ES2295152T3 - Compuestos fluorescentes. - Google Patents
Compuestos fluorescentes. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2295152T3 ES2295152T3 ES01925207T ES01925207T ES2295152T3 ES 2295152 T3 ES2295152 T3 ES 2295152T3 ES 01925207 T ES01925207 T ES 01925207T ES 01925207 T ES01925207 T ES 01925207T ES 2295152 T3 ES2295152 T3 ES 2295152T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- ring
- double bond
- compound
- baselineskip
- formula
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 168
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims abstract description 43
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims abstract description 31
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims abstract description 26
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 23
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 15
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims abstract description 14
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 40
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 28
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 22
- 125000004043 oxo group Chemical group O=* 0.000 claims description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 22
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 claims description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 12
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 8
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 6
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 5
- GVNVAWHJIKLAGL-UHFFFAOYSA-N 2-(cyclohexen-1-yl)cyclohexan-1-one Chemical compound O=C1CCCCC1C1=CCCCC1 GVNVAWHJIKLAGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 101150065749 Churc1 gene Proteins 0.000 claims description 4
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102100038239 Protein Churchill Human genes 0.000 claims description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 4
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 claims description 4
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 claims description 3
- 150000004668 long chain fatty acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- 125000003837 (C1-C20) alkyl group Chemical group 0.000 claims 4
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 claims 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims 1
- 150000004982 aromatic amines Chemical class 0.000 claims 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims 1
- -1 nitrogen-containing compound Chemical class 0.000 abstract description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 17
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 16
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 14
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 13
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 9
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 8
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 6
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000001551 total correlation spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 2
- 101100207331 Arabidopsis thaliana TPPI gene Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 238000003919 heteronuclear multiple bond coherence Methods 0.000 description 2
- 238000005570 heteronuclear single quantum coherence Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000001911 insensitive nuclei enhancement by polarisation transfer Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 238000004324 time-proportional phase incrementation Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 238000012584 2D NMR experiment Methods 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710093674 Cyclic nucleotide-gated cation channel beta-1 Proteins 0.000 description 1
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 238000000292 Malcolm Levitt pulse sequence Methods 0.000 description 1
- 241000228347 Monascus <ascomycete fungus> Species 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102100025946 Transforming growth factor beta activator LRRC32 Human genes 0.000 description 1
- 101710169732 Transforming growth factor beta activator LRRC32 Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000005100 correlation spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000000469 ethanolic extract Substances 0.000 description 1
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 239000000576 food coloring agent Substances 0.000 description 1
- 235000002864 food coloring agent Nutrition 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000004362 fungal culture Methods 0.000 description 1
- 238000003881 globally optimized alternating phase rectangular pulse Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000003929 heteronuclear multiple quantum coherence Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001208 nuclear magnetic resonance pulse sequence Methods 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N psoralen Chemical class C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OC=C2 ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000003460 sulfonic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
- C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D493/04—Ortho-condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B57/00—Other synthetic dyes of known constitution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B61/00—Dyes of natural origin prepared from natural sources, e.g. vegetable sources
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6827—Total protein determination, e.g. albumin in urine
- G01N33/6839—Total protein determination, e.g. albumin in urine involving dyes, e.g. Coomassie blue, bromcresol green
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Electroluminescent Light Sources (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
- Luminescent Compositions (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Led Devices (AREA)
- Cathode-Ray Tubes And Fluorescent Screens For Display (AREA)
Abstract
Complejo que comprende un compuesto según la fórmula (I): (Ver fórmula) en la que: cada uno de R, R¿ y R¿ es un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo C1 - 20 de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, grupos hidroxilo y/u oxo; los anillos A, B y C incluyen opcionalmente uno o más dobles enlaces; los anillos B y C están opcionalmente sustituidos con uno o más átomos de halógeno, incluyendo tautómeros de fórmula (I) y una molécula orgánica, en el que la molécula orgánica es un compuesto que contiene nitrógeno, y en el que el compuesto de fórmula (I) interacciona con la molécula orgánica de modo que emite fluorescencia tras la excitación.
Description
Compuestos fluorescentes.
Esta invención se refiere en general a
compuestos fluorescentes novedosos y a compuestos que pueden
funcionar como colorantes fluorescentes, a métodos de aislamiento
de tales compuestos de microorganismos y a usos de tales compuestos
en aplicaciones científicas.
Los compuestos que fluorescen tienen muchos usos
y se sabe que son particularmente adecuados para aplicaciones
biológicas en las que se requiere fluorescencia para la detección
de células completas, componentes celulares y funciones celulares.
Por ejemplo, muchas técnicas analíticas y de diagnóstico requieren
que las muestras se etiqueten de manera fluorescente, de modo que
puedan detectarse. Esto se logra usando colorantes o sondas
fluorescentes que interaccionan con una amplia variedad de
materiales tales como células, tejidos, proteínas, anticuerpos,
enzimas, fármacos, hormonas, lípidos, nucleótidos, ácidos nucleicos,
hidratos de carbono o polímeros naturales o sintéticos para preparar
conjugados fluorescentes.
Con sondas fluorescentes sintéticas, se usan
frecuentemente ligandos para conferir una especificidad para una
reacción bioquímica que va a observarse, y el colorante
fluorescente proporciona los medios de detección o cuantificación
de la interacción. Estas aplicaciones incluyen, entre otras, la
detección de proteínas (por ejemplo en geles o disolución acuosa),
rastreo celular, la detección de proteínas mediante anticuerpos
marcados de manera fluorescente, la evaluación de la actividad
enzimática, la tinción de ácidos nucleicos.
La absorbancia a longitudes de onda largas
aumenta normalmente la utilidad de una sonda fluorescente ya que
reduce la interferencia de la autofluorescencia celular y reduce el
efecto citotóxico del fluoróforo en combinación con la luz. Aunque
los láseres son particularmente útiles como fuente de luz
concentrada para la excitación de fluorescencia, actualmente la
salida de los láseres se restringe a longitudes de onda
particulares de la luz. Por tanto, los compuestos cuyos espectros
de excitación coinciden con la salida del láser son de gran
utilidad. El láser de argón es la fuente luminosa más común para la
excitación de fluorescencia, y tiene salidas principales de luz a
488 nm y 514 nm. Por tanto, los compuestos fluorescentes que se
excitan mediante cualquiera de estas longitudes de onda son de
particular utilidad. Alternativamente, puede lograrse la excitación
de fluorescencia usando fuentes luminosas en estado sólido tales
como diodos emisores de luz. Los compuestos fluorescentes excitados
mediante la luz emitida por estas fuentes alternativas son también
de particular utilidad.
Los compuestos fluorescentes rojos se usan
extensamente en muchos campos de estudio biológico. Muchos de
estos, incluyendo los colorantes rojo Texas, isotiocianato de
tetrametilrodamina o BODIPY que emite en el rojo requieren
excitación a longitudes de onda del verde tales como 542 nm. Esto
limita su uso en muchas aplicaciones, especialmente aquéllas en las
que se usa el láser de ion argón para la excitación. Pueden
excitarse compuestos tales como bromuro de etidio con luz del láser
de ion argón (banda a 520 nm), pero no son adecuados generalmente
para el etiquetado de moléculas orgánicas diferentes a los ácidos
nucleicos. Pueden excitarse otros compuestos tales como
ficoeritrina usando el láser de ion argón (488 nm) y emite en las
longitudes de onda del naranja/rojo. Sin embargo, la ficoeritrina
tiene una escasa estabilidad y un alto peso molecular, lo que la
hace inadecuada para muchas aplicaciones tales como rastreo
celular, marcaje de ácidos nucleicos o tinción de proteínas.
Para la tinción de proteínas, existen varios
métodos disponibles. Estos métodos pueden utilizar compuestos no
fluorescentes o compuestos fluorescentes. El método más comúnmente
usado utiliza azul de Coomassie, que no es fluorescente, puede
requerir el uso de grandes cantidades de disolventes orgánicos y
requiere mucho tiempo. Están disponibles otros métodos de detección
de proteínas basados en fluorescencia que son potencialmente más
sensibles que los métodos no fluorescentes. Sin embargo, estos
métodos son en general mucho más caros que los métodos no
fluorescentes, lo que limita su uso generalizado. Por tanto, serán
de particular utilidad compuestos que combinen características
espectrales útiles y una sensibilidad relativamente alta.
Existen varios métodos para la cuantificación de
proteínas en disolución. Estos métodos se basan en una gama de
técnicas, e incluyen métodos en los que los colorantes se unen a
proteínas solubles. Estos colorantes pueden ser o bien compuestos no
fluorescentes o bien fluorescentes. Los métodos basados en
colorantes fluorescentes son a menudo más sensibles que los basados
en colorantes no fluorescentes, y permiten la determinación de la
concentración de proteínas a lo largo de un amplio intervalo de
concentraciones. Los compuestos que combinan características
espectrales útiles con una capacidad de unirse a proteínas serán de
particular utilidad.
En estudios enzimáticos, existe un uso
generalizado de compuestos fluorescentes para la detección de
actividades enzimáticas particulares. Por ejemplo, el
di-\beta-D-galactopiranósido
de fluoresceína (FDG) es un compuesto no fluorescente fluorescente.
La escisión del compuesto FDG puede monitorizarse mediante el
aumento de fluorescencia en la disolución, y por tanto permite una
cuantificación sensible de la actividad enzimática. Actualmente,
sólo un número limitado de fluoróforos son adecuados para este
procedimiento. Por tanto, serán de utilidad compuestos
fluorescentes novedosos que puedan conjugarse a una variedad de
sustratos.
Para la tinción de color doble, existe una
elección muy limitada de fluoróforos de bajo peso molecular. El
fluoróforo verde predominante es la fluoresceína, que absorbe
fuertemente luz de la banda a 488 nm del láser de ion argón, y la
vuelve a emitir a 518 nm. Actualmente, existen pocos fluoróforos
rojos o naranjas compatibles que sean de bajo peso molecular y se
exciten mediante las bandas a 488 nm o 514 nm del láser de ion
argón. Por tanto, serán de utilidad compuestos de bajo peso
molecular que se exciten mediante láseres de ion argón y que emitan
a longitudes de onda superiores a 600 nm, particularmente si existe
un solapamiento espectral mínimo con la fluoresceína.
