CN113121488B - 一种基于香豆素衍生物的检测偶氮还原酶的荧光探针分子及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于香豆素衍生物检测偶氮还原酶的荧光探针分子及其制备方法和应用，属于蛋白酶检测试剂技术领域。本发明制备的荧光探针分子能提供与特定的生物酶‑偶氮还原酶相结合的分子，使偶氮还原酶还原探针结构中的偶氮基团，释放出荧光团香豆素衍生物，改变探针分子的荧光同时释放出抗癌活性药物苯丙氨酸氮芥，从而选择性识别和检测液相体系中的偶氮还原酶。因此，本发明提供了所述荧光探针分子在制备检测偶氮还原酶的试剂和/或检测水体中Sn2+中的应用。

Description

一种基于香豆素衍生物的检测偶氮还原酶的荧光探针分子及 其制备方法和应用
技术领域
本发明属于蛋白酶检测试剂技术领域，具体涉及一种基于香豆素衍生物检测偶氮还原酶的荧光探针分子及其制备方法和应用。
背景技术
偶氮还原酶(Azo)是一种广泛分布在低氧肿瘤中的一种还原性酶，是一种在大多数常氧健康组织中以低水平存在的酶。它利用NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原态，还原型辅酶Ⅰ)作为电子供体，还原各种具有偶氮结构的分子，会引起偶氮键的断键反应。因此，通过偶氮基团连接荧光分子和药物分子，使其在低氧肿瘤区域被偶氮还原酶还原断键释放荧光分子和药物分子，是一种肿瘤成像和药物靶向递送对低氧肿瘤诊疗一体化的策略。
荧光探针被视为生物科学基础研究、开发新药物及临床诊断的强大工具。但目前有关偶氮还原酶的探针研究工作还不多见。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于香豆素衍生物检测偶氮还原酶的荧光探针分子及其制备方法和应用，所述荧光探针分子具有灵敏性高、选择性好的特点。
本发明提供了一种基于香豆素衍生物检测偶氮还原酶的荧光探针分子，所述荧光探针分子为具有如式I所述结构的化合物；
Figure BDA0003030499340000011
本发明提供了所述基于香豆素衍生物检测偶氮还原酶的荧光探针分子的制备方法，包括以下步骤：
1)在硫酸的作用下，将4-氨基苯乙酮和4-(二乙氨基)水杨醛混合发生缩合反应，得到第一反应液；
2)将步骤1)所述第一反应液和高氯酸混合发生成环反应，得到结构式如式II所示的化合物YL；
Figure BDA0003030499340000021
3)在盐酸的作用下将步骤2)中所述化合物YL和NaNO2混合发生重氮化反应，得到如式Ⅲ所示的重氮盐；
Figure BDA0003030499340000022
4)在氢氧化钠水溶液作用下，将苯胺和2-溴乙醇混合发生取代反应，得到N-苯基二乙醇胺；
5)将步骤4)中所述N-苯基二乙醇胺和POCl3混合发生氯化反应，得到苯丙氨酸氮芥；
6)将步骤3)中所述重氮盐和步骤5)所述苯丙氨酸氮芥混合发生偶联反应，得到基于香豆素衍生物检测偶氮还原酶的荧光探针分子；
其中步骤1)～3)与步骤4)～5)之间没有时间顺序的限制。
优选的，步骤1)中所述4-氨基苯乙酮和4-(二乙氨基)水杨醛的摩尔比为(0.9～1.2)：1；
所述缩合反应的温度为80～90℃；所述缩合反应的时间为6～7h；
所述缩合反应伴随搅拌；所述搅拌的转速为400～450rpm。
优选的，步骤2)中所述第一反应液和高氯酸的体积比为1：(0.1～0.06)；
所述高氯酸的体积浓度为68％～72％。
优选的，步骤3)中所述化合物YL和NaNO2的摩尔比为1：(1.1～1.2)；
所述重氮化反应的温度为0～5℃；所述重氮化反应的时间为30～40min。
优选的，步骤4)中所述苯胺和2-溴乙醇的摩尔比为(0.4～0.6)：1；
所述氢氧化钠水溶液中氢氧化钠和2-溴乙醇的摩尔比为1：(8～9)；所述氢氧化钠水溶液的质量浓度为9％～11％；
所述取代反应的温度为95～105℃；所述取代反应的时间为10～14h。
优选的，步骤5)中所述N-苯基二乙醇胺和POCl3的摩尔比为(0.8～1.2)： 1；
所述氯化反应的温度为110～115℃，所述氯化反应的时间为1～1.2h。
优选的，步骤6)中所述重氮盐的原料化合物YL和所述苯丙氨酸氮芥的摩尔比为(0.8～1.2)：1。
本发明提供了所述基于香豆素衍生物检测偶氮还原酶的荧光探针分子或所述制备方法制备得到的基于香豆素衍生物检测偶氮还原酶的荧光探针分子在制备检测偶氮还原酶的试剂和/或检测水体中Sn2+中的应用。
