)가 아니고;
(x)R'은 -Ac이고, R''은 Me이고, 고리 A는 C3과 C3a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 B는 C4과 C4a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 C는 C8과 C8a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 -(CH)2C(Me)CH-i-Pr이 아니고;
(xi)R'은 -(CH)2Me이고, R''은 Me이고, 고리 A는 C3과 C3a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 B는 C4과 C4a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 C는 C8과 C8a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 -C(O)(CH)4Me가 아니고;
(xii)R'는 -n-Pr이고, R''은 Me이고, 고리 A가 이중결합을 포함하지 않고;고리 B와 C가 C8a와 C4a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 -C(O)(CH)4Me가 아니고;
(xiii)R'=-n-Pr이고, R''은 Me이고, 고리 A, B 및 C가 이중결합을 포함하지 않는 경우, R은 -C(O)(CH)4Me가 아니고;
(xiv)R'은 -(CH)2Me이고, R''은 Me이고, 고리 A가 이중결합을 포함하지 않고; 고리 B 및 C가 C8a와 C4a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 -C(O)(CH)6Me가 아니고;
(xv)R'가 -C(CH2)(Me)이고, R''은 Me이고, 고리 A가 이중결합을 포함하지 않고; 고리 B 및 C가 C8a와 C4a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 -C(O)(CH)4Me가 아니고;
(xvi)R'이 -(CH)2Me이고, R''은 Me이고, 고리 A가 이중결합을 포함하지 않고; 고리 B 및 C가 C8a와 C4a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 -C(O)(CH)4Me가 아님.
바람직하게, 본 발명의 제2 양태에 따르는 화합물은 식 (Ⅰa)에 표현된 것이고, 더욱 바람직하게 식 (Ⅰb)에 표현된 입체화학적 특징을 가진다.
더욱 더 바람직한 것은, R이 -C(OH)CHC(O)(CH)6CH3, R'이 -CH2OH이고 R''이 Me인 것으로 제2 양태에 따르는 본 발명은 식 (Ⅰc)에 따르는 5,6-디하이드로-3-[(1Z, 4E, 6E, 8E)-1-하이드록시-3-옥소-1,4,6,8-데카테트라에닐]-6-하이드록시메틸-9a-메틸-2H-furo[3,2-g][2]벤조피란-2-9(9aH)-디온의 화합물인 것이다.
식 (Ⅰ)-(Ⅰc)에 따르는 화합물은 모든 해당 토토머 구조를 포함하는 것으로 이해할 수 있다.
화학적으로, 5,6-디하이드로-3-[(1Z, 4E, 6E, 8E)-1-하이드록시-3-옥소-1,4,6,8-데카테트라에닐]-6-하이드록시메틸-9a-메틸-2H-furo[3,2-g][2]벤조피란-2-9(9aH)-디온과 같은 식 (Ⅰ)-(Ⅰc)의 화합물은 아자필론 화합물의 일원이다. 이 아자필론 화합물은 다양한 곰팡이에 의해 생산되는 것으로Monascus sp.에 의해 생산된 식품 첨가물에서 착색제로서 이들의 역할, 이들의 항생물학적 기능, 및 효소 기능을 억제하는 이들의 능력에 대해 연구된 바 있다.
아자필론 핵은 또한Monascus sp.에 의해 생산된 색소에서도 발견된 바 있다. 통상의 아자피론 핵을 포함하는 색소는 디하이드로-모나신(dihydro-monascin) 및 모나스코루빈(monascorubin)을 포함한다. 생체분자 또는 유기 화합물의 염색을 위한 형광 염료로서 이들의 활성에 대한 기록은 없다.
출원인에게 알려진 종래의 기술 중에서 식 (Ⅰ)-(Ⅰc)에 표현된 구조를 가진 화합물이 형광성을 가진다거나 생체분자 또는 유기 화합물을 형광 염색하는 데 적합할 것이라고 교시하거나 제안한 바가 없었다. 따라서, 겔상의 단백질을 감도 높게 검출하고, 세포를 추적하고 이중 색으로 염색하는 것을 포함하는 이 화합물과 관련된 예상하지 못했던 장점이 있다.
본 발명자들은 식 (Ⅰ)-(Ⅰc)에 따르는 화합물이 수용액 상에서 형광성이 없으나, 유기화합물과 상호작용하여 강력한 형광성 염색을 만들 수 있다는 것을 의외로 발견하였다. 바람직한 실시예에서, 식 (Ⅰ)-(Ⅰc)에 따르는 화합물은 유기 분자의 검출 및 표지에 사용되는 것이다.
바람직하게, 식 (Ⅰ)-(Ⅰc)에 따르는 화합물은 유기분자와 결합하는 경우, 파란색 파장에서 여기된 후 형광성을 나타낸다. 더욱 바람직하게는, 식 (Ⅰ)-(Ⅰc)에 따르는 화합물은 300-560 nm의 흡수대의 빛에 의해 여기되는 것이다.