El documento EP 0578067 da a conocer un reactivo
de marcaje fotoquímico que contiene una estructura quelante de ion
europio y un derivado de furocumarina unido mediante un espaciador
y su uso en sistemas de sonda génica.
Stadler, M. et al. Nat. Prod. Lett.,
1995, 7(1), 7-14 da a conocer los derivados
de azafilona, bulgarolactona A y B.
Los presentes inventores han aislado nuevos
compuestos derivados de un hongo que pueden combinarse fácilmente
con una gama de moléculas orgánicas para producir complejos
fluorescentes.
En un primer aspecto de la invención, se
proporciona un complejo que comprende un compuesto según la fórmula
(I):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- \quad
- cada uno de R, R' y R'' es un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo C_{1-20} de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, grupos hidroxilo y/u oxo;
- \quad
- los anillos A, B y C incluyen opcionalmente uno o más dobles enlaces
- \quad
- los anillos B y C están opcionalmente sustituidos con uno o más átomos de halógeno, incluyendo tautómeros de fórmula (I), y una molécula orgánica,
en el que la molécula orgánica es
un compuesto que contiene nitrógeno,
y
en el que el compuesto de fórmula
(I) interacciona con la molécula orgánica de modo que emite
fluorescencia tras la
excitación.
Preferiblemente, el complejo que comprende un
compuesto de fórmula (Ia), incluyendo tautómeros del mismo:
\vskip1.000000\baselineskip
Preferiblemente el complejo que comprende un
compuesto que tiene la estereoquímica tal como se representa en la
fórmula (Ib), incluyendo tautómeros del mismo:
Preferiblemente, R es un grupo alquenilo
conjugado C_{1-20} de cadena lineal o ramificada
opcionalmente sustituido con grupos hidroxilo y oxo; R' es un grupo
alquilo C_{1-20} de cadena lineal o ramificada
opcionalmente sustituido con un grupo hidroxilo y R'' es un grupo
alquilo C_{1-20} de cadena lineal o ramificada,
incluyendo tautómeros del mismo.
Preferiblemente, el compuesto que contiene
nitrógeno se selecciona del grupo que consiste en proteínas,
aminoácidos, péptidos, ácidos nucleicos y aminas alifáticas o
aromáticas.
Preferiblemente, el compuesto de fórmula (I)
interacciona con el compuesto orgánico en presencia de un
tensioactivo de modo que emite fluorescencia tras la excitación.
Preferiblemente, el tensioactivo se selecciona del grupo que
consiste en sales de ácidos sulfónicos o ácidos grasos de cadena
larga.
En un segundo aspecto, la presente invención
proporciona un compuesto según la fórmula (I):
en la que cada uno de R, R' y R''
es un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo alquilo,
alquenilo o alquinilo C_{1-20} de cadena lineal o
ramificada opcionalmente sustituido con uno o más halógenos,
grupos hidroxilo y/u
oxo;
los anillos A, B y C están opcionalmente
sustituidos con uno o más átomos de halógeno; y los anillos A, B y
C incluyen opcionalmente uno o más dobles enlaces;
con la condición de que:
- (i)
- R\neq-C(OH)CHC(O)(CH)_{6}CH(Et)(Me) cuando R'=CH_{2}OH, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a;
- (ii)
- R\neq-C(OH)CHC(O)(CH)_{6}CH(Et)(Me) cuando R'=Me, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a;
- (iii)
- R\neq-C(OH)CHC(O)(CH)_{6}CH(Et)(Me) cuando R'=Me, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
\global\parskip0.930000\baselineskip
- (iv)
- R\neq-C(O)(CH)_{4}Me cuando R'=n-propilo, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (v)
- R\neq-C(O)(CH)_{6}Me cuando R'=n-propilo, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (vi)
- R\neq-C(O)(CH)_{5}Me cuando R' =-(CH)_{2}Me, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (vii)
- R\neq-C(O)(CH)_{6}Me cuando R'=-(CH)_{2}Me, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (viii)
- R\neq-(CH)_{2}C(Me)CHC(Me)(Et), cuando R'=Ac, R''=Me, C4=C1, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (ix)
- R\neq-(CH)_{2}C(Me)CHC(Me)(Et), cuando R'=-Ac, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (x)
- R\neq-(CH)_{2}C(Me)CH-i-propilo cuando R'=-Ac, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (xi)
- R\neq-C(O)(CH)_{4}Me cuando R'=-(CH)_{2}Me, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (xii)
- R\neq-C(O)(CH)_{4}Me- cuando R'=n-propilo, R''=Me, el anillo A no incluye un doble enlace; y los anillos B y C incluyen dobles enlaces entre C8a y C4a y C5 y C6;
- (xiii)
- R\neq-C(O)(CH)_{4}Me cuando R'=n-propilo, R''=Me, los anillos A, B y C no incluyen dobles enlaces.
- (xiv)
- R\neq-C(O)(CH)_{6}Me cuando R' =-C(CH)_{2}Me, R''=Me, el anillo A no incluye un doble enlace; y los anillos B y C incluyen dobles enlaces entre C8a y C4a y C5 y C6;
- (xv)
- R\neq-C(O)(CH)_{4}Me cuando R'=C(CH)_{2}(Me), R''=Me, el anillo A no incluye un doble enlace; y los anillos B y C incluyen dobles enlaces entre C8 y C4a y C5 y C6;
- (xvi)
- R\neq-C(O)(CH)_{4}Me cuando R'=-(CH)_{2}Me, R''=Me, el anillo A no incluye un doble enlace; y los anillos B y C incluyen dobles enlaces entre C8a y C4a y C5 y C6;
- (xvii)
- R\neq-C(O)(CH_{2})_{4}Me cuando R' =-n-propilo, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (xviii)
- R\neq-C(O)(CH_{2})_{6}Me cuando R'=n-propilo, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (xix)
- R\neq-C(O)(CH_{2})_{5}Me cuando R' =-(CH)_{2}Me, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (xx)
- R\neq-C(O)(CH_{2})_{6}Me cuando R'=(CH)_{2}Me, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (xxi)
- R\neq-Ac cuando R'=(CH)_{2}C(Me)CHCH(Me)(Et), R''=Me, C4=C1, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (xxii)
- R\neq-Ac cuando R'=(CH)_{2}C(Me)CHCH(Me)(Et), R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y Coa; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
\global\parskip1.000000\baselineskip
- (xxiii)
- R\neq-Ac cuando R'=(CH)_{2}C(Me)CH-i-propilo, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (xxiv)
- R\neq-C(O)(CH_{2})_{4}Me cuando R'=(CH)_{2}Me, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (xxv)
- R\neq-C(O)(CH_{2})_{4}Me cuando R'=-n-propilo, R''=Me, el anillo A no incluye un doble enlace; y los anillos B y C incluyen dobles enlaces entre C8a y C4a y C5 y C6;
- (xxvi)
- R\neq-C(O)(CH_{2})_{4}Me cuando R'=n-propilo, R''=Me, los anillos A, B y C no incluyen dobles enlaces.
- (xxvii)
- R\neq-C(O)(CH_{2})_{6}Me cuando R'=(CH)_{2}Me, R''=Me, el anillo A no incluye un doble enlace; y los anillos B y C incluyen dobles enlaces entre C8a y C4a y C5 y C6;
- (xxviii)
- R\neq-C(O)(CH_{2})_{4}Me cuando R'=C(CH_{2})(Me), R''=Me, el anillo A no incluye un doble enlace; y los anillos B y C incluyen dobles enlaces entre C8a y C4a y C5 y C6;
- (xxix)
- R\neq-C(O)(CH_{2})_{4}Me cuando R'=-(CH)_{2}Me, R''=Me, el anillo A no incluye un doble enlace; y los anillos B y C incluyen dobles enlaces entre C8a y C4a y C5 y C6, incluyendo tautómeros del mismo.
Preferiblemente, el compuesto según el segundo
aspecto de la invención está de acuerdo con la fórmula (Ia) y más
preferiblemente, tiene la estereoquímica tal como se representa en
la fórmula (Ib).
Incluso más preferiblemente, el R es
-C(OH)CHC(O)(CH)_{6}CH_{3}, R' es
-CH_{2}OH y R'' es Me de manera que la presente invención según
el segundo aspecto consiste en el compuesto
5,6-dihidro-3-[(1Z,4E,6E,8E)-1-hidroxi-3-oxo-1,4,6,8-decatetraenil]-6-hidroximetil-9a-metil-2H-furo[3,2-g][2]benzopiran-2-9(9aH)-diona
según la fórmula (Ic), incluyendo tautómeros del mismo:
En un tercer aspecto de la invención, se
proporciona el uso de un compuesto según la fórmula (I):
en la
que:
- \quad
- cada uno de R, R' y R'' es un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo C_{1-20} de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, grupos hidroxilo y/u oxo;
- \quad
- los anillos A, B y C incluyen opcionalmente uno o más dobles enlaces;
- \quad
- los anillos B y C están opcionalmente sustituidos con uno o más átomos de halógeno, incluyendo tautómeros de fórmula (I);
o un compuesto de fórmula (Ia),
incluyendo tautómeros del
mismo:
o un compuesto que tiene la
estereoquímica tal como se representa en la fórmula (Ib),
incluyendo tautómeros del
mismo:
o un compuesto de fórmula (I), (Ia)
o (Ib) en el que R es un grupo alquenilo conjugado
C_{1-20} de cadena lineal o ramificada
opcionalmente sustituido con grupos hidroxilo y oxo; R' es un grupo
alquilo C_{1-20} de cadena lineal o ramificada
opcionalmente sustituido con un grupo hidroxilo y R'' es un grupo
alquilo C_{1-20} de cadena lineal o ramificada,
incluyendo tautómeros del mismo, o un compuesto según una cualquiera
de las reivindicaciones 8 a 12, para la formación de un complejo
con una molécula orgánica, en la que la molécula orgánica es un
compuesto que contiene nitrógeno, y el complejo puede emitir
fluorescencia tras la
excitación.
Preferiblemente, la molécula orgánica que
contiene nitrógeno es una proteína, péptido, azúcar, ácido
nucleico, molécula de la superficie celular o detergente, o está
incluida en un anticuerpo o una célula.
Preferiblemente, el compuesto está unido a la
molécula orgánica a través de una molécula conectora.
