CN111675919B - Pcp及其在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Pcp及其在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111675919B
CN111675919B CN202010517107.9A CN202010517107A CN111675919B CN 111675919 B CN111675919 B CN 111675919B CN 202010517107 A CN202010517107 A CN 202010517107A CN 111675919 B CN111675919 B CN 111675919B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pcp
cells
colorectal cancer
hct116
bis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010517107.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111675919A (zh
Inventor
汤昆
张磊
张付利
常海波
王春丽
刘芳艳
邹娅欣
王子健
魏义渠
杜雅音
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan University
Original Assignee
Henan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan University filed Critical Henan University
Priority to CN202010517107.9A priority Critical patent/CN111675919B/zh
Publication of CN111675919A publication Critical patent/CN111675919A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111675919B publication Critical patent/CN111675919B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
    • C09B23/08—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups more than three >CH- groups, e.g. polycarbocyanines
    • C09B23/083—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups more than three >CH- groups, e.g. polycarbocyanines five >CH- groups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/08—Indoles; Hydrogenated indoles with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, directly attached to carbon atoms of the hetero ring

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明属于化工医药技术领域，涉及1,5‑二[N‑(3,5‑二(2‑(2‑甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)苄基‑2,3,3‑三甲基‑3H‑吲哚]五碳菁溴化盐染料(简称PCP)在制备抗肿瘤药物中的应用。MTT结果显示：PCP能显著抑制结直肠癌细胞系HCT116和SW480细胞活力。可用于制备抗肿瘤药物。本发明的化合物PCP作为新型抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑制肿瘤效果显著，将为治疗和治愈肿瘤提供新的治疗途径和手段。

