CN113354583B - 用于检测乏氧水平的荧光探针、其制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测乏氧水平的荧光探针、其制备方法及其应用，能实现特异性响应Na2S2O4，用于检测乏氧水平的荧光探针，其结构如下所示：
该探针包含氮氮双键，它可以在乏氧环境下断裂而使化合物荧光恢复。本发明引入萘二甲酰亚胺作为荧光团，具有荧光稳定且荧光量子效率高的特点。本发明所述荧光探针制备方法简便，光谱变化明显，特异性效果好，细胞毒性小，成像效果好，特异性定性检测Na2S2O4，可在乏氧条件下释放荧光团母体和抗肿瘤药物氮芥类化合物，进行乏氧成像的同时又可抑制肿瘤细胞生长，具有诊疗一体化功能，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明对Na2S2O4具有特异性响应，涉及一种用于检测乏氧水平的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤细胞存在普遍乏氧的现象，这是因为正常细胞转化为肿瘤细胞过程中会消耗大量氧气，这一过程会导致还原应激。常规医学成像技术只有当实体瘤体积足够大时，才能检测到其存在。因此，能够提供一种在早期就能检测肿瘤细胞的技术具有重要意义。荧光成像技术可以在实体瘤的直径仅为350μm时就能进行检测，这对早期肿瘤的诊断有巨大的进展。
近年来，萘二甲酰亚胺由于具有良好的化学稳定性，较高的荧光量子产率，多个可修饰的反应位点，极好的细胞通透性和组织穿透能力等优点，已经成为一种理想的可用于生物研究的荧光团。根据前人研究，该荧光团上取代基的取代方式和性质很大程度上影响了荧光团的光物理性质，3、4位取代的萘二甲酰亚胺具有很高的活性。偶氮键对乏氧环境具有高度敏感性，可在乏氧环境下使萘二甲酰亚胺荧光团荧光再生，为乏氧荧光成像奠定基础。传统药物治疗也需要在有氧条件下完成，然而肿瘤细胞中氧含量有限，利用乏氧环境释放药物分子这一设计思路逐渐得到人们关注。其中，氮芥类药物及其衍生物可与肿瘤细胞的DNA结合交联来阻止癌细胞增殖，达到治疗目的，因此在治疗癌症方面已有多年历史。如何检测乏氧水平成为亟待解决的技术问题。
发明内容
为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种用于检测乏氧水平的荧光探针、其制备方法及其应用，本发明荧光探针能在乏氧条件下释放荧光团母体和抗肿瘤药物氮芥类化合物，进行乏氧成像的同时又可抑制肿瘤细胞生长，具有诊疗一体化功能，具有良好的应用前景。
为达到上述发明创造目的，本发明采用如下发明构思：
本发明检测乏氧水平的荧光探针的合成路线如下：
根据上述发明构思，本发明采用如下技术方案：
一种用于检测乏氧水平的荧光探针，其分子结构如下：
一种本发明用于检测乏氧水平的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备化合物1：
在冰浴条件下，将1,8-萘二甲酸酐溶解在质量百分比浓度不低于70wt％的浓硫酸中，在滴液漏斗中装入含质量百分比浓度不低于68wt％浓硝酸的浓硫酸溶液，缓慢滴加进入1，8-萘二甲酸酐溶液中，在室温条件下搅拌反应；随后，倒入冰水，在冰醋酸中重结晶，其中化合物1的结构式如下：
(2)制备化合物2：
在单口烧瓶中加入用乙醇溶解的化合物1和质量百分比浓度不低于38wt％浓盐酸溶液，缓慢加入无水氯化亚锡，回流，反应完全后加水稀释，抽滤，其中化合物2的结构式如下：
(3)制备化合物3：
在单口烧瓶中依次加入化合物2、乙醇、N,N-二甲基乙二胺，然后加热回流，待反应液冷却至室温则有黄色沉淀析出，分别用冰乙醇、石油醚溶液洗涤至少两次，真空干燥，其中化合物3的结构式如下：
(4)制备化合物4：
在冰浴条件下，在搅拌过程中将N,N-二羟乙基苯胺缓慢加入含三氯氧磷的圆底烧瓶中，室温下进行反应；缓慢加入甲苯，冰水，反复多次萃取后，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，其中化合物4的结构式如下：