本发明提供所述基于香豆素衍生物检测偶氮还原酶的荧光探针分子或所述制备方法制备得到的基于香豆素衍生物检测偶氮还原酶的荧光探针分子在制备检测细菌和/生物细胞的试剂中的应用。
本发明提供的所述基于香豆素衍生物检测偶氮还原酶的荧光探针分子或所述制备方法制备得到的基于香豆素衍生物检测偶氮还原酶的荧光探针分子在制备诊断和/或治疗肿瘤的试剂中的应用。
本发明提供了一种基于香豆素衍生物检测偶氮还原酶的荧光探针分子，所述荧光探针分子为具有如式I所述结构的化合物。本发明提供的荧光探针分子能提供与特定的生物酶——偶氮还原酶相结合的分子，使偶氮还原酶还原探针结构中的偶氮基团，释放出荧光团香豆素衍生物，在改变荧光探针分子的荧光的同时还能释放出抗癌活性药物苯丙氨酸氮芥，从而选择性识别和检测液相体系中的偶氮还原酶。实验表明，所述荧光探针分子能够检测水溶液中的偶氮还原酶以及荧光成像细胞内的偶氮还原酶，与偶氮还原酶反应前相比，反应后荧光探针分子的荧光强度在水溶液、细胞中增长约150倍，表明所述荧光探针分子具有检测偶氮还原酶高灵敏度的特点。
同时，所述荧光探针分子结构清晰、荧光团光性质稳定且物理化学性质稳定性好、选择性好、对其它常见氨基酸类、金属离子和活性氧自由基具有抗干扰性。此外，本发明荧光探针分子穿透细胞的渗透性好，可以实现细胞内偶氮还原酶的荧光检测；所述荧光探针分子的荧光团发光范围为近红外，发射波长为620nm。由此可见，所述荧光探针分子可作为一种生物科学基础研究、开发新药物及临床诊断的工具，应用前景良好。
本发明还提供了所述荧光探针分子的制备方法，合成方法步骤简单，易合成，收率高。实验表明产率达到30％以上。
附图说明
图1为本发明荧光探针分子的合成路线；其中a为H2SO4，90℃，6h； b为2-溴乙醇，10％氢氧化钠水溶液，回流，过夜；c为POCl3，110℃，1h； d为20％盐酸溶液，NaNO2，EtOH，0～5℃，3h；
图2为本发明荧光探针分子的1H-NMR谱图；
图3为本发明荧光探针分子的13C-NMR谱图；
图4为本发明荧光探针分子的HRMS(ESI)谱图；
图5为本发明荧光探针分子在一定水溶液体系中对Sn2+响应荧光光谱变化图；
图6为本发明荧光探针分子在一定水溶液体系中对不同氨基酸和活性氧自由基在620nm处荧光光谱变化图；
图7为本发明荧光探针分子在一定水溶液体系中对不同浓度Sn2+响应的荧光光谱变化图；
图8为本发明荧光探针分子在620nm处荧光强度与相对应Sn2+浓度拟合曲线图；
图9为本发明荧光探针分子在细胞内对内源性偶氮还原酶荧光识别图；其中，(a)、(e)、(i)、(m)、(q)为明场；(b)、(f)、(j)、(n)、(r)为DAPI通道； (c)、(g)、(k)、(o)、(s)为化合物YL-OD通道；(c)为只加入0.5mmol/L的本发明荧光探针分子10L的荧光图片；(g)为先加入0.4mg/L谷胱甘肽乙酯低氧孵育2h后再加入0.5mmol/L的本发明荧光探针分子10L孵育1h的荧光图片；(k)为先加入0.6mg/L谷胱甘肽乙酯低氧孵育2h后再加入0.5mmol/L 的本发明荧光探针分子10L孵育1h时的荧光图片；(o)为先加入0.8mg/L谷胱甘肽乙酯低氧孵育2h后再加入0.5mmol/L的本发明荧光探针分子10L孵育1h的荧光图片；(s)为先加入1.2mg/L谷胱甘肽乙酯低氧孵育2h后再加入0.5mmol/L的本发明荧光探针分子10L孵育1h的荧光图片；(d)、(h)、 (l)、(p)和(t)均为各个通道叠加图；
图10为本发明荧光探针分子在细胞内对大鼠肠道内的大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和铜绿单胞菌的这三种偶氮还原酶高表达细菌的内源性偶氮还原酶荧光识别图；(a)、(e)、(i)分别为大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和铜绿单胞菌的荧光成像；(b)、(f)、(j)分别为大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和铜绿单胞菌加入0.5mmol/L的本发明荧光探针分子10L的荧光图片；(c)、(g)、(k)分别为大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和铜绿单胞菌加入2×10-3M的偶氮还原酶抑制剂鱼藤酮溶液10L24h后加入0.5mmol/L的本发明荧光探针分子10L的荧光图片；(d)、(h)、(l)为分别为大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和铜绿单胞菌加入2×10-3M的偶氮还原酶抑制剂鱼藤酮溶液10L 24h后加入2mol/L Sn2+ 10L再加入0.5mmol/L的本发明荧光探针分子10L的荧光图片。
具体实施方式
本发明提供了一种基于香豆素衍生物检测偶氮还原酶的荧光探针分子，所述荧光探针分子为具有如式I所述结构的化合物；
Figure BDA0003030499340000051
本发明提供了所述基于香豆素衍生物检测偶氮还原酶的荧光探针分子的制备方法，见图1，具体包括以下步骤：
1)在硫酸的作用下，将4-氨基苯乙酮和4-(二乙氨基)水杨醛混合发生缩合反应，得到第一反应液；
2)将步骤1)所述第一反应液和高氯酸混合发生成环反应，得到结构式如式II所示的化合物YL；
Figure BDA0003030499340000061
3)在盐酸的作用下将步骤2)中所述化合物YL和NaNO2混合发生重氮化反应，得到重氮盐，得到如式Ⅲ所示的化合物；
Figure BDA0003030499340000062
4)在氢氧化钠水溶液作用下，将苯胺和2-溴乙醇混合发生取代反应，得到N-苯基二乙醇胺；
5)将步骤4)中所述N-苯基二乙醇胺和POCl3混合发生氯化反应，得到苯丙氨酸氮芥；
6)将步骤3)中所述重氮盐和步骤5)所述苯丙氨酸氮芥混合发生偶联反应，得到基于香豆素衍生物检测偶氮还原酶的荧光探针分子；
其中步骤1)～3)与步骤4)～5)之间没有时间顺序的限制。
本发明在硫酸的作用下，将4-氨基苯乙酮和4-(二乙氨基)水杨醛混合发生缩合反应，得到第一反应液。
在本发明中，所述4-氨基苯乙酮和4-(二乙氨基)水杨醛的摩尔比优选为 (0.9～1.2)：1，更优选为1:1。所述缩合反应的温度优选为80～90℃，更优选为85℃；所述缩合反应的时间优选为6～7h，更优选为6.5h。所述缩合反应伴随搅拌；所述搅拌的转速优选为400～450rpm，更优选为420～440rpm。所述硫酸的体积浓度优选为98％。所述硫酸的添加体积优选为4-氨基苯乙酮和4-(二乙氨基)水杨醛总体积的110％～140％。所述硫酸的作用为提供酸性的反应条件。本发明对所述4-氨基苯乙酮、4-(二乙氨基)水杨醛和硫酸的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的4-氨基苯乙酮、4-(二乙氨基)水杨醛和硫酸的来源即可。所述缩合反应结束后，优选将第一反应液置于冰水中猝灭反应。
得到第一反应液后，本发明将所述第一反应液和高氯酸混合发生成环反应，得到结构式如式II所示的化合物YL。
Figure BDA0003030499340000071
在本发明中，所述第一反应液和高氯酸的体积比优选为1：(0.1～0.06)，更优选为1:0.08。所述高氯酸的体积浓度优选为68％～72％，更优选为70％。所述成环反应的温度为0～5℃，更优选为2℃；所述成环反应的时间优选为 10～15min，更优选为12min。所述成环反应优选伴随搅拌；所述搅拌利于析出沉淀。分离沉淀后进一步纯化得到化合物YL；所述分离沉淀的方法优选采用抽滤的方法进行。所述抽滤后得到滤饼，优选用水洗涤滤饼后，得到紫黑色固体。所述纯化优选采用硅胶柱层析进行；所述硅胶柱层析优选填充 200～300目的硅胶。所述硅胶柱层析时采用的洗脱剂优选为二氯甲烷和甲醇的混合物；所述二氯甲烷和甲醇的体积比优选为100～105：1，更优选为 102～104:1，最优选为103:1。
得到化合物YL后，本发明在盐酸的作用下将所述化合物YL和NaNO2混合发生重氮化反应，得到重氮盐。
在本发明中，所述化合物YL和NaNO2的摩尔比优选为1：(1.1～1.2)，更优选为1：1.1。所述重氮化反应的温度优选为0～5℃，更优选为2～4℃，最优选为3℃。所述重氮化反应的时间优选为30～40min，更优选为32～38min，最优选为35min。所述盐酸的体积浓度优选为18％～22％，更优选为20％。
本发明在氢氧化钠水溶液作用下，将苯胺和2-溴乙醇混合发生取代反应，得到第二反应液。
在本发明中，所述苯胺和2-溴乙醇的摩尔比优选为(0.4～0.6)：1，更优选为0.5:1。所述氢氧化钠水溶液中氢氧化钠和2-溴乙醇的摩尔比优选为1： (8～9)，更优选为1:8.5。所述氢氧化钠水溶液的质量浓度优选为9％～11％，更优选为10％。本发明对所述苯胺和2-溴乙醇以及氢氧化钠的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的苯胺和2-溴乙醇以及氢氧化钠的来源即可。所述取代反应的温度优选为95～105℃，更优选为100℃。所述取代反应的时间优选为10～14h，更优选为12～13h。所述取代反应优选进行回流过夜。
在本发明中，取代反应结束后，优选将第二反应液冷却至室温。
得到第二反应液后，本发明将所述第二反应液用乙酸乙酯和水的混合液萃取，得到N-苯基二乙醇胺。
在本发明中，所述乙酸乙酯和水的混合液中乙酸乙酯和水的体积比优选为(4～6)：1，更优选为5:1。所述乙酸乙酯和水的混合液和第二反应液的体积比优选为(2～3):1，更优选为2.5:1。所述萃取的次数优选包括3～4次。萃取后，优选合并有机层，得到有机层优选去除乙酸乙酯，得到粗产物。所述去除乙酸乙酯的方法优选采用减压蒸馏法进行。所述减压蒸馏法的蒸馏温度优选为50～55℃，更优选为52℃。所述粗产物优选采用硅胶柱层析纯化。所述硅胶柱层析纯化时硅胶的规格优选为200～300目，更优选为200目。所述硅胶柱层析纯化时，洗脱剂优选为石油醚和乙酸乙酯的混合物。在所述混合物中，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为3～5:1，更优选为4:1。纯化后的产物干燥后得到淡黄色固体，即为N-苯基二乙醇胺。
得到N-苯基二乙醇胺后，本发明将所述N-苯基二乙醇胺和POCl3混合发生氯化反应，得到第三反应液。
在本发明中，所述N-苯基二乙醇胺和98％POCl3的摩尔比优选为 (0.8～1.2)：1，更优选为1:1。本发明对所述POCl3的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的POCl3来源即可。所述氯化反应的温度优选为 110～115℃，更优选为112℃～113℃。所述氯化反应的时间优选为1～1.2h，更优选为1.1h。所述氯化反应结束后，本发明将所述第三反应液进行猝灭反应。所述猝灭反应优选将所述第三反应液置于冰水中。所述冰水和POCl3的体积比为(1～1.2)：1。
得到猝灭后的第三反应液后，本发明优选将所述第三反应液用乙酸乙酯和水的混合液萃取，得到苯丙氨酸氮芥。
在本发明中，所述乙酸乙酯和水的混合液和第三反应液的体积比优选为(2～3):1，更优选为2.5:1。所述萃取的次数优选包括3～4次。萃取后，优选合并有机层，得到有机层优选去除乙酸乙酯，得到粗产物。所述去除乙酸乙酯的方法优选采用减压蒸馏法进行。所述减压蒸馏法的蒸馏温度优选为 50～55℃，更优选为52℃。所述粗产物优选采用硅胶柱层析纯化。所述硅胶柱层析纯化时硅胶的规格优选为200～300目，更优选为200目。所述硅胶柱层析纯化时，洗脱剂优选为石油醚和乙酸乙酯的混合物。在所述混合物中，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为(10～14):1，更优选为(12～13):1。
得到重氮盐和苯丙氨酸氮芥后，本发明将所述重氮盐和所述苯丙氨酸氮芥混合发生偶联反应，得到第四反应液。
在本发明中，所述重氮盐的原料化合物YL和所述苯丙氨酸氮芥的摩尔比优选为(0.8～1.2)：1，更优选为1:1。所述苯丙氨酸氮芥优选先溶解于乙醇中再与重氮盐发生偶联反应。所述偶联反应的温度优选为0～5℃，更优选为1～4℃，最优选为3℃。所述偶联反应的时间优选为2～3h，更优选为2.5h。所述偶联反应优选伴随搅拌。所述偶联反应结束后，优选将第四反应液进行低温过夜；所述低温指-18～-20℃，更优选为-20℃。
得到第四反应液后，本发明优选将所述第四反应液用二氯甲烷和水的混合液萃取，得到基于香豆素衍生物检测偶氮还原酶的荧光探针分子。
在本发明中，所述二氯甲烷和水的混合液中二氯甲烷和水的体积比优选为(4～6):1，更优选为5:1。所述萃取优选为3～4次。所述萃取后，优选合并有机层，去除二氯甲烷，纯化，得到荧光探针分子。所述去除二氯甲烷的方法优选采用减压蒸馏法进行；所述减压蒸馏法的蒸馏温度优选为48～50℃，更优选为49℃。所述纯化优选采用硅胶柱层析进行。硅胶柱层析中硅胶的规格优选为200～300目，更优选为200目。所述硅胶柱层析的洗脱剂优选为二氯甲烷和甲醇的混合液。所述二氯甲烷和甲醇的体积比优选为(150～160)： 1，更优选为155:1。