Description

PCP及其在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于化工医药技术领域，具体涉及一种新型五甲川花菁染料PCP在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
结直肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率与死亡率近年来不断上升，现分别居全球癌症发病率和死亡率的3位和第2位。随着诊疗新技术的应用和化疗药物的不断更新，结直肠癌患者的预后得到了极大的改善，但患者总生存率并没有得到显著提高。到目前为止，对于结直肠癌的治疗，虽然有中医药辅助治疗等多种手段，但仍以手术、化疗治疗为主。手术治疗对病人身体有较大程度的损伤，而且肿瘤的进展分期也决定着手术的可行性。目前的化疗药物也存在不同程度的副作用。因此，开发新的结直肠癌治疗药物仍然是众多科研工作者的首要任务。
菁染料具有易于合成、荧光效果好、发射光谱范围可调、便于与生物分子结合等诸多优点,被广泛应用于活体生物细胞标记中。其中花菁染料在医学领域可用于基因探测、蛋白检测、荧光探针等方面。但随着生物技术发展，已合成花菁染料不能满足应用需求。因此，研究开发新型花菁染料对于生物医学领域意义重大。新型五甲川花菁染料PCP设计合成与其在制备抗肿瘤药物中的应用为本课题组首次研究，并且实验发现此化合物具有治疗结直肠癌的潜能，目前没有关于该化合物相关抗肿瘤活性的研究。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种新型花菁染料作为药物的新用途，具体为PCP在制备抗肿瘤药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：新型五甲川花菁染料PCP在制备抗肿瘤药物中的应用，所述PCP的化学结构如下所示：
Figure GDA0003209793360000021
其相关性质如下：
化学名称：1,5-二[N-(3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)苄基-3,3-二甲基-3H-吲哚]二碳菁溴化盐染料(简称PCP)。
分子式：C67H95N2O16；分子量：1184.48；检测方式：1HNMR、13C NMR和ESI-MS；性状：蓝色固体；来源：本实验室合成。药理性质：溶于水。
进一步的，所述PCP的作用浓度为0.20-50μM。
本发明提供了一种体外抑制肿瘤细胞活力的方法，将PCP加入肿瘤细胞的培养液中，加入PCP的终浓度为0.20-50μM；所述肿瘤细胞是结直肠癌细胞系HCT116和SW480。
本发明提供了一种抗结直肠癌药物,该药物能够进入肿瘤细胞并定位到线粒体上；所述肿瘤细胞是结直肠癌细胞系HCT116和SW480。
本发明还提供了一种抗结直肠癌药物，该抗结直肠癌药物的活性成分为PCP。
本发明的有益效果。
本发明提供了PCP在制备抗肿瘤药物中的应用。MTT结果显示：PCP能剂量依赖地抑制结直肠癌HCT116和SW480细胞的增殖。平板克隆试验结果显示：PCP显著抑制人结直肠癌细胞系HCT116和SW480细胞集落生长，并呈现浓度依赖性。PCP的亚细胞定位结果显示：该化合物可进入肿瘤细胞并且定位到线粒体上。活性氧检测结果显示：本发明的小分子化合物能够引起细胞活性氧的产生。本发明的小分子化合物PCP作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，其作用浓度小，抑制肿瘤效果显著，将为治疗和治愈肿瘤提供新的治疗途径和手段。
附图说明
图1.PCP结构鉴定1H NMR(a)、13C NMR(b)和ESI-MS(c)数据。A 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)spectrum of PCP；B13C NMR(100MHz,DMSO-d6)spectrum of PCP；C ESI-MS ofPCP。
图2.PCP对结直肠癌HCT116细胞增殖的影响。A为不同浓度PCP干预后，细胞相对存活率结果；B-K分别为浓度为0μM、0.20μM、0.39μM、0.78μM、1.56μM、3.12μM、6.25μM、12.50μM、25μM、50μM的PCP干预后细胞形态及数量结果。*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。
图3.PCP对结直肠癌SW480细胞增殖的影响。A为不同浓度PCP干预后，细胞相对存活率结果；B-K分别为浓度为0μM、0.20μM、0.39μM、0.78μM、1.56μM、3.12μM、6.25μM、12.50μM、25μM、50μM的PCP干预后细胞形态及数量结果。*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。
图4.PCP抑制结直肠癌HCT116和SW480细胞增殖的平板克隆试验。A为浓度分别为0μM、0.78μM、1.56μM、3.12μM、6.25μM、12.50μM的PCP抑制结直肠癌HCT116细胞增殖的平板克隆试验；B为浓度分别为0μM、0.78μM、1.56μM、3.12μM、6.25μM、12.50μM的PCP抑制结直肠癌SW480细胞增殖的平板克隆试验。
图5.PCP在HCT116和SW480结直肠癌细胞中的亚细胞定位。A为PCP在HCT116结直肠癌细胞中的亚细胞定位；B为PCP在SW480结直肠癌细胞中的亚细胞定位。
图6.PCP在HCT116和SW480结直肠癌细胞中活性氧的测定。A为浓度分别为0μM、3.12μM、6.25μM、12.50μM的PCP引起HCT116细胞活性氧的产生情况；B为浓度分别为0μM、3.12μM、6.25μM、12.50μM的PCP引起SW480细胞活性氧的产生情况。
具体实施方式
为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作出进一步的说明，但所述实施旨在解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实验方法。
应用实例1.PCP合成与结构鉴定。
PCP按照如下路线合成。
Figure GDA0003209793360000041