En un cuarto aspecto de la presente invención,
se proporciona una composición que incluye:
(i) un compuesto según la fórmula (I)
en la
que:
- \quad
- cada uno de R, R' y R'' es un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo C_{1-20} de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, grupos hidroxilo y/u oxo;
- \quad
- los anillos A, B y C incluyen opcionalmente uno o más dobles enlaces;
- \quad
- los anillos B y C están opcionalmente sustituidos con uno o más átomos de halógeno, incluyendo tautómeros de fórmula (I), y
(ii) una molécula orgánica,
en la que la molécula orgánica es
un compuesto que contiene
nitrógeno,
en la que el compuesto interacciona
con una molécula orgánica de modo que emite fluorescencia tras la
excitación.
En un quinto aspecto de la invención, se
proporciona un complejo que comprende un compuesto según la fórmula
(I) en la que:
- \quad
- cada uno de R, R' y R'' es un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo C_{1-20} de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, grupos hidroxilo y/u oxo;
- \quad
- los anillos A, B y C incluyen opcionalmente uno o más dobles enlaces;
- \quad
- los anillos B y C están opcionalmente sustituidos con uno o más átomos de halógeno, incluyendo tautómeros de fórmula (I), y una molécula inorgánica,
en el que la molécula inorgánica es
una molécula que contiene nitrógeno,
y
en el que el compuesto puede
interaccionar con la molécula inorgánica de modo que emite
fluorescencia tras la
excitación.
Preferiblemente, el complejo según el quinto
aspecto de la invención está de acuerdo con la fórmula (Ia),
incluyendo tautómeros del mismo; y más preferiblemente tiene la
estereoquímica tal como se representa en la fórmula (Ib),
incluyendo tautómeros del mismo.
Preferiblemente, R es un grupo alquenilo
conjugado C_{1-20} de cadena lineal o ramificada
opcionalmente sustituido con grupos hidroxilo y oxo; R' es un grupo
alquilo C_{1-20} de cadena lineal o ramificada
opcionalmente sustituido con un grupo hidroxilo y R'' es un grupo
alquilo C_{1-20} de cadena lineal o ramificada,
incluyendo tautómeros del mismo.
Preferiblemente, el complejo según el quinto
aspecto de la invención comprende un compuesto en el que R es
-C(OH)CHC(O)(CH)_{6}CH_{3}, R' es
-CH_{2}OH y R'' es Me de manera que el compuesto consiste en el
compuesto
5,6-dihidro-3-[(1Z,4E,6E,8E)-1-hidroxi-3-oxo-1,4,6,8-decatetraenil]-6-hidroximetil-9a-metil-2H-furo[3,2-g][2]benzopiran-2-9(9aH)-diona
según la fórmula (Ic), incluyendo tautómeros del mismo.
Preferiblemente, la molécula inorgánica que
contiene nitrógeno se selecciona del grupo que consiste en
amoniaco, hidrazina e hidroxilamina, compuestos que contienen
amoniaco, compuestos que contienen hidrazina y compuestos que
contienen hidroxilamina.
Preferiblemente, el compuesto de fórmula (I)
interacciona con el compuesto inorgánico en presencia de un
tensioactivo de modo que emite fluorescencia tras la excitación a
un amplio intervalo de longitudes de onda. Preferiblemente, el
tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en sales de
ácidos sulfónicos o ácidos grasos de cadena larga.
Preferiblemente, el complejo según el quinto
aspecto de la invención, emite fluorescencia tras la excitación a
longitudes de onda del ultravioleta al azul. Preferiblemente, el
complejo según el quinto aspecto de la invención emite
fluorescencia cuando se excita mediante luz en el intervalo de
300-560 nm. Preferiblemente, el complejo según el
quinto aspecto de la invención emite fluorescencia cuando se excita
mediante luz a aproximadamente 400 nm, 488 nm o 514 nm.
Preferiblemente, el complejo según el quinto aspecto de la
invención emite fluorescencia a longitudes de onda del visible tras
la excitación a 488 nm.
En un aspecto adicional de la invención, se
proporciona una composición que comprende un complejo según el
quinto aspecto de la invención y un vehículo analíticamente
aceptable y, opcionalmente, un fluorocromo.
Químicamente, los compuestos de fórmula
(I)-(Ic), tales como
5,6-dihidro-3-[(1Z,4E,6E,8E)-1-hidroxi-3-oxo-1,4,6,8-decatetraenil]-6-hidroximetil-9a-metil-2H-furo[3,2-g][2]benzopiran-2-9(9aH)-diona,
son miembros de la familia de la azafilona. Los compuestos de
azafilona se producen por una variedad de hongos, y se han
investigado por su papel como agentes colorantes en alimentos.
También se ha hallado el núcleo de azafilona en
los pigmentos producidos por Monascus spp. Los pigmentos que
contienen el número de azafilona común incluyen
dihidro-monascorubina. No existe registro de su
utilidad como colorantes fluorescentes para la tinción de
biomoléculas o compuestos orgánicos.
Ninguna de las técnicas anteriores conocidas por
los solicitantes enseña o sugiere que un compuesto de la
estructura descrita en la fórmula (I)-(Ic) fuese fluorescente, ni
sugiere que sería adecuado para su uso en la tinción fluorescente
de biomoléculas o compuestos orgánicos. Por consiguiente, existen
propiedades inesperadas y ventajosas asociadas a este compuesto
incluyendo la detección sensible de proteínas en geles, rastreo
celular y tinción de doble color.
Inesperadamente, se ha descubierto que los
compuestos según la fórmula (I)-(Ic) no son fluorescentes en
disolución acuosa, pero pueden interaccionar con compuestos
orgánicos que contienen nitrógeno para producir un tinte sumamente
fluorescente. En una realización preferida, los compuestos según la
fórmula (I)-(Ic) de la invención se usan en la detección y el
etiquetado de moléculas orgánicas que contienen nitrógeno.
Preferiblemente, el compuesto según la fórmula
(I)-(Ic), cuando se une a una molécula orgánica que contiene
nitrógeno, emite fluorescencia tras la excitación a longitudes de
onda del azul. Más preferiblemente, los compuestos según la fórmula
(I)-(Ic) se excitan mediante la luz en el intervalo de absorbancia
de 300-560 nm.
En una realización preferida, un compuesto según
la fórmula (I)-(Ic) interacciona con proteínas para producir un
complejo fluorescente que puede excitarse mediante la luz generada
mediante transiluminadores (307 nm) de UV convencionales. Tras la
excitación, el complejo fluorescente emite luz a lo largo de un
amplio intervalo de longitudes de onda permitiendo la detección de
los complejos de proteína. La longitud de onda de excitación del
complejo de proteína/colorante incluye a la del bromuro de etidio
complejado con ADN. (Máximo de absorción 518 nm, máximos de emisión
605 nm). Esto es de particular utilidad porque permite usar el
mismo equipo para detectar tanto ADN como proteína en geles. El
amplio intervalo de longitudes de onda de excitación permite que se
excite fuertemente el compuesto mediante bandas de 488 nm y 514 nm
del láser de ión argón, así como absorben la luz emitida a partir
de las fuentes luminosas de diodo tales como las que emiten a
aproximadamente 400 nm.
En otra realización preferida, una forma
fluorescente del compuesto según la fórmula (I)-(Ic) puede absorber
fuertemente la luz de la salida de 488 nm del láser de ión argón, y
volver a emitir la luz a longitudes de onda más largas de 600
nm.
En otra realización preferida, el compuesto
según la fórmula (I) se incluye en una composición, junto con un
vehículo analíticamente aceptable, y puede usarse en combinación
con un fluorocromo tal como fluoresceína en aplicaciones de tinción
doble. Un fluorocromo de este tipo puede incluirse en la
composición o usarse por separado.
El compuesto según la fórmula (I)-(Ic) puede
producirse por una especie fúngica. Preferiblemente, la especie
fúngica es la cepa depositada en los Laboratorios analíticos del
gobierno australiano (Australian Government Analytical
Laboratories) (AGAL) el 15 de enero de 1998 identificada con el
número de acceso NM98/00507.
Los métodos para la purificación, el
aislamiento, así como la estructura del fluoróforo novedoso
5,6-dihidro-3-[(1Z,4E,6E,8E)-1-hidroxi-3-oxo-1,4,6,8-decatetraenil]-6-hidroximetil-9a-metil-2H-furo[3,2-g][2]benzopiran-2-9
(9aH)-diona y compuestos relacionados no se han descrito previamente.
(9aH)-diona y compuestos relacionados no se han descrito previamente.
La unión del compuesto según la fórmula (I)-(Ic)
a moléculas orgánicas que contienen nitrógeno puede implicar la
unión física o química directa o puede lograrse mediante el uso de
"moléculas de unión" conocidas en la técnica. Las moléculas
orgánicas que pueden estar unidas por el compuesto de la invención
cuando se usa como un colorante fluorescente incluyen, por ejemplo,
proteínas, péptidos, azúcares, ácidos nucleicos, anticuerpos,
biomoléculas de la superficie celular, detergentes y células.
Debido a las características de unión a compuestos orgánicos y
fluorescentes del compuesto, se apreciará que el compuesto podrá
usarse en cualquier aplicación en la que se requiere la detección de
un colorante fluorescente unido a un compuesto orgánico que
contiene nitrógeno.
En un aspecto adicional, la presente invención
consiste en un procedimiento de producción de un compuesto según la
fórmula (I)-(Ic) del segundo aspecto de la invención, comprendiendo
el procedimiento cultivar una especie fúngica en condiciones tales
que la especie fúngica produce el compuesto; y separar el
compuesto del cultivo.
El compuesto según la fórmula (I)-(Ic) puede
usarse como un colorante fluorescente cuando está en un extracto de
cultivo bruto o cuando se purifica mediante técnicas de extracción
y separación.
Se ha descubierto que tras la inoculación e
incubación de la cepa identificada con el número de acceso AGAL
NM98/00507 en el medio de cultivo, se produce por el hongo un
compuesto que es adecuado como colorante fluorescente.