(5)制备化合物G-1：
在冰浴条件下，将化合物3溶解在次氯酸溶液中，用水溶解后的亚硝酸钠分多次加入缓慢加入体系之中，常温下反应；然后缓慢加入化合物4，继续反应；将混合溶液的pH调至6～7，继续反应一段时间后，将pH调至不低于7，用二氯甲烷萃取产物，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，再用硅胶柱层析提纯，即得到可用于检测乏氧水平的探针化合物G-1。
优选地，在所述步骤(1)中，在滴液漏斗中装入至少10mL含51.0mmol浓硝酸的浓硫酸溶液，在冰浴条件下，缓慢将其滴加至至少20mL含50.5mmol的1,8-萘二甲酸酐的浓硫酸溶液中，在室温条件下反应至少90min；反应完全后，在冰醋酸中重结晶，得到化合物1。
优选地，在所述步骤(2)中，在单口烧瓶中加入含8.2mmol化合物1的乙醇溶液，冰浴条件下滴加不少于5mL浓盐酸，随后缓慢加入54.4mmol无水氯化亚锡，在不低于80℃条件下至少回流至少5h，反应完全后加水析出固体，抽滤，得到化合物2。
优选地，在所述步骤(3)中，在单口烧瓶中依次加入9.4mmol化合物2、9.9mmol N,N-二甲基乙二胺和至少20mL乙醇，然后加热回流不少于5h，待反应液冷却至室温则有沉淀析出，分别用冰乙醇、石油醚溶液洗涤两次，真空干燥，得到化合物3。
优选地，在所述步骤(4)中，在冰浴条件下，在搅拌过程中缓慢将55.2mmol N,N-二羟乙基苯胺加入含110.3mmol的三氯氧磷圆底烧瓶中，室温反应不少于2h；反应完毕后，冰浴条件下缓慢加入冰水以除去多余的三氯氧磷，并用甲苯萃取至少三次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，得到化合物4。
优选地，在所述步骤(5)中，在冰浴条件下，将0.3mmol化合物3溶解在盐酸溶液中，然后分多次缓慢滴加用水溶解的亚硝酸钠溶液，室温反应至少30min；随后，缓慢加入化合物4，反应至少30min；再将pH调至6～7，反应不少于30min；最后，将pH调至不低于7，用二氯甲烷萃取，合并有机相，经无水硫酸钠干燥后，柱层析分离纯化，得到探针化合物G-1。
一种本发明用于检测乏氧水平的荧光探针的应用，用于定性检测Na2S2O4，用于体外或体内乏氧水平的检测。本发明用于体外的乏氧水平测试，也适用于体内的乏氧水平测试，制备方法简便，光谱变化明显，特异性效果好，细胞毒性小，可同时用于乏氧成像和抑制肿瘤细胞生长。
本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：
1.本发明荧光探针G-1制备方法方便，易于生产；
2.本发明荧光探针G-1光谱变化明显，具有良好的特异性，细胞毒性小，可同时用于乏氧成像和抑制肿瘤细胞生长。
附图说明
图1是本发明用于表征荧光探针G-1的1H-NMR图。
图2是本发明用于表征荧光探针G-1的13C-NMR图。
图3是本发明荧光探针G-1对Na2S2O4的浓度响应图。
图4是本发明荧光探针G-1的响应时间图。
图5是本发明荧光探针G-1对活性氧、还原剂、阴离子、阳离子、氨基酸等分析物的响应光谱。
图6是本发明荧光探针G-1的细胞毒性图。
图7是本发明荧光探针G-1在细胞内检测乏氧水平的细胞成像图。
图8是本发明荧光探针G-1对癌细胞的增殖抑制实验图。
具体实施方式
以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：
实施例一：
在本实施例中，一种用于检测乏氧水平的荧光探针，其分子结构如下：
简称G-1，对Na2S2O4具有特异性响应。
一种本实施例用于检测乏氧水平的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(6)制备化合物1：
在冰浴条件下，将1,8-萘二甲酸酐溶解在质量百分比浓度为70wt％的浓硫酸中，在滴液漏斗中装入含质量百分比浓度为68wt％浓硝酸的浓硫酸溶液，缓慢滴加进入1，8-萘二甲酸酐溶液中，在室温条件下搅拌反应；随后，倒入冰水，在冰醋酸中重结晶，其中化合物1的结构式如下：
(7)制备化合物2：
在单口烧瓶中加入用乙醇溶解的化合物1和质量百分比浓度为38wt％浓盐酸溶液，缓慢加入无水氯化亚锡，回流，反应完全后加水稀释，抽滤，其中化合物2的结构式如下：
(8)制备化合物3：
将9.4mmol化合物2、9.9mmol N,N-二甲基乙二胺、20mL乙醇依次加入至单口烧瓶中，加热回流5h，待反应液冷却至室温则有沉淀析出，分别用冰乙醇、石油醚溶液洗涤两次，真空干燥，得到化合物3；化合物3的结构式如下：
(9)制备化合物4：
将55.2mmol N,N-二羟乙基苯胺在冰浴条件下缓慢加入到含110.3mmol三氯氧磷中，室温反应2h；并用甲苯萃取三次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，得到化合物4；化合物4的结构式如下：
(10)制备化合物G-1：
将0.3mmol化合物3在冰浴条件下于盐酸体系中溶解，分多次缓慢加入用水溶解的亚硝酸钠溶液，常温反应30min；然后缓慢加入化合物4，反应30min；反应结束后，将体系pH调至6～7，继续反应30min，再将pH调至7以上，用二氯甲烷萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，再用硅胶柱层析提纯，即得到可用于检测乏氧水平的探针化合物G-1。探针化合物G-1的结构式如下：
本实施例荧光探针G-1制备方法方便，易于生产。
实施例二
在本实施例中，将实施例一荧光探针G-1化合物经过真空干燥后将其配成1mmol·L-1的DMSO储存溶液，在4℃冰箱中保存备用。探针溶液在使用时，需先用PBS(10mmol·L-1，pH7.40)将其稀释至10μmol·L-1的使用液。在探针溶液中依次加入不同当量的Na2S2O4溶液，并测试荧光光谱。
结果图3所示，染料对Na2S2O4有较好的响应性。当在体系加入少量Na2S2O4后，475nm处的荧光发射峰开始逐渐下降，并在550nm处出现了一处新的发射峰，斯托克斯位移达到了130nm，可以排除探针自身的自吸收现象。当体系中加入0.2～3mmol·L-1Na2S2O4时，所得荧光强度与所加Na2S2O4浓度之间呈良好的线性关系，R2＝0.991。随着Na2S2O4浓度逐渐增大，荧光强度趋于稳定。
实施例三
在本实施例中，取4瓶G-1浓度为10μmol·L-1的测试液，分别加入终浓度为0、1、3、5mmol·L-1的Na2S2O4，37℃反应条件下测试其在0～100min内荧光探针G-1对Na2S2O4的响应。取5瓶G-1浓度为10μmol·L-1的测试液，用氮气鼓泡1h以营造乏氧条件，分别加入终浓度为1.0、0.5、0.2、0.1、0U/mL的细胞色素P450酶，5min后，在每个瓶中加入NADPH(100μmol·L-1)，将体系温度控制在37℃，测试其随时间变化的荧光响应情况。
结果如图4所示，其中图a为探针与不同浓度Na2S2O4的荧光响应时间图，图b为探针与不同浓度细胞色素P450酶的荧光响应时间图。结果发现，当探针G-1本身的荧光很弱，但随着Na2S2O4的加入，荧光逐渐增强，荧光达到稳定的时间也越短，探针G-1与5mmol·L- 1Na2S2O4的反应约在20min后达到稳定。同样，随着不同浓度P450酶的加入，溶液荧光逐渐增强，加入1U/mLP450酶的荧光强度约是未加P450酶的3倍；所有组的荧光强度基本在240s后保持基本不变。
实施例四
在本实施例中，本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：用纯水配制多种分析物的储备液，并将其稀释至使用液后加入至荧光探针中，通过荧光光谱反映反应结果。
结果如图5所示，图中1为单独荧光染料G-1的荧光强度，2为荧光染料添加Na2S2O4后的荧光强度，4～23为荧光染料与其余还原剂、活性氧、氨基酸、阴离子、阳离子等物种荧光强度，从图中可以发现，该荧光染料具有良好的特异性，除对Na2S2O4有很高的响应外，其余分析物与荧光探针反应的荧光都不是很强，即荧光染料对Na2S2O4具有相对专一的响应性。
实施例五
在本实施例中，将从液氮罐中取出的HeLa细胞解冻，接种至含5％FBS和1％双抗(青霉素+链霉素)(2mL)的DMEM中，于5％CO2，95％空气，37℃条件下孵育24h。用胰酶消化已经贴壁的细胞并将其种在96孔板中培养24h。加入含探针溶液的DMEM溶液染毒24h。然后，用含MTT溶液的DMEM溶液替代旧液，在细胞培养箱中培养4h。最后，用DMSO溶解已经形成的甲瓒产物，通过酶标仪定量测试490nm处的吸光度来反映活细胞数量。
如图6所示，G-1探针自身的毒性较小，即使浓度达到100μM，细胞存活率也在90％左右，而后续生物实验所需的探针浓度均为1μmol·L-1，根据细胞毒性结果，该浓度探针对应的细胞存活率接近100％，适用于生物实验。
实施例六
在本实施例中，将HeLa细胞密度调至15×104/mL后接种至共聚焦培养皿中，轻轻混匀后分别放入21％、10％、5％、1％氧含量状态下三气培养箱中。待细胞贴壁后，用完全培养基配制得到终浓度为1μmol·L-1的探针G-1溶液，此为新培养基溶液，在PBS缓冲溶液清洗两次后用此培养基代替原培养基加入共聚焦培养皿中，并于三气培养箱孵育30min。在拍摄前，还需用PBS缓冲溶液清洗以免影响拍照，再加入适量PBS缓冲溶液防止细胞脱板。最后用激光共聚焦拍照。
如图7所示，图中从左到右依次是探针在不同氧含量水平(21％、10％、5％、1％)下的细胞成像效果。随着氧含量的降低，荧光强度也逐渐增强。并且通过平均荧光发射强度可更直观地观察到荧光强度随含氧量的变化，平均荧光强度3.654从增加到了34.832，增加了9.5倍。实验表明，探针可以作为细胞中乏氧的指示剂，检测细胞体内的乏氧水平。
实施例七
在本实施例中，将HeLa、A549、NB4、MDA-MB-231细胞调整至合适密度后以100μL/孔接种于96孔板之中(A549、NB4、MDA-MB-231细胞培养方式与HeLa细胞相似)。实验分为16组，每种细胞分别与不同浓度(0～50μmol·L-1)的化合物3、化合物4、探针G-1、化合物3和化合物4的混合溶液孵育72h，其中孵育探针3和探针4的混合溶液的实验组需要将细胞放入含1％氧含量的培养箱中。随后，避光加入终浓度为0.5mg/mL的MTT使用液。4h后，吸去上清液，再在每个孔中加入150μLDMSO，混匀后使用酶标仪测定其在490nm处的吸光值。
如图8所示，经探针G-1孵育后四种细胞的的IC50值大于经过化合物3孵育后的IC50值，表明探针G-1细胞毒性更小，更具安全性；经化合物3和化合物4的混合液在乏氧条件下孵育得到的IC50值普遍低于经过探针G-1孵育后的IC50值，与化合物3的IC50值相当，表明探针G-1在乏氧条件下可抑制肿瘤细胞生长，具有一定抗肿瘤活性。实验证明，经过修饰后的探针G-1细胞存活率增大，生物安全性更高；乏氧条件下，探针G-1可抑制肿瘤细胞生长，具有一定的抗肿瘤活性。
综上所述，上述实施例引入萘二甲酰亚胺作为荧光团，制备方法简便，光谱变化明显，可快速、专一地响应Na2S2O4，细胞毒性较小，可同时实现乏氧成像和抑制肿瘤细胞增长。上述实施例特异性响应Na2S2O4，因此可以用于检测乏氧水平的荧光探针及其制备方法，其结构如下所示：
上面对本发明实施例结合附图进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种用于检测乏氧水平的荧光探针，其特征在于：其分子结构如下：
简称G-1，对Na2S2O4具有特异性响应。
2.一种权利要求1所述用于检测乏氧水平的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备化合物1：
在冰浴条件下，将1,8-萘二甲酸酐溶解在质量百分比浓度不低于70wt％的浓硫酸中，在滴液漏斗中装入含质量百分比浓度不低于68wt％浓硝酸的浓硫酸溶液，缓慢滴加进入1，8-萘二甲酸酐溶液中，在室温条件下搅拌反应；随后，倒入冰水，在冰醋酸中重结晶，其中化合物1的结构式如下：
(2)制备化合物2：
在单口烧瓶中加入用乙醇溶解的化合物1和质量百分比浓度不低于38wt％浓盐酸溶液，缓慢加入无水氯化亚锡，回流，反应完全后加水稀释，抽滤，其中化合物2的结构式如下：
(3)制备化合物3：
在单口烧瓶中依次加入化合物2、乙醇、N,N-二甲基乙二胺，然后加热回流，待反应液冷却至室温则有黄色沉淀析出，分别用冰乙醇、石油醚溶液洗涤至少两次，真空干燥，其中化合物3的结构式如下：
(4)制备化合物4：
在冰浴条件下，在搅拌过程中将N,N-二羟乙基苯胺缓慢加入含三氯氧磷的圆底烧瓶中，室温下进行反应；缓慢加入甲苯，冰水，反复多次萃取后，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，其中化合物4的结构式如下：
(5)制备化合物G-1：
在冰浴条件下，将化合物3溶解在次氯酸溶液中，用水溶解后的亚硝酸钠分多次加入缓慢加入体系之中，常温下反应；然后缓慢加入化合物4，继续反应；将混合溶液的pH调至6～7，继续反应一段时间后，将pH调至不低于7，用二氯甲烷萃取产物，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，再用硅胶柱层析提纯，即得到可用于检测乏氧水平的探针化合物G-1。
3.根据权利要求2所述用于检测乏氧水平的荧光探针的制备方法，其特征在于：在所述步骤(1)中，在滴液漏斗中装入至少10mL含51.0mmol浓硝酸的浓硫酸溶液，在冰浴条件下，缓慢将其滴加至至少20mL含50.5mmol的1,8-萘二甲酸酐的浓硫酸溶液中，在室温条件下反应至少90min；反应完全后，在冰醋酸中重结晶，得到化合物1。
4.根据权利要求2所述用于检测乏氧水平的荧光探针的制备方法，其特征在于：在所述步骤(2)中，在单口烧瓶中加入含8.2mmol化合物1的乙醇溶液，冰浴条件下滴加不少于5mL浓盐酸，随后缓慢加入54.4mmol无水氯化亚锡，在不低于80℃条件下至少回流至少5h，反应完全后加水析出固体，抽滤，得到化合物2。
5.根据权利要求2所述用于检测乏氧水平的荧光探针的制备方法，其特征在于：在所述步骤(3)中，在单口烧瓶中依次加入9.4mmol化合物2、9.9mmol N,N-二甲基乙二胺和至少20mL乙醇，然后加热回流不少于5h，待反应液冷却至室温则有沉淀析出，分别用冰乙醇、石油醚溶液洗涤两次，真空干燥，得到化合物3。
6.根据权利要求2所述用于检测乏氧水平的荧光探针的制备方法，其特征在于：在所述步骤(4)中，在冰浴条件下，在搅拌过程中缓慢将55.2mmol N,N-二羟乙基苯胺加入含110.3mmol的三氯氧磷圆底烧瓶中，室温反应不少于2h；反应完毕后，冰浴条件下缓慢加入冰水以除去多余的三氯氧磷，并用甲苯萃取至少三次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，得到化合物4。
7.根据权利要求2所述用于检测乏氧水平的荧光探针的制备方法，其特征在于：在所述步骤(5)中，在冰浴条件下，将0.3mmol化合物3溶解在盐酸溶液中，然后分多次缓慢滴加用水溶解的亚硝酸钠溶液，室温反应至少30min；随后，缓慢加入化合物4，反应至少30min；再将pH调至6～7，反应不少于30min；最后，将pH调至不低于7，用二氯甲烷萃取，合并有机相，经无水硫酸钠干燥后，柱层析分离纯化，得到探针化合物G-1。
8.一种权利要求1所述用于检测乏氧水平的荧光探针的应用，其特征在于：用于定性检测Na2S2O4，用于体外或体内乏氧水平的检测。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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