CN112557354A - 一类具有荧光特性的苯并萘啶类化合物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类具有荧光特性的苯并萘啶类化合物的用途；所述苯并萘啶类生物碱苯可用作荧光染色剂，其结构通式为：

其中，R₁为氨基或‑NR_a，R_a为C1‑C4烷基、C1‑C4酰基或‑SO₃H；R₂为C1‑C4烷基、C1‑C4酰基或‑SO₃H；R₃选自羰基或

R_b选自氢原子、C1‑C4烷基、C1‑C4酰基或‑SO₃H。本发明首次发现其具有荧光强度高、斯托克斯位移大等优点，同时对真核细胞的毒性低，因此可以作为一类新的有机小分子探针的荧光团。荧光染色实验表明，苯并萘啶类化合物可以将原核生物进行荧光染色，如链霉菌；也可以将真核生物进行荧光染色，如人肿瘤细胞，同时不影响其生长。

Description

一类具有荧光特性的苯并萘啶类化合物的用途

技术领域

本发明涉及天然药物化学，更具体地说，涉及一类具有荧光特性的苯并萘啶类化合物的用途。

背景技术

由于利用荧光分析检测各种离子或者分子具有较高的敏感性，良好的选择性，响应快速，通量高的特点，现已广泛应用于生物学、生物技术、分子识别、临床诊断和生命科学等领域。近几年小分子荧光探针已成为监控活细胞中生理过程的重要手段。

发明内容

本发明首次发现一类白浅灰链霉菌来源的苯并萘啶类生物碱具有荧光特性；因此，本发明的目的正是在于提供一类具有荧光特性的苯并萘啶类化合物的用途。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种苯并萘啶类生物碱在作为荧光染色剂中的用途，所述苯并萘啶类生物碱的结构通式如下式(Ⅰ)所示：

