CN113149980A - 一类靶向puf60的叔丁氧羰基类小分子有机化合物及其衍生物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类叔丁氧羰基类小分子有机化合物或其相关类似物或药学上可接受的盐，其结构如式(I)‑(V)所示。本发明还公开了所述叔丁氧羰基类小分子有机化合物或其药物组合物在制备预防和/或治疗各种恶性肿瘤等药物中的用途，作为PUF60的抑制剂在制备预防和/或治疗PUF60介导的疾病药物中的用途。本发明还首次创新提出所述叔丁氧羰基类小分子有机化合物或其药物组合物靶向PUF60在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一类靶向PUF60叔丁氧羰基类小分子有机化合物及其衍生物，以及该类化合物或含有该类化合物的药物组合物在制备治疗各种恶性肿瘤生长、转移、复发以及肿瘤耐药的相关疾病的药物中的应用。
背景技术
卵巢癌(Ovarian cancer，OC)是世界范围内女性癌症死亡的第二位原因(1)。过去的三十年来，几乎所有肿瘤的5年生存率增长约20％，卵巢癌却未发生明显变化，5年生存率依旧低于45％(2-3)。卵巢癌在诊断时常常处于晚期，并且病因和病理不清，尽管细胞减灭术和基于铂的化学疗法仍然是卵巢癌治疗的金标准，但卵巢癌的复发率仍然很高。超过80％的患者对一线化疗有反应；然而，大约 70％的晚期上皮性卵巢癌患者会在5年内复发并出现耐药性。因此深入研究卵巢癌发展的具体机制，并且有针对性地寻找出新的治疗靶点，具有十分重要的科学意义和应用价值。
据文献报道，在卵巢癌中，基因组拷贝数变化非常普遍，基因组拷贝数变化的中位值高达46％(4)。8q24是拷贝数变化做高的染色体区域，并且8q24区域的扩增与卵巢癌的不良预后相关(5)。PUF60是8q24.3拷贝数变化引起的多系统表型的驱使基因(6)。PUF60(Poly-U Binding Splicing Factor)是一个分子量约 60KD的剪接因子，位于人染色体的8q24.3，其N-端不保守，中间区域有两个 RNA识别结构域(RRM)，C-端为U2AF同源结构(UHM)，是PUF60最保守序列，其中UHM与RRM结构相似，因此具有RNA结合功能，除此之外，UHM还具有其独特的结构功能，即介导PUF60形成二聚体(7)。研究表明，PUF60与 U2AF65以合作的方式与3’剪接位点结合，并可选择结合位点、调节剪接效率，改变剪接类型(8)。
近年来PUF60在肿瘤中的功能也逐渐被发现。在结肠癌中，PUF60的可变剪接体因缺乏对MYC的抑制作用，而使MYC表达水平升高，促进结肠癌细胞生长，且使癌细胞对凋亡有更强的抵抗力(9)。在肝癌中也发现其有促肿瘤生成的功能(10)。PUF60作为RNA结合蛋白，其如何影响mRNA功能从而影响肿瘤发生发展及其作用分子机制，目前尚无报道。因此，深入研究PUF60在卵巢癌发生发展中的作用以及通过何种方式来调控RNA对于卵巢癌的临床治疗具有重要意义。
本发明人发现，PUF60可促进卵巢癌细胞的增殖，并且可影响氧化磷酸化途径基因的mRNA稳定性，本发明发现叔丁氧羰基类小分子有机化合物可特异性抑制PUF60的表达，并抑制PUF60的功能，可显著抑制癌症细胞如卵巢癌细胞的增殖，具有潜在的临床转化意义。
发明内容
鉴于PUF60在肿瘤发生发展过程中关键的调控作用，本发明在虚拟筛选的基础上，创造性地设计并合成了一系列叔丁氧羰基类小分子有机化合物，该类化合物可以作为PUF60抑制剂，不仅能够抑制PUF60蛋白的表达及其功能，而且能够有效抑制卵巢癌细胞，具有良好的临床应用前景。本发明所述叔丁氧羰基类小分子有机化合物属于首次报道的PUF60抑制剂，可作为抑制PUF60的先导化合物和潜在的临床候选药物。
本发明提供了一类结构新颖的可作为PUF60抑制剂和治疗肿瘤药物的叔丁氧羰基类小分子有机化合物及其相关类似物，包括其可用盐、以及酯等。
本发明提出一种如(I)所示的叔丁氧羰基类小分子有机化合物或其相关类似物或药学上可接受的盐，其结构式如(I)所示：
其中：
m＝0或者1；
X选自下列基团中的任意一个：(CH2)n、C(O)、O、NH、S；其中，n＝0-5；
本发明所述式(I)中，当
为吡啶基噻唑时，其结构如下式(Ⅱ)所示：
其中：
m＝0或者1；
X选自下列基团中的任意一个：(CH2)n、C(O)、O、NH、S；其中，n＝0-5；
U、V、Z、W、T为CH或N，且U、V、Z、W、T中有且仅有一个为N；
R2、R3分别独立的选自下列基团中的任意一个或多个：C1-C4的链状烷基、羟基、甲氧基、Boc哌嗪、硫代吗啉、4-7元的烷杂环；其中所述4-7元的烷杂环至少含有一个氮原子、C1-C4烷基-N-C2-C4吗啉基、C1-C4烷基-N-C2-C4醇羟基、 C1-C4烷基-N-C2-C4甲基醚、C1-C4甲基醚-N-C1-C4甲基醚。
本发明所述式(I)中，当
嘧啶基时，其结构如下式(Ⅲ)所示：
其中：
m＝0或者1；
X选自下列基团中的任意一个：(CH2)n、C(O)、O、NH、S；其中，n＝0-5；
Q、Y、M为CH或N，且Q、Y、M中有且仅有两个同时为N。
本发明所述式(Ⅲ)中，当
为苯环时，其结构如下式(Ⅳ)所示：
其中：
m＝0或者1；
X选自下列基团中的任意一个：O、NH；
Q、Y、M为CH或N，且Q、Y、M中有且仅有两个同时为N；
R4选自下列基团中的任意一个或多个：C1-C4的链状烷基、羟基、甲氧基、 Boc哌嗪、硫代吗啉、4-7元的烷杂环，其中所述烷杂环至少含有一个氮原子、 C1-C4烷基-N-C2-C4吗啉基、C1-C4烷基-N-C2-C4醇羟基、C1-C4烷基-N-C2-C4甲基醚、C1-C4甲基醚-N-C1-C4甲基醚。
本发明所述式(IV)中，当
为哌啶环，m＝1时，其结构如下式(V) 所示：
其中：
X选自下列基团中的任意一个：O、NH；
Q、Y、M为CH或N，且Q、Y、M中有且仅有两个同时为N；
R4选自下列基团中的任意一个或多个：C1-C4的链状烷基、羟基、甲氧基、 Boc哌嗪、硫代吗啉、4-7元的烷杂环，其中所述4-7元的烷杂环至少含有一个氮原子、C1-C4烷基-N-C2-C4吗啉基、C1-C4烷基-N-C2-C4醇羟基、C1-C4烷基 -N-C2-C4甲基醚、C1-C4甲基醚-N-C1-C4甲基醚；
本发明还提供了所述的叔丁氧羰基类小分子有机化合物或其相关类似物或药学上可接受的盐，所述叔丁氧羰基类小分子有机化合物与酸形成酸加成盐；其中，所述酸包括但不限于是：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、酒石酸、水杨酸、柠檬酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、乳酸、丙酮酸、马来酸、琥珀酸。
本发明中，所述叔丁氧羰基类小分子有机化合物或其相关类似物或药学上可接受的盐可以与放射性基团、荧光基团或者生物素结合形成标记物。
本发明提供的叔丁氧羰基类小分子有机化合物或其相关类似物或药学上可接受的盐，包括但不限于下列小分子化合物：
N-(4-叔丁氧羰基氨基哌啶)-2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基噻唑-5-甲酰胺
4-[2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基-5-噻唑亚甲基]-哌嗪基-1-甲酸叔丁酯
4-[2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基-5-噻唑亚甲氧基]-哌啶基-1-甲酸叔丁酯
4-[2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基-5-噻唑亚甲氨基]-哌啶基-1-甲酸叔丁酯
S-3-[4-甲基-2-(2-乙基-4-吡啶基)-5-噻唑亚甲氨基]-吡咯烷基-1-甲酸叔丁酯
R-3-[2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基-5-噻唑亚甲氨基]-吡咯烷基-1-甲酸叔丁酯
1-[2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基-5-噻唑亚甲基]-哌啶基-4-氨基甲酸叔丁酯
1-[2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基-5-噻唑亚甲基]-吡咯烷基-3-氨基甲酸叔丁酯
1-[4-甲基-2-(2-乙基-4-吡啶基)-5-噻唑亚甲基]-哌啶基-3-氨基甲酸叔丁酯
1-[4-(4-氟苯氨基)-2-嘧啶基]-哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯
1-[4-(2-氟苯氨基)-2-嘧啶基]-哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯
1-[4-(4-氟苄基氨基)-2-嘧啶基]-哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯
1-[4-(4-氟苯氧基)-2-嘧啶基]-哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯
1-[4-(6-氟吡啶-3-氧基)-2-嘧啶基]-哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯
1-[4-(4-氰基苯氧基)-2-嘧啶基]-哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯
1-[4-(4-甲砜基苯氧基)-2-嘧啶基]-哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯
1-[6-(4-甲砜基苯氧基)-4-嘧啶基]-哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯
本发明还提供了一种药物组合物，其含有上述的式(I)-(V)所述的叔丁氧羰基类小分子有机化合物或其相关类似物或药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。所述药物组合物被配制成可注射流体、气雾剂、乳膏、凝胶剂、丸剂、胶囊剂、糖浆剂、透皮贴剂或赋形剂等。
本发明中，所述药物组合物用于下列至少之一：
抑制PUF60的工具化合物；
治疗PUF60活化引起或调控的疾病的药物组合物；
治疗PUF60活化引起或调控的癌症的药物组合物。
本发明还提供了式(I)-(V)所述的叔丁氧羰基类小分子有机化合物或其相关类似物或药学上可接受的盐，或所述药物组合物在制备PUF60抑制剂的应用。
本发明还提供了式(I)-(V)所述的叔丁氧羰基类小分子有机化合物或其类似物或药学上可接受的盐，或所述药物组合物在制备靶向PUF60抑制剂抑制 PUF60蛋白的表达的药物中的应用。
本发明还提供了式(I)-(V)所述的叔丁氧羰基类小分子有机化合物或其类似物或药学上可接受的盐，或所述药物组合物在制备靶向PUF60抑制剂减缓靶基因的降解速率中的应用。
本发明还提供了所述PUF60通过促进氧化磷酸化相关基因mRNA降解影响卵巢癌发展具体机制中的应用。
本发明还提供了式(I)-(V)所述的叔丁氧羰基类小分子有机化合物或其类似物或药学上可接受的盐，或所述药物组合物在制备预防和/或治疗PUF60介导的疾病的药物中的应用。
本发明还提供了式(I)-(V)所述的叔丁氧羰基类小分子有机化合物或其类似物或药学上可接受的盐，或所述药物组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明还提供了式(I)-(V)所述的叔丁氧羰基类小分子有机化合物或其类似物或药学上可接受的盐，或所述药物组合物在制备抑制/杀死肿瘤的增殖、生长、迁移、浸润、复发药物中的应用；其中，所述肿瘤包括恶性肿瘤，选自胃癌、头颈部肿瘤、肺癌、白血病、卵巢癌、结直肠癌、淋巴瘤、脑和神经肿瘤、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、食管癌、胰腺癌、宫颈癌，优选为卵巢癌。
本发明还提供了式(I)-(V)所述的叔丁氧羰基类小分子有机化合物或其类似物或药学上可接受的盐，或所述药物组合物在制备抑制/杀死肿瘤细胞的增殖、生长、迁移、浸润、和/或复发药物中的应用；其中，所述肿瘤细胞包括恶性肿瘤细胞，选自胃癌细胞、头颈部肿瘤细胞、肺癌细胞、白血病细胞、卵巢癌细胞、结直肠癌细胞、淋巴瘤细胞、脑和神经肿瘤细胞、膀胱癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、胰腺癌细胞、宫颈癌细胞；优选为卵巢癌细胞；进一步优选为PUF60异常表达的卵巢癌细胞；进一步优选为卵巢癌细胞OVCAR8。
本发明还提供所述的靶向PUF60蛋白的应用，所述PUF60蛋白可以作为肿瘤的治疗新靶点；具体而言，所述的PUF60通过促进氧化磷酸化途径相关基因 mRNA降解影响卵巢癌发展的具体机制，为卵巢癌的综合治疗提供新的治疗靶点和研究思路。
在本发明的一个具体实施例中，PUF60在卵巢癌中明显高表达。
在本发明的一个具体实施例中，PUF60可促进卵巢癌细胞的增殖。
在本发明的一个具体实施例中，PUF60蛋白可降低卵巢癌细胞的氧化磷酸化能力。
在本发明的一个具体实施例中，PUF60蛋白可促进卵巢癌细胞的氧化磷酸化相关基因mRNA降解。
本发明中，式(I)-(V)所述的叔丁氧羰基类小分子有机化合物或其类似物或药学上可接受的盐，或所述药物组合物可以单独使用或与其他药物联合使用。
本发明的有益效果在于，本发明首次证明PUF60可以作为治疗卵巢癌的潜在的靶点。本发明首次创新提出所述式(I)-(V)所示的叔丁氧羰基类小分子有机化合物或药学上可接受的盐或药物组合物可以作为靶向PUF60抑制剂在制备治疗肿瘤尤其是卵巢癌的药物中的应用。本发明在卵巢癌领域首次提出利用靶向PUF60治疗卵巢癌，本发明还公开了所述叔丁氧羰基类小分子有机化合物或其类似物或药学上可接受的盐不仅能够抑制PUF60蛋白的表达及其功能，而且能够有效抑制卵巢癌细胞，具有良好的临床应用前景。
附图说明
图1为PUF60在各种类型的卵巢癌组织中的表达情况,通过免疫组化分析PUF60在各种卵巢癌组织中的表达，其中图A为浆液性卵巢癌组织；图B为透明卵巢癌组织；图C为黏液性卵巢癌组织；图D为子宫内膜样卵巢癌组织；图E为子卵巢囊肿组织；图F为正常卵巢上皮组织。
图2为PUF60蛋白可促进卵巢癌细胞的增殖的体内外实验，其中，图A是在卵巢癌细胞OVCAR8中；PUF60干扰和对照组的细胞增殖曲线；图B是在卵巢癌细胞ES-2 中，PUF60干扰和对照组的细胞增殖曲线；图C为裸鼠皮下成瘤的瘤体；图D为裸鼠皮下成瘤的瘤体生长曲线；图D为裸鼠皮下成瘤的瘤体重量；图E为裸鼠皮下成瘤的瘤体体积。
图3为PUF60蛋白可降低卵巢癌细胞的氧化磷酸化能力，增强糖酵解能力，其中，图A是在卵巢癌细胞OVCAR8中，PUF60干扰和对照组的细胞耗氧量测定；图B 是卵巢癌细胞OVCAR8中，PUF60干扰和对照组的细胞基础耗氧量及呼吸潜力计算；图C是在卵巢癌细胞ES-2中，PUF60干扰和对照组的细胞耗氧量测定；图D 是卵巢癌细胞ES-2中，PUF60干扰和对照组的细胞基础耗氧量及呼吸潜力计算；图E是卵巢癌细胞OVCAR8中，PUF60干扰和对照组的细胞外产酸能力测定；图F 是卵巢癌细胞OVCAR8中，PUF60干扰和对照组的糖酵解及糖酵解潜力计算；图 G是卵巢癌细胞ES-2中，PUF60干扰和对照组的细胞外产酸能力测定；图F是卵巢癌细胞ES-2中，PUF60干扰和对照组的糖酵解及糖酵解潜力计算。
图4为PUF60蛋白可促进氧化磷酸化相关基因的降解，其中，图A是在卵巢癌细胞OVCAR8中，PUF60干扰和对照组中NDUFS8的mRNA降解曲线；图B是在卵巢癌细胞OVCAR8中，PUF60干扰和对照组中NDUFA2的mRNA降解曲线；图C是在卵巢癌细胞OVCAR8中，PUF60干扰和对照组中NDUFA8的mRNA降解曲线。
图5PUF60与PF17的亲和力测定及PF17对PUF60蛋白的抑制能力，其中图A是为 SPR测定小分子抑制剂PF17与PUF60蛋白的亲和力，图B是PF17对卵巢癌细胞 OVCAR8和ES-2细胞中PUF60蛋白的抑制作用。
图6为PF17抑制卵巢癌细胞的增殖的IC50测定值，其中图A为PF17对卵巢癌细胞(PUF60高表达细胞OVCAR8和ES-2,PUF60低表达细胞OVCAR3和OVCAR5,卵巢正常细胞IOSE-80)的IC50测定；图B为PF17对耐紫杉醇卵巢癌细胞和对照组细胞的IC50测定；图C为PF17对耐顺铂卵巢癌细胞和对照组细胞的IC50测定。
图7为抑制剂PF17可抑制卵巢癌细胞的生长。其中图A为PF17对卵巢癌细胞克隆形成能力的影响。其中图B为PF17对卵巢癌细胞克隆形成的数目统计。
图8为抑制剂PF17氧化磷酸化基因mRNA降解功能的影响，其中，图A、B是在卵巢癌细胞OVCAR8及ES-2中，对照组和过表达组，及对照组给药和过表达组给药组中NDUFA2的mRNA降解曲线；图C、D是在卵巢癌细胞OVCAR8及ES-2中，对照组和过表达组，及对照组给药和过表达组给药组中NDUFA8的mRNA降解曲线；图E、F是在卵巢癌细胞OVCAR8及ES-2中，对照组和过表达组，及对照组给药和过表达组给药组中NDUFS8的mRNA降解曲线；
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
实验所得化合物的纯度结果均来自于Agilent 1200series LC system高效液相色谱分析仪(色谱条件：Zorbax XDB-C18(4.6×150nm，5μm)，柱40℃，流动相为MeOH/H2O，运行流速1.5mL/min，紫外检测波长为254nm，进样量为10μL)；核磁共振波谱仪为Bruker 500或300型(内标：TMS，使用溶剂为CDCl3或DMSO-d6)；反应中间体以及终产物的纯化均使用层析色谱柱(所用硅胶200-300目)，所使用的硅胶购买于青岛海洋化工厂。所有溶剂在使用前均经过重新蒸馏，所使用的无水溶剂均是按标准方法干燥处理获得；除特别说明外，所有反应均是在氮气保护下进行并用TLC跟踪反应进度，后处理均经过饱和食盐水洗和无水硫酸钠干燥。实施例1-1：N-(4-叔丁氧羰基氨基哌啶)-2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基噻唑-5-甲酰胺的制备(PF-01)
中间体2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基噻唑-5-羧酸乙酯的制备
取化合物乙硫异酰胺(6.8g,41mmol)溶解于50ml无水乙醇中，室温下加入吡啶(7.5ml,123mmol)和2-氯代乙酰乙酸乙酯(7.3ml,53mmol)，回流搅拌7h，减压蒸馏除去大部分溶剂，乙酸乙酯和水萃取三次，蒸干溶剂得到粗产物2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基噻唑-5-羧酸乙酯(7.3g,产率65％)。
中间体2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基噻唑-5-羧酸的制备
将中间体2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基噻唑-5-羧酸乙酯(1.17g,4.2mmol)溶于20mL无水甲醇，加入NaOH(340mg,8.4mmol)，于60℃下反应2h，反应完全后用1.5M HCl调节溶液pH至6-7，减压蒸干大部分溶剂，真空干燥
24h得到白色固体1.19g，产率＞100％。
取中间体2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基噻唑-5-羧酸(600mg,2.4mmol)加入到8mLDMF中，冰浴下加入EDC.HCl(600mg,3.1mmol)、HOBt(357mg,2.6 mmol)，0℃下搅拌30min加入成4-叔丁氧羰基氨基哌啶(961mg,4.8mmol)，继续搅拌4h至反应完成，乙酸乙酯和水萃取，经柱层析纯化后得到化合物N-(4- 叔丁氧羰基氨基哌啶)-2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基噻唑-5-甲酰胺(PF-01)，产率 46％。1H NMR(500MHz,DMSO):δ8.62(d,J＝5.1Hz,1H),7.73(s,1H),7.68(d,J ＝5.1Hz,1H),6.82(s,1H),4.00(d,J＝11.8Hz),3.55(s,1H),3.12(t,J＝11.5Hz, 2H),2.88(q,J＝7.5,2H),2.43(s,3H),1.82(d,J＝10.9Hz,2H),1.40(s,11H),1.26 (t,J＝7.5Hz,3H).