Se apreciará que será posible producir
compuestos según la fórmula (I)-(Ic) usando técnicas distintas de
las del sobrenadante de un cultivo fúngico adecuado. Por ejemplo,
si el hongo produce un "precursor", entonces será posible
modificar este precursor hasta su forma fluorescente por medios
químicos, físicos o enzimáticos. El conocimiento de que tales
compuestos pueden obtenerse a partir de microorganismos debe
permitir el descubrimiento y la producción de otros compuestos
adecuados para su uso como colorantes fluorescentes que pertenecen a
la misma familia o compuestos bastante distintos con
características útiles. El compuesto según la fórmula (I) puede
producirse también sintéticamente mediante síntesis química directa,
o mediante la modificación de producto(s)
intermedio(s) en la ruta biosintética usada por los
hongos.
El compuesto según la fórmula (I)-(Ic) del
segundo aspecto de la presente invención puede producirse también
sintéticamente por medios químicos. El conocimiento de que se
produce un nuevo compuesto fluorescente mediante hongos puede
conducir a otros medios de producción del compuesto a parte de
cultivar los hongos en las condiciones requeridas.
El compuesto según la fórmula (I)-(Ic) tiene la
ventaja distinta de que se une a células y otras moléculas
orgánicas en su forma fluorescente de modo que puede usarse como un
medio para rastrear las células o las otras moléculas orgánicas
cuando se marcan con el compuesto.
En un sexto aspecto, la presente invención
consiste en el uso del compuesto según la fórmula (I)-(Ic) como un
colorante o marcador fluorescente, preferiblemente en técnicas
científicas para la tinción, el marcaje y/o la detección de
moléculas orgánicas que contienen nitrógeno.
Los ejemplos del uso del compuesto según la
fórmula (I)-(Ic) incluyen, pero no se limitan a, colorantes de
rastreo celular para microscopía, colorantes de fluidez de
membrana, conjugación con anticuerpos, conjugación a ácidos
nucleicos, colorantes de formación de imágenes de ligandos de la
superficie celular, conjugación a azúcares, análisis citométricos
y microscopia confocal. Sin embargo, se apreciará que el compuesto
sería adecuado para cualquier uso en el que se requiera
fluorescencia en las longitudes de onda del rojo, incluyendo cuando
se excita a 488 nm.
En un séptimo aspecto, la presente invención
consiste en un método de marcaje fluorescente de un compuesto
orgánico que contiene nitrógeno, comprendiendo el método provocar
que el compuesto según la fórmula (I)-(Ic) se una a un compuesto
orgánico que contiene nitrógeno de manera que el compuesto orgánico
se marque fluorescentemente con el compuesto.
Preferiblemente, el compuesto orgánico marcado
fluorescentemente se detecta cuando se expone a un amplio intervalo
de longitudes de onda, preferiblemente longitudes de onda en el
intervalo de 300-560 nm.
El compuesto orgánico que contiene nitrógeno
puede incluir, pero no se limita a, proteínas, péptidos, azúcares,
ácidos nucleicos, anticuerpos, biomoléculas de la superficie
celular, detergentes y células. El compuesto puede unirse
directamente al compuesto orgánico debido a una asociación física o
química o puede unirse al compuesto orgánico a través de una
molécula conectora. Si el compuesto está unido a un ligando
específico para el compuesto orgánico, por ejemplo un anticuerpo o
lectina, entonces la unión de este ligando al compuesto orgánico
provocará que se marque fluorescentemente el compuesto
orgánico.
En un octavo aspecto, la presente invención
consiste en un método de detección del compuesto orgánico que
contiene nitrógeno en una muestra que incluye el compuesto
orgánico, comprendiendo el método marcar el compuesto orgánico
según el método del séptimo aspecto de la presente invención; y
detectar el compuesto orgánico en la muestra monitorizando o
detectando su fluorescencia. Preferiblemente, el compuesto orgánico
marcado se detecta cuando se expone la muestra a luz de un amplio
intervalo de longitudes de onda, preferiblemente longitudes de onda
en el intervalo de 300-560 nm, más preferiblemente
longitudes de onda del azul.
La monitorización o detección de la
fluorescencia del compuesto orgánico marcado puede realizarse por
cualquier medio conocido en la técnica. Tales medios incluyen, pero
no se limitan a, transiluminación, espectroscopia, microscopía y
citometría.
A lo largo de este memoria descriptiva, se
entenderá que la palabra "comprender", o variaciones tales
como "comprende" o "que comprende", implican la inclusión
de una etapa o número entero de elementos indicados, o grupo de
elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de
cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de
elementos, números enteros o etapas.
Cualquier discusión de documentos, actos,
materiales, dispositivos, artículos o similares que se ha incluido
en la presente memoria descriptiva es exclusivamente para el fin de
proporcionar un contexto para la presente invención. No ha de
considerarse como una admisión de que cualquiera o todos estos
aspectos forman parte de la base de la técnica anterior o eran un
conocimiento general común en el campo relevante para la presente
invención tal como existía en Australia antes de la fecha de
prioridad de cada reivindicación de esta solicitud.
Con el fin de que pueda entenderse más
claramente la presente invención, se describirán formas preferidas
con referencia a los siguientes ejemplos y dibujos adjuntos.
La figura 1 muestra un espectro de RMN de
5,6-dihidro-3-[(1Z,4E,6E,8E)-1-hidroxi-3-oxo-1,4,6,8-decatetraenil]-6-hidroximetil-9a-metil-2H-furo[3,2-g][2]benzopiran-2-9(9aH)-diona,
un compuesto fluorescente según los aspectos primero, segundo,
tercero y cuarto de la invención.
La figura 2 muestra un ejemplo de un espectro de
emisión del compuesto identificado por la figura 1 cuando se une a
albúmina de suero bovino (BSA) y yoduro de propidio unido a ADN. El
número de moles del compuesto purificado usado para unirse al BSA
en exceso, fue igual al número de moles de yoduro de propidio
usado para unirse al ADN en exceso. Existen dos bandas de excitación
que dan como resultado una emisión a 605 nm. Tal como se observa,
la excitación mediante luz a 390-400 nm da como
resultado una emisión máxima de luz a 605 nm.
Ejemplo
1
Se obtuvo un cultivo biológicamente puro del
microorganismo que tenía todas las características identificativas
de la cepa identificada con el número de acceso AGAL NM
98/00507.
Se preparó un medio de cultivo para el hongo,
número de acceso AGAL NM 98/00507, añadiendo 40 g de sacarosa
(CSR), 5 g de extracto de levadura (Difco), 10 g de peptona (Difco)
y 10 g de agar (Difco) a 1 l de agua. Se trató en autoclave la
mezcla durante 15 min. a 115°C tanto para esterilizar el medio como
para disolver el agar. Se vertió el líquido en las placas de
cultivo y se dejó solidificar a temperatura ambiente. Tras enfriar,
se inoculó un cultivo del hongo en la superficie del medio, y se
incubó a 25°C durante tres días. Se transfirió el cultivo a un
refrigerador y se inoculó a 4°C hasta que el cultivó cambió a un
color rojo intenso y la producción del colorante era alta
(normalmente de 3 a 5 días).
Una vez el cultivo produjo suficiente colorante
para recoger, se transfirió el medio de cultivo, incluyendo la
biomasa fúngica, a etanol a una razón de un volumen de medio de
cultivo con respecto a dos volúmenes de etanol. Se extrajo el
colorante en la fase etanólica mediante incubación a 4°C y agitando
durante 16 horas. Se decantó la fase líquida del medio de cultivo
residual, y se centrifugó a 3000 rpm durante 10 min. a 4°C.
El extracto clarificado (extracto A) o bien se
almacenó para su uso, o bien se purificó según uno de los
procedimientos descritos en los ejemplos 2 y 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se redujo en volumen a alto vacío el extracto
etanólico bruto del extracto A producido según el método descrito
en el ejemplo 1, se sometió a cromatografía sobre polvo de celulosa
usando metanol como disolvente y se aplicó a una columna sephadex
LH-20, también eluida con metanol. Se recogieron las
fracciones durante 48 horas y se recogió la banda púrpura que se
eluía cerca del final. Se liofilizó esta fracción y se resuspendió
en un volumen mínimo de metanol (ácido acético al 0,1%) y se
almacenó.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se sometió el extracto B producido según el
método descrito en el ejemplo 2 a purificación por HPLC (columna
C16-amida de Supelco, resuelta en metanol al
75%/agua, ácido acético al 0,05%, luego acetonitrilo al 50%/agua,
ácido acético al 0,05%). Se congeló la fracción final (-20°C) para
eliminar el agua y se evaporó el acetonitrilo restante bajo una
corriente de nitrógeno.
Este procedimiento produjo
6-dihidro-3-[(1Z,4E,6E,8E)-1-hidroxi-3-oxo-1,4,6,8-decatetraenil]-6-hidroximetil-9a-metil-2H-furo[3,2-g][2]benzopiran-2-9(9aH)-diona
analíticamente pura que era un sólido naranja.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se analizó el compuesto producido según el
ejemplo 3 usando una combinación de espectroscopia de RMN y
espectroscopia de masas de alta resolución para determinar la
estructura de
6-dihidro-3-[(1Z,4E,6E,8E)-1-hidroxi-3-oxo-1,4,6,8-decatetraenil]-6-hidroximetil-9a-metil-2H-furo[3,2-g]
[2]benzopiran-2-9(9aH)-diona.
Se preparó la muestra para RMN disolviendo el
compuesto purificado por HPLC obtenido del ejemplo 3 (\sim5 mg)
en CDCl_{3} (0,5 ml; 99,96% en átomos, Aldrich) y filtrándolo a
un tubo de RMN (PP527, Wilmald). Se desgasificó la muestra y se
equilibró bajo una atmósfera de nitrógeno.
Los datos de RMN se adquirieron en un
espectrómetro de RMN Bruker DRX600 (600 MHz) a 27°C y se procesaron
usando el programa xwinNMR (versión 2.6; Bruker). Todos los
experimentos de RMN 2D se realizaron con detección en cuadratura
con una anchura espectral de ^{1}H de 6009 Hz y un retraso de
recirculación de 2 s. Los desplazamientos químicos eran con
referencia al CHCl_{3} residual (\deltaH 7,26 ppm; \deltaC
77,01 ppm). Se determinó que los pulsos de \pi/2 de ^{1}H de
alta potencia eran de 9,5 ms y de baja potencia (para el bloqueo de
espín MLEV) a 25,15 ms. El pulso de \pi/2 de alta potencia de
^{13}C fue de 10,5 ms y se usó un pulso de baja potencia de 65 ms
para el desacoplamiento de GARP. Se suministraron pulsos en
gradiente a lo largo del eje z usando un programa senoidal de
100
etapas.
etapas.