(Ⅰ)；其中，R₁为氨基或-NR_a，R_a为C1-C4烷基、C1-C4酰基或-SO₃H；R₂为C1-C4烷基、C1-C4酰基或-SO₃H；R₃选自羰基或

R_b选自氢原子、C1-C4烷基、C1-C4酰基或-SO₃H。

优选的，所述R₁选自-NHCH₃或-NHCH₂CH₃；所述R₂选自甲基或乙基；R₃为

或

R₄为C1-C4烷基。

优选的，所述苯并萘啶类生物碱具有如式(Ⅱ)所示的结构：

(Ⅱ)。

优选的，所述苯并萘啶类生物碱是从红树林来源的白浅灰链霉菌Streptomycesalbogriseolus中提取、分离而得。

优选的，所述苯并萘啶类生物碱用于在可见光和/或近红外光谱区标记生物分子。

优选的，所述生物分子为蛋白质或核酸分子。

优选的，所述苯并萘啶类生物碱用于对肿瘤细胞或微生物细胞进行荧光染色。

本发明还涉及一种上述苯并萘啶类生物碱在用于荧光传感器中的用途。

所述荧光传感器依托所述苯并萘啶类生物碱具有的荧光染色特性来实现其功能。

所述荧光传感器中苯并萘啶类生物碱用于在可见光和/或近红外光谱区标记生物分子，或是用于对肿瘤细胞或微生物细胞进行荧光染色。

本发明还涉及一种包含上述苯并萘啶类生物碱的荧光检测试剂盒。

所述荧光检测试剂盒依托所述苯并萘啶类生物碱具有的荧光染色特性来实现荧光测试。

所述荧光检测试剂盒中苯并萘啶类生物碱用于在可见光和/或近红外光谱区标记生物分子，或是用于对肿瘤细胞或微生物细胞进行荧光染色。

本发明还涉及一种细胞荧光示踪染料的方法，所述方法中采用的荧光染色剂为上述苯并萘啶类生物碱；所述方法包括如下步骤：

S1、接种细胞进行细胞的常规培养；

S2、加入含本发明的苯并萘啶类生物碱10～30μM的DMSO溶液共培养；

S3、24～48小时后，弃去细胞培养上清液，在荧光共聚焦显微镜下观察细胞的染色情况。

所述细胞荧光示踪染料的方法依托所述苯并萘啶类生物碱具有的荧光染色特性来完成。

所述方法中采用苯并萘啶类生物碱在可见光和/或近红外光谱区标记生物分子，或是采用苯并萘啶类生物碱对肿瘤细胞或微生物细胞进行荧光染色。

与现有技术相比，本发明的苯并萘啶类化合物来源于本实验室从红树林土壤中分离得到的白浅灰链霉菌Streptomyces albogriseolus，本发明首次发现其具有荧光强度高、斯托克斯位移大等优点，同时对真核细胞的毒性低，因此可以作为一类新的有机小分子探针的荧光团。荧光染色实验表明，苯并萘啶类化合物可以将原核生物进行荧光染色，如链霉菌；也可以将真核生物进行荧光染色，如人肿瘤细胞，同时不影响其生长。现有的已知小分子荧光探针，如香豆素、罗丹明、喹啉、萘酰亚胺、酞氰染料及氟硼类化合物，苯并萘啶类化合物可以作为一类新的结构类型，进一步发展为荧光传感器，其用途将非常广泛。苯并f[1,7]萘啶类母核曾被用于小分子免疫增强剂，用于治疗病毒性出血热性疾病，该类型小分子作为疫苗佐剂，专利PCT：WO2010/144734 A1；WO2011/084549 A1；WO2011/130379 A1，未见有荧光特性的报道。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为苯并萘啶类化合物在溶剂中的激发-发射光谱图；其中，1为发射光，2为激发光；

图2为白浅灰链霉菌自身的荧光特性示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

苯并萘啶类生物碱(结构式Ⅱ)的化合物1的提取分离

接种红树林来源白浅灰链霉菌Streptomyces albogriseolusMGR072孢子悬液于500mL的三角瓶中，28℃,200rpm培养36h作为种子液；以10％的接种量于30L液体振荡培养，初始pH为7.2～7.4，28℃培养一周；离心收集菌体，乙酸乙酯：甲醇：甲酸＝80:15:5(V:V:V)的萃取液重复浸泡萃取5次，浓缩蒸干得浸膏，得到的褐色浸膏即为粗提物。

粗提物采用乙酸乙酯：水＝1:1(V:V)两相系统进行萃取，弃去水相，得到的乙酸乙酯相继续浓缩蒸干，采用石油醚：甲醇＝1:1(V:V)两相系统进行萃取，即得粗品(2g)。粗品(2g)用适量的甲醇溶解后经中压液相反相硅胶(RP-18，170g)柱层析，分别用30％甲醇-水系统洗脱，浓缩合并后经凝胶柱(Sephadex LH-20)层析，甲醇洗脱。经TLC检测，然后经正相硅胶柱层析，石油醚：乙酸乙酯(20:1)洗脱得到化合物1(2.0mg)。

苯并萘啶类生物碱(结构式Ⅱ)的化合物1的结构信息

结构式Ⅱ黄色无定型粉末；

(c 0.0017,MeOH)；UVλ_max(MeOH)250,380,525nm；CD(MeOH):Δε₁₉₅+0.6,Δε₂₀₁-0.6,Δε₂₀₅+0.3,Δε₂₂₀+0.4,Δε₂₂₇+0.3,Δε₂₃₁-0.1,Δε₂₃₇+0.4,Δε₂₄₉ 0.2；IR(KBr)ν_max 3427,2927,1609,1562,1415,1350,1257,762,615cm^-1；¹Hand ¹³C NMR data,see Table 1；ESIMS m/z 451.2[M+H]⁺；HRESIMS m/z 451.2043[M+H]⁺,(calcd for C₂₄H₂₇N₄O₅,m/z 451.1981),449.1622[M-H]^-,(calcd for C₂₄H₂₅N₄O₅,m/z449.1825)；HPLC-ESI-MS/MS m/z 473.1745[M+Na]⁺,923.3739[2M+Na]⁺,238.0986,223.0740,212.0804,210.0839,195.0789,184.0596,181.0752,169.0764.

表1

表1信号归属基于DEPT、PFG ¹H-¹H COSY、PFG HMQC及PFG HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)表示。

实施例2、苯并萘啶类化合物的荧光特性表征

化合物1在日光下呈现明亮的黄绿色。在甲醇溶液中，测定化合物1的荧光光谱，如图1所示。最大激发光在394nm,最大发射光在509nm。对于苯并萘啶类化合物的产生菌红树林来源白浅灰链霉菌Streptomyces albogriseolus由于能够产生该类强荧光性的化合物，而变成一株绿色的荧光链霉菌，如图2所示。

实施例3、苯并萘啶类化合物的荧光染色

步骤1.细胞培养

根据细胞培养条件要求，配置完全细胞培养基。配方为按V/V比例DMEM培养液中加入10％FBS和1％青链霉素双抗。细胞置于37℃、5％CO2人工细胞培养箱中培养，细胞传代时用0.25％胰蛋白酶消化，加完全培养基培养终止消化后吹打均匀，按合适比例稀释传代。

步骤2.种细胞

在六孔板每孔中先放入已灭菌的盖玻片，将消化好的两种肝癌细胞MHCC-97H和SK-Hep1细胞均匀的铺在孔板里(2mL/孔)，每孔接种8000-10000个细胞，在37℃、5％CO2人工细胞培养箱中培养过夜。

步骤3.加药

过夜后显微镜下观察细胞是否基本贴壁。化合物I母液浓度为10nM，取15μL 1-36母液于15mL培养液中，振荡均匀后，吸走孔内原有培养液，再加入含药培养液2mL/孔，即保证每孔内药物浓度为10μM。继续置于37℃、5％CO2人工细胞培养箱中培养。

步骤4.玻片处理

分别在培养24h、48h和96h后进行玻片处理。以下各步骤均要保证不可以使玻片干燥。显微镜下观察细胞生长情况。吸走孔内原有培养液，1mL PBS漂洗两次，去掉培养基和死细胞。加1mL。4％多聚甲醛固定10-15min。吸走固定液，再用1mL PBS漂洗两次。在载玻片板中央涂上封片液，用镊子取出盖玻片倒扣在载玻片上(细胞面应朝下)。

步骤5.荧光观察

荧光显微镜下进行观察；发现肿瘤细胞被染色能够检测到绿色荧光。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (8)

1.一种苯并萘啶类生物碱在作为荧光染色剂中的用途，其特征在于，所述苯并萘啶类生物碱的结构通式如下式(Ⅰ)所示：

其中，R₁为氨基或-NR_a，R_a为C1-C4烷基、C1-C4酰基或-SO₃H；R₂为C1-C4烷基、C1-C4酰基或-SO₃H；R₃选自羰基或

R_b选自氢原子、C1-C4烷基、C1-C4酰基或-SO₃H。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述R₁选自-NHCH₃或-NHCH₂CH₃；所述R₂选自甲基或乙基；R₃为

R₄为C1-C4烷基。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述苯并萘啶类生物碱具有如式(Ⅱ)所示的结构：

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述苯并萘啶类生物碱用于在可见光和/或近红外光谱区标记生物分子。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述苯并萘啶类生物碱用于对肿瘤细胞或微生物细胞进行荧光染色。

6.一种苯并萘啶类生物碱在用于荧光传感器中的用途，其特征在于，所述苯并萘啶类生物碱为如权利要求1所述用途中的苯并萘啶类生物碱。

7.一种包含苯并萘啶类生物碱的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述苯并萘啶类生物碱为如权利要求1所述用途中的苯并萘啶类生物碱。

8.一种细胞荧光示踪染料的方法，其特征在于，所述方法中采用的荧光染色剂为如权利要求1所述用途中的苯并萘啶类生物碱，所述方法包括如下步骤：

S1、接种细胞进行细胞的常规培养；

S2、加入所述的苯并萘啶类生物碱10～30μM的DMSO溶液共培养；

S3、24～48小时后，弃去细胞培养上清液，在荧光共聚焦显微镜下观察细胞的染色情况。

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