本发明提供了所述基于香豆素衍生物检测偶氮还原酶的荧光探针分子或所述制备方法制备得到的基于香豆素衍生物检测偶氮还原酶的荧光探针分子在制备检测偶氮还原酶的试剂中的应用。
在本发明中，由于偶氮还原酶是低氧肿瘤中广泛分布的还原酶，本发明提供的荧光探针分子使偶氮还原酶还原探针结构中的偶氮基团，释放出荧光团香豆素衍生物，改变荧光探针分子的荧光同时还释放出抗癌活性药物苯丙氨酸氮芥，达到检测低氧肿瘤的同时还能靶向抗癌的治疗目的。基于此，本发明优选提供了所述荧光探针分子在制备诊断和/或治疗低氧肿瘤的试剂或药物中的应用；同时本发明优选提供了所述荧光探针分子在诊断和/或治疗低氧肿瘤中的应用。
同时，由于偶氮还原酶在低氧细菌或细胞中存在，因此，通过检测低氧细菌中内源性偶氮还原酶的荧光识别，间接检测样本中细菌的存在。本发明提供了所述荧光探针分子在制备检测低氧细菌或低氧生物细胞的试剂中的应用，同时本发明还提供了所述荧光探针分子在检测表达偶氮还原酶的细菌或生物细胞中的应用。本发明对所述细菌的种类不做具体限定，针对本领域熟知的表达偶氮还原酶的细菌均可适用，例如包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿单胞菌。所述低氧细菌优选采用浓度不低于40mg/m的谷胱甘肽乙酯处理细胞2h得到。
同时，本发明还提供了荧光探针分子在检测水体中Sn2+中的应用。在本发明中，通过荧光检测实验表明，与GSH、NO、NO2 -、Vc、HS-、HSO4 -、 SO3 2-、H2O2、H2PO4 -、HPO3 2-相比，所述荧光探针分子仅对Sn2+荧光检测具有特异选择性，并且随着Sn2+中浓度的增加荧光探针分子的荧光强度随之增加。
下面结合实施例对本发明提供的一种基于香豆素衍生物检测偶氮还原酶的荧光探针分子及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
基于香豆素衍生物偶氮还原酶检测荧光探针分子的具体合成路线见图 1。
(1)圆底烧瓶中加入4-氨基苯乙酮(13.5g，0.1mol)和4-(二乙氨基) 水杨醛(19.3g，0.1mol)，加入50mL分析纯硫酸以400-450rpm的转速进行搅拌，升温至90℃反应6h。反应结束将反应液倒入冰水中，加入反应液体积的0.3倍体积的70％高氯酸溶液。搅拌15min析出沉淀后抽滤，用水洗涤滤饼，干燥后得紫黑色固体，经硅胶柱层析(200目硅胶)纯化，用洗脱剂(甲醇：二氯甲烷＝1：100，体积比)洗脱，得化合物YL(14.5g，产率 49.5％)。
(2)圆底烧瓶中加入2-溴乙醇(2.48g，20mmol)和苯胺(930mg， 10mmol)，加入10％氢氧化钠水溶液(氢氧化钠与2-溴乙醇的摩尔比为8： 1)回流过夜。反应结束后，冷却至室温，用乙酸乙酯和水的混合液(乙酸乙酯：水＝5:1，体积比)萃取3次，合并有机层，53℃减压蒸馏除去乙酸乙酯，将粗产物通过硅胶柱层析纯化，所用洗脱剂为石油醚乙酸乙酯溶液(石油醚与乙酸乙酯＝4：1，体积比)，得到淡黄色固体N-苯基二乙醇胺(950mg，产率52.3％)。
(3)将步骤(2)所得化合物N-苯基二乙醇胺(500mg，2.76mmol) 加入圆底烧瓶，在冰浴条件下加入3mL POCl3，然后升温至110℃反应1h。反应结束后在反应液中加入冰水淬灭反应，用乙酸乙酯和水的混合液(乙酸乙酯：水＝5:1，体积比)萃取3次，萃取溶剂和反应液的体积比为2:1，合并有机层，50℃减压蒸馏除去乙酸乙酯，将粗产物通过硅胶柱层析纯化，所用洗脱剂为石油醚乙酸乙酯溶液(石油醚：乙酸乙酯＝12:1，体积比)，得到淡粉色固体苯丙氨酸氮芥(391mg，产率65％)。
(4)将步骤(1)所得化合物YL(293mg，1mmol)加入圆底烧瓶，冰浴条件下加入5mL20％浓盐酸，搅拌20min，加入NaNO2(76mg，1.1 mmol)，在0℃条件下搅拌30min。将步骤(3)所得化合物苯丙氨酸氮芥 (218mg，1mmol)溶于5mL乙醇，加入反应液，保持0℃搅拌2h。反应结束将圆底烧瓶封口置于冰箱过夜。次日取出将反应液用二氯甲烷和水混合物(二氯甲烷：水＝5:1，体积比)萃取3次，合并有机层，50℃减压蒸馏除去二氯甲烷，通过柱层析纯化得到深蓝色固体YL-OD(156mg，产率30％)，即为基于香豆素衍生物检测偶氮还原酶的荧光探针分子。