Los datos para los experimentos con 1D se
adquirieron usando puntos reales de 32 K y se rellenó con ceros
hasta 64 K y se realizó la multiplicación Gaussiana para aumentar
la resolución. Se logró la correlación (HSQC) carbono - hidrógeno
mediante una transferencia de INEPT doble de sensibilidad
potenciada usando selección de gradiente de TPPI eco/antieco
(Palmer, A. G., III, Cavanagh, J., y Wright, P. (1991) J. Magn.
Reson. 93, 151-70; Schleucher, J., Schwendinger,
M., Sattler, M., y Schmidt, P. (1994) J. Biomol.RMN 4,
301-6; Kay, L. E., Keifer, P., y Saarinen, T.
(1992) J. Am. Chem. Soc. 114(26), 10663-5).
Se recogieron puntos de datos de 2 K en t2 (128 barridos por
incremento) con un retraso de recirculación de 1,3 s con
desacoplamiento durante la adquisición. En t1, se usaron 512
incrementos (10-170 ppm) y se optimizó la secuencia
de INEPT para un acoplamiento X-H de 145 Hz. Se usó
una razón de gradiente de 80:20,1 para seleccionar la sensibilidad
de la fase TPPI eco/
antieco.
antieco.
Se midieron los espectros ROESY unidimensionales
usando un pulso Gaussiano selectivo sobre el protón de interés
(Kessler, H., H. Oschkinat, C. Griesinger & W. Bermel, (1986)
J. Magn. Reson. 70, 106; Stonehouse, J., P. Adell, J. Keeler &
A. J. Shaka, (1994) J. Am. Chem. Soc. 116, 6037; Stott, K., J.
Stonehouse, J. Keeler, T. L. Hwang & A. J. Shaka, (1995) J. Am.
Chem. Soc. 117, 4199 4200). Se usó un programa Gaussiano de 1000
etapas (60 ms, 64,6 dB) para conseguir un pulso de \pi/2. Se usó
un tiempo de mezclado de 100 ms (13 dB) para un bloqueo de espín de
onda continuo. Se logró la selección en gradiente con un gradiente
del 15% a lo largo del eje z. Se acumularon transitorios de 10 K
sobre 6009 Hz. Se midieron los aumentos de ROE como un porcentaje
del pico irradiado y no se compensó su desviación de la frecuencia
portadora.
Se midieron espectros (TOCSY) de transferencia
Hartman-Hahn homonuclear bidimiensional usando la
secuencia de pulsos MLEV17 (Bax, A. & Davis. D. G. (1985) J.
Magn. Reson. 63(1), 207-13) flanqueada con
pulsos centrados de baja potencia de 2 ms. Se usó apodización de
campana senoidal desplazada (90°) en el procesamiento de ambas
dimensiones.
Se adquirió la correlación de
^{1}H-^{13}C en 2D a través de coherencia de
cero y doble cuanto heteronuclear optimizada para acoplamientos a
larga distancia (HMBC) con un filtro (145 Hz) J de paso bajo para
suprimir las correlaciones de un enlace (Bax, A., & M. F.
Summers, (1986) J. Am. Chem. Soc. 108, 2093 - 2094) sin
desacoplamiento durante el tiempo de adquisición y usando pulsos en
gradiente (50:30:40,1) para la selección. El retraso para la
evolución de los acoplamientos a larga distancia se optimizó para
los acoplamientos de 20, 10, 5 y 2 Hz en experimentos separados.
Se usó una anchura espectral de 210 ppm en F1 y se calculó la
magnitud del espectro final para destruir la información de las
fases.
^{1}H RMN (600 MHz, CDCl_{3}) \delta 1,75,
s, C9a-Me; 1,84, dd, J 6,7, 1,1 Hz,
C9'-Me; 2,80, dd, J 17,2, 3,6 Hz, H5\alpha; 2,89,
ddd, J 17,1, 11,5, 1,9 Hz, H5\beta; 3,85, dd, J 12, 2, 5,5 Hz,
C_{6}CH_{2}OH; 3,97, dd, J 12,2, 3,4 Hz, C_{6}CH_{2}OH;
4,39, m, H6; 5,97, m, H9'; 6,10, d, J 15,1 Hz, H4', 6,19, ddd, J
15,1, 10,6, 1,6 Hz, H8'; 6,25, dd, J 14,6, 11,2 Hz, H6'; 6,58, dd,
J14,5, 10,5 Hz, H7'; 6,79, s, H2'; 7,16, sa, H4,7,32, dd, J 15,2,
11,2 Hz, H5'; 7,85, s, H8.
^{13}C RMN (125 MHz, CDCl_{3}) \delta 18,
8, C9'-Me; 28, 0, C9a-Me; 29,3, C5;
63,4, C6-CH_{2}OH; 79,0, C6; 86,2, C9a; 101,0,
C2'; 112,2, C8a; 113,4, C4; 115,3, C3; 126,5, C4'; 128,6, C6';
131,7, C8'; 136,0, C9'; 140,9, C4a; 142,0, C7'; 142,6, C5'; 159,0,
C8; 168,2, C2/C3a; 177,7, C1'; 185,0, C3'; 190,0, C9.
Se usó la coherencia cuántica sencilla
heteronuclear (HSQC) para correlacionar y asignar todos los protones
a carbonos protonados. Además, se caracterizó cada sistema de
espines realizando una serie de experimentos de espectroscopia de
correlación total (TOCSY) con tiempos de mezclado de 8 mseg., 20
mseg., 100 mseg. El tiempo de mezclado más corto dio correlaciones
sólo con los protones acoplados directamente mientras que el tiempo
de mezclado más largo identificó el sistema de espines completo y
dio información sobre acoplamientos a larga distancia muy pequeños
que fueron valiosos para asignar las posiciones de los muchos
protones (aparentemente) no acoplados. Se lograron conectividades
espaciales minuciosas mediante una serie de experimentos de
espectroscopia de correlación de marco de rotación selectiva
unidimensional (ROESY). Se logró la excitación selectiva mediante
un impulso gaussiano de 90 grados de baja potencia y usando una
sección en gradiente para observar sólo los ROE libres de
transferencias TOCSY. Se halló que un tiempo de mezclado de 100
mseg. era óptimo. Se halló que eran esenciales espectros de
coherencia cuántica múltiple heteronuclear a larga distancia (HMBC)
con tiempos de mezclado de 25, 50, 100 y 250 mseg. para asignar
todos los carbonos no protonados. Incluso tras esto, se halló que
C2 no se correlacionaba con ningún protón y coincidía con C3a a
168,2 ppm.
A partir de los datos espectrales, eran
teóricamente posibles varios esqueletos tricíclicos pero una
(6-dihidro-3-[(1Z,4E,6E,8E)-1-hidroxi-3-oxo-1,4,6,8-decatetraenil]-6-hidroximetil-9a-metil-2H-furo[3,2-g][2]benzopiran-2-9
(9aH)-diona), se ajustaba a los datos disponibles exactamente.
(9aH)-diona), se ajustaba a los datos disponibles exactamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometió el compuesto producido según el
ejemplo 3 a espectrometría de masas de alta resolución para
determinar que la fórmula molecular del compuesto era
C_{23}H_{22}O_{7}.
Espectro de masas (ESI, ion positivo) m/e 411
(M+H^{+}, 55%), 317 (5), 249 (12), 163 (10), 121 (100), 93 (4).
ESI-FTICR de ion negativo Encontrado: M - H^{+},
409,1304, C_{23}H_{21}O_{7} requiere 409,1293; hallado:
247,0617, C_{13}H_{12}O_{5} requiere 247,0685.
\vskip1.000000\baselineskip
\lambda_{max} (MeOH) 432, 555 nm,
\varepsilon 10000, 4000. \lambda_{max} (MeOH alcalino) 432
nm. \varepsilon 16000. \lambda_{max} (MeOH ácido) 390,560 nm,
\varepsilon 6000, 10000.
\nu_{max} (puro) 3400 (a), 2925, 2854, 1744,
1712, 1589, 1259, 1010 cm^{-1}.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se preparó un gel de proteína según uno
cualquiera de varios protocolos convencionales. Por ejemplo, se
preparó un gel de SDS-page según el protocolo de
Laemmli (R.U. 1970, Nature, 227:680-685). Tras
completarse la electroforesis, se extrajo el gel del aparato de
electroforesis. Se fijó el gel en un recipiente que contenía 100 ml
de una disolución de tinción compuesta por 90 ml de agua, 10 ml de
glicerol y 5 ml de extracto A. Se incubaron el gel y la disolución
de tinción con agitación suave durante 90 minutos. Tras el
procedimiento de tinción de 90 minutos, se eliminó la disolución y
se lavó brevemente el gel tres veces con agua. Tras estos lavados
breves, se colocó el gel en 100 ml de glicerol al 10% y agua y se
incubó con agitación durante 30 min. adicionales.
Para visualizar las proteínas en el gel, se
transfirió el gel a un transiluminador de UV (307 nm), y se
fotografió usando una película en blanco y negro polaroid 667 y un
conjunto de filtro diseñado para la detección de geles de bromuro
de etidio (por ejemplo, E-7591 de Molecular
probes).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se cultiva un microorganismo en condiciones para
promover la esporulación y se usa el extracto B para facilitar la
identificación de células esporuladas en un cultivo de células
predominantemente vegetativas. Por ejemplo, se hizo crecer
Saccharomyces cerevisiae en un caldo a base de agua que
contenía glucosa 10 g/l, extracto de levaduras 5 g/l y peptona 10
g/l. Tras una incubación de 16 horas a 30°C, se recogieron las
células mediante centrifugación y se resuspendieron en 1 ml de agua.
Se pusieron las alícuotas de 5 \mul del cultivo sobre un medio
semisólido compuesto por acetato de potasio al 5%, agar al 2% y
agua. Se incubaron los cultivos a 22°C durante 4 días para permitir
la esporulación de las células de levadura. Se resuspendió el
cultivo esporulado en agua hasta una densidad de 1 x 10^{9}
células por ml. Se añadieron 5 \mul de extracto B a 1 ml del
cultivo esporulado. Para la contratinción, se añadieron 5 \mul de
una disolución 10 mM (en DMSO) de diacetato de
5(6)-carboxifluoresceína (CFDA) al cultivo
esporulado. Tras 5 minutos, se recogió el cultivo esporulado
mediante centrifugación y se resuspendió en 1 ml de agua. El examen
bajo un microscopio de epifluorescencia (excitación a 488 nm)
permitió la diferenciación rápida entre células esporuladas y
vegetativas.
Los expertos en la técnica apreciarán que pueden
realizarse numerosas variaciones y/o modificaciones en la
invención tal como se muestra en las realizaciones específicas sin
apartarse del espíritu o alcance de la invención tal como se
describe ampliamente. Por tanto, las presentes realizaciones deben
considerarse en todos los aspectos como ilustrativas y no
restrictivas.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante se dirige únicamente a ayudar al lector y no forma
parte del documento de patente europea. Incluso si se ha procurado
el mayor cuidado en su concepción, no se pueden excluir errores u
omisiones y el OEB declina toda responsabilidad a este
respecto.
\bullet EP 0578067 A (0010)
Bibliografía no relativa a patentes citada en la
descripción.
Claims (46)
1. Complejo que comprende un compuesto según la
fórmula (I):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- \quad
- cada uno de R, R' y R'' es un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo C_{1-20} de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, grupos hidroxilo y/u oxo;
- \quad
- los anillos A, B y C incluyen opcionalmente uno o más dobles enlaces;
- \quad
- los anillos B y C están opcionalmente sustituidos con uno o más átomos de halógeno, incluyendo tautómeros de fórmula (I) y una molécula orgánica,
en el que la molécula orgánica es
un compuesto que contiene nitrógeno,
y
en el que el compuesto de fórmula
(I) interacciona con la molécula orgánica de modo que emite
fluorescencia tras la
excitación.
2. Complejo según la reivindicación 1, que
comprende un compuesto de fórmula (Ia), incluyendo tautómeros del
mismo:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
3. Complejo según la reivindicación 2, que
comprende un compuesto que tiene la estereoquímica tal como se
representa en la fórmula (Ib), incluyendo tautómeros del mismo
4. Complejo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, que comprende un compuesto en el que R es
un grupo alquenilo conjugado C_{1-20} de cadena
lineal o ramificada opcionalmente sustituido con grupos hidroxilo y
oxo; R' es un grupo alquilo C_{1-20} de cadena
lineal o ramificada opcionalmente sustituido con un grupo hidroxilo
y R'' es un grupo alquilo C_{1-20} de cadena
lineal o ramificada, incluyendo tautómeros del mismo.
5. Complejo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el compuesto que contiene
nitrógeno se selecciona del grupo que consiste en proteínas,
aminoácidos, péptidos, ácidos nucleicos y aminas aromáticas o
alifáticas.
6. Complejo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el compuesto de fórmula (I)
interacciona con la molécula orgánica en presencia de un
tensioactivo de modo que emite fluorescencia tras la
excitación.
7. Complejo según la reivindicación 6, en el
que el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en sales
de ácidos sulfónicos o ácidos grasos de cadena larga.
8. Compuesto según la fórmula (I):
en la que cada uno de R, R' y R''
es un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo alquilo,
alquenilo o alquinilo C_{1-20} de cadena lineal o
ramificada opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, grupos
hidroxilo y/u
oxo;
los anillos A, B y C están opcionalmente
sustituidos con uno o más átomos de halógeno; y los anillos A, B y
C incluyen opcionalmente uno o más dobles enlaces;
con la condición de que:
- (i)
- R\neqC(OH)CHC(O)(CH)_{6}CH(Et)(Me) cuando R'=CH_{2}OH, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a;
\global\parskip0.930000\baselineskip
- (ii)
- R\neq-C(OH)CHC(O)(CH)_{6}CH(Et)(Me) cuando R'=Me, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a;
- (iii)
- R\neq-C(OH)CHC(O)(CH)_{6}CH(Et)(Me) cuando R'=Me, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (iv)
- R\neq-C(O)(CH)_{4}Me cuando R'=n-propilo, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (v)
- R\neq-C(O)(CH)_{6}Me cuando R'=n-propilo, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (vi)
- R\neq-C(O)(CH)_{5}Me cuando R'=-(CH)_{2}Me, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6
- (vii)
- R\neq-C(O)(CH)_{6}Me cuando R'=-(CH)_{2}Me, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (viii)
- R\neq-(CH)_{2}C(Me)CHC(Me)(Et), cuando R'=-Ac, R''=Me, C4=C1, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (ix)
- R\neq-(CH)_{2}C(Me)CHC(Me)(Et), cuando R'=-Ac, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (x)
- R\neq-(CH)_{2}C(Me)CH-i-propilo cuando R'=-Ac, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (xi)
- R\neq-C(O)(CH)_{4}Me cuando R'=-(CH)_{2}Me, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (xii)
- R\neq-C(O)(CH)_{4}Me- cuando R'=n-propilo, R''=Me, el anillo A no incluye un doble enlace; y los anillos B y C incluyen dobles enlaces entre C8a y C4a y C5 y C6;
- (xiii)
- R\neq-C(O)(CH)_{4}Me cuando R'=n-propilo, R''=Me, los anillos A, B y C no incluyen dobles enlaces.
- (xiv)
- R\neq-C(O)(CH)_{6}Me cuando R' =-C(CH)_{2}Me, R''=Me, el anillo A no incluye un doble enlace; y los anillos B y C incluyen dobles enlaces entre C8a y C4a y C5 y C6;
- (xv)
- R\neq-C(O)(CH)_{4}Me cuando R'=C(CH)_{2}(Me), R''=Me, el anillo A no incluye un doble enlace; y los anillos B y C incluyen dobles enlaces entre C8 y C4a y C5 y C6;
- (xvi)
- R\neq-C(O)(CH)_{4}Me cuando R'=-(CH)_{2}Me, R''=Me, el anillo A no incluye un doble enlace; y los anillos B y C incluyen dobles enlaces entre C8a y C4a y C5 y C6;
- (xvii)
- R\neq-C(O)(CH_{2})_{4}Me cuando R'=-n-propilo, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (xviii)
- R\neq-C(O)(CH_{2})_{6}Me cuando R'=n-propilo, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (xix)
- R\neq-C(O)(CH_{2})_{5}Me cuando R'=-(CH)_{2}Me, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (xx)
- R\neq-C(O)(CH_{2})_{6}Me cuando R'=(CH)_{2}Me, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (xxi)
- R\neq-Ac cuando R'=(CH)_{2}C(Me)CHCH(Me)(Et), R''=Me, C4=C1, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
\global\parskip1.000000\baselineskip
- (xxii)
- R\neq-Ac cuando R'=(CH)_{2}C(Me)CHCH(Me)(Et), R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (xxiii)
- R\neq-Ac cuando R'=(CH)_{2}C(Me)CH-i-propilo, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (xxiv)
- R\neq-C(O)(CH_{2})_{4}Me cuando R'=(CH)_{2}Me, R''=Me, el anillo A incluye un doble enlace entre C3 y C3a; el anillo B incluye un doble enlace entre C4 y C4a; y el anillo C incluye un doble enlace entre C8 y C8a y C5 y C6;
- (xxv)
- R\neq-C(O)(CH_{2})_{4}Me cuando R'=-n-propilo, R''=Me, el anillo A no incluye un doble enlace; y los anillos B y C incluyen dobles enlaces entre C8a y C4a y C5 y C6;
- (xxvi)
- R\neq-C(O)(CH_{2})_{4}Me cuando R'=n-propilo, R''=Me, los anillos A, B y C no incluyen dobles enlaces.
- (xxvii)
- R\neq-C(O)(CH_{2})_{6}Me cuando R'=(CH)_{2}Me, R''=Me, el anillo A no incluye un doble enlace; y los anillos B y C incluyen dobles enlaces entre C8a y C4a y C5 y C6;
- (xxviii)
- R\neq-C(O)(CH_{2})_{4}Me cuando R'=C(CH_{2})(Me), R''=Me, el anillo A no incluye un doble enlace; y los anillos B y C incluyen dobles enlaces entre C8a y C4a y C5 y C6;
- (xxix)
- R\neq-C(O)(CH_{2})_{4}Me cuando R'=-(CH)_{2}Me, R''=Me, el anillo A no incluye un doble enlace; y los anillos B y C incluyen dobles enlaces entre C8a y C4a y C5 y C6, incluyendo tautómeros del mismo.
9. Compuesto según la reivindicación 8, según la
fórmula (Ia):
10. Compuesto según la reivindicación 9, que
tiene la estereoquímica tal como se representa en la fórmula
(Ib):
11. Compuesto según la fórmula (Ic), en la que R
es -C(OH)CHC(O)(CH)_{6}CH_{3}, R'
es -CH_{2}OH y R'' es Me siendo el compuesto
5,6-dihidro-3-[(1Z,4E,6E,8E)-1-hidroxi-3-oxo-1,4,6,8-decatetraenil]-6-hidroximetil-9a-metil-2H-furo[3,2-g][2]benzopiran-2-9(9aH)-diona
según la fórmula (Ic), incluyendo tautómeros del mismo:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
12. Compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 11, en el que el compuesto puede interaccionar
con una molécula orgánica que contiene nitrógeno de modo que emite
fluorescencia tras la excitación.
13. Complejo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 o compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 12, en los que el compuesto, cuando
interacciones con una molécula orgánica que contiene nitrógeno,
emite fluorescencia tras la excitación a longitudes de onda del
ultravioleta al azul.
14. Complejo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 o compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 12, en los que el compuesto, cuando
interacciona con una molécula orgánica que contiene nitrógeno,
emite fluorescencia cuando se excita mediante luz en el intervalo
de 300-560 nm.
15. Complejo o compuesto según la reivindicación
14, en los que la molécula orgánica es una proteína y el
compuesto, cuando interacciona con la proteína, emite fluorescencia
tras la excitación a 307 nm.
16. Complejo o compuesto según la reivindicación
14, en los que el compuesto emite fluorescencia cuando se excita
mediante luz a aproximadamente 400 nm, 488 nm y 514 nm.
17. Complejo o compuesto según la reivindicación
16, en los que el compuesto emite fluorescencia a aproximadamente
600 nm tras la excitación a 488 nm.
18. Composición que incluye un complejo o
compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, y
un vehículo analíticamente aceptable y opcionalmente un
fluorocromo.
19. Procedimiento para la preparación de un
compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, que
comprende cultivar una especie fúngica en condiciones tales que la
especie fúngica produce el compuesto, y separar el compuesto del
cultivo.
20. Uso de un compuesto según la fórmula
(I):
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
- \quad
- cada uno de R, R' y R'' es un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo C_{1-20} de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, grupos hidroxilo y/u oxo;
- \quad
- los anillos A, B y C incluyen opcionalmente uno o más dobles enlaces;
- \quad
- los anillos B y C están opcionalmente sustituidos con uno o más átomos de halógeno, incluyendo tautómeros de fórmula (I);
o un compuesto de fórmula (Ia), incluyendo
tautómeros del mismo:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o un compuesto que tiene la
estereoquímica tal como se representa en la fórmula (Ib),
incluyendo tautómeros del
mismo:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o un compuesto de fórmula (I), (Ia)
o (Ib), en las que R es un grupo alquenilo conjugado
C_{1-20} de cadena lineal o ramificada
opcionalmente sustituido con grupos hidroxilo y oxo; R' es un grupo
alquilo C_{1-20} de cadena lineal o ramificada
opcionalmente sustituido con un grupo hidroxilo y R'' es un grupo
alquilo C_{1-20} de cadena lineal o ramificada,
incluyendo tautómeros del mismo, o un compuesto según una
cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, como un colorante o
marcador fluorescente tras la interacción con una molécula orgánica
que contiene
nitrógeno.
21. Uso según la reivindicación 20, en una
técnica para teñir, marcar y/o detectar moléculas orgánicas.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
22. Uso de un compuesto según la fórmula
(I):
en la
que:
- \quad
- cada uno de R, R' y R'' es un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo C_{1-20} de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, grupos hidroxilo y/u oxo;
- \quad
- los anillos A, B y C incluyen opcionalmente uno o más dobles enlaces;
- \quad
- los anillos B y C están opcionalmente sustituidos con uno o más átomos de halógeno, incluyendo tautómeros de fórmula (I);
o un compuesto de fórmula (Ia), incluyendo
tautómeros del mismo:
o un compuesto que tiene la
estereoquímica tal como se representa en la fórmula (Ib),
incluyendo tautómeros del
mismo:
o un compuesto de fórmula (I), (Ia)
o (Ib), en las que R es un grupo alquenilo conjugado
C_{1-20} de cadena lineal o ramificada
opcionalmente sustituido con grupos hidroxilo y oxo; R' es un
grupo alquilo C_{1-20} de cadena lineal o
ramificada opcionalmente sustituido con un grupo hidroxilo y R''
es un grupo alquilo C_{1-20} de cadena lineal o
ramificada, incluyendo tautómeros del mismo, o un compuesto según
una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, para la formación de
un complejo con una molécula orgánica, en el que la molécula
orgánica es una molécula que contiene nitrógeno, y el complejo puede
emitir fluorescencia tras la
excitación.
23. Método para marcar fluorescentemente una
molécula orgánica que contiene nitrógeno, que comprende producir
un compuesto según la fórmula (I):
en la
que:
- \quad
- cada uno de R, R' y R'' es un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo C_{1-20} de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, grupos hidroxilo y/u oxo;
- \quad
- los anillos A, B y C incluyen opcionalmente uno o más dobles enlaces;
- \quad
- los anillos B y C están opcionalmente sustituidos con uno o más átomos de halógeno, incluyendo tautómeros de fórmula (I); o un compuesto de fórmula (Ia), incluyendo tautómeros del mismo:
o un compuesto que tiene la
estereoquímica tal como se representa en la fórmula (Ib),
incluyendo tautómeros del
mismo:
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
o un compuesto de fórmula (I), (Ia)
o (Ib), en las que R es un grupo alquenilo conjugado
C_{1-20} de cadena lineal o ramificada
opcionalmente sustituido con grupos hidroxilo y oxo; R' es un
grupo alquilo C_{1-20} de cadena lineal o
ramificada opcionalmente sustituido con un grupo hidroxilo y R''
es un grupo alquilo C_{1-20} de cadena lineal o
ramificada, incluyendo tautómeros del mismo, o un compuesto según
una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, para unirse a una
molécula orgánica que contiene nitrógeno de una manera tal que se
marca fluorescentemente la molécula orgánica con el
compuesto.
24. Complejo, compuesto, método, composición o
uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 13 a 15 y
19, en los que la molécula orgánica es una proteína, péptido,
azúcar, ácido nucleico, molécula de la superficie celular o
detergente, o está incluida en un anticuerpo o una célula.
25. Complejo, compuesto, composición, método o
uso según la reivindicación 24, en los que el compuesto está unido a
la molécula orgánica a través de una molécula conectora.
26. Método de detección de una molécula orgánica
que contiene nitrógeno en una muestra que incluye la molécula
orgánica, comprendiendo el método marcar la molécula orgánica según
el método de la reivindicación 23, y detectar la molécula orgánica
en la muestra monitorizando o detectando su fluorescencia.
27. Método según la reivindicación 26, en el que
la molécula orgánica marcada se detecta cuando la muestra se
expone a luz de un amplio intervalo de longitudes de onda,
preferiblemente longitudes de onda en el intervalo de
300-560 nm, más preferiblemente longitudes de onda
del ultravioleta al azul.
28. Método según la reivindicación 26 o la
reivindicación 27, en el que la monitorización o detección de la
fluorescencia de la molécula orgánica marcada es mediante
transiluminación, espectroscopia, microscopía o citome-
tría.
tría.
29. Composición que incluye:
(i) un compuesto según la fórmula (I)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
- \quad
- cada uno de R, R' y R'' es un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo C_{1-20} de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, grupos hidroxilo y/u oxo;
- \quad
- los anillos A, B y C incluyen opcionalmente uno o más dobles enlaces;
- \quad
- los anillos B y C están opcionalmente sustituidos con uno o más átomos de halógeno, incluyendo tautómeros de fórmula (I), y
(ii) una molécula orgánica,
en el que la molécula orgánica es
una molécula que contiene
nitrógeno,
en el que el compuesto interacciona
con una molécula orgánica de modo que emite fluorescencia tras la
excitación.
\newpage
30. Complejo que comprende un compuesto según la
fórmula (I):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
- \quad
- cada uno de R, R' y R'' es un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo C_{1-20} de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, grupos hidroxilo y/u oxo;
- \quad
- los anillos A, B y C incluyen opcionalmente uno o más dobles enlaces;
- \quad
- los anillos B y C están opcionalmente sustituidos con uno o más átomos de halógeno, incluyendo tautómeros de fórmula (I), y
una molécula inorgánica,
en el que la molécula inorgánica es
una molécula que contiene nitrógeno,
y
en el que el compuesto puede
interaccionar con la molécula inorgánica de modo que emite
fluorescencia tras la
excitación.
31. Complejo según la reivindicación 30, que
comprende un compuesto según la fórmula (Ia), incluyendo
tautómeros del mismo:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
32. Complejo según la reivindicación 31, en el
que el compuesto tiene la estereoquímica tal como se representa en
la fórmula (Ib), incluyendo tautómeros del mismo:
33. Complejo según una cualquiera de las
reivindicaciones 30 a 32, en el que R es un grupo alquenilo
conjugado C_{1-20} de cadena lineal o ramificada
opcionalmente sustituido con grupos hidroxilo y oxo; R' es un grupo
alquilo C_{1-20} de cadena lineal o ramificada
opcionalmente sustituido con un grupo hidroxilo y R'' es un grupo
alquilo C_{1-20} de cadena lineal o ramificada,
incluyendo tautómeros del mismo.
34. Complejo según la reivindicación 32 ó 33,
que comprende un compuesto en el que R es
-C(OH)CHC(O)(CH)_{6}
CH_{3}, R' es -CH_{2}OH y R'' es Me siendo el compuesto 5,6-dihidro-3-[(1Z,4E,6E,8E)-1-hidroxi-3-oxo-1,4,6,8-decatetraenil]-6-hidroximetil-9a-metil-2H-furo[3,2-g][2]benzopiran-2-9(9aH)-diona según la fórmula (Ic), incluyendo tautómeros del mismo:
CH_{3}, R' es -CH_{2}OH y R'' es Me siendo el compuesto 5,6-dihidro-3-[(1Z,4E,6E,8E)-1-hidroxi-3-oxo-1,4,6,8-decatetraenil]-6-hidroximetil-9a-metil-2H-furo[3,2-g][2]benzopiran-2-9(9aH)-diona según la fórmula (Ic), incluyendo tautómeros del mismo:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
35. Complejo según una cualquiera de las
reivindicaciones 30 a 34, en el que la molécula que contiene
nitrógeno se selecciona del grupo que consiste en amoniaco,
hidrazina e hidroxilamina, compuestos que contienen amoniaco,
compuestos que contienen hidrazina y compuestos que contienen
hidroxilamina.
36. Complejo según una cualquiera de las
reivindicaciones 30-35, en el que el compuesto
interacciona con la molécula inorgánica en presencia de un
tensioactivo de modo que emite fluorescencia tras la excitación a
un amplio intervalo de longitudes de onda.
37. Complejo según la reivindicación 36, en el
que el tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en sales
de ácidos sulfónicos y ácidos grasos de cadena larga.
38. Complejo según una cualquiera de las
reivindicaciones 30 a 37, en el que el compuesto, cuando
interacciona con una molécula inorgánica, emite fluorescencia tras
la excitación a longitudes de onda del ultravioleta al azul.
39. Complejo según una cualquiera de las
reivindicaciones 30-37, en el que el compuesto
emite fluorescencia cuando se excita mediante luz en el intervalo
de 300-560 nm.
40. Complejo según la reivindicación 39, en el
que el compuesto emite fluorescencia cuando se excita mediante luz
a aproximadamente 400 nm, 488 nm o 514 nm.
41. Complejo según la reivindicación 40, en el
que el compuesto emite fluorescencia a longitudes de onda del
visible tras la excitación a 488 nm.
42. Composición que incluye un complejo según
una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 41, un vehículo
analíticamente aceptable y opcionalmente, un fluorocromo.
43. Uso de un compuesto según la fórmula (I)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
como un colorante o marcador
fluorescente tras la interacción con una molécula
inorgánica
en el que:
- \quad
- halógenos, grupos hidroxilo y/u oxo;
- \quad
- los anillos A, B y C incluyen opcionalmente uno o más dobles enlaces;
- \quad
- los anillos B y C están opcionalmente sustituidos con uno o más átomos de halógeno, incluyendo tautómeros de fórmula (I).
46. Método según la reivindicación 45, en el que
la biomolécula se detecta cuando la muestra se expone a luz de un
amplio intervalo de longitudes de onda, preferiblemente longitudes
de onda en el intervalo de 300-560 nm, más
preferiblemente longitudes de onda del ultravioleta al azul.
47. Método según la reivindicación 45 o la
reivindicación 46, en el que la monitorización o detección de la
fluorescencia de la biomolécula es mediante transiluminación,
espectroscopia, microscopia o citometría.
48. Composición que incluye:
(i) un compuesto según la fórmula (I)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en el
que:
- \quad
- cada uno de R, R' y R'' es un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno o un grupo alquilo, alquenilo o alquenilo C_{1-20} de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con uno o más halógenos, grupos hidroxilo y/u oxo;
- \quad
- los anillos A, B y C incluyen opcionalmente uno o más dobles enlaces;
- \quad
- los anillos B y C están opcionalmente sustituidos con uno o más átomos de halógeno, incluyendo tautómeros de fórmula (I), y
(ii) una molécula inorgánica,
en la que la molécula inorgánica es
una molécula que contiene
nitrógeno;
en la que el compuesto puede
interaccionar con una molécula inorgánica de modo que emite
fluorescencia tras la
excitación.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPQ7117 | 2000-04-26 | ||
| AUPQ7117A AUPQ711700A0 (en) | 2000-04-26 | 2000-04-26 | Fluorescent compounds |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2295152T3 true ES2295152T3 (es) | 2008-04-16 |
Family
ID=3821207
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES01925207T Expired - Lifetime ES2295152T3 (es) | 2000-04-26 | 2001-04-26 | Compuestos fluorescentes. |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20030157518A1 (es) |
| EP (1) | EP1309598B1 (es) |
| JP (1) | JP2003533446A (es) |
| KR (1) | KR100855651B1 (es) |
| CN (1) | CN1255409C (es) |
| AT (1) | ATE377012T1 (es) |
| AU (1) | AUPQ711700A0 (es) |
| CA (1) | CA2407641A1 (es) |
| DE (1) | DE60131176T2 (es) |
| DK (1) | DK1309598T3 (es) |
| ES (1) | ES2295152T3 (es) |
| HK (1) | HK1055742A1 (es) |
| NZ (1) | NZ522291A (es) |
| WO (1) | WO2001081351A1 (es) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030077263A1 (en) * | 1999-10-29 | 2003-04-24 | Immunex Corporation | Method of activating dendritic cells |
| AUPQ711700A0 (en) | 2000-04-26 | 2000-05-18 | Macquarie Research Limited | Fluorescent compounds |
| AU2003901361A0 (en) | 2003-03-25 | 2003-04-10 | Fluorotechnics Pty Limited | Method of enhancing fluorescence |
| WO2007051256A1 (en) * | 2005-11-04 | 2007-05-10 | Fluorotechnics Pty Limited | Method for monitoring protein digestion |
| FR2894253B1 (fr) * | 2005-12-06 | 2009-11-13 | Pentax Corp | Composition d'histocolorant pour endoscope |
| FR2951721A1 (fr) | 2009-10-26 | 2011-04-29 | Univ Rouen | Procede de synthese d'analogues de l'epicocconone |
| CN110615777A (zh) * | 2019-08-19 | 2019-12-27 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 化合物及其制备方法和应用 |
| CN111808116B (zh) * | 2020-07-24 | 2023-04-07 | 西北农林科技大学 | 一种荧光类化合物及其制备方法与应用 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH606433A5 (es) | 1974-11-07 | 1978-10-31 | Nestle Sa | |
| US5013565A (en) * | 1990-08-03 | 1991-05-07 | Uop | Water-soluble red pigments from monascorubrin and rubropunctatin as food colorants |
| US6046022A (en) * | 1996-09-30 | 2000-04-04 | Peking University | Methods and compositions employing red rice fermentation products |
| AUPO470197A0 (en) * | 1997-01-21 | 1997-02-13 | Attfield, Paul Victor | Fluorescent dyes from microorganisms |
| AUPQ711700A0 (en) | 2000-04-26 | 2000-05-18 | Macquarie Research Limited | Fluorescent compounds |
| DE60125403T2 (de) | 2000-11-17 | 2007-10-11 | Ciba Speciality Chemicals Holding Inc. | Verfahren zur verbesserung der pigmentfluoreszenz |
| DE60232613D1 (de) | 2001-01-11 | 2009-07-30 | Tosoh Corp | Fluoreszierender Farbstoff und Verfahren zur Messung von Nukleinsäuren |
| AU2003901361A0 (en) * | 2003-03-25 | 2003-04-10 | Fluorotechnics Pty Limited | Method of enhancing fluorescence |
-
2000
- 2000-04-26 AU AUPQ7117A patent/AUPQ711700A0/en not_active Abandoned
-
2001
- 2001-04-26 EP EP01925207A patent/EP1309598B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-26 WO PCT/AU2001/000472 patent/WO2001081351A1/en active IP Right Grant
- 2001-04-26 ES ES01925207T patent/ES2295152T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-26 JP JP2001578440A patent/JP2003533446A/ja active Pending
- 2001-04-26 AT AT01925207T patent/ATE377012T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-04-26 CN CNB018085296A patent/CN1255409C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-04-26 US US10/258,310 patent/US20030157518A1/en not_active Abandoned
- 2001-04-26 DE DE60131176T patent/DE60131176T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-26 KR KR1020027014339A patent/KR100855651B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2001-04-26 CA CA002407641A patent/CA2407641A1/en not_active Abandoned
- 2001-04-26 NZ NZ522291A patent/NZ522291A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-04-26 DK DK01925207T patent/DK1309598T3/da active
-
2003
- 2003-11-10 HK HK03108140A patent/HK1055742A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-12-03 US US11/949,525 patent/US8114963B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1426415A (zh) | 2003-06-25 |
| HK1055742A1 (en) | 2004-01-21 |
| EP1309598A4 (en) | 2004-04-14 |
| US20080085993A1 (en) | 2008-04-10 |
| ATE377012T1 (de) | 2007-11-15 |
| WO2001081351A1 (en) | 2001-11-01 |
| CN1255409C (zh) | 2006-05-10 |
| AUPQ711700A0 (en) | 2000-05-18 |
| EP1309598B1 (en) | 2007-10-31 |
| KR100855651B1 (ko) | 2008-09-03 |
| JP2003533446A (ja) | 2003-11-11 |
| DE60131176D1 (de) | 2007-12-13 |
| KR20030016251A (ko) | 2003-02-26 |
| NZ522291A (en) | 2004-10-29 |
| DE60131176T2 (de) | 2008-08-07 |
| US20030157518A1 (en) | 2003-08-21 |
| US8114963B2 (en) | 2012-02-14 |
| EP1309598A1 (en) | 2003-05-14 |
| DK1309598T3 (da) | 2008-03-17 |
| CA2407641A1 (en) | 2001-11-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Fu et al. | Small-molecule fluorescent probes and their design | |
| Patonay et al. | Near-infrared fluorogenic labels: new approach to an old problem | |
| Papkovsky et al. | Emerging applications of phosphorescent metalloporphyrins | |
| Zhu et al. | Lysosome-targeting ratiometric fluorescent pH probes based on long-wavelength BODIPY | |
| US8114963B2 (en) | Fluorescent compounds | |
| Kim et al. | Far-red/near-infrared emitting, two-photon absorbing, and bio-stable amino-Si-pyronin dyes | |
| Shiraishi et al. | A BODIPY–indole conjugate as a colorimetric and fluorometric probe for selective fluoride anion detection | |
| CN102702768B (zh) | 一种新型红光bodipy荧光染料及其制备方法和应用 | |
| CN106317063B (zh) | 一种反应型汞离子荧光探针的制备与应用 | |
| WO2006001944A1 (en) | Substituted azaporphyrins as fluorescence labels | |
| CN103820104B (zh) | 一类以尼罗蓝为母体的近红外荧光探针、其制法及应用 | |
| KR101846075B1 (ko) | 선형 업컨버전 형광 특성을 이용한 생체물질 검출 방법 | |
| Wei et al. | Engineering a lipid droplet targeting fluorescent probe with a large Stokes shift through ester substituent rotation for in vivo tumor imaging | |
| Sousa et al. | Solvent polarity and pH effects on the spectroscopic properties of neutral red: application to lysosomal microenvironment probing in living cells | |
| CN110642882B (zh) | 一种兼具双氧水检测和光动力杀伤癌细胞活性的荧光探针及其制备方法和应用 | |
| Zhu et al. | Dual sites fluorescence probe for hydrogen sulfide: AIEE activity and supramolecular assembly with β-cyclodextrin | |
| Havlík et al. | Versatile fluorophores for bioimaging applications: π-expanded naphthalimide derivatives with skeletal and appendage diversity | |
| CN104650610A (zh) | 一种不对称近红外bodipy荧光染料及其制备和应用 | |
| Feng et al. | Turn-on fluorescent probes that can light up endogenous RNA in nucleoli and cytoplasm of living cells under a two-photon microscope | |
| CN103710021A (zh) | 以硝基苯并咪唑为rna识别基团的荧光染料、其制备方法及应用 | |
| CN106518925B (zh) | 靶向线粒体苝酐荧光探针及其应用 | |
| AU2001252032B2 (en) | Fluorescent compounds | |
| AU3038001A (en) | Detection reagent | |
| Ding et al. | Diaminomaleonitrile-functionalised schiff bases: synthesis, solvatochromism, and lysosome-specific imaging | |
| WO2022027174A1 (zh) | 一种细胞核荧光染料及其染色方法 |