向50mL二口圆底烧瓶中加入丙二醛双苯亚胺盐酸盐(130.7mg，0.46mmol，1.0eq)，化合物3(526.7mg，0.92mmol，2.0eq)，除氧30min，加入除氧的冰乙酸5mL和乙酸酐5mL，搅拌10min，氩气保护下110℃反应3h。TLC监控反应结束，冷却至室温，旋蒸除去溶剂得粗品。粗品经柱层析(200-300目硅胶，流动相:甲醇：二氯甲烷＝1:20)分离得蓝色固体化合物PCP：186.0mg，产率：33.5％。
1H NMR(400MHZ,DMSO-d6)δ8.39(t,J＝14.0Hz,2H),7.67(d,J＝7.6Hz,2H),7.35(m,4H),7.25(m,2H),6.51-6.38(m,9H),5.30(s,4H),4.01(m,8H),3.67(m,8H),3.52-3.46(m,24H),3.39-3.35(m,8H),3.20(s,12H),1.73(s,12H)；13C NMR(100MHZ,DMSO-d6)δ173.44,160.05,154.86,142.17,140.96,137.41,128.54,126.17,124.97,122.59,111.34,105.34,103.88,99.87,71.27,69.91,69.77,69.59,68.79,67.25,58.03,49.08,46.50,27.27；MS(ESI):calcd for[M]+1184.48,found 1183.73。PCP结构鉴定1H NMR(A)、13C NMR(B)和ESI-MS(C)图谱如图1，A 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)spectrum of PCP；B13C NMR(100MHz,DMSO-d6)spectrum of PCP；C ESI-MS of PCP。
应用实例2.MTT法测定PCP对结直肠癌细胞系HCT116和SW480细胞活力的抑制作用。
HCT116和SW480细胞按3×103/孔接种至96孔板，应用含5％CO2、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640完全培养基37℃培养24h，加入不同浓度(分别为0.78μM、1.56μM、3.12μM、6.25μM、12.50μM)的PCP，每个浓度设定5个复孔，药物作用48h后，弃培养液，MTT试剂测定细胞活力。
测定方法为：15μL/孔加入预先配制好的MTT反应液，继续培养4h，吸弃上清，100μL/孔加入DMSO溶解还原产物，避光反应5min，490nm波长处读取吸光度值，计算细胞活力，以测定PCP干预孔吸光度值/对照孔吸光度值作为细胞活力。
IC50指细胞生长被抑制一半时抑制剂的浓度。这里即为结直肠癌细胞系HCT116和SW480细胞数量分别为对照组一半时PCP的浓度。
结果：PCP对结直肠癌HCT116和SW480细胞的IC50值为6.25μM。图2：PCP抑制结直肠癌HCT116细胞活力的测定；图3：PCP抑制结直肠癌SW480细胞活力的测定。其中A为不同浓度PCP干预后，细胞相对存活率结果；B-K为浓度分别为0μM、0.20μM、0.39μM、0.78μM、1.56μM、3.12μM、6.25μM、12.50μM、25μM、50μM的PCP干预后细胞形态及数量结果。*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。
应用实例3.利用平板克隆试验验证PCP对结直肠癌细胞系HCT116和SW480细胞增殖的抑制作用。
HCT116和SW480细胞按500/孔接种至6孔板，应用含5％CO2、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640完全培养基37℃培养24h，加入不同浓度(分别为0μM、0.78μM、1.56μM、3.12μM、6.25μM、12.50μM)的PCP，药物作用48h后，弃去含有PCP的培养基，加入不含PCP的培养基培养14d后用1％的结晶紫染色液对细胞集落进行染色，双蒸水洗去染液后晾干。
结果：PCP作用48h后能显著抑制HCT116和SW480细胞克隆生长，由单个细胞生成细胞集落的大小和数量与PCP浓度呈负相关。见图4：其中A：PCP抑制结直肠癌HCT116细胞增殖的平板克隆试验。B:PCP抑制结直肠癌SW480细胞增殖的平板克隆试验。PCP浓度分别为0μM、0.78μM、1.56μM、3.12μM、6.25μM、12.50μM的PCP培养HCT116和SW480细胞2d后对细胞增殖的干预情况。
应用实例4.PCP在HCT116和SW480结直肠癌细胞中的亚细胞定位。
HCT116和SW480细胞按0.7*105的密度铺于20ml小皿，应用含5％CO2、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640完全培养基37℃培养24h，加入20μM的PCP，药物作用2h后，吸弃上清，使用Mito-Tracker Green(线粒体绿色荧光探针)对线粒体进行特异性荧光染色、使用DAPI染液对细胞核进行特异性染色，在激光扫描共聚焦显微镜下观察PCP进入细胞情况以及在细胞中亚定位。
结果：见图5：20μM的PCP作用2h后进入HCT116和SW480细胞，并且定位到线粒体上。其中A为PCP在HCT116结直肠癌细胞中的亚细胞定位；B为PCP在SW480结直肠癌细胞中的亚细胞定位。蓝光为细胞核DAPI染色，绿光为线粒体Mito-Tracker Green染色，红光为PCP自身荧光,Bright Fielda为白光视野。
应用实例5.PCP在HCT116和SW480结直肠癌细胞中活性氧的测定。
HCT116和SW480细胞按0.6*105/孔接种至6孔板，应用含5％CO2、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640完全培养基37℃培养24h，加入不同浓度(分别为0μM、3.12μM、6.25μM、12.50μM)的PCP，药物作用48h后，吸弃上清，每孔加入培养基稀释1000倍的DCFH-DA活性氧荧光探针1mL,37℃培养箱20min后用无血清培养基洗涤三次，使用荧光显微镜直接观察活性氧产生水平。
结果:PCP在HCT116和SW480结直肠癌细胞中引起活性氧的产生，活性氧的量与PCP浓度呈正相关。见图6：A：PCP引起HCT116细胞活性氧的产生；B：PCP引起SW480细胞活性氧的产生。PCP浓度分别为0μM、3.12μM、6.25μM、12.50μM时，活性氧的产生呈现浓度依赖性。Bright Field为相应的白光视野。