实施例1-2：4-[2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基-5-噻唑亚甲基]-哌嗪基-1-甲酸叔丁酯的制备(PF-02)
中间体2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基-5-溴甲基噻唑的制备
将中间体2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基噻唑-5-羧酸乙酯(2.2g,8.0mmol)用LiAlH4还原，还原产物(1.6g,86％)溶于20mL DCM中，冰浴下逐渐滴加PBr3 (0.65ml,6.8mmol)，继续搅拌3h直至反应完全，用K2CO3调节pH至中性，乙酸乙酯和水萃取两次，柱层析纯化得到白色粉末1.1g，产率53％。
取中间体2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基-5-溴甲基噻唑(178mg,0.6mmol)与 1-叔丁氧羰基哌嗪(223mg,1.2mmol)、K2CO3(166mg,1.2mmol)混合溶解于10mL丙酮中，室温搅拌4h至反应完全。减压蒸干溶剂，用乙酸乙酯和水萃取两次，经硅胶柱层析纯化得到无色晶体163mg，产率67％。1H NMR(300MHz, DMSO):δ8.56(d,J＝5.2Hz,1H),7.68(s,1H),7.61(d,J＝5.2Hz,1H),3.71(s, 2H),3.34(m,4H),2.81(q,J＝7.5Hz,2H),2.40(s,3H),2.38(m,4H),1.39(s,9H), 1.25(t,J＝7.5Hz,3H).
实施例1-3：4-[2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基-5-噻唑亚甲氧基]-哌啶基-1-甲酸叔丁酯的制备(PF-03)
取N-叔丁氧羰基-4-羟基哌啶(200mg,1.0mmol)溶于5ml DMF中，冰浴下加入NaH(120mg,3.0mmol)，继续搅拌30min后加入中间体2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基-5-溴甲基噻唑(178mg,0.6mmol)，冰浴下反应2h，少量冰水淬灭，乙酸乙酯和水萃取两次，经硅胶柱层析纯化后得到无色油状物32mg，产率 13％。1H NMR(500MHz,DMSO):8.57(d,J＝5.0Hz,1H),7.71(s,1H),7.64(d,J＝ 5.0Hz,1H),4.75(s,2H),4.69(m,1H),3.06(s,2H),2.95(s,2H),2.83(q,J＝7.5Hz, 2H),2.40(s,3H),1.83(s,2H),1.68(s,2H),1.38(s,9H),1.25(t,J＝7.5Hz,3H).
实施例1-4：1-[4-(4-氟苯氨基)-2-嘧啶基]-哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯的制备(PF10)
取原料对氟苯胺(200mg,1.8mmol)和2,4-二氯嘧啶(405mg,2.7mmol) 溶于10mL无水乙醇中，室温下加入DIEA(0.5mL,5.4mmol)，升温至40℃搅拌4h直至反应完成，经萃取和硅胶柱纯化后得到白色粉末(310mg,78％)。该白色粉末(100mg,0.45mmol)和Cs2CO3(292mg,0.9mmol)一起加入到8mL CH3CN中，80℃下回流4h，减压蒸干溶剂，乙酸乙酯和水萃取两次，硅胶柱纯化后得到白色粉末153mg,产率88％。1H NMR(500MHz,DMSO):δ9.23(s, 1H),7.91(d,J＝5.6Hz,1H),7.67(t,J＝8.9Hz,2H),7.15(t,J＝8.9Hz,2H),6.82 (d,J＝7.7Hz,1H),5.98(d,J＝5.6Hz,1H),4.49(d,J＝11.5Hz,2H),3.50(s,1H), 2.93(t,J＝11.5Hz,2H),1.76(d,J＝10.9Hz,2H),1.39(s,9H),1.33(t,J＝10.9Hz, 2H).
实施例1-5：1-[4-(4-氟苄基氨基)-2-嘧啶基]-哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯的制备(PF12)
取原料4-氟苄胺(225mg,1.8mmol)、2,4-二氯嘧啶(406mg,2.7mmol) 和Cs2CO3(1.17g,3.6mmol)一起加入到15ml CH3CN中，40℃下反应8h，萃取并经硅胶柱纯化后得到白色粉末(350mg,87％)。另取白色粉末(100mg, 0.45mmol)、4-叔丁氧羰基氨基哌啶(135mg,0.7mmol)和Cs2CO3(293g,0.9 mmol)一起加入到10ml CH3CN中，80℃下回流6h，减压蒸干溶剂，乙酸乙酯和水萃取两次，硅胶柱纯化后得到白色粉末,产率45％。1H NMR(500MHz,DMSO):δ7.71(d,J＝5.5Hz,1H),7.50(s,1H),7.38-7.31(m,2H),7.17-7.10(m, 2H),6.79(d,J＝7.8Hz,1H),5.76(d,J＝5.5Hz,1H),4.50(d,J＝11.5Hz,2H),4.42 (s,2H),3.46(s,1H),2.81(t,J＝11.5Hz,2H),1.68(d,J＝10.6Hz,2H),1.39(s,9H), 1.25(t,J＝10.6Hz,2H).
实施例1-6：1-[4-(6-氟吡啶-3-氧基)-2-嘧啶基]-哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯的制备 (PF14)
取原料2-氟-5-羟基吡啶(200mg,1.8mmol)和2,4-二氯嘧啶(405mg,2.7 mmol)溶于6mL水和丙酮(1:1)的混合溶液中，室温下加入NaOH(600mg,15.2 mmol)的饱和水溶液，室温搅拌2h后升温至40℃直至反应完成，经萃取和硅胶柱纯化后得到白色粉末(280mg,70％)。该白色粉末(100mg,0.44mmol)和 Cs2CO3(430mg,1.3mmol)一起加入到8mL的CH3CN中，80℃下回流4h，减压蒸干溶剂，乙酸乙酯和水萃取两次，硅胶柱纯化后得到白色粉末95mg,产率56％。1H NMR(500MHz,DMSO):δ8.27(d,J＝5.5Hz,1H),8.17(s,1H), 7.97-7.90(m,1H),7.30-7.26(m,1H),6.80(d,J＝7.5Hz,1H),6.28(d,J＝5.5Hz, 1H),4.25(d,J＝11.9Hz,2H),3.46(s,1H),2.89(t,J＝11.9Hz,2H),1.70(d,J＝ 11.3Hz,2H),1.38(s,9H),1.26(t,J＝11.3Hz,2H).
实施例1-1到1-42化合物PF01到PF17的制备方法如表1所示：
以下实施例1-7到1-17提供了本发明化合物PF04-PF17的制备方法及产物检测结果。
实施例1-7、4-[2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基-5-噻唑亚甲氨基]-哌啶基-1-甲酸叔丁酯的制备(PF04)
将1-叔丁氧羰基哌嗪替换成1-叔丁氧羰基-4-氨基哌啶按制备化合物PF01 的方法制备化合物PF04。1H NMR(300MHz,CDCl3):8.54(d,J＝5.1Hz,1H),7.63 (s,1H),7.52(d,J＝5.1Hz,1H),3.97(s,2H),2.86(m,4H),2.70(m,1H),2.42(s,3H), 2.02(s,1H),1.87(m,4H),1.44(s,9H),1.33(t,J＝7.5Hz,3H).
实施例1-8、S-3-[4-甲基-2-(2-乙基-4-吡啶基)-5-噻唑亚甲氨基]-吡咯烷基-1-甲酸叔丁酯的制备(PF05)
将1-叔丁氧羰基哌嗪替换成S-1-叔丁氧羰基-3-氨基吡咯烷按制备化合物 PF01的方法制备化合物PF05。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.58(d,J＝5.2Hz, 1H),7.66(s,1H),7.55(d,J＝5.2Hz,1H),3.98(s,2H),3.54(m,J＝9.5Hz,2H), 3.49(s,1H),3.41(m,J＝9.5Hz,2H),2.89(q,J＝7.6Hz,2H),2.45(s,3H),2.08(m, 1H),1.77(m,J＝9.8Hz,2H),1.47(s,9H),1.36(t,J＝7.6Hz,3H).
实施例1-9、R-3-[2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基-5-噻唑亚甲氨基]-吡咯烷基-1-甲酸叔丁酯的制备(PF06)
将1-叔丁氧羰基哌嗪替换成R-1-叔丁氧羰基-3-氨基吡咯烷按制备化合物 PF01的方法制备化合物PF06。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.58(d,J＝5.2Hz, 1H),7.66(s,1H),7.56(d,J＝5.2Hz,1H),3.98(s,2H),3.74(m,1H),3.54(m,J＝ 9.5Hz,2H),3.42(m,J＝9.5Hz,2H),2.89(q,J＝7.6Hz,2H),2.46(s,3H),2.07(m, 1H),1.77(m,J＝9.8Hz,2H),1.47(s,9H),1.36(d,J＝7.6Hz,3H).
实施例1-10、1-[2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基-5-噻唑亚甲基]-哌啶基-4-氨基甲酸叔丁酯的制备(PF07)
将1-叔丁氧羰基哌嗪替换成4-叔丁氧羰基氨基哌啶按制备化合物PF01的方法制备化合物PF07。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.59(d,J＝5.2Hz,1H),7.68 (s,1H),7.56(d,J＝5.2,1H),3.66(s,2H),3.52(m,1H),2.90(m,J＝15.5,7.6Hz, 4H),2.46(s,3H),2.20(t,J＝11.0Hz,2H),1.96(d,J＝11.0Hz,2H),1.59(d,J＝15.5 Hz,2H),1.47(s,9H),1.37(t,J＝7.6Hz,3H).
实施例1-11、1-[2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基-5-噻唑亚甲基]-吡咯烷基-3-氨基甲酸叔丁酯的制备(PF08)
将1-叔丁氧羰基哌嗪替换成3-叔丁氧羰基氨基吡咯烷按制备化合物PF01 的方法制备化合物PF08。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.60(d,J＝5.2Hz,1H), 7.68(s,1H),7.57(d,J＝5.2Hz,1H),3.80(s,2H),3.51(m,1H),2.91(q,J＝7.6Hz, 2H),2.71(m,J＝9.5Hz,2H),2.47(s,3H),2.42(d,J＝9.5Hz,2H),1.61(m,J＝9.8 Hz,2H),1.46(s,9H),1.38(t,J＝7.6Hz,3H).
实施例1-12、1-[4-甲基-2-(2-乙基-4-吡啶基)-5-噻唑亚甲基]-哌啶基-3-氨基甲酸叔丁酯的制备(PF09)
将1-叔丁氧羰基哌嗪替换成3-叔丁氧羰基氨基哌啶按制备化合物PF01的方法制备化合物PF09。1H NMR(500MHz,DMSO):δ8.56(d,J＝5.2Hz,1H),7.69(s, 1H),7.63(d,J＝5.2Hz,1H),6.71(d,J＝7.9Hz,1H),3.69(s,2H),3.38(m,1H), 2.82(q,J＝7.6Hz,2H),2.71(d,J＝15.5Hz,2H),2.38(s,3H),1.87(t,J＝11.0Hz, 2H),1.64(d,J＝8.9Hz,2H),1.43(t,J＝15.5Hz,2H),1.35(s,9H),1.26(t,J＝7.6 Hz,3H).
实施例1-13、1-[4-(2-氟苯氨基)-2-嘧啶基]-哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯的制备(PF11)
将原料对氟苯胺换成邻氟苯胺按制备化合物PF10的方法制备化合物 PF11。1HNMR(500MHz,DMSO)δ8.95(d,J＝5.5Hz,1H),8.04-7.87(m,2H), 7.31-7.14(m,2H),7.09(s,1H),6.83(d,J＝7.8Hz,1H),6.31((d,J＝5.5Hz,1H), 4.47(s,2H),3.50(s,1H),3.02-2.79(m,2H),1.74(s,2H),1.32(s,9H),1.27(s,2H).
实施例1-14、1-[4-(4-氟苯氧基)-2-嘧啶基]-哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯的制备(PF13)
将原料4-氟苯基苄氨替换成4-氟苯酚按制备化合物PF12的方法制备化合物PF13。1H NMR(500MHz,DMSO):δ8.22(d,J＝5.5Hz,1H),7.30-7.21(m,4H), 6.80(d,J＝7.4Hz,1H),6.12(d,J＝5.5Hz,1H),4.30(d,J＝12.1Hz,2H),3.47(s, 1H),2.88(t,J＝12.1Hz,2H),1.70(d,J＝10.8Hz,2H),1.38(s,9H),1.20(t,J＝10.8 Hz,2H).
实施例1-15、1-[4-(4-氰基苯氧基)-2-嘧啶基]-哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯的制备(PF15)
将原料4-氟苯基苄氨替换成4-氰基苯酚按制备化合物PF12的方法制备化合物PF15。1H NMR(500MHz,DMSO):δ8.29(d,J＝5.4Hz,1H),7.94(d,J＝8.6 Hz,2H),7.43(d,J＝8.6Hz,2H),6.80(d,J＝7.1Hz,1H),6.26(d,J＝5.4Hz,1H), 4.27(d,J＝12.0Hz,2H),3.47(s,1H),2.90(t,J＝12.0Hz,2H),1.70(d,J＝11.6Hz, 2H),1.38(s,9H),1.25(t,J＝11.6Hz,2H).
实施例1-16、1-[4-(4-甲砜基苯氧基)-2-嘧啶基]-哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯的制备 (PF16)
将原料2-氟-5-羟基吡啶换成4-甲磺酰基苯酚按制备化合物PF14的方法制备化合物PF16。1H NMR(500MHz,DMSO):δ8.30(d,J＝5.5Hz,1H),8.03-7.96 (m,2H),7.50-7.45(m,2H),6.85-6.76(m,1H),6.25(d,J＝5.5Hz,1H),4.29(s,2H), 3.48(s,1H),3.26(s,3H),2.91(t,J＝11.9Hz,2H),1.71(d,J＝10.7Hz,2H),1.38(s, 11H),1.28-1.20(m,2H).
实施例1-17、1-[6-(4-甲砜基苯氧基)-4-嘧啶基]-哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯的制备 (PF17)
将原料2-氟-5-羟基吡啶和2,4-二氯嘧啶换成4-甲磺酰基苯酚和4,6-二氯嘧啶按制备化合物PF14的方法制备化合物PF17。1H NMR(500MHz,DMSO):δ 8.21(s,1H),7.99-7.93(m,2H),7.43-7.36(m,2H),6.88(d,J＝6.9Hz,1H),6.50(s, 1H),4.30(d,J＝12.2Hz,2H),3.57(s,1H),3.25(s,3H),3.05(t,J＝12.2Hz,2H), 1.80(d,J＝11.4Hz,2H),1.40(s,9H),1.35(t,J＝11.4Hz,2H).