바람직한 실시예에서, 식 (Ⅰ)-(Ⅰc)에 따르는 화합물은 단백질과 상호작용하여 표준 UV 투사기(307 nm)에 의해 발생된 빛에 의해 여기될 수 있는 형광성 복합체를 생산한다. 여기시, 형광성 복합체는 단백질 복합체가 검출되도록 광범위한 파장에 걸쳐 빛을 낸다. 단백질/염료 복합체의 여기 파장은 DNA(최대 흡수 대역 518 nm, 최대 방출 대역 605 nm)와 에티듐 브로마이드 복합체의 파장을 포함한다. 이것은 겔 상의 DNA와 단백질 모두를 검출하는 데 동일한 장비를 사용하도록 하기 때문에 특히 활용성이 있는 것이다. 광범위한 여기 파장에 의해 화합물은 아르곤 이온 레이저의 488 nm와 514 nm 대역에서 강하게 여기되고 약 400 nm에서 방출하는 것과 같은 다이오드 광원에서 방출되는 빛을 흡수하게 된다.
다른 바람직한 실시예에서, 식 (Ⅰ)-(Ⅰc)에 따르는 화합물의 형광 형태는 아르곤-이온 레이저의 488 nm 출력으로부터 강하게 빛을 흡수할 수 있고 600 nm 이상의 파장에서 다시 빛을 낼 수 있다.
다른 바람직한 실시예에서, 식 Ⅰ에 따르는 화합물이 분석학적으로 수용가능한 담체와 함께 포함된 조성물이 플루오레세인과 같은 형광 색소와 조합하여 이중염색 용도에 사용할 수 있다. 이러한 형광 색소는 조성물에서 포함되거나 별도로 사용될 수도 있다.
식 (Ⅰ)-(Ⅰc)에 따르는 화합물은 곰팡이 품종에 의해 생산될 수 있다. 바람직한 곰팡이 품종은 1998년 1월 15일자로 Australian Government Analytical Laboratories (AGAL)에 기탁된 균주로 NM98/00507 수탁번호로 동정된 것이다.
새로운 형광단인 5,6-디하이드로-3-[(1Z, 4E, 6E, 8E)-1-하이드록시-3-옥소-1,4,6,8-데카테트라에닐]-6-하이드로메틸-9a-메틸-2H-furo[3,2-g][2]벤조피란-2-9(9aH)-디온 및 관련 화합물의 구조 및 정제 및 분리 방법은 이전에 공지된 적이 없었다.
식 (Ⅰ)-(Ⅰc)에 따르는 화합물을 유기 분자에 결합시키는 것은 화학적 또는 물리적 직접 결합을 포함하거나, 공지된 "결합 분자(linking molecules)"를 사용하여 달성할 수 있다. 형광 염료로 사용되는 경우 본 발명의 화합물에 의해 결합할 수 있는 유기 분자는 예를 들면 단백질, 펩타이드, 당, 핵산, 항체, 세포 표면 생체분자, 세제, 및 세포를 포함한다. 화합물의 형광성 및 유기 화합물-결합 특성에 의해, 화합물은 유기 화합물에 부착된 형광 염료의 검출이 필요한 모든 용도에 사용될 것이다.
본 발명의 제3 양태에서는 본 발명의 제1 및 제2 양태에 따르는 화합물을 생산하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 곰팡이 종이 화합물을 생산하는 조건 하에서 상기 곰팡이 종을 배양하는 단계; 및 배양물에서 화합물을 분리하는 단계를 포함한다.
식 (Ⅰ)-(Ⅰc)에 따르는 화합물은 배양 조추출하여 또는 추출 및 분리기술에 의해 정제하여 형광 염료로 사용될 수 있다. 본 발명자들은 성장 배지에서 AGAL 수탁 번호 NM98/00507로 동정된 균주의 접종 및 배양후 형광 염료로서 적합한 화합물이 곰팡이 의해 생산된다는 것도 발견하게 되었다. 이 방법 이외의 방법을 이용하여 적합한 곰팡이 배양물의 상청액으로부터 본 발명의 제1 및 제2 양태의 식 (Ⅰ)-(Ⅰc)에 따르는 화합물을 생산하는 것이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들면 곰팡이가 "전구체"를 생산한다면 이 전구체를 화학적, 물리적 또는 효소적 수단에 의해 이의 형광성 형태로 변경하는 것이 가능할 것이다. 이러한 화합물은 미생물로부터 얻을 수 있다는 지식으로부터 유용한 특징을 가진 별개의 화합물 또는 동일한 종의 화합물에 속하는 형광성 염료로 사용하기에 적합한 다른 화합물의 생산과 발견을 가능하게 할 수 있다. 식 (Ⅰ)에 따르는 화합물은 직접 화학적 합성에 의해 합성적으로 생산되거나 곰팡이에 의해 사용된 생합성 경로에서 중간체의 변형으로 생산될 수 있다.
본 발명의 식 (Ⅰ)-(Ⅰc)에 따르는 화합물은 화학적 수단에 의해 합성적으로 생산될 수도 있다. 새로운 형광성 화합물이 곰팡이에 의해 생산될 수 있다는 이해는 요구되는 조건하에서 곰팡이를 배양하는 것과는 별도로 화합물을 생산하는 다른 수단에 대한 발상을 하게 한다.
본 발명의 식 (Ⅰ)-(Ⅰc)에 따르는 화합물은 형광 형태에서 세포 및 기타 유기 분자에 연결되어 이 화합물로 표지된 경우 그 세포 또는 기타 유기 분자를 추적하는 수단으로 사용될 수 있다는 특별한 이점을 제공한다.
본 발명의 제4 양태는 본 발명의 제1 및 제2 양태에 따르는 화합물을 형광성 염료 또는 마커로, 바람직하게 유기 분자를 염색하고, 표지하고 및/또는 검출하는 과학 기술에 사용하는 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제1 및 제2 양태에 따르는 화합물의 용도의 예로는 현미경을 위한 세포 추적 염료, 막 유동성 염료, 항체와의 접합체, 핵산과의 접합체, 세포 표면 리간드의 영상화 염료, 당과의 접합체, 세포계측 분석, 및 다중 초점 현미경(confocal microscopy)을 포함하나 이것으로 한정되는 것은 아니다. 그러나 이 화합물이 488 nm에서 여기되는 경우를 포함하여 적색 파장에서 형광성이 필요한 모든 경우에 적합하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명의 제5 양태는 유기 화합물을 형광성-표지하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 본 발명의 제1 또는 제2 양태에 따르는 화합물을 유기 화합물에 결합시켜 상기 유기 화합물이 상기 화합물에 의해 형광성으로 표지되는 단계를 포함한다.
바람직하게, 형광성으로 표지되는 유기 화합물은 광대역의 파장, 바람직하게 300-560nm 대역의 파장에 노출되는 경우 검출된다.
유기 화합물로는 단백질, 펩타이드, 당, 핵산, 항체, 세포표면 생체분자, 세제 및 세포를 포함하나 이것으로 한정되는 것은 아니다. 화합물은 화학적 또는 물리적 회합에 의해 유기 화합물에 직접 결합할 수 있거나 또는 결합 분자에 의해 유기 화합물에 결합할 수 있다. 이 화합물이 유기 화합물, 예를 들면 항체 또는 렉틴(lectin)에 특이적인 리간드에 부착된다면, 이 리간드와 유기 화합물의 결합에 의해 유기 화합물이 형광으로 표지될 것이다.
본 발명의 제6 양태는 유기 화합물을 포함하는 샘플에서 유기 화합물을 검출하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명의 제5 양태의 방법에 따라 유기 화합물을 표지하는 단계; 및 이의 형광성을 감시하거나 검출함으로써 샘플 내에 유기 화합물을 검출하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 표지된 유기 화합물은 샘플이 광대역의 파장, 바람직하게 300-560 nm의 대역의 파장, 더욱 바람직하게 청색 파장의 빛에 노광시 검출이 된다.
표지된 유기 화합물의 형광성을 감시하거나 검출하는 것은 공지된 모든 수단을 이용할 수도 있다. 이러한 수단으로는 투사기, 분광 현미경, 및 세포계측기를 포함하나 이것으로 한정되는 것은 아니다.
이 명세서 전반에서 "포함한다"라는 용어, 또는 "포함하는" 또는 "포함하여"라는 변환어는 언급된 성분, 정수 또는 단계, 또는 일군의 성분들, 정수들 또는 단계들을 포함하나, 임의의 다른 성분, 정수 또는 단계, 또는 일군의 성분들, 정수들 또는 단계들을 제외하고자 하는 것은 아니다.
본 명세서에서 포함된 자료, 기술, 문건, 장치, 문헌 등에 관한 논의는 본 발명의 배경만을 제공하기 위한 것이다. 이들의 일부 또는 전부가 종래 기술의 일부를 이루고 이 출원의 각기 청구항의 우선일 이전에 호주에 존재하는 본 발명의 해당 분야에 일반적인 상식인 것으로 인정하는 것은 아니다.
본 발명을 보다 명확하게 이해시키기 위해서, 다음의 실시예와 첨부된 도면을 참조로 하여 바람직한 실시형태가 기재될 것이다.
실시예 1
추출물 A의 제조
AGAL 수탁번호 NM98/00507로 동정된 균주의 모든 동정 특징을 가진 미생물의 생물학적 순수 배양물을 얻었다.
AGAL 수탁번호 NM98/00507 곰팡이의 성장 배지로, 슈크로즈(CSR) 40 g, 이스트 추출물(Difca) 5 g, 펩톤(Difco) 10 g, 및 아가(Difco) 10 g을 1L의 물에 첨가하여, 제조하였다. 이 혼합물을 115℃에서 15분간 자동항온기에 넣어 배지를 멸균시키고 아가를 용해시킨다. 액체를 배양 접시에 붓고 실온에서 고정시켰다. 냉각후 곰팡이의 배양물을 배지의 표면에 접종시키고 25℃에서 3일간 배양시켰다.배양물을 냉장고로 옮기고 배양물이 강렬한 붉은색으로 변하고 염료가 많이 생산될 때까지(통상 3 내지 5일) 4℃에서 배양하였다.