将上述制备的荧光探针分子分别进行氢核磁共振、碳核磁共振波谱(核磁共振仪厂家为德国布鲁克公司，型号为布鲁克DRX 500)以及高分辨率质谱(厂家为安捷伦科技有限公司，型号为Agilent1100LC/MSD TOF)的检测，结果如图2～图4所示，氢核磁共振检测的具体结果如下：
1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ(ppm)8.842(d,J＝8Hz,1H),8.521(d, J＝8.4Hz,2H),8.226(d,J＝8Hz,1H),8.054(t,J＝10Hz,3H),7.892(d,J＝8.8Hz,2H), 7.580(d,J＝9.6Hz,1H),7.443((s,1H),7.010(d,J＝9.2Hz,2H),3.906(d,J＝6.4Hz, 4H),3.848(t,J＝6.4Hz,4H),3.762(d,J＝6.8Hz,4H),1.273(s,6H).(见图2)。
13C NMR(100MHz,d6-DMSO)δ(ppm)164.88,159.78,157.01, 155.72,151.08,149.11,144.21,133.08,130.46,130.12,129.51,128.21,126.26, 123.29,120.30,119.51,112.66,110.19,96.46,52.35,46.26,41.48,12.79(见图 3)。
HEMS(ESI):calcd for C29H31N4Cl2O+[M]+＝521.1869,found[M]+ m/z＝521.1870(见图4)。
同时结合图3中13C-NMR谱图以及图4HRMS(ESI)谱图结果可知，得到荧光探针分子的结构式如式I所示；
Figure BDA0003030499340000121
实施例2
基于香豆素衍生物偶氮还原酶检测荧光探针分子对Sn2+荧光检测的选择性
采用荧光分光光度计(型号为上海棱光科技技术有限公司的F97XP)测探针在Sn2+存在下和不含Sn2+的荧光发射光谱。结果见图5。由图5可知，未加Sn2+时，探针在620nm处没有荧光发射；而在Sn2+存在下，探针的荧光强度增强了近450倍，说明探针对Sn2+有较好的响应。
实施例3
采用EtOH(乙醇)：PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)＝6：4(v：v)溶液控制实验条件。
将实施例1制备的荧光探针分子用EtOH：PBS＝6：4(v：v)的溶剂溶解并定容到100mL的容量瓶中，配制成荧光探针分子浓度为2×10-5mol/L 的溶液。
将样品瓶分为12组，每组样品瓶分别加入5mL浓度为2×10-5mol/L 的本发明荧光探针分子YL-OD的EtOH：PBS＝6：4(v：v)溶液，第一瓶溶液作为空白组，其它11组分别加入50μL浓度为0.01mol/L的GSH、NO、 NO2 -、Vc、HS-、HSO4-、SO3 2-、H2O2、H2PO4 -、HPO3 2-、Sn2+。待测液配制好后，马上转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其荧光光谱。激发波长为565nm，发射波长为620nm。
本发明荧光探针分子对Sn2+荧光选择性检测结果如图6所示。可见，本发明荧光探针YL-OD分子在620nm处仅对Sn2+有明显的荧光增强现象(约 150倍增强)，表明本发明荧光探针分子对偶氮还原酶表现出一定的荧光选择性。
实施例4
基于香豆素衍生物偶氮还原酶检测荧光探针分子对Sn2+的荧光滴定
采用含乙醇的PBS溶液控制实验条件。在含乙醇的PBS溶液中，乙醇 (EtOH)：PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)＝6：4(v：v)溶液。
将实施例1制备的荧光探针分子用含乙醇的PBS溶液溶解并定容到100 mL的容量瓶中，配制成荧光探针分子浓度为2×10-5mol/L的溶液。
Sn2+的配制：称取氯化锡380mg，加入100μL的浓盐酸溶解，蒸馏水稀释至1mL，配制成2mol/L母液备用。
取一个10mL的样品瓶，加入5mL浓度为2×10-5mol/L的实施例1制备的荧光探针分子YL-OD的溶液，将配制好的2mol/L的Sn2+溶液逐渐滴加入测试体系后转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定每次滴加相应的荧光光谱。荧光测试光栅缝隙大小为5nm×5nm。
图7为所述荧光探针分子在水溶液体系中随Sn2+浓度变化的荧光光谱图。结果表明，表明随着Sn2+的不断加入，荧光强度不断增加，当Sn2+的浓度达到探针分子的24当量时达到饱和。
实施例5
基于香豆素衍生物偶氮还原酶检测荧光探针分子对Sn2+的定量荧光检测
采用含乙醇的PBS溶液控制实验条件。在含乙醇的PBS溶液中，乙醇 (EtOH)：PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)＝6：4(v：v)。
将实施例1制备是荧光探针分子用含乙醇的PBS溶液溶解并定容到 1000mL的容量瓶中，配制成荧光探针分子浓度为2×10-6mol/L的溶液。
Sn2+的配制：称取氯化锡380mg，加入100μL的浓盐酸溶解，蒸馏水稀释至1mL，配制成2mol/L母液备用。
取一个10mL的样品瓶加入5mL浓度为2×10-6mol/L的实施例1制备的荧光探针分子YL-OD的溶液，再将配制好的2mol/L的Sn2+溶液逐渐滴加入测试体系后转移至1cm×1cm的标准石英比色皿中，测定其不同Sn2+浓度对应的荧光光谱。荧光测试光栅缝隙大小为5nm×5nm。
将荧光光谱620nm处的荧光强度与相应Sn2+浓度进行拟合，在Sn2+浓度为0μM～50μM范围内得到一拟合曲线(图8)，表明本发明荧光探针分子在水溶液体系中可以定量检测Sn2+浓度。
实施例6
基于香豆素衍生物偶氮还原酶检测荧光探针分子在细胞内对内源性偶氮还原酶的荧光识别
取5皿贴壁的Hela细胞，将培养皿中的Hela细胞用PBS缓冲液(每升缓冲液中含有2.90gNa2HPO4·12H2O；0.30gNaH2PO4·2H2O)清洗三次，以除去培养液。再向这5皿培养皿Hela细胞中加入1mLPBS溶液，然后向 Hela细胞中分别加入10L 0.5mmol/L细胞核染色剂Hoechst后孵育半h。 Hela细胞用PBS缓冲液洗涤3次，之后向培养皿中分别加入浓度为10mg/mL 的谷胱甘肽乙酯溶液0L、40L、60L、80L、120L后继续低氧孵育2h。 Hela细胞再次用PBS溶液洗涤3次后，加入浓度为2×10-3M的实施例1制备的荧光探针分子5L，并将皿放于无菌培养箱中37℃孵育1h，用PBS缓冲液洗涤3次然后放置在荧光共聚焦显微镜下进行荧光成像实验。结果见图 9。由图9中(c)中可以看到，实施例1制备的荧光探针分子自身在细胞质内无荧光发射，当谷胱甘肽乙酯浓度达到120mg/mL时，细胞内发射出强烈的荧光(图9中(s))。该实验表明，本发明荧光探针分子可以在细胞内对内源性的偶氮还原酶进行荧光识别。实验所用仪器为Olympus FV-10i激光共聚焦显微镜。
实施例7
基于香豆素衍生物偶氮还原酶检测荧光探针分子在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿单胞菌内对内源性偶氮还原酶的荧光识别：
无菌操作台进行大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和铜绿单胞菌接种，37℃恒温摇床过夜后，进行细菌划板培养，40h长出菌落后挑取培养板单菌落进行液体培养基37℃恒温摇床培养过夜，得到大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和铜绿单胞菌菌液。每种菌液分为四组，分别为空白组、探针组、抑制剂+探针组以及抑制剂+探针+Sn2+组。空白组：正常培养并检测荧光；探针组：加入探针孵育30min后检测荧光；抑制剂+探针组：加入抑制剂24h后，细菌 2000～3000rpm离心5min加入PBS进行混悬后洗1～2次，再加入探针孵育 30min后检测荧光；抑制剂+探针+Sn2+组：加入抑制剂24h后，细菌 2000～3000rpm离心5min加入PBS进行混悬后洗1～2次，再加入探针及Sn2+孵育30min后检测荧光。