实施例2、PUF60在多种肿瘤组织中高表达
技术方法：
(1)TCGA数据分子PUF60在多种肿瘤癌组织中高表达
OncomineTM平台示大型基因芯片数据库，具有强大的分析功能集，可计算基因表达，簇和基因集模块，自动从数据中提取生物学信息。其独特功能包括：可扩展性—具有700多个独立数据集；高质量-拥有专业策划的数据；一致性-具有丰富，广泛且受控制的术语本体；标准化分析—约定确保对结果进行清晰一致的解释。我们将PUF60输入后查看PUF60在多种肿瘤癌组织中高表达情况。
(2)免疫组化染色显示PUF60在代表性卵巢癌中高表达
2.1主要试剂
PUF60一抗购自Abcam公司，HRP二抗购自Abmart公司；DAB显色液购自Thermo公司；中性树胶购自上海生工生物技术有限公司；临床样本来自奉贤区中心医院，常州妇幼保健院。
2.2对上述组织芯片进行免疫组化染色并统计PUF60在组织中的表达水平：
1脱蜡至水化：二甲苯20分钟1/2二甲苯10分钟无水乙醇10分钟95％乙醇10分钟85％乙醇10分钟75％乙醇10分钟PBS(磷酸盐缓冲液)洗至水化；
2抗原热修复：沸水加热0.01M柠檬酸钠抗原修复液(pH6.0)至95℃左右，然后小心放入组织芯片或组织切片水浴加热15分钟，取出后可自然冷却至室温；α-SMA抗体染色不需抗原热修复步骤；
3消除内源性过氧化物酶活性：使用0.3％过氧化氢在37℃孵育30分钟，然后用PBS冲洗；
4抗原封闭：用10％牛血清(BSA)室温封闭1小时；在湿盒内进行；
5一抗孵育：向玻片的组织上滴加一抗150-200ul，4℃孵育过夜，PBS冲洗3次；置湿盒进行反应；
6二抗孵育：滴加二抗(山羊抗兔-HRP标记二抗1:500稀释，兔抗小鼠-HRP标记二抗1:200稀释)150-200ul，在室温孵育1小时，置湿盒内进行，孵育完毕后用PBS洗3次；
7发色：使用DAB显色液(现用现配)，DAB显色一般持续1-5分钟，显微镜下控制发色程度，用自来水终止反应，然后PBS冲洗；
8使用苏木精复染细胞核1-2分钟，自来水冲洗5-10分钟；
9脱水，75％乙醇5分钟85％乙醇5分钟95％乙醇5分钟无水乙醇5分钟 1/2二甲苯10分钟二甲苯20分钟，自然晾干；
10用中性树胶封片、镜检。
OncomineTM平台数据库分析显示PUF60在多种肿瘤中高表达，筛选条件为p值小于0.05，PUF60高表达位于前10％，至少3个以上数据库支持，PUF60 在多种肿瘤中高表达的数据库数目如表2所示。代表性卵巢癌免疫组化染色结果如图1所示，与正常卵巢及良性卵巢囊肿患者样本相比，PUF60在各种类型的卵巢癌组织中显著上调。
表2，PUF60在多种肿瘤中高表达的数据库支持数目
实施例3、PUF60可促进代表性卵巢癌细胞的增殖
1，细胞活力实验(CCK8法)
检测前一天，在96孔板中接种待检测细胞(100μl/孔)，每孔接种3000-4000 个细胞，置于37℃，CO2培养箱。待其贴壁后，向每孔加入10μl的CCK-8试剂(注意避光及产生气泡)，放入CO2培养箱中继续培养1小时，用酶标仪测定450nm处的吸光度值作为零点。每天同一时间按照步骤2操作，连续检测5 天。绘制细胞生长曲线，统计分析。
2裸鼠移植瘤模型的建立
实验动物采用雌性BALB/C/nu裸鼠，6周龄，体重18-22g；购自上海斯莱克公司饲，饲养于SPF级动物实验室，实验动物程序经南方医科大学附属奉贤中心医院实验动物伦理委员会批准；实验动物在屏障环境内，按符合伦理委员会要求的条件喂养和管理；选取裸鼠12只，随机分为2组：Sh-PUF60-OVCAR8 细胞组和control-OVCAR8细胞组呈对数生长的细胞使用0.25％胰酶消化，细胞密度调整为2×107个细胞/ml，并重悬于PBS中备用；碘伏消毒裸鼠接种部位， 1ml胰岛素注射针吸取0.1ml的细胞悬液5×106个细胞)，接种于裸鼠左侧腹股沟部位；观察与测量过程中，观察小鼠精神、活动力、反应、饮食及排便以及肿瘤体积和生长速度等情况；6周后分组处理，颈椎脱臼处死。剥除皮下瘤，测量体积；完整剥离肿瘤，游标卡尺测量肿瘤结节短径(a)、长径(b)，按公式((a2×b)/2) 求出肿瘤近似体积(V)单位cm3；采用SPSS17.0统计软件处理，数据以均数±标准差表示，采用方差分析，P<0.05差异有显著性；病理学检查：肿瘤用4％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片、免疫组化染色，光镜下观察肿瘤细胞的病理变化。
结果如图2所示，体内外实验表明，PUF60干扰后，卵巢癌细胞的增殖能力明显降低，证明PUF60可促进体内外卵巢癌细胞的增殖。
实施例4.PUF60可降低代表性卵巢癌细胞的氧化磷酸化能力
为了测定卵巢癌细胞的代谢水平，本发明进行了Seahorse XF实验，XF实验前一天，将细胞接种到Seahorse XF细胞培养板中，在生长培养基中过夜培养；并且打开Seahorse仪器和电脑，并打开软件，使仪器升温至37℃，过夜预热；水化探针：在UtilityPlate中加入Seahorse XF校准液，将测试板放回Utility Plate上，置于37℃无CO2培养箱中过夜水化探针。
XF实验当天，准备检测液：用Seahorse XF Base Medium配制检测液，加入所需要的底物。糖酵解压力测试：L-谷氨酰胺。线粒体压力测试：葡萄糖，丙酮酸钠和L-谷氨酰胺，将溶液加热至37℃，用NaOH调pH值至7.4，0.2μM过滤，置37℃水浴中备用。观察细胞：将细胞板从CO2培养箱中取出，在显微镜下观察细胞状态。细胞换液：将生长培养基换为检测液，然后将细胞放置在37℃无CO2培养箱中1小时。配药：糖酵解压力测试：配制葡萄糖(Glucose)10mM，寡霉素 (oligomycin)1μM，2-DG 50mM。线粒体压力测试：配制寡霉素(oligomycin)1μM， FCCP 1μM，鱼藤酮(rotenone)/抗霉素A(antimycin A)0.5μM/0.5μM。将稀释好的药物分别加入测试板上的加药孔中。设计实验模板：用软件记录实验条件和设计实验程序。开始运行实验程序，将加过药的测试板和装有校准液的Utility Plate 一起放置到仪器托板上，仪器自动校准探针。当软件出现提示信息时，将Utility Plate换为细胞板。实验完成时根据软件提示信息退出测试板和细胞板，并在显微镜下观察细胞状态。采用wave软件对实验数据进行分析。
结果如图3所示，PUF60干扰后，卵巢癌细胞氧化磷酸化水平明显升高，糖酵解能力明显降低，证明PUF60可降低卵巢癌细胞的氧化磷酸化水平，增加糖酵解能力化水平。
实施例5、PUF60可促进代表性卵巢癌中氧化磷酸化基因的降解
将OVCAR8细胞接种到6孔板中，进行siRNA干扰，48小时后，加入10 μg/mL的放线菌素D，并在指定的时间点收集细胞。用Simply P Total RNA提取试剂盒(BSC52S1，BIOER)提取RNA，并通过RT-PCR对其进行分析，估算出mRNA的周转率和半衰期。
结果如图4所示，PUF60干扰后，氧化磷酸化途径相关基因mRNA的降解速率明显降低，表明PUF60可促进卵巢癌细胞氧化磷酸化基因NDUFA2， NDUFA8，NDUFS8的mRNA降解，降低氧化磷酸化基因的mRNA稳定性。
实施例6、本发明化合物与PUF60蛋白的结合活性以及抗肿瘤增殖活性 1,技术方法