일단 배양물이 수득하기에 충분한 염료를 생산하면, 곰팡이의 바이오매스를 포함하는 배양 배지를 에탄올 2부피에 대해 배양배지 1 부피의 비율로 에탄올에 넣었다. 4℃에서 배양하고 16시간 동안 진탕하여 염료를 에탄올 상으로 추출하였다. 액상을 잔류 배양 배지에서 따라내고 4℃에서 10분간 3000rpm으로 원심분리하였다.
청정 추출물(추출물 A)을 사용전까지 저장하거나 실시예 2 및 3에서 기재된 공정중 하나에 따라 더욱 정제하였다.
실시예 2
추출물 A의 정제에 의한 추출물 B를 제조
실시예 1에 기재된 방법에 따라 생산된 추출물 A의 에탄올 조추출물을 고압하에서 감량시키고 메탄올을 용매로 사용하여 셀룰로즈 분말상에서 크로마토그래피시켜서 세파덱스 LH-20 컬럼에 적용하고 메탄올로도 용출시켰다. 분획을 48시간에 걸쳐 수집하고 말단 근처에서 용출되는 보라색 대역을 수집하였다. 이 분획을 동결건조하고 (0.1% 아세트산) 메탄올의 최소 용량에서 재현탁시키고 저장시켰다.
실시예 3
5,6-디하이드로-3-[(1Z, 4E, 6E, 8E)-1-하이드록시-3-옥소-1,4,6,8-데카테트라에닐]-6-하이드록시메틸-9a-메틸-2H-furo[3,2-g][2]벤조피란-2-9(9aH)-디온의 정제
실시예 2에 기재된 방법에 따라 제조된 추출물 B에 HPLC 정제를실시하였다(Supelco C16-아미드 컬럼, 75% 메탄올/물, 0.05% 아세트산, 이후 50% 아세토니트릴/물, 0.05 아세트산에 용해). 최종 분획을 동결(-20℃)시켜 물을 제거하고 질소 스트림하에서 남은 아세토니트릴을 증발시켰다.
이 방법으로 분석학적으로 순수한 5,6-디하이드로-3-[(1Z, 4E, 6E, 8E)-1-하이드록시-3-옥소-1,4,6,8-데카테트라에닐]-6-하이드록시메틸-9a-메틸-2H-furo[3,2-g][2]벤조피란-2-9(9aH)-디온의 오렌지색 고체를 얻었다.
실시예 4
5,6-디하이드로-3-[(1Z, 4E, 6E, 8E)-1-하이드록시-3-옥소-1,4,6,8-데카테트라에닐]-6-하이드록시메틸-9a-메틸-2H-furo[3,2-g][2]벤조피란-2-9(9aH)-디온의 구조 결정
실시예 3에 따라 제조된 화합물을 NMR 분광기와 고 분해능 질량 분광분석의 조합으로 분석하여 5,6-디하이드로-3-[(1Z, 4E, 6E, 8E)-1-하이드록시-3-옥소-1,4,6,8-데카테트라에닐]-6-하이드록시메틸-9a-메틸-2H-furo[3,2-g][2]벤조피란-2-9(9aH)-디온의 구조를 결정하였다.
핵자기공명 분광기
실시예 3에서 얻은 HPLC 정제된 화합물을 CDCl3(0.5 ㎖; 99.96 원자 %, Aldrich)에 용해하고 NMR 관(PP527, Wilmald)으로 여과시켜서 NMR 샘플을 제조하였다. 이 샘플에 가스를 제거하고 질소 분위기하에서 평형시켰다.
27℃에서 Bruker DRX600(600 MHz) NMR 분광기에서 NMR 데이터를 얻어서xwinNMR(version 2.6; Bruker)를 이용하여 처리하였다. 모든 2D NMR 실험은 6009 Hz의1H 스펙트럼 대역과 2초의 재순환 지연(recyclic delay)으로 구상 검출(quadrature detection)을 실시하였다. 화학적 이동(chemical shift)은 잔류 CHCl3(dH 7.26 ppm; dC 77.01 ppm)으로 참조되었다. 높은 전압1H p/2 펄스가 9.5 ms가 되도록 측정하였고, 낮은 전압(MLEV 스핀 잠금)은 25.15 ms가 되도록 측정하였다.13C 높은 전압 p/2 펄스는 10.5 ms였고, GARP 짝풀림을 위해 65 ms의 낮은 전압 펄스가 사용되었다. 100 단계 사인 프로그램을 이용하여 z-축을 따라 변화하는 펄스(gradient pulse)가 전달되었다.
1D 실험 데이터를 32K 리얼 포인트를 이용하여 얻었고 0을 65K까지 채운 후 분해능을 증강시키기 위해 가우스의 정수를 곱했다. 탄소-수소 상관성(HSQC)을 감도가 증강된 이중 INEPT 전환을 통해 에코/안티에코-TPPI 구배(80:20.1)를 선택하여 달성하였다(Palmer, A. G., III, Cavanagh, J., and Wright, P. (1991)J. Magn. Reson. 93, 151-70; Schleucher, J., Schwendinger, M., Sattler, M., and Schmidt, P. (1994)J. Biomol. NMR 4, 301-6; Kay, L. E., Keifer, P., and Saarinen, T. (1992)J. Am. Chem. Soc. 114(26),10663-5). 2K 데이터 포인트를 습득 동안 짝풀림으로 1.3초 재순환 지연하는 t2(증가당 128 스캔)에서 수집하였다. t1에서 512 증가를 사용하고(10-170 ppm) INEPT 서열을 145Hz의 X-H 커플링을 위해 최적화하였다. 80:20.1의 구배 비율을 사용하여 에코/안티에코-TPPI 위상 감도를 선택하였다.
1차원 ROESY 스펙트럼을 대상의 양성자에 대한 선택적 가우스 펄스를 이용하여 측정하였다(Kessler, H., H. Oschkinat, C. Griesinger & W. Bermel, (1986)J. Magn. Reson. 70, 106; Stonehouse, J., P. Adell, J. Keeler & A.J. Shaka, (1994)J. Am. Chem. Soc. 116, 6037; Stott, K., J. Stonehouse, J. Keeler, T.L. Hwang & A.J. Shaka, (1995)J. Am. Chem. Soc. 117, 4199 4200). 1000 단계 가우스 프로그램(60 ms, 64.6 dB)를 사용하여 p/2 펄스를 달성하였다. 100 ms(13 dB)의 최대 시간을 연속파 스핀 잠금을 위해 사용하였다. z-축으로 15% 기울기로 기울기를 선택하였다. 10 K 경과가 6009 Hz에 걸쳐 축적되었다. ROE 증강이 조사된 피크의 백분율로 측정되고 캐리어 주파수로부터 오프셋을 위해 보정되지는 않았다.
2차원 동종핵의 Hartman-Hahn 전이 스펙트럼(TOCSY)이 2ms의 저전압 트림 펄스로 플랭킹된 MLEV17 (Bax, A., & Davis, D. G. (1985)J. Magn . Reson. 63(1),207-13) 펄스 시컨스를 이용하여 측정되었다. 사인 벨 전환(90°) 아포다이제이션(apodisation)을 1차원과 2차원 모두를 처리하는 데 사용하였다.
하나의 대역의 상관성(Bax, A., & M.F. Summers, (1986)J. Am. Chem. Soc. 108, 2093 - 2094)을 억제하기 위해 low-pass J 필터(145 Hz)로 긴 범위의 짝지음(long range coupling)으로 최적화된 이종핵 제로와 이중 양자 일관성(HMBC)을 통해 인식 시간 동안 짝풀림없이 선택을 위한 구배의 펄스(50:30:40.1)를 이용하여, 2D1H-13C 상관성이 얻어졌다. 긴 범위 짝지음 발생의 지연은 별개의 시험에서 20, 10, 5 및 2Hz의 짝지음에 최적화되었다. 위상 정보를 없애기 위해 산출된 최종 스펙트럼 크기 및 F1에서 210 ppm의 스펙트럼 대역이 사용되었다.
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ 1.75, s, C9a-Me; 1.84, dd, J 6.7, 1.1 Hz, C9'-Me; 2.80, dd, J 17.2, 3.6 Hz, H5α; 2.89, ddd, J 17.1, 11.5, 1.9 Hz, H5β; 3.85, dd, J 12.2, 5.5 Hz, C6CH 2OH; 3.97, dd, J 12.2, 3.4 Hz, C6CH 2OH; 4.39, m, H6; 5.97, m, H9; 6.10, d, J 15.1 Hz, H4, 6.19, ddd, J 15.1, 10.6, 1.6 Hz, H8; 6.25, dd, J 14.6, 11.2 Hz, H6; 6.58, dd, J 14.5, 10.5 Hz, H7; 6.79, s, H2; 7.16, bs, H4, 7.32, dd, J 15.2, 11.2 Hz, H5; 7.85, s, H8.
13C NMR (125MHz, CDCl3) δ 18.8, C9-Me; 28.0, C9a-Me; 29.3, C5; 63.4, C6-CH2OH; 79.0, C6; 86.2, C9a; 101.0, C2; 112.2, C8a; 113.4, C4; 115.3, C3; 126.5, C4; 128.6, C6; 131.7, C8; 136.0, C9; 140.9, C4a; 142.0, C7; 142.6, C5; 159.0, C8; 168.2, C2/C3a; 177.7, C1; 185.0, C3; 190.0, C9.
이종핵 단일 양자 일관성(Heteronuclear single Quantum Coherence: HSQC)를 이용하여 양성자화된 탄소에 모든 양성자를 관련시키고 배치시켰다. 또한, 각 스핀 시스템은 일련의 총 상관성 분광기(total correlation spectroscopy: TOCSY) 실험을 8 msec, 20 msec, 100 msec의 혼합시간으로 실시하는 것에 특징이 있다. 가장 짧은 혼합시간은 바로 이웃한 양성자에만 상관성을 제공하고, 가장 긴 혼합시간은 전체 스핀 시스템을 확인하고 많은(명백한) 짝풀린 양성자의 위치를 지정하는매우 작은 긴 범위의 짝짓기에 대한 정보를 제공한다. 공간 연관성이 일련의 1차원 선별 회전축 상관 분광기(ROESY) 실험에 의해 달성되었다. 선택적 여기는 저전압 가우스의 90°펄스에 의해 달성되고 기울기 섹션을 이용하여 TOCSY 전이가 없는 ROE만 관찰하였다. 100 msec의 혼합 시간이 최적인 것으로 나타났다. 25, 50, 100 및 250 msec의 혼합시간으로 긴 범주의 이종핵의 다중 양자 일관성(Heteronuclear multiple quantum coherence: HMBC) 스펙트럼에서 비양성자화된 탄소 모두를 배치하는 데 필수적이라는 것을 발견하였다. 이후에도, C2가 임의의 양성자와 상관성이 없다는 것을 발견하였고 168.2 ppm에서 C3a와 일치하였다.
이 스펙트럼 데이터로부터 여러개의 트리사이클릭 골격이 이론적으로 가능하지만 (5,6-디하이드로-3-[(1Z, 4E, 6E, 8E)-1-하이드록시-3-옥소-1,4,6,8-데카테트라에닐]-6-하이드록시메틸-9a-메틸-2H-furo[3,2-g][2]벤조피란-2-9(9aH)-디온)만이 제공된 데이터에 정확하게 맞았다.
질량 분광분석
실시예 3에 따라 제조된 화합물을 고 분해능 질량 분광분석을 실시하여 화합물의 분자식이 C23H22O7이라는 것을 알아냈다.
질량 스펙트럼 (ESI, 양이온) m/e 411 (M+H+, 55%), 317 (5), 249 (12), 163 (10), 121 (100), 93 (4). 음이온 ESI-FTICR 관측d: M-H+, 409.1304, C23H21O7은 409.1293이 필요하고; 관측: 247.0617, C13H12O5은 247.0685이 필요함.
λmax 및 νmax
λmax (MeOH) 432, 555 nm, ε 10000, 4000. λmax (알칼리성 MeOH) 432 nm, ε 16000. λmax (산성 MeOH) 390, 560 nm, ε 6000, 10000.
νmax (neat) 3400 (br), 2925, 2854, 1744, 1712, 1589, 1259, 1010 cm-1
실시예 5
추출물 A를 이용한 단백질 겔의 염색
단백질 겔을 다수의 표준 프로토콜 중 하나에 따라 제조하였다. 예를 들면 SDS 페이지 겔을 Laemmli 방법(U.K. 1970,Nature, 227:680-685)에 따라 제조하였다. 전기천공을 완료한 후 겔을 전기천공장치에서 제거하였다. 겔을 90 ㎖의 물, 10 ㎖의 글리세롤 및 5 ㎖의 추출물 A로 이루어진 염색 용액 100 ㎖를 담은 용기에 고정시켰다. 이 겔과 염색 용액을 90분동안 온화하게 진탕하면서 배양하였다. 90분의 염색 과정 후, 용액을 제거하고 겔을 물로 3회 간단하게 세정하였다. 이러한 간이 세정 후, 겔을 10% 글리세롤 수용액 100 ㎖에 넣고 추가 30분 동안 진탕하며 배양하였다.
겔에서 단백질을 가시화하기 위해, 겔을 자외선 투사기(307 nm)로 이동시키고 폴라로이드 667 흑백 필름을 이용하여 사진을 찍고 에티듐 브로마이드 겔의 검출을 위해 여과기 세트를 지정하였다(예를 들면 분자 프로브 E-7591).
실시예 6
포자 및 영양 세포의 표피 형광성 분별
미생물을 포자 형성을 촉진하는 조건 하에서 배양하고 추출물 B를 사용하여 주로 영양 세포 배양물 내에 있는 포자의 동정을 실시하였다. 예를 들면Saccharomyces cerevisiae를 10 g/ℓ의 글루포스, 5 g/ℓ의 이스트 추출물, 및 10 g/ℓ의 펩톤을 함유한 수계 브로스에서 성장시켰다. 30℃에서 16시간 배양한 후, 세포를 원심분리에 의해 얻었고 물 1㎖에 재현탁하였다. 배양물 5 ㎕의 수적을 5% 아세트산칼륨, 2% 아가 및 물로 이루어진 반고체 배지에 점적하였다. 배양물을 22℃에서 4일간 배양하여 이스트 세포의 포자 생성을 가능하게 하였다. 포자형성 배양물을 물에서 재현탁하여 ㎖당 1×109세포의 밀도로 물에 재현탁시켰다. 5㎕의 추출물 B를 1 ㎖의 포자형성된 배양물에 첨가하였다. 대조염색을 위해, 5(6)-카복시플루오레세인 디아세테이트(CFDA)의 10mM 용액 5㎕을 포자 배양물에 첨가하였다. 5분후, 포자형성된 배양물을 원심분리에 의해 수득하고 1㎖의 물에 재현탁하였다. 표피형광성 현미경(여기 488 nm)하에서 실험하여 포자세포와 무성세포의 분별이 조속하게 처리될 수 있었다.
당업자라면, 특정 실시예에 수많은 변형 및/또는 수정이 광범위하게 기재된 본 발명의 사상 또는 범주에서 이탈함없이 본 발명에 이루어질 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 실시예는 설명을 위한 것이지 한정하고자 하는 것은 아니다.
Claims (23)
- 식 (Ⅰ)의 토토머를 포함하는 식 (Ⅰ)로 표현되는 화합물:(Ⅰ)상기 식에서,R, R' 및 R" 각각은 수소 원자, 할로겐 원자, 또는 선택적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록시 및/또는 옥시기로 치환되는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-20알킬, 알케닐, 또는 알키닐기이고,고리 A, B, 및 C는 선택적으로 하나 이상의 이중 결합을 포함하고,고리 B 및 C는 선택적으로 하나 이상의 할로겐 원자로 치환되고,상기 화합물은 유기 화합물과 상호작용할 수 있고, 유기 화합물과 상호작용하는 경우 이 화합물은 광범위한 파장에서 여기된 후 형광성을 나타냄.
- 제1항에 있어서,식 (Ⅰa)의 토토머를 포함하는 식 (Ⅰa)로 표현되는 화합물:(Ⅰa).
- 제2항에 있어서,식 (Ⅰb)의 토토머를 포함하는 식 (Ⅰb)로 표현되는 입체화학적 특징을 가지는 화합물:(Ⅰb).
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,R은 하이드록시와 옥시기로 선택적으로 치환된 직쇄 또는 분지쇄의 C1-20공액결합된 알케닐기이고;R'은 하이드록시기와 선택적으로 치환된 직쇄 또는 분지쇄의 C1-20알킬기이고;R"은 직쇄 또는 분지쇄의 C1-20알킬기인 화합물 및 그의 토토머를 포함하는 화합물.
- 제3항에 있어서,R은 -C(OH)CHC(O)(CH)6CH3이고 R'은 -CH2OH이고 R"은 Me인, 식 (Ⅰc)로 표현되는 5,6-디하이드로-3-[(1Z, 4E, 6E, 8E)-1-하이드록시-3-옥소-1,4,6,8-데카테트라에닐]-6-하이드록시메틸-9a-메틸-2H-furo[3,2-g][2]벤조피란-2-9(9aH)-디온 및 그의 토토머를 포함하는 화합물:(Ic).
- 식(Ⅰ)의 토토머를 포함하며 식 (Ⅰ)에 따르는 화합물:(Ⅰ)상기 식에서,R, R' 및 R" 각각은 수소 원자, 할로겐 원자, 선택적으로 하나 이상의 할로겐, 하이드록시 및/또는 옥시기로 치환된 직쇄 또는 분지쇄의 C1-20알킬, 알케닐, 또는 알키닐기이고,고리 A, B 및 C는 선택적으로 하나 이상의 할로겐 원자로 치환되고;고리 A, B 및 C는 선택적으로 하나 이상의 이중 결합을 포함하는 식 (I)로 표현되는 화합물로서,단,(ⅰ)R'이-CH2OH이고, R''가 Me이고, 고리 A가 C3과 C3a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 B가 C4과 C4a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 C가 C8과 C8a 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 -C(OH)CHC(O)(CH)6C(Et)(Me)이 아니고;(ⅱ)R'이 Me이고, R''이 Me이고, 고리 A는 C3과 C3a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 B는 C4과 C4a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 C는 C8과 C8a 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 -C(OH)CHC(O)(CH)6C(Et)(Me)이 아니고;(ⅲ)R'이 Me이고, R''이 Me이고, 고리 A는 C3과 C3a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 B는 C4과 C4a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 C는 C8과 C8a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 -C(OH)CHC(O)(CH)6C(Et)(Me)이 아니고;(ⅳ)R'는 -n-프로필이고, R''는 Me이고, 고리 A는 C3과 C3a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 B는 C4과 C4a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 C는 C8과 C8a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 C(O)(CH)4Me가 아니고;(ⅴ)R'는 -n-프로필이고, R''은 Me이고, 고리 A는 C3과 C3a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 B는 C4과 C4a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 C는 C8과C8a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 C(O)(CH)6Me가 아니고;(ⅵ)R'는 -(CH)2Me이고, R''은 Me이고, 고리 A는 C3과 C3a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 B는 C4과 C4a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 C는 C8과 C8a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 C(O)(CH)5Me가 아니고;(ⅶ)R'은 -(CH)2Me이고, R''은 Me이고, 고리 A는 C3과 C3a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 B는 C4과 C4a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 C는 C8과 C8a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 C(O)(CH)6Me가 아니고;(ⅷ)R'은 -Ac이고, R''은 Me이고, C4는 Cl이고, 