结果见图10。由图10中(b)、(f)和(j)中可以看出，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿单胞菌表达的偶氮还原酶能使本发明荧光探针分子发射出强烈的红色荧光。图10中(c)、(g)和(k)中可以看出，加入偶氮还原酶抑制剂鱼藤酮之后，本发明探针无荧光发射。图10中(d)、(h)和(l)中可以看出，加入偶氮还原酶抑制剂鱼藤酮之后再加入Sn2+，所述荧光探针分子发射出强烈的红色荧光。该实验表明，本发明荧光探针分子可以在细菌内对内源性的偶氮还原酶进行荧光识别。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种基于香豆素衍生物的检测偶氮还原酶的荧光探针分子，其特征在于，所述荧光探针分子为具有如式I所述结构的化合物；
Figure DEST_PATH_FDA0003030499330000011
2.权利要求1所述基于香豆素衍生物的检测偶氮还原酶的荧光探针分子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）在硫酸的作用下，将4-氨基苯乙酮和4-(二乙氨基)水杨醛混合发生缩合反应，得到第一反应液；
2）将步骤1）所述第一反应液和高氯酸混合发生成环反应，得到结构式如式II所示的化合物YL；
Figure DEST_PATH_IMAGE004
式II
3）在盐酸的作用下将步骤2）中所述化合物YL和NaNO2混合发生重氮化反应，得到如式Ⅲ所示的重氮盐；
Figure DEST_PATH_IMAGE006
式Ⅲ
4）在氢氧化钠水溶液作用下，将苯胺和2-溴乙醇混合发生取代反应，得到N-苯基二乙醇胺；
5）将步骤4）中所述N-苯基二乙醇胺和POCl3混合发生氯化反应，得到苯丙氨酸氮芥；
6）将步骤3）中所述重氮盐和步骤5）所述苯丙氨酸氮芥混合发生偶联反应，得到权利要求1所述基于香豆素衍生物的检测偶氮还原酶的荧光探针分子；
其中步骤1）~3）与步骤4）~5）之间没有时间顺序的限制。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤1）中所述4-氨基苯乙酮和4-(二乙氨基)水杨醛的摩尔比为（0.9~1.2）：1；
所述缩合反应的温度为80~90℃；所述缩合反应的时间为6~7h；
所述缩合反应伴随搅拌；所述搅拌的转速为400~450rpm。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤2）中所述第一反应液和高氯酸的体积比为1：（0.1~0.06）；
所述高氯酸的体积浓度为68%~72%。
5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤3）中所述化合物YL和NaNO2的摩尔比为1：（1.1~1.2）；
所述重氮化反应的温度为0~5℃；所述重氮化反应的时间为30~40min。
6.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤4）中所述苯胺和2-溴乙醇的摩尔比为（0.4~0.6）：1；
所述氢氧化钠水溶液中氢氧化钠和2-溴乙醇的摩尔比为1：（8~9）；所述氢氧化钠水溶液的质量浓度为9%~11%；
所述取代反应的温度为95~105℃；所述取代反应的时间为10~14h。
7.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤5）中所述N-苯基二乙醇胺和POCl3的摩尔比为（0.8~1.2）：1；
所述氯化反应的温度为110~115℃，所述氯化反应的时间为1~1.2h；
所述重氮盐的原料化合物YL和所述苯丙氨酸氮芥的摩尔比为（0.8~1.2）：1。
8.权利要求1所述基于香豆素衍生物的检测偶氮还原酶的荧光探针分子或权利要求2~7任意一项所述制备方法制备得到的基于香豆素衍生物的检测偶氮还原酶的荧光探针分子在制备检测偶氮还原酶的试剂中的应用。
9.权利要求1所述基于香豆素衍生物的检测偶氮还原酶的荧光探针分子或权利要求2~7任意一项所述制备方法制备得到的基于香豆素衍生物的检测偶氮还原酶的荧光探针分子在检测水体中Sn2+中的应用。
10.权利要求1所述基于香豆素衍生物的检测偶氮还原酶的荧光探针分子或权利要求2~7任意一项所述制备方法制备得到的基于香豆素衍生物的检测偶氮还原酶的荧光探针分子在制备检测低氧细菌和/或低氧细胞的试剂中的应用。
11.权利要求1所述基于香豆素衍生物的检测偶氮还原酶的荧光探针分子或权利要求2~7任意一项所述制备方法制备得到的基于香豆素衍生物的检测偶氮还原酶的荧光探针分子在制备治疗肿瘤的试剂中的应用。
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