(1)表面等离子共振(SPR)测定化合物与PUF60蛋白的结合活性
表面等离子共振(SPR)是一种光学现象，可被用来实时跟踪在天然状态下生物分子间的相互作用。这种方法与传统手段比较，SPR具有无需对样品进行标记、能实时监测、灵敏度高等突出优点。实验操作如下：PUF60蛋白通过氨基偶联法固定在芯片表面，条件为pH4.5，10倍稀释，再将不同浓度的抑制剂溶液注入并流经生物传感器表面。小分子与PUF60蛋白的结合常数(KD)通过软件分析得到。
(2)CCK8法测定化合物抗肿瘤增殖活性
细胞增殖实验细胞增殖实验采用CCK8实验，CCK8(Cell Counting Kit-8)是一种运用比色法间接测定活细胞数量的方法。CCK8利用了Dojindo开发的水溶性四唑盐-WSTR-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)，它在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下能够被还原成水溶性的甲臜染料，在450nm处测量还原产物的吸光值与活细胞的数量呈正比，从而反映细胞活力情况。此实验可以用于评价化合物对卵巢癌细胞增殖的影响，从而判断化合物对卵巢癌细胞增殖的抑制作用并计算半数抑制浓度(IC50)。各细胞以3×103个/孔的密度，每孔100μL均匀接种到96孔板，在37℃恒温培养箱中放置24小时之后，对照组加入相应的培养基，实验组给予不同浓度的化合物，药物处理48小时之后取出在显微镜下观察细胞状态，避光每孔加入10μL CCK8，混合均匀后避光放置在37℃恒温培养箱，用酶标仪450nm处测定读取光吸收值，至对照组的OD值范围在0.8-1.2之间，实验重复三次，IC50用GraphPad 8.3Prism软件计算得到。
本发明化合物与PUF60蛋白的结合活性及其对多种肿瘤的抗增殖活性用 IC50(半数抑制浓度)来表示，上述测试结果见于表3。
表3.本发明化合物与PUF60蛋白结合离解常数及抗肿瘤增殖活性
2、结论
国际上至今没有检测PUF60蛋白与其小分子抑制剂结合情况，本发明实施例 1所示化合物都能通过与PUF60结合并发挥抗肿瘤活性，本发明大部分化合物并且具有良好的浓度依赖性。图5为PUF60与代表化合物PF17的亲和力测定及PF17 对PUF60蛋白的抑制能力，其中代表性化合物PF17与PUF60蛋白结合实验结果如图5A所示，KD值为20.06μM。图6A为代表化合物PF17对代表性卵巢癌细胞及正常卵巢细胞的IC50分别为9.51μM和129.00μM。
实施例7、抑制剂PF17对不同卵巢癌细胞中PUF60的抑制活性
本发明在上述结果的基础上，选用代表性化合物PF17进行生物学功能评价。细胞经不同浓度PF17处理24h后，用PBS清洗细胞，加入IP裂解液和磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂裂解细胞，再将细胞裂解液离心、定量、煮沸变性，用聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳分离蛋白质样品，然后转移到硝酸纤维素薄膜上，经BSA封闭液封闭1h后，分别用PUF60和β-tublin等抗体4℃孵育过夜，再用带有荧光标记的二抗孵育1h，最后用Odyssey扫膜仪检测蛋白的表达水平。
实验结果如图5B所示，不同浓度的PF17对卵巢癌细胞PUF60抑制效果， PF17能在5μM时明显抑制卵巢癌细胞内PUF60的表达。
实施例8、代表性抑制剂PF17对不同卵巢癌细胞的抑制活性
本发明在上述结果的基础上，选用代表性化合物PF17对不同卵巢癌细胞的抗肿瘤增殖活性进行评价，实验方法同实施例6，结果如图6A所示，本发明PF17 在PUF60高表达的卵巢癌细胞中的IC50较小，在PUF60低表达卵巢癌细胞及正常卵巢细胞中卵巢癌中的IC50较大，表明PF17对PUF60具有良好的特异性。
实施例9、代表性抑制剂PF17对化疗耐药卵巢癌细胞的抑制活性
本发明在上述结果的基础上，选用代表性化合物PF17进行生物学功能评价。实验方法同实施例6,结果如图6B所示，与非紫杉醇耐药株SKOV3-IP相比，紫杉醇耐药株SKOV3-TR中PUF60的表达量明显增高，抑制剂PF17对紫杉醇耐药株SKOV3-TR的敏感性更强；与非顺铂耐药株COCL相比，顺铂耐药株COCL 中PUF60的表达量明显增高，抑制剂PF17对顺铂耐药株COCL的敏感性更强。
实施例10、代表性抑制剂PF17可抑制卵巢癌细胞的生长
本试试例采用克隆形成实验，即取对数生长期的细胞，用0.25％胰酶消化并吹打成单个，6孔板中接种1000个细胞。待细胞贴壁，利用不同浓度的PF17 进行处理，置37℃5％CO2及饱和湿度的培养箱中，静置培养1周，经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2 次。4％多聚甲醛固定30min，弃去固定液，用PBS浸洗一次，结晶紫染2小时，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。将平皿置于白炽灯箱上，数码相机拍照，用肉眼直接计数克隆数。
结果如图7所示，图7为PF17抑制卵巢癌细胞的克隆形成能力，随着PF17 浓度的增加，抑制剂PF17可抑制明显抑制卵巢癌细胞的克隆形成能力，证明PF17 是强有力的肿瘤细胞抑制剂。
实施例11、代表性抑制剂PF17可增强氧化磷酸化途径基因的mRNA稳定性
将细胞接种到6孔板中，进行PUF60过表达，24小时后，加入抑制剂PF17，待药物处理24小时后，加入10μg/mL的放线菌素D，并在指定的时间点收集细胞。用Simply P TotalRNA提取试剂盒(BSC52S1，BIOER)提取RNA，并通过 RT-PCR对其进行分析，估算出mRNA的周转率和半衰期。
结果如图8所示，抑制剂PF17可缓解由PUF60对氧化磷酸化基因NDUFA2， NDUFA8，NDUFS6的mRNA加速降解，增强氧化磷酸化相关基因的mRNA稳定性。
[参考文献]
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Claims (15)
1.一类叔丁氧羰基类化合物或其相关类似物或药学上可接受的盐，其特征在于，其结构如下式(Ⅰ)所示：
其中：
m＝0或者1；
X选自下列基团中的任意一个：(CH2)n、C(O)、O、NH、S；其中，n＝0-5；
2.根据权利要求1所述一类叔丁氧羰基类化合物或其相关类似物或药学上可接受的盐，其特征在于，当
吡啶基噻唑时，其结构如下式(Ⅱ)所示：
其中：
m＝0或者1；
X选自下列基团中的任意一个：(CH2)n、C(O)、O、NH、S；其中，n＝0-5；
U、V、Z、W、T为CH或N，且U、V、Z、W、T中有且仅有一个为N；
R2、R3分别独立选自下列基团中的任意一个或多个：C1-C4的链状烷基、羟基、甲氧基、Boc哌嗪、硫代吗啉、4-7元的烷杂环；其中所述4-7元的烷杂环至少含有一个氮原子、C1-C4烷基-N-C2-C4吗啉基、C1-C4烷基-N-C2-C4醇羟基、C1-C4烷基-N-C2-C4甲基醚、C1-C4甲基醚-N-C1-C4甲基醚。
3.根据权利要求1所述一类叔丁氧羰基类化合物或其相关类似物或药学上可接受的盐，其特征在于，当