Claims (6)

1.1,5-二[N-(3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)苄基-3,3-二甲基-3H-吲哚]二碳菁溴化盐染料，其特征在于，染料简称为PCP；所述PCP的化学结构如下所示:
Figure FDA0003323538550000011
2.权利要求1所述的化合物1,5-二[N-(3,5-二(2-(2-甲氧乙氧基)乙氧基)乙氧基)苄基-3,3-二甲基-3H-吲哚]二碳菁溴化盐染料在制备抗肿瘤药物中的应用。
3.如权利要求2所述的PCP在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述PCP抑制结直肠癌细胞系HCT116和SW480细胞活力。
4.如权利要求3所述的PCP在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述PCP抑制癌细胞的作用浓度为0.20-50μM。
5.如权利要求2所述的PCP在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，PCP能够进入细胞并且定位到线粒体上，通过作用于线粒体发挥抗肿瘤作用。
6.如权利要求2所述的PCP在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，PCP通过产生活性氧发挥抗肿瘤作用。
CN202010517107.9A 2020-06-09 2020-06-09 Pcp及其在制备抗肿瘤药物中的应用 Active CN111675919B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010517107.9A CN111675919B (zh) 2020-06-09 2020-06-09 Pcp及其在制备抗肿瘤药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010517107.9A CN111675919B (zh) 2020-06-09 2020-06-09 Pcp及其在制备抗肿瘤药物中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111675919A CN111675919A (zh) 2020-09-18
CN111675919B true CN111675919B (zh) 2021-12-10

Family

ID=72454133

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010517107.9A Active CN111675919B (zh) 2020-06-09 2020-06-09 Pcp及其在制备抗肿瘤药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111675919B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113736281B (zh) * 2021-09-07 2022-09-30 河南大学 Cy7-Cl及其在制备抗结直肠癌药物中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103073909A (zh) * 2013-01-30 2013-05-01 河南大学 水溶性不对称吲哚菁荧光染料及其制备方法
CN109833485A (zh) * 2017-11-28 2019-06-04 深圳先进技术研究院 一种肿瘤线粒体靶向磁纳米探针及其制备方法及应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103073909A (zh) * 2013-01-30 2013-05-01 河南大学 水溶性不对称吲哚菁荧光染料及其制备方法
CN109833485A (zh) * 2017-11-28 2019-06-04 深圳先进技术研究院 一种肿瘤线粒体靶向磁纳米探针及其制备方法及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
吲哚菁绿纳米颗粒在癌症诊断和治疗中的应用;郑明彬等;《生物化学与生物物理进展》;20131026(第10期);第971-976页 *
新型水溶性不对称五甲川吲哚菁染料的合成、荧光性能及荧光标记;汤昆等;《应用化学》;20141130;第31卷(第11期);第1255-1260页 *
汤昆等.新型水溶性不对称五甲川吲哚菁染料的合成、荧光性能及荧光标记.《应用化学》.2014,第31卷(第11期), *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111675919A (zh) 2020-09-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113444035B (zh) 一类具有抗癌作用的萘基脲类化合物及其制备方法和应用
CN111559991B (zh) 一种萘胺类化合物及其盐的制备方法和应用
CN101715452A (zh) 氮杂吲哚-吲哚偶联衍生物及其制备和用途
CN104829596B (zh) 吡咯取代吲哚酮类衍生物、其制备方法、包含该衍生物的组合物、及其用途
CN111592482B (zh) 一种pH可逆激活型光热/光动力/荧光一体化探针分子
CN111675919B (zh) Pcp及其在制备抗肿瘤药物中的应用
CN111377975A (zh) 一种新的靶向线粒体的铱配合物及其制备方法和应用
WO2018086242A1 (zh) pH敏感的轴向取代硅酞菁配合物及其制备方法和在医药上的应用
CN106588946B (zh) 10-羟基喜树碱衍生物、合成方法及其应用
CN108727437A (zh) 一类姜黄素芳基金属配合物及其合成方法和应用
CN111196922B (zh) pH敏感型β-咔啉衍生物荧光探针在肿瘤荧光成像中的应用
CN111675921B (zh) Cypy及其在制备抗肿瘤药物中的应用
CN111574499B (zh) Cy5-650及其在制备抗肿瘤药物中的应用
CN113354583B (zh) 用于检测乏氧水平的荧光探针、其制备方法及其应用
CN111393482B (zh) 一种铂-铱异核金属配合物及其制备方法和应用
CN111675920B (zh) Pcps及其在制备抗肿瘤药物中的应用
CN111635350B (zh) Pcpc及其在制备抗肿瘤药物中的应用
CN113149980A (zh) 一类靶向puf60的叔丁氧羰基类小分子有机化合物及其衍生物及其应用
WO2023097854A1 (zh) 一种具有荧光活性的7-乙基-10-羟基喜树碱药物前体及其制备方法和应用
CN113736281B (zh) Cy7-Cl及其在制备抗结直肠癌药物中的应用
CN112300235B (zh) 一种苯并咪唑衍生物bi321及其制备方法和应用
CN112557354B (zh) 一类具有荧光特性的苯并萘啶类化合物的用途
CN115403503B (zh) 七甲川花菁素类染料偶联物、制法、药物组合物和应用
CN112375112B (zh) 一种苯并咪唑衍生物bi361及其制备方法和应用
CN109438525B (zh) 具有化疗和光疗抗肿瘤作用的化合物及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant