CN108949155B - 一种检测细胞内连二亚硫酸钠的荧光探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明涉及一种快速检测连二亚硫酸钠的荧光探针,属于有机小分子荧光探针领域。
背景技术
连二亚硫酸钠(Na2S2O4),也称为保险粉,是一种常见的白色砂状结晶或淡黄色粉末化学用品。连二亚硫酸钠被广泛用于纺织工业的还原性染色、还原清洗、印花和脱色及用作丝、毛、尼龙等织物的漂白,且由于不含重金属,经其漂白后的织物色泽十分鲜艳,不易退色。此外,连二亚硫酸钠还可用于食品漂白,诸如明胶、蔗糖、蜜饯,及肥皂、动(植)物油、竹器、瓷土的漂白等,以及应用于有机合成,如染料、药品的生产里作还原剂或漂白剂,同时连二亚硫酸钠是最适合木浆造纸的漂白剂。连二亚硫酸钠的广泛应用导致人们在生活中随时可接触到连二亚硫酸钠。但是,连二亚硫酸钠具有较强的毒性和致癌性,对眼睛、呼吸道黏膜有刺激性。经常接触连二亚硫酸钠可引起头痛、恶心、呕吐,以及引起眼、鼻黏膜刺激症状,严重时发生喉头痉挛及水肿、支气管痉挛。大量吸入连二亚硫酸钠可引起肺水肿、窒息、昏迷,甚至死亡。慢性连二亚硫酸钠中毒表现为嗅觉迟钝、慢性鼻炎、支气管炎、肺通气功能和免疫功能下降,严重者可引起肺部弥漫性间质纤维化和中毒性肺硬变。经口摄入连二亚硫酸钠的主要毒性表现为胃肠道反应,如恶心、呕吐。此外,可影响钙的吸收,使机体钙丢失。因此,实时检测活生物体内的连二亚硫酸钠对于研究其毒性,以及连二亚硫酸钠的安全使用和预防具有重要的作用。
传统的连二亚硫酸钠检测方法包括紫外可见分光光度法、化学发光法、电化学法、色谱法等,这些方法通常会引起待测样品的损失,不适用于活生物体内连二亚硫酸钠的实时原位检测。荧光成像由于具有高灵敏度、高选择性和实时监测,为检测活生物体内的连二亚硫酸钠提供了一种可行的方法。但检索发现,有关检测活生物体内连二亚硫酸钠的荧光探针及其应用还未见报道。
发明内容
针对现有技术中缺乏检测活生物体内连二亚硫酸钠的荧光探针的问题,本发明提供一种检测活生物体内连二亚硫酸钠荧光探针;本发明还提供了上述荧光探针的制备方法和在检测活生物体中连二亚硫酸钠的用途。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案。
一种检测连二亚硫酸钠的荧光探针,其结构式为如式(I)所示:
式(I);
其中,R为-H或-COOH;优选为-COOH。
一种上述荧光探针的合成方法,包括以下步骤:对氨基苯磺酸钠重氮化后的产物与如式(II)所示的化合物偶合:
式(II);
其中,R为-H或-COOH;优选为-COOH。
进一步的,合成方法包括以下步骤:
(1)将对氨基苯磺酸钠溶液和亚硝酸钠溶液混合搅匀;低温搅拌下加入盐酸,生成重氮盐;
(2)低温下,将重氮盐缓慢加入到式(II)所示的化合物溶液中,然后搅拌,再缓慢升至室温,过滤,干燥后得荧光探针。
步骤(1)中,对氨基苯磺酸钠溶液的质量百分浓度为15%;对氨基苯磺酸钠、亚硝酸钠和盐酸的摩尔比为1:2.5:1.2。
步骤(1)中,盐酸的质量百分浓度为30%。
步骤(1)和(2)中,低温温度为0-5℃。
步骤(2)中,重氮盐和式(II)所示的化合物的摩尔比为1:1。
步骤(2)中,搅拌时间为20-30min。
作为优选,步骤(2)中,过滤后还包括乙醇重结晶的过程
上述荧光探针在检测溶液、细胞中连二亚硫酸钠的应用。
本荧光探针的检测机理如下:
本发明的荧光探针能和连二亚硫酸钠发生还原反应,进而生成具有荧光的萘胺衍生物。通过定量检测溶液所发射荧光的强度,可以确定溶液或细胞中的连二亚硫酸钠的含量。
本发明具有以下优点:
本发明的偶氮衍生物的荧光探针能够与连二亚硫酸钠进行特异性反应,通过荧光信号的产生对连二亚硫酸钠进行定性检测,能够对活细胞中的连二亚硫酸钠进行实时快速检测。此外该荧光探针廉价易得,可经化学合成获得,且合成工艺简单易行,制备成本低,使用方便,能够快速检测活细胞中的连二亚硫酸钠。
附图说明
图1为探针6-羟基-5(4-磺酸基苯偶氮)-2-萘甲酸的1H NMR谱;
图2为探针6-羟基-5(4-磺酸基苯偶氮)-2-萘甲酸的13C NMR谱;
图3为探针1-(4-磺酸基苯偶氮)-2-萘酚的1H NMR谱;
图4为探针1对不同浓度连二亚硫酸钠的荧光线性关系;
图5为探针2对不同浓度连二亚硫酸钠的荧光线性关系;
图6为探针1对干扰物质与连二亚硫酸钠的荧光强度;
图7为探针2对干扰物质与连二亚硫酸钠的荧光强度;
图8为探针1在活细胞中的成像;
图9为探针2在活细胞中的成像。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明,但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 荧光探针1的合成
(1)将519 mg对氨基苯磺酸溶于2.5 mL 5%NaOH溶液中,冷却至室温,加入227 mgNaNO2,搅拌使其充分溶解;在将该溶液倒入小烧杯中,冰浴冷却至0℃,缓慢加入1 mL浓盐酸,配制成重氮盐溶液;
(2)将564 mg 2-羟基-6-萘甲酸、105 mg碳酸钠和40 mg NaOH溶于10 mL蒸馏水中,5℃条件下缓慢加入到重氮盐溶液中。滴加结束之后继续搅拌15分钟,抽滤得橙色固体,即荧光探针1,其结构式如式(III)所示,其1H NMR和13C NMR图谱见图1和图2:
式(III)。
实施例2 荧光探针2的合成
(1)将519 mg对氨基苯磺酸溶于2.5 mL 5%NaOH溶液中,冷却至室温,加入227 mgNaNO2,搅拌使其充分溶解;在将该溶液倒入小烧杯中,冰浴冷却至0℃,缓慢加入1 mL浓盐酸,配制成重氮盐溶液;
(2)将564 mg β-萘酚、105 mg碳酸钠和40 mg NaOH溶于10 mL蒸馏水中,5℃条件下缓慢加入到重氮盐溶液中。滴加结束之后继续搅拌15分钟,抽滤得橙色固体,其结构式如式(IV)所示,其1H NMR见图3:
式(IV)。
实施例2 荧光探针检测不同浓度连二亚硫酸钠
配制不同浓度的连二亚硫酸钠的PBS溶液(pH为7.4,浓度依次为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mM)1mL,然后加入9mL浓度为50 μM的实施例1获得的荧光探针1的PBS溶液(pH为7.4,含5%甲醇);进行荧光检测(λEx= 370 nm, λEm= 488 nm),计算各体系中荧光强度,建立荧光强度与连二亚硫酸钠浓度标准曲线,如图4所示:在试验浓度范围内,荧光强度与连二亚硫酸钠浓度呈线性正相关,随着连二亚硫酸钠浓度的增加,488 nm处的荧光强度逐渐增加,线性方程为y=157.94+2.74x(R2=0.9926);荧光探针1的检测下限为0.081 μM (S/N= 3)。
荧光探针2对不同浓度连二亚硫酸钠的响应的检测方法如上所述,荧光检测条件为λEx= 370 nm, λEm= 443 nm;荧光强度与连二亚硫酸钠浓度标准曲线,如图5所示:在试验浓度范围内,荧光强度与连二亚硫酸钠浓度呈线性正相关,随着连二亚硫酸钠浓度的增加,443 nm处的荧光强度逐渐增加,线性方程为y=30.42+17.8x(R2=0.9938)。
实施例3 荧光探针的选择性
取10份5mL的5 mM 荧光探针1的PBS溶液(pH为7.4,含20%甲醇),然后分别加入50μL浓度为10 mM的Hcys、Na2S、Na2SO3、NO、H2O2、HClO4、GSH、NaNO2、Vc干扰物质的PBS溶液。进行荧光检测(λEx= 370 nm, λEm= 488 nm);计算各体系的荧光强度,结果见图6:当探针1溶液中加入Hcys、Na2S、Na2SO3、NO、H2O2、HClO4、GSH、NaNO2、Vc等小分子时,只有连二亚硫酸钠可以导致溶液产生显著的荧光,而加入其他小分子时溶液的荧光基本没有变化,这表示荧光探针1只对连二亚硫酸钠有响应,而基本不受其他小分子的干扰。
荧光探针2的对不同干扰物质的响应检测方法如上所述,结果如图7所示:当探针2溶液中加入Hcys、Na2S、Na2SO3、NO、H2O2、HClO4、GSH、NaNO2、Vc等小分子时,只有连二亚硫酸钠可以导致溶液产生显著的荧光,而加入其他小分子时溶液的荧光基本没有变化,这表示荧光探针2只对连二亚硫酸钠有响应,而基本不受其他小分子的干扰。
实施例5 荧光探针在活细胞中的成像
将2份人肺癌A549细胞株加入铺有盖玻片的培养皿中,并置于温度为37℃的5%二氧化碳培养箱中,在采用DMEM培养基(含10%小牛血清)以及100 μg/ml的双抗进行培养,36小时后对铺有并长满细胞的盖玻片的培养皿采用不含血清的DMEM培养基冲洗3次,加入10μM实施例1中获得的荧光探针1后37℃下培养40分钟,然后分别进行如下操作:
(1)使用PBS冲洗铺有并长满细胞的盖玻片的培养皿3次,制片,在荧光显微镜下观察细胞,进行明场成像与荧光成像,结果如图8中A与B;
(2)加入200 μM浓度的连二亚硫酸钠,37℃下培养1小时,制片,在荧光显微镜下观察细胞,进行明场成像与荧光成像,结果如图8中C与D。
由图8可知,未加入连二亚硫酸钠的细胞不能产生荧光,如图8-B所示为全黑图像;而加入连二亚硫酸钠后细胞发出深蓝色荧光(灰度图中为深灰色),如图8-B所示。
荧光探针2在活细胞中的成像操作如上所述,图像如图9所示。由图9可知,未加入连二亚硫酸钠的细胞不能产生荧光,如图9-B所示为全黑图像;而加入连二亚硫酸钠后细胞发出深蓝色荧光(灰度图中为深灰色),如图9-D所示。荧光探针2可对活细胞中外源连二亚硫酸钠荧光成像。
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