嘧啶基时，其结构如下式(Ⅲ)所示：
其中：
m＝0或者1；
Q、Y、M为CH或N，且Q、Y、M中有且仅有两个同时为N。
4.根据权利要求3所述一类叔丁氧羰基类化合物或其相关类似物或药学上可接受的盐，其特征在于，当
为苯基时，其结构如下式(Ⅳ)所示：
其中：
m＝0或者1；
X选自下列基团中的任意一个：O、NH；
Q、Y、M为CH或N，且Q、Y、M中有且仅有两个同时为N；
R4选自下列基团中的任意一个或多个：C1-C4的链状烷基、羟基、甲氧基、Boc哌嗪、硫代吗啉、4-7元的烷杂环，其中所述烷杂环至少含有一个氮原子、C1-C4烷基-N-C2-C4吗啉基、C1-C4烷基-N-C2-C4醇羟基、C1-C4烷基-N-C2-C4甲基醚、C1-C4甲基醚-N-C1-C4甲基醚。
5.根据权利要求4所述一类叔丁氧羰基类化合物或其相关类似物或药学上可接受的盐，其特征在于，当
为哌啶环，m＝1时，其结构如下式(V)所示：
其中：
X选自下列基团中的任意一个：O、NH；
Q、Y、M为CH或N，且Q、Y、M中有且仅有两个同时为N；
R4选自下列基团中的任意一个或多个：C1-C4的链状烷基、羟基、甲氧基、Boc哌嗪、硫代吗啉、4-7元的烷杂环，其中所述4-7元的烷杂环至少含有一个氮原子、C1-C4烷基-N-C2-C4吗啉基、C1-C4烷基-N-C2-C4醇羟基、C1-C4烷基-N-C2-C4甲基醚、C1-C4甲基醚-N-C1-C4甲基醚；
6.叔丁氧羰基类小分子有机化合物或其相关类似物或药学上可接受的盐，其特征在于，选自：
N-(4-叔丁氧羰基氨基哌啶)-2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基噻唑-5-甲酰胺；
4-[2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基-5-噻唑亚甲基]-哌嗪基-1-甲酸叔丁酯；
4-[2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基-5-噻唑亚甲氧基]-哌啶基-1-甲酸叔丁酯；
4-[2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基-5-噻唑亚甲氨基]-哌啶基-1-甲酸叔丁酯；
S-3-[4-甲基-2-(2-乙基-4-吡啶基)-5-噻唑亚甲氨基]-吡咯烷基-1-甲酸叔丁酯；
R-3-[2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基-5-噻唑亚甲氨基]-吡咯烷基-1-甲酸叔丁酯；
1-[2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基-5-噻唑亚甲基]-哌啶基-4-氨基甲酸叔丁酯；
1-[2-(2-乙基-4-吡啶基)-4-甲基-5-噻唑亚甲基]-吡咯烷基-3-氨基甲酸叔丁酯；
1-[4-甲基-2-(2-乙基-4-吡啶基)-5-噻唑亚甲基]-哌啶基-3-氨基甲酸叔丁酯；
1-[4-(4-氟苯氨基)-2-嘧啶基]-哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯；
1-[4-(2-氟苯氨基)-2-嘧啶基]-哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯；
1-[4-(4-氟苄基氨基)-2-嘧啶基]-哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯；
1-[4-(4-氟苯氧基)-2-嘧啶基]-哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯；
1-[4-(6-氟吡啶-3-氧基)-2-嘧啶基]-哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯；
1-[4-(4-氰基苯氧基)-2-嘧啶基]-哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯；
1-[4-(4-甲砜基苯氧基)-2-嘧啶基]-哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯；
1-[6-(4-甲砜基苯氧基)-4-嘧啶基]-哌啶-4-氨基甲酸叔丁酯。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有如权利要求1-6之任一项所述的叔丁氧羰基类小分子有机化合物或其类似物或药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于下列至少之一：
抑制PUF60的工具化合物；
治疗PUF60活化引起或调控的疾病的药物组合物；
治疗PUF60活化引起或调控的癌症的药物组合物。
9.如权利要求1-6之任一项所述的叔丁氧羰基类小分子有机化合物或其类似物或药学上可接受的盐或如权利要求7-8所述的药物组合物在制备PUF60抑制剂中的应用。
10.如权利要求1-6之任一项所述的叔丁氧羰基类小分子有机化合物或其类似物或药学上可接受的盐或如权利要求7-8所述的药物组合物在于制备靶向PUF60抑制剂抑制PUF60蛋白的表达的药物中的应用。
11.如权利要求1-6之任一项所述的叔丁氧羰基类小分子有机化合物或其类似物或药学上可接受的盐或如权利要求7-8所述的药物组合物在于制备靶向PUF60抑制剂减缓靶基因的降解速率的药物中的应用。
12.如权利要求1-6之任一项所述的叔丁氧羰基类小分子有机化合物或其相关类似物或药学上可接受的盐或如权利要求7-8所述的药物组合物在制备预防和/或治疗肿瘤或肿瘤细胞的药物中的应用。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括恶性肿瘤，所述叔丁氧羰基类小分子有机化合物或其相关类似物或药学上可接受的盐用于抑制肿瘤的增殖、生长、迁移、浸润、克隆形成、和/或复发；其中，所述肿瘤或恶性肿瘤选自胃癌、头颈部肿瘤、肺癌、白血病胞、卵巢癌、结直肠癌、淋巴瘤、脑和神经肿瘤、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、食管癌、胰腺癌、宫颈癌。
14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为PUF60异常表达的卵巢癌。
15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述卵巢癌细胞为OVCAR8。
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| WO2011129427A1 (ja) * | 2010-04-16 | 2011-10-20 | 第一三共株式会社 | 癌の診断剤および治療剤 |
| CN107987054A (zh) * | 2017-11-28 | 2018-05-04 | 四川大学 | 一种新型cdk2抑制剂及其抗乳腺癌的应用 |
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