고리 A는 C3과 C3a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 B는 C4과 C4a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 C는 C8과 C8a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 (CH)2C(Me)CHC(Me)(Et)가 아니고;(ⅸ)R'은 -Ac이고, R''은 Me이고, 고리 A는 C3과 C3a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 B는 C4과 C4a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 C는 C8과 C8a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 -(CH)2C(Me)CHC(Me)(Et)가 아니고;(ⅹ)R'은 -Ac이고, R''은 Me이고, 고리 A는 C3과 C3a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 B는 C4과 C4a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 C는 C8과 C8a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 -(CH)2C(Me)CH-i-Pr이 아니고;(ⅹⅰ)R'은 -(CH)2Me이고, R''은 Me이고, 고리 A는 C3과 C3a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 B는 C4과 C4a 사이에 이중결합을 포함하고; 고리 C는 C8과 C8a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 -C(O)(CH)4Me가 아니고;(ⅹⅱ)R'는 -n-Pr이고, R''은 Me이고, 고리 A가 이중결합을 포함하지 않고; 고리 B와 C가 C8a와 C4a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 -C(O)(CH)4Me가 아니고;(ⅹⅲ)R'=-n-Pr이고, R''은 Me이고, 고리 A, B 및 C가 이중결합을 포함하지 않는 경우, R은 -C(O)(CH)4Me가 아니고;(ⅹⅳ)R'은 -(CH)2Me이고, R''은 Me이고, 고리 A가 이중결합을 포함하지 않고; 고리 B 및 C가 C8a와 C4a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 -C(O)(CH)6Me가 아니고;(ⅹⅴ)R'가 -C(CH2)(Me)이고, R''은 Me이고, 고리 A가 이중결합을 포함하지 않고; 고리 B 및 C가 C8a와 C4a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 -C(O)(CH)4Me가 아니고;(ⅹⅵ)R'이 -(CH)2Me이고, R''은 Me이고, 고리 A가 이중결합을 포함하지 않고; 고리 B 및 C가 C8a와 C4a 사이와 C5와 C6 사이에 이중결합을 포함하는 경우, R은 -C(O)(CH)4Me가 아님.
- 제6항에 있어서,식 (Ⅰa)으로 표현되는 화합물:(Ⅰa).
- 제7항에 있어서,식 (Ⅰb)로 표현되는 입체화학적 특징을 가지는 화합물:(Ⅰb).
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,유기화합물과 상호작용하여 청색 파장에서 여기된 후 형광성을 나타내는 화합물.
- 제9항에 있어서,300-560 nm 범위의 빛에 여기되어 형광성을 나타내는 화합물.
- 제10항에 있어서,상기 유기 화합물이 단백질이고, 상기 화합물이 단백질과 상호작용하여 307 nm에서 여기된 후 형광성을 나타내는 화합물.
- 제10항에 있어서,400 nm, 488 nm 및 514 nm에서 빛에 의해 여기되어 형광성을 나타내는 화합물.
- 제12항에 있어서,488 nm에서 여기된 후 600 nm에서 형광성을 나타내는 화합물.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따르는 화합물, 분석학적으로 수용가능한 담체 및 선택적으로 형광색소를 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따르는 화합물의 제조방법으로,곰팡이 종이 상기 화합물을 생산하는 조건하에서 곰팡이 종을 배양시키는 단계; 및상기 화합물을 배양물로부터 분리시키는 단계를 포함하는 제조방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따르는 화합물을 형광 염료 또는 마커로 사용하는 용도.
- 제16항에 있어서,유기 분자를 염색, 표지 및/또는 검출 기술에 사용하는 용도.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따르는 화합물을 유기 화합물에 결합시켜, 상기 유기 화합물을 상기 화합물에 의해 형광성 표지하는 단계를 포함하는 유기화합물에 형광성 표지하는 방법.
- 제1항 내지 제14항 및 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,상기 유기 화합물이 단백질, 펩타이드, 당, 핵산, 세포표면 분자 또는 세제 이거나 항체 또는 세포에 포함되는 것인화합물, 방법, 조성물 또는 용도.
- 제19항에 있어서,결합 분자를 통해 상기 유기 화합물에 결합되는 화합물, 방법 또는 용도.
- 유기 화합물을 포함하는 샘플에서 유기 화합물을 검출하는 방법으로,제18항에 따르는 방법에 의해 유기 화합물을 표지하는 단계, 및 이의 형광성을 감시하거나 검출하여 샘플에서 유기 화합물을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
- 제21항에 있어서,상기 샘플을 광범위한 파장, 바람직하게 300-560 nm, 더욱 바람직하게 청색 파장의 빛에 노광하여 상기 표지된 유기 화합물을 검출하는 방법.
- 제21항 또는 제22항에 있어서,상기 표지된 유기 화합물의 형광성의 감시 또는 검출이 투사기, 분광기, 현미경 또는 세포계측기에 의한 것인 방법.
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